專利名稱：具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海膽提取物及提取方法，尤其是一種操作簡單、成本低，從海膽內(nèi)
容物中提取具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖及方法。
背景技術(shù)：
海膽是一種棘皮動物，主要有紫海膽、蝦胰馬糞海膽及棘冠海膽等品種。海膽的營 養(yǎng)及藥用價值很高，其可食部分是它體腔內(nèi)的生殖腺(卵巢、精巢)，統(tǒng)稱海膽卵，又稱海膽 黃或海膽膏。目前，從海膽中提取抗癌物質(zhì)的技術(shù)有以下兩種一種是從海膽黃中提取多糖 SEP的記載，但由于提取物為非硫酸多糖，在提取過程中要進(jìn)行多次層析柱提純，工藝復(fù)雜， 以及海膽黃原料稀缺、成本高，導(dǎo)致海膽黃多糖SEP造價高，以至于不能實現(xiàn)一次性大規(guī)模 生產(chǎn)；另一種則是從海膽殼中提取海膽殼糖，雖然原料來源廣泛、成本低且制備工藝簡單， 可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，但是所提取的組分是硫酸巖藻糖，只具有抗乳腺癌、宮頸癌及喉癌的作 用。迄今為止，還沒有關(guān)于以海膽內(nèi)容物(去除海膽殼)為原料，分離提取既具有抗腫瘤功 效又具有免疫活性的單一硫酸多糖化合物的相關(guān)記載。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種操作簡單、成本低，從海 膽內(nèi)容物中提取具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖及方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖，是硫 酸半乳葡聚糖，分子結(jié)構(gòu)特征是1 — 6鍵合半乳糖為主鏈，1 — 4鍵合葡萄糖為支鏈，半乳糖 的0-2、 0-4位置上連有硫酸基，是溶于水的乳白色粉末，分子結(jié)構(gòu)式如下
<formula>formula see original document page 3</formula> —種上述具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖的制備方法，其特征在于依次 按如下步驟進(jìn)行 a.將海膽內(nèi)容物加無水丙酮常溫浸泡兩次，每次兩小時，然后將丙酮蒸干，得到干 燥的海膽內(nèi)容物； b.用9(TC熱水浸提丙酮處理過且干燥的海膽內(nèi)容物三次，每次3小時，合并浸提 液，將浸提液濃縮，加濃縮液體積3倍的工業(yè)乙醇，離心、取沉淀，干燥沉淀得海膽內(nèi)容物粗 多糖； c.將海膽內(nèi)容物粗多糖熱水溶解，按酶與海膽內(nèi)容物粗多糖質(zhì)量比為1 : 200加
入酶活力單位65 溫10分鐘；
300萬單位/克的木瓜蛋白酶于溶液中，6(TC保溫24小時，升至9(TC保
d.加入海膽內(nèi)容物粗多糖液總體積1/4的Sevage試劑，振蕩1 2小時，靜止、離 心，取上清；重復(fù)操作至無游離蛋白，向合并的上清液中加入1倍體積的工業(yè)乙醇醇析，取 沉淀； e.將沉淀干燥后，配成20mg/mL的水溶液，上DE52纖維素離子交換柱，用0 1. 0mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，流速1. 0mL/min，每管5mL分部收集，苯酚_硫酸法逐管測 定糖含量，合并相同組分； f.將200mg所得組分上S印harose 4B制備柱，以0. 9 % NaCl溶液洗脫，流速 10ml/20min，自動部分收集器收集，酚_硫酸法測糖分布，截取分子量為200萬Da的組分， 透析濃縮、干燥，得海膽內(nèi)容物多糖。 本發(fā)明是以海膽殼內(nèi)的所有內(nèi)容物為原料，經(jīng)過熱水浸提、酶解、過濾、化學(xué)提純、 沉淀、離子交換層析等工藝制備而成，操作簡單、成本低廉，所提取的單一多糖組分既具有 抑制乳腺癌及宮頸癌細(xì)胞的作用，同時還具有免疫活性。


圖1是本發(fā)明實施例所提取的海膽內(nèi)容物多糖對ConA、LPS誘導(dǎo)下T、B淋巴細(xì)胞 增殖反應(yīng)的影響曲線圖。
具體實施例方式
a.將海膽內(nèi)容物加無水丙酮常溫浸泡兩小時，棄去丙酮浸泡液；再次加入無水丙 酮常溫浸泡兩小時，然后將丙酮蒸干，得到干燥的海膽內(nèi)容物； b.用9(TC熱水浸提丙酮處理過且干燥的海膽內(nèi)容物三次，每次浸提3小時，合并 浸提液，將浸提液濃縮，加濃縮液體積3倍的工業(yè)乙醇，離心、取沉淀，干燥沉淀得海膽內(nèi)容 物粗多糖； c.將海膽內(nèi)容物粗多糖熱水溶解，按酶與海膽內(nèi)容物粗多糖質(zhì)量比為1 : 200加 入酶活力單位65 300萬單位/克的木瓜蛋白酶于溶液中，6(TC保溫24小時，升至9(TC保 溫10分鐘，滅木瓜蛋白酶活性； d.加入海膽內(nèi)容物粗多糖液總體積1/4的Sevage試劑(氯仿正丁醇=4:1)， 充分振蕩1 2小時，靜止、離心，取上清；從加入Sevage試劑開始，重復(fù)操作至無游離蛋白 (即無沉淀)為止，合并上清液并向上清液中加入1倍體積的工業(yè)乙醇醇析，取沉淀；
e.將沉淀干燥后，配成20mg/mL的水溶液，上DE52纖維素離子交換柱 (3. 5cmX 25cm)，用0 1. 0mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，流速1. 0mL/min，每管5mL分部收 集，苯酚_硫酸法逐管測定糖含量，繪制洗脫曲線，合并相同組分； f.將所得組分上S印harose 4B制備柱(4. 5X80cm)，上樣200mg，以0. 9% NaCl 溶液洗脫，流速10ml/20min，BS-100A自動部分收集器收集，酚-硫酸法測糖分布，截取分子 量為200萬Da的組分，透析濃縮、干燥，得海膽內(nèi)容物多糖。 檢驗方法及結(jié)果用高效液相色譜和超離心等方法鑒定所得沉淀物為單一組分， 分子量2.0Xl(f道爾頓。用甲醇解，氣相色譜，甲基化，氣-質(zhì)聯(lián)用，高碘酸鹽氧化，Smith 降解，酶降解，原子力電子顯微鏡等方法檢測，證明該多糖化合物為硫酸半乳葡聚糖，其結(jié) 構(gòu)特征為，(1 — 6)半乳糖是主鏈，(1 — 4)葡萄糖為支鏈，在半乳糖的0-2、0-4位置上連
4<formula>formula see original document page 5</formula>
實驗方法及結(jié)果 —.用MTT法實驗證明，該本發(fā)明實施例所得海膽內(nèi)容物多糖(硫酸半乳葡聚糖) 對乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞具有一定程度的抑制作用，抑制率分別為15%和35%，最佳作 用量為50ug/ml ，說明該多糖具有明顯的抗腫瘤活性。 二.通過體外免疫實驗表明，不同濃度的本發(fā)明實施例所得海膽內(nèi)容物多糖對小 鼠脾臟的T、B淋巴細(xì)胞具有顯著的剌激增殖的作用且均呈現(xiàn)一定劑量依賴性。
1.免疫活性實驗 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗MTT比色法檢測海膽內(nèi)容物多糖對ConA誘導(dǎo)脾T淋巴細(xì)胞 增殖反應(yīng)的影響。 健康Black/6小鼠3只，脫頸處死后，無菌取出脾臟置平皿中擠壓、剪碎，常規(guī)制 備小鼠脾單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色計數(shù)(活細(xì)胞數(shù)> 95% )，完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 5X 106/ml。 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，RPMI-1640培養(yǎng)液100 y L/孔，100 P L海膽內(nèi)容物多糖(lmg/ ml)稀釋，同時每孔加入10 ii L的ConA溶液使其終濃度為5 y g/mL，并設(shè)置陰性對照和ConA 對照孔，各組均設(shè)3個復(fù)孔。然后，每孔加入脾淋巴細(xì)胞懸液100 P L (5 X 105細(xì)胞/孔)，培 養(yǎng)板置于37°〇，5% (A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。52h后取出，每孔輕輕吸上清液700ul，加入700ul 不含小牛血清的1640培養(yǎng)液，同時加入MTT (5mg/ml) 20 y L/孔，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4h，各孔分 別加入三聯(lián)液100ii L(10% SDS-5X異丙醇-0. 012mol/L鹽酸，W/V/V)終止反應(yīng)，37。C孵箱 過夜，搖勻后酶標(biāo)儀計測波長570nm的0D值。 B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗MTT比色法檢測海膽內(nèi)容物多糖對LPS誘導(dǎo)脾B淋巴細(xì)胞增 殖反應(yīng)的影響。 健康Black/6小鼠3只，脫頸處死后，無菌取出脾臟置平皿中擠壓、剪碎，常規(guī)制 備小鼠脾單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色計數(shù)(活細(xì)胞數(shù)> 95% )，完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 5X 106/mL。 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，RPMI-1640培養(yǎng)液100 y L/孔，100 P L海膽內(nèi)容物多糖(lmg/ mL)稀釋，同時每孔加入10 ii L的LPS溶液使其終濃度為10 y g/mL，并設(shè)置陰性對照和LPS 對照孔，各組均設(shè)3個復(fù)孔。然后，每孔加入脾淋巴細(xì)胞懸液100 P L (5 X 105細(xì)胞/孔)，培 養(yǎng)板置于37°C ， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。52h后取出，每孔輕輕吸上清液700 y L，加入700 y L 不含小牛血清的1640培養(yǎng)液，同時加入MTT (5mg/mLl) 20 y L/孑L混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4h，各孔 分別加入三聯(lián)液100ii L(10% SDS-5X異丙醇-0. 012mol/L鹽酸，W/V/V)終止反應(yīng)，37。C孵 箱過夜，搖勻后酶標(biāo)儀計測波長570nm的0D值。 結(jié)果采用MTT法檢測的結(jié)果是含有海膽內(nèi)容物多糖各孔所測的OD值均高于陰性 對照組，圖1所示在1. 9531 1000 ii g/mL濃度范圍內(nèi)海膽內(nèi)容物多糖對ConA誘導(dǎo)的T淋 巴細(xì)胞具有明顯的增殖作用；在1.9531 1000 iig/mL濃度范圍內(nèi)對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì) 胞增殖反應(yīng)有顯著的增強作用。說明海膽內(nèi)容物多糖對ConA、 LPS誘導(dǎo)下小鼠脾臟的T、 B淋巴細(xì)胞具有顯著的剌激增加作用,
權(quán)利要求
一種具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖，是硫酸半乳葡聚糖，分子結(jié)構(gòu)特征是1→6鍵合半乳糖為主鏈，1→4鍵合葡萄糖為支鏈，半乳糖的O-2、O-4位置上連有硫酸基，是溶于水的乳白色粉末，分子結(jié)構(gòu)式如下F2010100101292C00011.tif
2. —種如權(quán)利要求1所述具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖的制備方法，其特 征在于依次按如下步驟進(jìn)行a. 將海膽內(nèi)容物加無水丙酮常溫浸泡兩次，每次兩小時，然后將丙酮蒸干，得到干燥的 海膽內(nèi)容物；b. 用9(TC熱水浸提丙酮處理過且干燥的海膽內(nèi)容物三次，每次3小時，合并浸提液，將 浸提液濃縮，加濃縮液體積3倍的工業(yè)乙醇，離心、取沉淀，干燥沉淀得海膽內(nèi)容物粗多糖；c. 將海膽內(nèi)容物粗多糖熱水溶解，按酶與海膽內(nèi)容物粗多糖質(zhì)量比為1 : 200加入酶 活力單位65 300萬單位/克的木瓜蛋白酶于溶液中，6(TC保溫24小時，升至9(TC保溫 10分鐘；d. 加入海膽內(nèi)容物粗多糖液總體積1/4的Sevage試劑，振蕩1 2小時，靜止、離心，取 上清；重復(fù)操作至無游離蛋白，向合并的上清液中加入1倍體積的工業(yè)乙醇醇析，取沉淀；e. 將沉淀干燥后，配成20mg/mL的水溶液，上DE52纖維素離子交換柱，用0 1. 0mo1/ L的NaCl溶液梯度洗脫，流速1. 0mL/min，每管5mL分部收集，苯酚_硫酸法逐管測定糖含 量，合并相同組分；f. 將200mg所得組分上S印harose 4B制備柱，以0. 9 % NaCl溶液洗脫，流速 10ml/20min，自動部分收集器收集，酚_硫酸法測糖分布，截取分子量為200萬Da的組分， 透析濃縮、干燥，得海膽內(nèi)容物多糖。
全文摘要
本發(fā)明公開一種具有抗腫瘤和免疫活性的海膽內(nèi)容物多糖(硫酸半乳葡聚糖)，是以海膽殼內(nèi)的所有內(nèi)容物為原料，經(jīng)過熱水浸提、酶解、過濾、化學(xué)提純、沉淀、離子交換層析等工藝制備而成，分子結(jié)構(gòu)特征是1→6鍵合半乳糖為主鏈，1→4鍵合葡萄糖為支鏈，半乳糖的O-2、O-4位置上連有硫酸基，是溶于水的乳白色粉末，分子結(jié)構(gòu)式如下n(n＝1786)。
文檔編號A61P37/02GK101775078SQ201010010129
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月18日
發(fā)明者王長海, 白日霞, 薛業(yè), 趙培余 申請人:大連民族學(xué)院