專利名稱：腎來源的干細胞及其分離、分化和使用方法
技術領域：
本發(fā)明大體涉及分離腎干細胞的方法、由該方法分離的細胞和這些細胞的治療應用。更具體的，本發(fā)明涉及分離的、腎來源的、具有分化形成任一或所有三胚層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)細胞的祖細胞，以及分離所述細胞和誘導由所述方法分離的細胞的特異性分化的方法，和這些細胞中存在的特異性標志物如蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。
背景技術：
腎的腎毒性和缺血性損傷導致急性腎衰，多數(shù)經(jīng)常表現(xiàn)為急性腎小管壞死(ATN)。損傷后，腎經(jīng)歷再生反應，導致腎功能的恢復。對再生腎小管的細胞來源了解很少。新腎小管細胞的三種可能來源是(1)臨近的受破壞較少的腎小管細胞；(2)推測可能為骨髓起源的腎外細胞，歸巢到受損腎；或(3)駐留的腎干細胞。有證據(jù)支持受破壞較少的腎小管細胞的作用。重演發(fā)育過程，這些細胞脫分化、增殖并最終重新形成裸露的腎小管的內(nèi)層、恢復腎的結構和功能完整性[1-5]。已經(jīng)表征了定義這種腎再生的分子事件，并且已經(jīng)在實驗模型和人體內(nèi)測試了加速所述修復過程的策略[1-6]。
發(fā)現(xiàn)具有分化成不同細胞譜系的骨髓來源的干細胞已經(jīng)導致重新審視參與器官損傷恢復的細胞來源和過程[7-14]。骨髓來源的細胞能遷移到腎并形成腎小管上皮細胞[15-17]。然而，腎外細胞對再生性腎反應的貢獻小。骨髓細胞也能向腎小球腎炎動物模型中的腎小球和腎移植后內(nèi)皮和間質(zhì)組織提供細胞[8-26]。
已經(jīng)在很多器官中發(fā)現(xiàn)干細胞，這些器官包括骨髓、胃腸道粘膜、肝、腦、胰、前列腺和皮膚[27-31]。這些細胞參與這些器官中的正常細胞更替，并是器官損傷后的細胞來源?？寺》治鲆呀?jīng)證明成體腎的單個細胞具有腎小管生成的能力，盡管所述細胞還沒有非常詳細的表征[32]。腎發(fā)育的深入研究已經(jīng)證明單個后腎間充質(zhì)細胞能形成腎單位除集合管之外所有部分的上皮細胞，集合管的上皮細胞由輸尿管芽細胞形成[33]。后腎間充質(zhì)的譜系限制出現(xiàn)在發(fā)育較晚階段[34]。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供分離的多能腎祖細胞(MRPC)，所述細胞對波形蛋白、Oct-4、CD90和CD44呈現(xiàn)細胞標志物陽性，對關閉帶、細胞角蛋白、SSEA-1、NCAM、CD11b、CD45、CD31、CD106和I與II類MHC分子呈現(xiàn)細胞標志物陰性。本發(fā)明提供非胚胎和/或非生殖細胞的分離的MRPC。上述本發(fā)明細胞可具有在體外、活體外或體內(nèi)誘導分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細胞類型的能力。本發(fā)明的細胞可具有誘導分化成兩種分化細胞類型或所有三種分化細胞類型的能力。例如，所述細胞可具有誘導分化形成至少腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元和肝細胞類型的細胞(“指定類型的細胞”是指組成器官或參與器官功能的感興趣的所有細胞，僅舉幾例，腎小球膜細胞和腎小管細胞，它們是腎細胞類型的細胞)的能力。所述細胞可以是人細胞、大鼠細胞或小鼠細胞。所述細胞可以來自胎兒、新生兒、兒童或成體。繼續(xù)體外培養(yǎng)后(例如，細胞已培養(yǎng)超過4個月或已經(jīng)歷至少約90到約160次群體倍增)，所述細胞還可以表達高水平端粒酶并維持長端粒，例如長約12Kb、約16Kb或約23Kb的端粒。
本發(fā)明也提供上述MRCP群體和擴張所述MRCP的培養(yǎng)基的組合物。所述培養(yǎng)基可以包括血小板來源的生長因子(PDGF-BB)、表皮生長因子(EGF)和白血病抑制因子(LIF)。所述組合物的細胞也具有分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細胞類型的能力。
本發(fā)明進一步提供從上述MRPC獲得的分化細胞，其中所述后代細胞可以是腎、肝、神經(jīng)元或內(nèi)皮細胞。所述腎細胞可以是腎小管細胞。
本發(fā)明提供分離的轉(zhuǎn)基因MRPC，其中通過插入預選的分離DNA、或通過用預選的分離DNA替換所述細胞基因組的節(jié)段、或通過刪除或滅活所述細胞基因組的至少一部分，所述MRPC的基因組已經(jīng)被改變。這種改變可以是通過病毒轉(zhuǎn)導，如通過病毒載體整合，或通過使用DNA病毒、RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入DNA。作為替代方案，所述分離的轉(zhuǎn)基因細胞的細胞基因組一部分可以用反義核酸分子滅活，所述反義核酸分子的序列與待滅活細胞基因組的所述部分的序列互補。進而，所述細胞基因組的一部分可以用對應待滅活細胞基因組的所述部分序列的核酶序列來滅活。另外，所述細胞基因組的一部分可以用對應待滅活細胞基因組所述部分序列的小干擾RNA(siRNA)序列滅活。所述改變的基因組可以含有選擇或篩選標志物基因的基因序列，該基因的表達使得所述具有改變基因組的祖細胞或其后代可以與具有未改變基因組的祖細胞區(qū)分開。例如，所述標志物可以是綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-gal、Neo、DHFRm或潮霉素。所述轉(zhuǎn)基因細胞可以表達能被誘導型啟動子或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、酶或其它細胞產(chǎn)物表達的其它細胞機制所調(diào)節(jié)的基因。
本發(fā)明提供通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腎細胞約4周而分離MRPC的方法，其中所述培養(yǎng)基基本由DMEM-LG、MCDB-201、胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒(ITS)、地塞米松、抗壞血酸2-磷酸、青霉素、鏈霉素和胎牛血清(FCS)組成，其中還有表皮生長因子(EGF)、血小板來源的生長因子(PDGF-BB)和白血病抑制因子(LIF)。所述細胞可以培養(yǎng)約4-6周，或更長時間，或當多數(shù)細胞類型已經(jīng)死亡并且培養(yǎng)物變成單形態(tài)的紡錘形細胞。所述細胞可以培養(yǎng)于纖連蛋白上，并可以維持于約2-5×102細胞/cm2的濃度。所述方法進一步可以包括在添加生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所鋪的細胞。所使用的生長因子可以選自PDGF-BB、EGF、胰島素樣生長因子(IGF)和LIF。
本發(fā)明提供包含促進未分化MRPC繼續(xù)生長或分化的因子的細胞分化溶液。具體的，本發(fā)明提供培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，由此用支持這些細胞選擇性生長的培養(yǎng)基直接從腎組織衍生MRPC。例如，所述培養(yǎng)基的組成可以是60％DMEM-LG(Gibco-BRL，Grand Island，NY)、40％MCDB-201(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)、含1×胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒(ITS)、10-9M地塞米松(Sigma)和10-4M抗壞血酸2-磷酸(Sigma)、100U青霉素和1000U鏈霉素(Gibco)與2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)，還含表皮生長因子(EGF)10ng/ml、血小板來源的生長因子(PDGF)-BB10ng/m和白血病抑制因子(LIF)10ng/ml(全部來自R&D Systems，Minneapolis，MN)。所述細胞可以生長于纖連蛋白(FN)(Sigma)上。所述細胞可以維持于約2-5×102細胞/cm2的濃度。
本發(fā)明還提供根據(jù)上述方法分離的腎細胞和哺乳動物MRPC的培養(yǎng)克隆群體。
本發(fā)明提供通過向哺乳動物給予全異體的MRPC誘導哺乳動物耐受隨后的MRPC來源的組織移植物或其它器官移植物從而重構哺乳動物腎的方法。
本發(fā)明提供通過給予適當生長因子并使細胞生長從而將未分化的MRPC在活體外擴張成分化細胞的方法。這些生長因子可以包括FGF2、TGF、LIF、VEGF、bFGF、FGF-4、肝細胞生長因子，或其組合。本發(fā)明還提供由此方法獲得的分化細胞。這種分化細胞可以是外胚層、中胚層或內(nèi)胚層細胞。所述分化細胞還可以是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細胞類型的。另外，所述分化的腎細胞可以是腎小管細胞。
本發(fā)明提供上述細胞的多種用途。例如，本發(fā)明提供體內(nèi)分化MRPC的方法，這是通過上述方法分離多能腎祖細胞并將擴張的所述細胞群體給予對象，導致所述細胞群體被植入并體內(nèi)分化成組織特異性細胞，使得由于損傷或疾病而有缺陷的細胞或器官的功能第一次被提高、重構或提供。所述組織特異性細胞可以是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細胞類型的。還提供由此方法獲得的分化細胞。
本發(fā)明還提供通過給予治療有效量的上述細胞或其后代治療需要治療的對象的方法。所述MRPC或其后代可以歸巢到所述對象的一種或多種器官并移植入其內(nèi)和/或其上，使得由于損傷或疾病而有缺陷的細胞或器官的功能第一次被提高、重構或提供。所述后代可以具有進一步分化的能力，或者它們可以是終末分化的。
本發(fā)明提供使用所述分離細胞的方法，這是通過宮內(nèi)移植細胞群以形成細胞或組織的嵌合體，從而在移植后的出生前或出生后人或動物中產(chǎn)生人細胞，其中所述細胞在所述人或動物中產(chǎn)生治療性酶、蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物以糾正遺傳缺陷。本發(fā)明還提供使用所述細胞在需要治療治療的對象中進行基因治療的方法，包括通過將編碼期望基因產(chǎn)物的分離的預選DNA導入所述細胞中從而遺傳改變所述細胞，培養(yǎng)擴張所述細胞，并將所述細胞給予所述對象以產(chǎn)生期望基因產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供修復需要這種修復的對象中的損壞組織的方法，包括培養(yǎng)擴張所述分離MRPC，并將有效量的所述擴張細胞給予所述具有損壞組織的對象。另外，本發(fā)明還提供修復需要這種修復的對象中的損壞組織的方法，包括將外源分子給予所述對象刺激內(nèi)源性MRPC增殖并分化成腎的不同細胞譜系。例如，本發(fā)明提供當通過給予分子如LIF、集落刺激因子或胰島素樣生長因子而刺激時，腎中存在的內(nèi)源性MRPC細胞增殖并分化成腎的不同細胞譜系的方法。這些受刺激的MRPC然后能有助于疾病如急性腎小管壞死中腎的再生和疾病如肝硬化中非腎組織的再生。
本發(fā)明提供使用MRPC誘導對傳染性因子免疫應答的方法，包括遺傳改變多能腎祖細胞的培養(yǎng)擴張的克隆群體，以表達激發(fā)抗傳染性因子的保護性免疫應答的一種或多種預選抗原性分子，并向所述對象給予有效誘導所述免疫應答的量的所述遺傳改變的細胞。
本發(fā)明提供使用MRPC鑒定與生理異常相關的遺傳多態(tài)性的方法，包括從統(tǒng)計學顯著的、從中可獲得表型數(shù)據(jù)的個體群中分離所述MRPC，培養(yǎng)擴張來自統(tǒng)計學顯著的個體群的MRPC以建立MRPC培養(yǎng)物，在培養(yǎng)的MRPC中鑒定至少一種遺傳多態(tài)性，誘導培養(yǎng)的MRPC分化，并通過將具有正?；蛐偷腗RPC表現(xiàn)的分化模式與具有鑒定的遺傳多態(tài)性的MRPC表現(xiàn)的分化模式比較，表征與所述至少一種遺傳多態(tài)性相關的異常代謝過程。
本發(fā)明進一步提供治療對象中癌癥的方法，包括遺傳改變MRPC以表達殺腫瘤蛋白、抗血管生成蛋白或與刺激抗原免疫應答相關蛋白一起在腫瘤細胞表面表達的蛋白，并向所述對象給予有效抗癌量的所述遺傳改變的MRPC。
本發(fā)明提供使用MRPC表征對生物或藥理因子的細胞應答的方法，包括從統(tǒng)計學顯著的個體群分離MRPC，培養(yǎng)擴張從統(tǒng)計學顯著的個體群分離的所述MRPC以建立多種MRPC培養(yǎng)物，將所述MRPC培養(yǎng)物與一種或多種生物或藥理因子接觸，鑒定對所述一種或多種生物或藥理因子的一種或多種細胞應答，和比較來自所述統(tǒng)計學顯著的群體中個體的MRPC培養(yǎng)物的一種或多種細胞應答。
本發(fā)明還提供將特異性分化細胞用于治療的方法，包括將所述特異性分化細胞給予需要的患者。進一步提供遺傳工程化MRPC用于選擇性表達內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的用途，和體內(nèi)生長的MRPC用于移植/給予動物以治療疾病的用途。例如，來源于MRPC的分化細胞可用于治療與腎的腎小管、血管、間質(zhì)或腎小球結構相關的疾病。例如細胞可用于治療腎小球基底膜疾病，如Alports綜合征；腎小管轉(zhuǎn)運疾病，如Bartter綜合征、胱氨酸尿或腎性尿崩癥；各種病因的進行性腎病，如糖尿病性腎病或腎小球腎炎；Fabry病、高草酸尿，用于加速從急性腎小管壞死中恢復。所述細胞可用于將細胞植入哺乳動物，包括給予自體、異體或異種細胞以恢復或糾正所述哺乳動物的組織特異性代謝功能、酶功能、結構功能或其它功能。所述細胞可用于將細胞植入哺乳動物，引起細胞類型的體內(nèi)分化，并用于將所述分化的腎祖細胞給予所述哺乳動物。所述細胞，或其體內(nèi)或體外分化的后代，可用于糾正遺傳病、退行性疾病或癌癥過程。它們可用作治療劑例如輔助患者從癌癥治療的化療或放療、自身免疫病治療的恢復，或誘導受體耐受。
本發(fā)明進一步提供分析上述MRPC的基因譜圖(gene profiling)的方法，以及該基因譜圖在數(shù)據(jù)庫中的用途。還提供分析基因譜圖后的上述MRPC用于輔助藥物發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫中的用途。
本發(fā)明進一步提供使用MRPC或從MRPC分化的細胞與載體(carrier)裝置一起形成人工腎。合適的載體裝置在本領域公知。例如，所述載體裝置可以是中空纖維基裝置。與該裝置一起使用的所述分化的MRPC可以是腎細胞。本發(fā)明進一步提供從對象血液中除去毒素的方法，包括將所述血液在活體外與形成中空纖維基裝置內(nèi)層的分離的MRPC接觸。
另外，在上述方法中，所述細胞可以與可接受的基質(zhì)如藥學上可接受的基質(zhì)一起給予。所述基質(zhì)可以是可生物可降解的。所述基質(zhì)還可以提供另外的遺傳物質(zhì)、細胞因子、生長因子或促進所述細胞生長和分化的其它因子。所述細胞還可以在給予之前被膠囊化。所述膠囊化細胞可以包含于聚合物膠囊中。
本發(fā)明的細胞還可以通過各種給予方法給予對象，包括局部注射、全身注射、腸胃外給予、口服給予或?qū)m內(nèi)注射給胚胎。上述方法的對象可以是哺乳動物。所述哺乳動物可以是人。
本發(fā)明還提供鑒定輔助腎再生的藥物因子、包括生物因子的方法，包括用在腎單位形成過程中被活化的基因的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)染MRPC，其中所述啟動子區(qū)可操作的連接到受體基因，使所述轉(zhuǎn)染細胞與藥物因子接觸，并檢測表達的由所述標志物基因編碼的表達蛋白，其中所述蛋白檢測鑒定藥物因子是否能輔助腎再生。所述標志物基因可以是綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-gal、Neo、DHFRm或潮霉素。
附圖簡述
圖1A-C.(A)來源于成體骨髓的小鼠MAPC的相差顯微圖；(B)小鼠多能腎祖細胞的相差顯微圖；和(C)大鼠腎祖細胞的相差顯微圖。所有三種細胞具有相似的紡錘形態(tài)。
圖2A-B.小鼠MRPC的相差圖(A)和掃描電子顯微圖(B)證明細胞聚集成原始小球。
圖3A-B.小鼠MRPC的免疫組化，(A)FITC標記的抗細胞角蛋白抗體染色，顯示細胞角蛋白的細胞漿染色；和(B)德克薩斯紅標記的抗ZO-1抗體，顯示沿細胞邊緣的特征性spickled染色。
圖4A-D.培養(yǎng)于對照培養(yǎng)基(A和B)或含腎發(fā)生混合物的培養(yǎng)基(C和D)中的小鼠MRPC的相差圖(A和C)和相同圖像的熒光顯微圖(B和D)。在所述混合物存在下，細胞聚集并變成與Pax-2表達一致的eGFP陽性。
圖5A-F.大鼠MRPC(A)能被誘導分化成內(nèi)皮(B)、神經(jīng)元(C)和肝細胞(D)。特征性相差形態(tài)和標志物的免疫組化被標出來(E和F)。
圖6A-B.Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的腎，(A)β-半乳糖苷酶活性染色(藍色細胞指示陽性染色)；(B)β半乳糖苷酶的免疫組化(棕色染色指示陽性細胞)。箭頭指示間質(zhì)區(qū)中的陽性染色細胞。
圖7.200次群體倍增下的MRPC的FACS分析，證明100％的二倍體細胞。
圖8.Southern印跡分析，證明在90和160次群體倍增后端粒長度被維持。
圖9.大鼠MRPC的轉(zhuǎn)染和體外分化。用MSCV-eGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染大鼠MRPC，通過FACS選擇高水平GFP表達的細胞。這些細胞被稱為eMRCP。如圖9所示，eGFP能容易的通過直接熒光和抗GFP抗體檢測。eGFP轉(zhuǎn)染的細胞仍能用適當?shù)倪x擇培養(yǎng)基分化成其它細胞類型。示出了分化成內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元的eMRPC的形態(tài)的實例。
圖10A-B.囊下注射后的體內(nèi)分化。eMRPC注射到Fisher大鼠的腎小囊下。三周后，取腎進行共聚焦顯微檢查。圖10A顯示在注射位點的囊下形成的GFP陽性細胞結節(jié)和包括的囊樣結構。圖10B顯示一些GFP陽性細胞已經(jīng)被摻入腎小管。
圖11A-F.腎缺血/再灌注后的體內(nèi)分化(缺血/再灌注后的再生腎)。A)MRPC的腎小管管型；B)駐入腎小球的MRPC；C)存在于再生腎小管的幾個MRPC(箭頭)；D)MRPC陽性腎小管的分組；E)具有很多MRPC的腎小管；F)該腎小管中的幾個陽性細胞，包括成簇的可能來自間質(zhì)MRPC細胞的細胞。
圖12.PCNA染色ARF模型中的主動脈內(nèi)注射。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上增殖細胞核抗原(PCNA，粉紅)染色陽性的細胞、細胞核(TOPRO3，藍)和表達eGFP的MRPC(綠)。摻入腎小管的MRPC呈現(xiàn)PCNA染色陽性。
圖13.ZO-1染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上緊密連接蛋白關閉帶-1(ZO-1，紅)染色陽性的細胞、細胞核(TOPRO3，藍)和表達eGFP的MRPC(綠)。由此可見摻入腎小管后MRPC表達ZO-1。
圖14.波形蛋白染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上間質(zhì)中波形蛋白(紅)染色陽性的細胞、細胞核(TOPRO3，藍)和表達eGFP的MRPC(綠)。由此可見摻入腎小管后MRPC喪失波形蛋白表達。
圖15.PHE-A(近端腎小管標志物)染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上近端腎小管標志物PHE-A(紅)染色陽性的細胞、細胞核(TOPRO3，藍)和表達eGFP的MRPC(綠)。由此可見摻入腎小管的MRPC對PHE-A染色陽性。
圖16.PNA(遠端腎小管標志物)染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上遠端腎小管標志物花生凝集素(PNA，紅)染色陽性的細胞、細胞核(TOPRO3，藍)和表達eGFP的MRPC(綠)。由此可見摻入腎小管的MRPC對PNA染色陽性。
圖17.THP(亨利袢標志物)染色。缺血-再灌注損傷和MRPC注射后兩周收獲的Fisher大鼠腎的冷凍切片。切片上亨利袢標志物Tamm Horsfall蛋白(THP，紅)染色陽性的細胞、細胞核(TOPRO3，藍)和表達eGFP的MRPC(綠)。由此可見摻入腎小管的MRPC對THP染色弱。
圖18.快速藥物發(fā)現(xiàn)模型針對細胞命運。
具體實施方案急性腎衰后的腎功能恢復依賴于壞死腎小管細胞用功能性腎上皮細胞的替換。這些新腎小管細胞的來源被認為是臨近的、受破壞較少的腎小管細胞，盡管腎外細胞也有一定程度的貢獻。
本發(fā)明人已經(jīng)分離并表征了腎中存在的能分化成不同細胞譜系的干細胞。這些來源于腎的干細胞此處被稱為多能腎祖細胞(MRPC)。MRPC的來源包括成體、新生兒、兒童或胎兒的腎。MRPC可以來自正常和/或轉(zhuǎn)基因動物。MRPC可以來自損傷或未損傷的、健康或有疾病的腎。MRPC可以分化形成任何或所有三種生殖細胞層(內(nèi)胚層、中胚層、外胚層)。此處所述的多能成體干細胞用本發(fā)明人建立的方法分離，本發(fā)明人鑒定了表征MRPC的多種特異性細胞標志物。
本發(fā)明的方法可用于從人、大鼠、小鼠和其它物種來源的任何成體、兒童或胎兒分離MRPC。因此本領域技術人員現(xiàn)在可以獲得腎活組織，并根據(jù)發(fā)明人鑒定的這些細胞之上或之中表達的標志物、使用本領域技術人員已知的陽性或陰性選擇技術來分離細胞，從而分離MRPC，無需過多的實驗。
本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了分離和表征成體腎來源干細胞的重要數(shù)據(jù)。這些細胞的存在對理解損傷腎的修復應答有重要影響并改變了腎再生的當前模型。本發(fā)明的MRPC分化的體外模式系統(tǒng)允許測試負責腎細胞譜系進程(例如，未分化干細胞向分化腎細胞——包括腎的小管細胞——的進程)的特異性因子。未誘導狀態(tài)或經(jīng)不同程度分化后的MRPC為腎病的細胞治療提供重要的治療工具，或作為向受破壞腎遞送治療性基因或因子的載體。成體腎來源的干細胞的存在對其它器官系統(tǒng)的損傷和修復研究也有重要影響。
Verfaillie等人分離了成體骨髓來源的間充質(zhì)干細胞，這些細胞被稱為多能成體祖細胞或MAPC，它們有能力體外分化為間充質(zhì)細胞以及具有臟壁中胚層、神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層特征的細胞[35]。發(fā)明人將相似的培養(yǎng)條件應用于成體腎以確定成體腎中是否存在腎干細胞。在衍生腎干細胞的細胞群體方面它們是成功的。
分離腎祖細胞(MRPC)用培養(yǎng)MAPC使用的相似培養(yǎng)條件從小鼠和大鼠腎分離腎祖細胞(即干)細胞[35]。具體的說，將所述細胞鋪于低血清培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)基可以含有以下成分50-60％DMEM-LG(Gibco-BRL，Grand Island，NY)，30-40％MCDB-201(SigmaChemical Co，St.Louis，MO)，以及1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)，10-8M-10-9M地塞米松(Sigma)和10-3M-10-4M抗壞血酸2-磷酸(Sigma)，100U青霉素和1000U鏈霉素(Gibco)，還有纖連蛋白(FN)(Sigma)和1-3％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，UT)和5-20ng/ml表皮生長因子(EGF)、5-20ng/ml血小板來源的生長因子(PDGF)-BB和5-20ng/ml白血病抑制因子(LIF)(全部來自R&D Systems，Minneapolis，MN)。在一個實施方案中，培養(yǎng)基含有60％DMEM-LG，40％MCDB-201，以及1×ITS，10-9M地塞米松和10-4M抗壞血酸2-磷酸，100U青霉素和1000U鏈霉素，還有纖連蛋白和2％胎牛血清和10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-BB和10ng/ml LIF。該培養(yǎng)基用于維持和擴張未分化狀態(tài)的細胞。細胞維持于2-5×102細胞/cm2。所述分離細胞呈現(xiàn)波形蛋白和Oct-4細胞標志物陽性，呈現(xiàn)關閉帶、細胞角蛋白和I與II類MHC分子陰性。所述細胞對CD90和CD44也呈現(xiàn)抗原陽性，對SSEA-1、NCAM、CD11b、CD45、CD31和CD106呈現(xiàn)抗原陰性。
一旦建立細胞培養(yǎng)，就可以用含40％FCS和10％DMSO的DMEM冷凍并保存細胞為冷凍保存物。制備培養(yǎng)細胞的冷凍保存物的其它方法對本領域技術人員也是已知的。
體外分化腎祖細胞使用適當?shù)纳L因子、趨化因子和細胞因子，可以將本發(fā)明的MRPC誘導分化形成多種細胞譜系，例如包括外胚層、中胚層或內(nèi)胚層來源的各種細胞。
在一個實施例中，如上分離的細胞能被誘導分化。MRPC與含F(xiàn)GF2、TGF-β、和LIF的“腎發(fā)生混合物”一起培養(yǎng)。除了形態(tài)變化以外，所述細胞表達上皮細胞標志物，包括細胞角蛋白和關閉帶-1(ZO-1)。這些細胞是急性腎衰后再生細胞的來源。
防止免疫排斥的移植方法通用供體細胞可操作MRPC作為通用供體細胞，并用于治療遺傳病或其它疾病和替換酶的基因治療。盡管未分化MRPC不表達I型HLA或II型HLA抗原，一些分化后代表達至少I型HLA抗原。通過消除I型HLA和II型HLA抗原并潛在的引入預期受體的HLA抗原，使細胞不成為NK介導殺傷的容易的靶標，或變得對無限制病毒復制和/或惡性轉(zhuǎn)化敏感，MRPC可以被修飾用作通用供體細胞。通過同源重組或在啟動子區(qū)引入點突變或在所述抗原的起始外顯子中引入導致終止密碼子的點突變，如用chimeroplast，可以實現(xiàn)HLA抗原的消除。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺相關病毒或其它病毒轉(zhuǎn)導或經(jīng)用所述HLA抗原cDNA轉(zhuǎn)染靶細胞可以實現(xiàn)宿主HLA抗原的轉(zhuǎn)移。
宮內(nèi)移植以繞過免疫識別MRPC可以用于宮內(nèi)移植以在免疫系統(tǒng)發(fā)育之前糾正遺傳異常，或?qū)雽⒈凰拗髂褪艿募毎?。這可以是在動物中大量制備人細胞的方式，或可以用作通過移植生成正確蛋白質(zhì)或酶的細胞而糾正人胚胎遺傳缺陷的方式?；蛑委熆蓮纳眢w提取并分離本發(fā)明的MRPC以未分化狀態(tài)在培養(yǎng)中生長，或誘導分化培養(yǎng)，并用各種技術尤其是病毒轉(zhuǎn)導得以遺傳改變。遺傳物質(zhì)的攝入和表達是可證明的，并且外來DNA的表達在整個發(fā)育期間穩(wěn)定。將外來DNA插入干細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和其它載體對本領域技術人員已知。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染后，增強型綠色熒光蛋白(eGFP)表達在終末分化細胞中持續(xù)存在，證明導入MRPC的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達在整個分化期間持續(xù)。
基因治療的候選基因例如包括編碼IV型膠原α5鏈(COL4A5)、多囊蛋白、α-半乳糖苷酶A、噻嗪類敏感的氯化鈉共轉(zhuǎn)運蛋白(NCCT)、nephrin、輔肌動蛋白或水通道蛋白(aquaporin)2的基因。
這些基因可以由誘導型啟動子驅(qū)動，從而使酶表達水平可以得到調(diào)節(jié)。這些誘導型啟動子系統(tǒng)可以包括與待生成蛋白連接的人雌激素受體(ER)的突變的配體結合結構域。這要求個體攝入他莫西芬以誘導蛋白表達。替代方案有四環(huán)素開關系統(tǒng)、RU486和雷帕霉素誘導系統(tǒng)。獲得相對選擇性表達的其它方法是使用組織特異性啟動子。例如，可以導入由KSP-鈣粘蛋白、nephrin或uromodulin特異性啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因。
遺傳改變的MRPC可以局部導入或全身輸注。它們可遷移到腎，在此細胞因子、生長因子和其它因子誘導細胞分化?，F(xiàn)作為周圍組織一部分的分化細胞保留生成所導入基因的蛋白產(chǎn)物的能力。
遺傳改變的MRPC也可以包封在惰性載體中，使細胞在生成分泌蛋白時免受宿主免疫系統(tǒng)影響。細胞微膠囊化技術對本領域技術人員已知(例如見Chang，P.，et al.[45])。細胞微膠囊化材料例如包括聚合物膠囊、藻酸-聚-L-賴氨酸-藻酸微膠囊、聚-L-賴氨酸-藻酸鋇膠囊、藻酸鋇膠囊、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)中空纖維和聚醚砜(PES)中空纖維。例如美國專利No.5,639,275(Baetge，E.，et al.)[46]描述了用含遺傳工程化細胞的生物相容性膠囊長期、穩(wěn)定表達生物活性分子的改進裝置和方法。這些生物相容性免疫隔離膠囊與本發(fā)明的MRPC組合，提供治療多種生理疾病的方法。
微膠囊化本發(fā)明細胞的另一優(yōu)點是存在向微膠囊中摻入各種細胞的機會，每種細胞產(chǎn)生生物治療分子。本發(fā)明的MRPC可被誘導分化成多種完全不同的譜系，每種譜系能被遺傳改變以生成治療有效水平的生物活性分子。攜帶不同遺傳元件的MRPC可以被包封在一起以產(chǎn)生各種生物活性分子。
可以在活體外遺傳改變本發(fā)明的MRPC，以消除一種最顯著的基因治療屏障。例如，可以獲得對象的腎活組織，并從所述活組織中分離MRPC。然后遺傳改變所述MRPC以表達一種或多種期望的基因產(chǎn)物。然后可以在活體外篩選或選擇MRPC以鑒定已被成功改變的細胞，這些細胞可以局部或全身性重新導入所述對象。作為替代方案，MRPC可以被遺傳改變并培養(yǎng)誘導分化形成用于移植的特定細胞譜系。每種情況下，所述移植MRPC提供能表達所期望基因產(chǎn)物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞來源。該方法可用于治療Alports綜合征、巴特綜合征、胱氨酸尿、腎性尿崩癥、腎小管酸中毒、范科尼綜合征、法布里病、多囊性腎病，僅作為幾個例子。本發(fā)明的細胞可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導，從而可以提供靶基因產(chǎn)物的更持久來源。
遺傳改變MRPC的方法通過用本領域技術人員已知的各種方法將DNA或RNA導入細胞，此處所述方法分離的細胞可被遺傳修飾。這些方法一般分成四大類(1)病毒轉(zhuǎn)移，例如，包括使用DNA或RNA病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、猴病毒40(SV40)、腺病毒、辛德比斯病毒和牛乳頭瘤病毒；(2)化學轉(zhuǎn)移，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染和DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染方法；(3)膜融合轉(zhuǎn)移，例如，使用負載DNA的膜泡，如脂質(zhì)體、血影細胞(red blood cell ghost)和原生質(zhì)體；和(4)物理轉(zhuǎn)移技術，如微注射、電穿孔或直接“裸”DNA轉(zhuǎn)移。通過插入預選的分離DNA、通過用預選的分離DNA替換所述細胞基因組的節(jié)段或通過刪除或滅活所述細胞基因組的至少一部分，可以遺傳改變MRPC。通過各種手段可以實現(xiàn)刪除或滅活細胞基因組的至少一部分，例如，包括但不限于遺傳重組、用反義技術(可以包括使用肽核酸或PNA)或用核酶技術。通過同源重組或病毒整合入宿主細胞基因組可以實現(xiàn)插入一或多種預選DNA序列。用質(zhì)粒表達載體和核定位序列也可以將期望基因序列導入細胞，尤其是導入細胞核。指導多核苷酸入核的方法已經(jīng)在現(xiàn)有技術中描述。使用允許用某些化學物/藥物正或負誘導感興趣基因的啟動子，可以導入遺傳物質(zhì)，這些遺傳物質(zhì)在給予既定藥物/化學物后可被消除，或可以加標簽以允許用化學物誘導(包括但不限于他莫西芬反應性突變雌激素受體)在特定細胞區(qū)隔(包括但不限于細胞膜)中表達。
磷酸鈣轉(zhuǎn)染依靠質(zhì)粒DNA/鈣離子的沉淀，它可用于將含靶基因或多核苷酸的質(zhì)粒DNA導入分離或培養(yǎng)的MRPC中。簡單的說，將質(zhì)粒DNA混合入氯化鈣溶液，然后加入磷酸緩沖溶液中。形成沉淀以后將溶液直接加入培養(yǎng)細胞中。DMSO或甘油處理可用于提高轉(zhuǎn)染效率，用雙-羥乙基氨基乙磺酸(BES)可以提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體的水平。磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)有商品提供(如ProFection，Promega Corp.，Madison，WI)。
DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染對本領域技術人員也是已知的，當需要瞬時轉(zhuǎn)染時比磷酸鈣轉(zhuǎn)染更優(yōu)選，因為它經(jīng)常更有效。
因為本發(fā)明的細胞是分離細胞，微注射對于轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)到細胞中會特別有效。簡單的說，將細胞置于光學顯微鏡的工作臺上。在顯微鏡提供的放大輔助下，將玻璃微吸管導入核中注射DNA或RNA。這種方法有利，因為它提供期望遺傳物質(zhì)向核中的直接遞送，避免被注射多核苷酸的細胞漿和溶酶體降解。這種技術已經(jīng)有效的用于轉(zhuǎn)基因動物的生殖系修飾。
本發(fā)明的細胞也可用電穿孔進行遺傳修飾。將靶DNA或RNA加入培養(yǎng)細胞懸液中。將DNA/RNA-細胞懸液置于兩個電極之間并施加電脈沖，引起細胞外膜瞬間滲透性，表現(xiàn)為出現(xiàn)跨膜孔。靶多核苷酸通過膜上的開孔進入細胞，當電場中斷后，孔在約1-30分鐘內(nèi)閉合。
可用與多核苷酸形成穩(wěn)定復合體的陽離子脂質(zhì)體進行DNA或RNA的脂質(zhì)體遞送，以遺傳修飾細胞。為了穩(wěn)定脂質(zhì)體復合體，可以加入二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)。用于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移的推薦試劑是Lipofectin(LifeTechnologies，Inc.)，它有商品供應。例如，Lipofectin是陽離子脂質(zhì)N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N-N-N-三甲基氯化銨和DOPE的混合物。體內(nèi)或體外遞送線性DNA、質(zhì)粒DNA或RNA可以用脂質(zhì)體遞送完成，脂質(zhì)體能攜帶較大的DNA，一般能保護多核苷酸不被降解，并能靶向特定細胞或組織，由于這些事實，脂質(zhì)體遞送可以是優(yōu)選的方法。依賴脂質(zhì)體技術的其它多種遞送系統(tǒng)也有商品供應，包括EffecteneTM(Qiagen)、DOTAP(Roche Molecular Biochemicals)、FuGene 6TM(Roche MolecularBiochemicals)和Transfectam(Promega)。引入純化的病毒或細胞囊膜成分可以增強陽離子脂質(zhì)介導的基因轉(zhuǎn)移效率，如水泡性口炎病毒囊膜的純化的G糖蛋白(VSV-G)，見Abe，A.，et al.[47]的方法。
已經(jīng)表明用脂質(zhì)多胺包被的DNA可有效遞送DNA進入原代和建立的哺乳動物細胞系的基因轉(zhuǎn)移技術可用于將靶DNA導入MRPC。這種技術一般性描述于Loeffler，J.and Behr，J.[48]。
裸質(zhì)粒DNA可直接注射入由來自分離MRPC的分化細胞形成的組織團。這種技術已經(jīng)顯示可有效轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA進入骨骼肌組織，已經(jīng)觀察到單次肌肉注射后小鼠骨骼肌中表達超過19個月。分裂越快的細胞攝入裸質(zhì)粒DNA的效率越高。因此，有利的是用質(zhì)粒DNA處理之前刺激細胞分裂。
微粒(microprojectile)基因轉(zhuǎn)移也可用于體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因進入MRPC。微?；蜣D(zhuǎn)移的基本操作由J.Wolff[49]描述。簡單的說，編碼靶基因的質(zhì)粒DNA包被到微珠上，微珠通常是1-3微米大小的金或鎢顆粒。將包被顆粒放置到載片上，載片插在發(fā)射室上面。發(fā)射以后，載片被加速到達保持網(wǎng)，保持網(wǎng)形成停止載片進一步運動的屏障，使包被多核苷酸的顆粒被推動，通常由氦氣流推動，到達目標表面，如由分化MRPC形成的組織團。微顆粒注射技術以前已被描述，且這些方法對本領域技術人員已知(見[50-52])。
信號肽可與質(zhì)粒DNA連接[53]以指導DNA入核進行更高效表達。
病毒載體可用于遺傳改變本發(fā)明的MRPC及其后代。如之前已經(jīng)描述的物理方法那樣，使用病毒載體遞送例如一種或多種靶基因、多核苷酸、反義分子或核酶序列進入細胞。病毒載體和使用它們將DNA遞送到細胞中的方法是本領域技術人員公知的?？捎糜谶z傳改變本發(fā)明細胞的病毒載體的實例包括但不限于腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)、α-病毒載體(如辛德比斯病毒載體)和皰疹病毒載體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可有效轉(zhuǎn)導快速分裂的細胞，盡管也已經(jīng)開發(fā)很多用于有效轉(zhuǎn)移DNA進入非分裂細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[54]。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細胞系對本領域技術人員已知。包裝細胞系提供病毒載體衣殼生成和毒粒成熟需要的病毒蛋白。通常，這些包括gag、pol和env逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。適當?shù)陌b細胞系選自產(chǎn)生親嗜性、異嗜性或雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的已知細胞系，提供一定程度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)特異性。
逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA載體通常與包裝細胞系一起用于在細胞內(nèi)產(chǎn)生期望靶序列/載體組合。簡單的說，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA載體是一種質(zhì)粒DNA，其中在多克隆位點附近含有兩個逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR，還含有SV40啟動子，第一個LTR位于該SV40啟動子的5’端，SV40與克隆到多克隆位點中的靶基因序列可操作的連接，隨后是3’第二個LTR。逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA載體形成以后，可以用前述磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染將其轉(zhuǎn)入包裝細胞系。病毒生成約48小時以后，收獲此時含有靶基因序列的病毒載體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶向特定細胞類型已經(jīng)被Martin，F(xiàn)等[55]證明，他們使用抗表面糖蛋白高分子量黑素瘤相關抗原的單鏈可變片段抗體，將該抗體與雙嗜性鼠白血病病毒包膜融合，以使載體靶向遞送靶基因到黑素瘤細胞中。當期望用靶向遞送時，例如當分化細胞是期望的遺傳改變目標時，與抗體片段融合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于靶向遞送到這些細胞中，所述抗體片段抗從本發(fā)明MRPC分化的各種細胞譜系表達的特異性標志物。
慢病毒載體也可用于遺傳改變本發(fā)明細胞。很多這種載體已經(jīng)在文獻中描述并且對本領域技術人員已知[56]。這些載體已經(jīng)有效的遺傳改變?nèi)嗽煅杉毎鸞57]。慢病毒載體的包裝細胞系已經(jīng)描述[58-59]。
重組皰疹病毒，如I型單純皰疹病毒(HSV-1)已經(jīng)成功用于向表達紅細胞生成素受體的細胞進行靶向DNA遞送[60]。這些載體也可用于遺傳改變本發(fā)明的細胞，本發(fā)明已經(jīng)證明這些細胞可以被病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導。
腺病毒載體具有高轉(zhuǎn)導效率，可插入DNA片段高達8kb，并且能感染復制和分化細胞。很多腺病毒載體已經(jīng)描述于文獻中并且本領域技術人員已知[61-62]。將靶DNA插入腺病毒載體的方法對基因治療領域的技術人員是已知的，使用重組腺病毒載體將靶DNA導入特定細胞類型的方法也是已知的[63]。通過修改病毒載體纖維序列已經(jīng)證明對某些細胞類型的結合親合力。已經(jīng)描述基因轉(zhuǎn)移中允許調(diào)節(jié)蛋白表達的腺病毒載體系統(tǒng)[64]。擴增具有遺傳修飾性受體特異性的腺病毒載體的系統(tǒng)也已經(jīng)描述，以提供向特定細胞類型的轉(zhuǎn)導靶向[65]。最近描述的綿羊腺病毒載體甚至解決了已有體液免疫干擾成功基因轉(zhuǎn)移的潛在可能性[66]。
也已經(jīng)有提供靶向基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定基因表達的、使用分子結合物載體(molecularconjugate vector)的腺病毒載體，通過將含靶基因的質(zhì)粒DNA與聚賴氨酸縮合來構建這些載體，其中所述聚賴氨酸與不能復制的腺病毒連接。
α-病毒載體，尤其是辛德比斯病毒載體，也可用于轉(zhuǎn)導本發(fā)明的細胞。這些載體有商品供應(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并已描述于例如美國專利No.5,843,723[68]以及Xiong，C.，et al.[69]，Bredenbeek，P.J.，et al.[70]和Frolov，I.，et al.[71]。
在本領域技術人員已知的技術中，用遺傳標志物可以證明靶細胞的成功轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導。例如，已經(jīng)表明維多利亞水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白是鑒定和跟蹤遺傳修飾造血細胞的有效標志物[72]。替代性選擇標志物包括β-Gal基因、截短型神經(jīng)生長因子受體、藥物選擇標志物(包括但不限于NEO、MTX、潮霉素)。
MRPC可用于組織修復本發(fā)明的干細胞也可用于組織修復。發(fā)明人已經(jīng)證明本發(fā)明的MRPC分化形成所有三種生殖細胞層。例如，通過前述方法，MRPC誘導分化成肝細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元，或者可以植入腎以增強從疾病中恢復，所述疾病包括腎小管上皮細胞疾病，如運輸障礙或急性腎小管壞死；腎小球疾病，如Alports綜合征；腎小管-間隙疾??；和腎脈管系統(tǒng)障礙如HUS/TTP。
基質(zhì)也用于將本發(fā)明細胞遞送到特定解剖學位點，其中在基質(zhì)中摻入特定生長因子，或者由摻入基質(zhì)中的質(zhì)粒編碼特定生長因子，而所述基質(zhì)被細胞攝入，這些生長因子可用于指導起始細胞群體的生長。DNA可被摻入基質(zhì)的孔中，例如在用于形成某些聚合物基質(zhì)的成泡過程期間摻入。隨著用于成泡過程的聚合物擴張，它將DNA限制于這些孔中，實現(xiàn)受控和持續(xù)地釋放質(zhì)粒DNA。這種基質(zhì)制備方法由Shea，et al.描述[73]。
編碼細胞因子、生長因子或激素的質(zhì)粒DNA可以誘捕于聚合物基因活化的基質(zhì)載體中，如Bonadio，J.，et al.[74]所述。然后將可生物降解的聚合物植入腎附近，此處植入MRPC并吸收DNA，使MRPC生成高局部濃度的所述細胞因子、生長因子或激素，加速受破壞組織的修復。
本發(fā)明提供的細胞或通過本發(fā)明方法分離的MRPC可用于生成移植組織或器官。Oberpenning，et al.[75]報道通過培養(yǎng)犬膀胱外層的肌肉細胞和犬膀胱內(nèi)層的襯層細胞，從這些培養(yǎng)物中制備組織片，并包被小聚合物球使肌肉細胞在外側(cè)、襯層細胞在內(nèi)側(cè)，從而形成了工作膀胱。然后將該球插入狗的泌尿系統(tǒng)，則開始發(fā)揮膀胱的功能。Nicklason，et al.[76]報道了從培養(yǎng)的平滑肌和內(nèi)皮細胞生成長血管移植材料。從培養(yǎng)細胞形成組織層的其它方法對本領域技術人員已知(例如見Vacanti，et al.，U.S.Patent No.5,855,610[77])。這些方法與本發(fā)明細胞組合使用時尤其有效。
對于此處所述的目的，遺傳改變或未改變的、本發(fā)明的自體或異體MRPC可以分化或未分化形式給予患者，可以直接注射到腎位置，全身性，附在可接受基質(zhì)的表面上或表面周圍，或藥學上可接受的載體組合。
MRPC提供研究分化途徑的模式系統(tǒng)本發(fā)明的細胞還可以用于進一步研究發(fā)育過程。例如，Ruley，et al.(WO 98/40468)[78]已經(jīng)描述抑制特定基因表達并獲得受抑制基因DNA序列的載體和方法。可用載體如Ruley所述的載體處理本發(fā)明細胞，所述載體抑制可以通過DNA序列分析鑒定的基因表達。然后可誘導細胞分化并可以表征所述改變基因型/表型的作用。
例如，Hahn，et al.[79]證明，當一組已知與癌癥相關的基因被導入細胞時，正常人上皮成纖維細胞可被誘導經(jīng)歷致瘤性轉(zhuǎn)變。
用含誘導型表達元件的載體控制基因表達提供研究某些基因產(chǎn)物對細胞分化影響的方法。誘導型表達系統(tǒng)對本領域技術人員已知。一種這樣的系統(tǒng)是No，D.，et al.[80]所述的蛻皮激素誘導型系統(tǒng)。
MRPC可用于研究特定遺傳改變、毒性物質(zhì)、化療劑或其它藥劑對發(fā)育途徑的影響。本領域技術人員已知的組織培養(yǎng)技術允許大量培養(yǎng)幾百幾千種來自不同個體的細胞樣品，提供進行快速篩選懷疑具有如致畸性或致突變性的化合物的機會。
為研究發(fā)育途徑，可用特定生長因子、細胞因子或其它藥劑處理MRPC，包括懷疑具有致畸性的化學物處理。也可用前述方法和載體遺傳修飾MRPC。而且，可用反義技術或用導入細胞中改變天然基因序列表達的蛋白質(zhì)處理來改變MRPC。例如，信號肽序列可用于將期望肽或多肽導入細胞。Rojas，et al.[81]已經(jīng)描述了將多肽和蛋白質(zhì)導入細胞中的特別有效的技術。這種方法產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)物，所述產(chǎn)物能導入培養(yǎng)基并跨細胞膜轉(zhuǎn)位到細胞內(nèi)部。這樣可使用任意數(shù)量的蛋白質(zhì)，以確定靶蛋白對細胞分化的影響。作為替代方案，Phelan et al.[82]所述的技術可用于連接皰疹病毒蛋白VP22到功能蛋白上，以進入細胞。
通過導入外來DNA或經(jīng)沉默或外切基因組DNA，也可將本發(fā)明細胞遺傳工程化，從而產(chǎn)生具有缺陷表型的分化細胞，以測試潛在化療劑或基因治療載體的有效性。
MRPC提供各種分化和未分化培養(yǎng)細胞類型供高通量篩選本發(fā)明的MRPC例如可培養(yǎng)于96孔或其它多孔培養(yǎng)板，以提供例如靶細胞因子、趨化因子、生長因子或藥物基因組學或藥物遺傳學方面藥物組合物的高通量篩選系統(tǒng)。本發(fā)明的MRPC提供獨特的系統(tǒng)，其中來自同一個體的細胞可以被分化形成特定細胞譜系。與多數(shù)原代培養(yǎng)物不同，這些細胞可以在培養(yǎng)中維持，并可以在以后研究。來自同一個體和來自不同個體的細胞的多種培養(yǎng)物可用感興趣的因子處理，以確定所述細胞的因子對具有相同遺傳背景的某些類型的分化細胞或?qū)z傳不相同個體的相似類型的細胞的作用是否存在差異。因此，例如，可以及時和成本有效的方式篩選細胞因子、趨化因子、藥物組合物和生長因子，以更清楚闡明它們的作用。從大個體群中分離并表征了是否存在遺傳多態(tài)性尤其是單核苷酸多態(tài)性的細胞可以保存于細胞培養(yǎng)物庫中，用于各種篩選技術。例如，來自統(tǒng)計顯著的個體群的多能成體干細胞提供高通量篩選鑒定多態(tài)性的理想系統(tǒng)，統(tǒng)計學顯著性可根據(jù)本領域技術人員已知的方法確定，所述多態(tài)性與對各種物質(zhì)的陽性或陰性反應增加相關，所述物質(zhì)例如是藥物組合物、疫苗制劑、細胞毒性化學物、突變劑、細胞因子、趨化因子、生長因子、激素、抑制性化合物、化療劑以及多種其它化合物或因子。從這些研究中獲得的信息對治療傳染性疾病、癌癥和多種代謝疾病有廣泛應用潛力。
在使用MRPC表征對生物或藥理因子或這些因子的組合庫的細胞應答的方法中，從統(tǒng)計學顯著的個體群中分離MRPC，培養(yǎng)擴張，并使之與一種或多種生物或藥理因子接觸。當分化細胞是某些生物或藥理因子的期望靶標時，可以在培養(yǎng)擴張之前或之后誘導分化MRPC。通過比較來自統(tǒng)計學顯著的個體群的MRPC培養(yǎng)物的一種或多種細胞應答，可以確定所述生物或藥理因子的作用。作為替代方案，遺傳相同的MRPC或從其分化的細胞可用于篩選分離的(separate)化合物，如組合庫中的化合物。與基于細胞的高通量篩選組合使用的基因表達系統(tǒng)已經(jīng)被描述[83]。用于鑒定內(nèi)皮細胞活化抑制劑的高通量篩選技術已經(jīng)由Rice等描述，其中使用原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)[84]。本發(fā)明的細胞提供多種細胞類型，既有終末分化的也有未分化的，用于鑒定大量靶生物或藥理因子的高通量篩選技術。最重要的是，本發(fā)明的細胞提供來自多種遺傳多樣性個體的培養(yǎng)細胞來源，這些個體可對生物和藥理因子產(chǎn)生不同應答。
MRPC可以凍存原種形式提供，單獨提供或與預包裝的培養(yǎng)基和培養(yǎng)添加劑組合，并可以另外組合提供分開包裝的有效濃度的適當因子，以誘導分化成特定細胞類型。作為替代方案，MRPC可以凍存原種形式提供，所述凍存原種由本領域技術人員已知的方法制備，并含有由上述方法誘導分化的細胞。
MRPC和遺傳譜分析遺傳性變異對疾病易感性可有間接和直接影響。對于直接影響，甚至導致單核苷酸多態(tài)性(SNP)的單個核苷酸變化都可以改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，直接影響疾病或疾病易感性。經(jīng)常可以在體外檢測到所得蛋白質(zhì)的功能性改變。例如，某些APO-脂蛋白E基因型與某些個體中阿爾茨海默病的發(fā)作和進程有關。
DNA序列異?？赏ㄟ^動態(tài)等位基因特異性雜交、DNA芯片技術和本領域技術人員已知的其它技術檢測。據(jù)估計，蛋白質(zhì)編碼區(qū)僅占人基因組的約3％，并估計可能有200,000-400,000種共有SNP位于編碼區(qū)。
使用SNP相關遺傳分析的現(xiàn)有研究設計涉及從可進行表型表征的許多個體獲得供遺傳分析的樣本。不幸的是，如此獲得的遺傳相關性僅限于鑒定與易鑒定表型相關的特定多態(tài)性，并且不提供疾病深層原因的進一步信息。
本發(fā)明的MRPC提供橋接疾病相關遺傳元件的鑒定和患病個體中最終表型表達之間間隙的必要元素。簡單的說，從統(tǒng)計學顯著的可獲得表型數(shù)據(jù)的個體群中分離MRPC[85]。然后培養(yǎng)擴張這些MRPC樣品，并將所述細胞的亞培養(yǎng)物保存為凍存原種，該凍存原種可用于提供供隨后發(fā)育研究的培養(yǎng)物。從細胞的擴張群體，可進行多種遺傳分析，以鑒定遺傳多態(tài)性。例如，可使用本領域技術人員已知的當前技術如DNA芯片技術[86-90]，在較短時間內(nèi)在大樣本群體中鑒定單核苷酸多態(tài)性。SNP分析技術也已經(jīng)由本領域技術人員描述[91-97]。
當某些多態(tài)性與特定疾病表型相關時，可用非攜帶者的細胞作為對照，來自鑒定為多態(tài)性攜帶者的個體的細胞可用于研究發(fā)育異常。本發(fā)明的MRPC具體提供研究與特定遺傳病表現(xiàn)相關的發(fā)育異常的實驗系統(tǒng)，因為使用此處所述的某些方法和本領域技術人員已知的某些其它方法，這些細胞可以被誘導分化形成特定細胞類型。例如，當特定SNP與腎病相關時，可使用未分化的MRPC和分化形成腎前體或其它腎源細胞的MRPC來表征所述多態(tài)性的細胞效應?？稍诜只^程中跟蹤表現(xiàn)某些多態(tài)性的細胞，以鑒定影響藥物靈敏度、對趨化因子和細胞因子的應答、對生長因子、激素和抑制劑的應答以及對受體表達和/或功能變化的應答的遺傳元件。這些信息對于設計針對遺傳來源的或有遺傳傾向的疾病的治療方法是無價的。
在本發(fā)明使用MRPC鑒定與生理異常相關的遺傳多態(tài)性的方法中，從統(tǒng)計學顯著的可獲得表型數(shù)據(jù)的個體群中分離MRPC(本領域技術人員定義統(tǒng)計學顯著群體為足以包括具有至少一種遺傳多態(tài)性的成員的群體大小)，并培養(yǎng)擴張以建立MRPC培養(yǎng)物。然后使用來自所述培養(yǎng)細胞的DNA鑒定所述群體的培養(yǎng)MRPC之間的遺傳多態(tài)性，并誘導分化所述細胞。通過比較具有正常基因型的MRPC表現(xiàn)的分化模式和具有已鑒定遺傳多態(tài)性或具有對假定藥物應答的MRPC表現(xiàn)的分化模式，鑒定并表征與具體遺傳多態(tài)性相關的異常代謝過程。
MRPC和疫苗遞送當遺傳改變產(chǎn)生抗原性蛋白時，本發(fā)明的MRPC也可用作抗原提呈細胞。例如，使用多種已改變的自體或異體祖細胞，并提供本發(fā)明祖細胞和質(zhì)粒的組合，所述質(zhì)粒嵌入生物降解基質(zhì)中用于延長釋放以轉(zhuǎn)染伴隨細胞，可激發(fā)對一種或多種抗原的免疫應答，通過依次釋放抗原提呈細胞潛在性提高免疫應答的最終效果。本領域已知在長時期內(nèi)多次給予一些抗原經(jīng)最終抗原激發(fā)后產(chǎn)生更高的免疫應答。
異源的分化或未分化MRPC疫苗載體提供通過外來細胞表面標志物刺激免疫系統(tǒng)的附加優(yōu)點。疫苗設計實驗已經(jīng)顯示用多種抗原刺激免疫系統(tǒng)能引發(fā)對疫苗制劑中某些單個抗原的免疫應答升高。
已經(jīng)鑒定例如甲型肝炎、乙型肝炎、水痘(禽痘)、脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳、破傷風、萊姆病、麻疹、腮腺炎、風疹、乙型流感(Hib)、BCG、日本腦炎、黃熱病和輪狀病毒的免疫有效抗原。
通過擴張克隆群體的多能腎祖細胞培養(yǎng)，遺傳改變擴張細胞以表達一種或多種預選的抗原性分子以誘發(fā)抗傳染性因子的保護性免疫應答，向所述對象導入誘導免疫應答有效量的遺傳改變細胞，可以實施用本發(fā)明的MRPC誘導對象如人對傳染性因子免疫應答的方法。給予遺傳改變細胞的方法在本領域已知。有效誘導免疫應答的遺傳改變細胞的量是產(chǎn)生期望抗原的充分表達從而產(chǎn)生可測量抗體應答的細胞的量，通過本領域技術人員已知的方法進行測量。優(yōu)選的，所述抗體應答是保護性抗體應答，通過用適當傳染性因子攻擊時對疾病的抵抗力來檢測所述抗體應答。
MRPC和癌癥治療本發(fā)明的MRPC提供癌癥治療的新型載體。例如，當局部或全身遞送時，MRPC可被誘導分化形成歸巢到腎組織的細胞。通過遺傳工程化這些細胞并經(jīng)外部遞送元件刺激而經(jīng)歷凋亡，可以破壞新形成的血管并消除流向腫瘤的血流。外部遞送元件的實例是抗生素四環(huán)素，其中細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導促進凋亡的基因如Caspase或BAD，所述基因位于四環(huán)素應答元件的控制下。四環(huán)素應答元件已經(jīng)在文獻中描述[98]，提供了內(nèi)皮細胞中體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達調(diào)控[99]，并且有商業(yè)供應(CLONETECHLaboratories，Palo Alto，CA)。
作為替代方案，未分化MRPC或分化形成特定細胞譜系的MRPC可以被遺傳改變以生成產(chǎn)物，用于輸出到細胞外環(huán)境，所述產(chǎn)物對腫瘤細胞有毒性或破壞血管發(fā)生(如色素上皮來源的因子(PEDF)[100])。例如，Koivunen，et al.[101]描述了含選擇性抑制MMP-2和MMP-9(與腫瘤發(fā)生相關的基質(zhì)金屬蛋白酶)氨基酸序列的環(huán)肽，所述環(huán)肽在動物模型中阻止腫瘤生長和侵入，并在體內(nèi)特異性靶向血管生成性血管。當需要將細胞遞送到腫瘤部位、產(chǎn)生腫瘤抑制性產(chǎn)物、然后被破壞時，細胞還可以被遺傳改變以引入位于誘導型啟動子控制下的促凋亡蛋白。
MRPC也提供遞送癌癥疫苗的載體，因為它們能從患者中分離、活體外培養(yǎng)、活體外遺傳改變以表達適當抗原，尤其是和與增加對抗原的免疫應答相關的受體組合時更是如此，并重新導入所述對象以誘發(fā)對腫瘤細胞上表達的蛋白質(zhì)的免疫應答。含MRPC或MRPC分離培養(yǎng)成分的試劑盒本發(fā)明的MRPC可以在試劑盒中與適當包裝材料一起提供。例如，MRPC可以凍存原種形式提供，附隨單獨包裝的前述適當因子和培養(yǎng)基，用于未分化狀態(tài)培養(yǎng)。另外，也可提供單獨包裝的前述的分化誘導因子。
本發(fā)明也可以提供含有效量的用于分離培養(yǎng)患者細胞的適當因子的試劑盒。從患者獲得腎活組織以后，臨床技術人員僅需要用此處所述方法用試劑盒中提供的刺激因子選擇MRPC，然后用作為試劑盒組分提供的培養(yǎng)基用本發(fā)明所述方法培養(yǎng)細胞，基本培養(yǎng)基的組成已在前述。
本發(fā)明的一個方面是制備在臨床條件下從人對象分離MRPC的試劑盒。使用包裝在一起的試劑盒組分，可以從腎活組織分離MRPC。使用包括分化因子、培養(yǎng)基和用于分離和/或誘導培養(yǎng)物中MRPC分化的說明書的其它試劑盒組分，臨床技術人員可以從患者自身腎組織樣品中產(chǎn)生成群的未分化或分化細胞。試劑盒中其它的材料可提供遞送多核苷酸的載體，所述多核苷酸編碼細胞表達的期望蛋白。這些載體例如可以使用隨試劑盒提供的磷酸鈣轉(zhuǎn)染材料和使用說明而導入培養(yǎng)細胞。可以提供將遺傳改變的MRPC注射回患者的其它材料。
參考以下具體實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例1.分離腎祖細胞(MRPC)小鼠腎細胞來源包括2-4月齡β-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)基因的C57B1/6ROSA26小鼠。此外，從含由控制eGFP蛋白表達的Pax-2啟動子組成的轉(zhuǎn)基因的FVB小鼠的腎分離細胞(由Dr.Michael Bendel-Stenzel，U.of Minnesota惠贈)。大鼠腎來源包括2-4月齡Fisher大鼠，包括Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠，其中所含轉(zhuǎn)基因組合新霉素抗性基因與lacZ報告基因，所述lacZ報告基因位于包括近端和遠端增強子的3.6kb小鼠Oct-4上游序列控制之下(由Dr.Austin Smith，U.of Edinburgh惠贈)[36]。該策略允許通過在培養(yǎng)基中包括G418而直接選擇Oct-4表達細胞。Oct-4與多能性相關。
安樂死以后立即收獲腎，部分消化，然后將細胞懸液鋪于上述培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含血清低并且缺乏支持已知原代腎細胞系生長所需要的生長因子，但含有已知支持MAPC生長的生長因子。保持低細胞密度以避免細胞-細胞接觸。4-6周后多數(shù)細胞類型死亡，培養(yǎng)物變成單形性紡錘體形細胞(圖1A-1C)。這些細胞的群體倍增時間為24-36小時，已經(jīng)培養(yǎng)了90次群體倍增，沒有衰老跡象。經(jīng)FACS分析，這些細胞具有正常核型和DNA含量，這使它們與癌性細胞不同。MRPC表達Oct-4和波形蛋白，但不表達細胞角蛋白或I或II類MHC分子，這與“干細胞”表型一致。
實施例2.表面標志物的FACS分析MRPC上存在的細胞表面標志物經(jīng)FACS分析。細胞計量分析在FACS流式細胞儀(Beckton Dickinson，San Diego，USA)上進行。用7AAD排除死細胞，基于3層級門進行雙重排除(前/側(cè)分散(FSC/SSC)面積，F(xiàn)SC高度/寬度和SSC高度/寬度)。未染色細胞和對應的同種型抗體用作陰性對照。每個反應計數(shù)5000次事件。所用抗體包括小鼠抗大鼠CD90-PerCP、CD11b-FITC、CD45-PE、CD106-PE、CD44H-FITC、RT1B-生物素、RT1A-生物素、CD31-生物素(全部來自BecktonDickinson，San Diego，USA)和純化的抗小鼠SSEA-1(MAB4301，來自Chemicon，Temecula，USA)。小鼠ES細胞用作SSEA-1的陽性對照，新鮮大鼠骨髓細胞用于其它標志物。細胞表面標志物分析的結果列于下表1。
表1
如上表1所示，MRPC對CD90和CD44呈陽性，從而與骨髓來源的MAPC區(qū)分開來。缺少MHC I和II類分子進一步支持這些細胞是原始未分化細胞。
實施例3.大鼠MRPC的DNA分析和細胞遺傳學分析大鼠MRPC培養(yǎng)超過200次群體倍增，同時維持其起始表型和外觀。用FACS進行的DNA分析確認200次群體倍增時所述MRPC是100％二倍體，沒有多倍體(圖7)和細胞遺傳學異常的跡象。
另外，在90和160次群體倍增時檢查端粒長度和端粒酶活性(圖8)。為檢測端粒長度，用標準方法制備細胞DNA。將2μgDNA用HinfIII和RsaI消化過夜。所得片段跑0.6％瓊脂糖凝膠并真空印跡到(+)尼龍膜上。然后用地高辛(DIG)標記的六聯(lián)體(TTAGGG)過夜探測印跡膜。第二天，洗滌之后，將印跡膜與抗DIG-堿性磷酸酶共同孵育30分鐘。然后借助化學發(fā)光檢測端粒片段。沒有觀察到端?？s短。
為研究端粒酶活性，等量細胞在1×CHAPS緩沖液中于冰上裂解10分鐘。13,0000×g離心10分鐘沉淀碎片。用Bradford方法定量蛋白質(zhì)。將1-2μg蛋白質(zhì)用于端粒重復擴增方案(TRAP)。根據(jù)制造商說明實施由Roche改編的TRAP方案。該方案使用基于ELISA的檢測系統(tǒng)來確定端粒酶活性。酶數(shù)據(jù)顯示端粒酶活性得以維持。所述數(shù)據(jù)也證明從較早到較晚的時間區(qū)間獲得30.3倍和15.4倍端粒酶活性。這可能是由于從異源群體中選擇干細胞。
因此，盡管是200次群體倍增，細胞沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，也沒有細胞衰老的跡象。另外，所述細胞保留了分化成腎細胞以及所有三種生殖細胞譜系的細胞的能力。
實施例4.體外分化腎祖細胞上述分離的細胞可以被誘導分化。MRPC與“腎發(fā)生混合物”(nephrogeniccocktail)一起培養(yǎng)，所述腎發(fā)生混合物包含50ng/ml FGF2、4ng/ml TGF-β和20ng/mlLIF。14天后細胞表型從單個紡錘體形細胞變成細胞聚集體(圖2A和2B)。缺少腎發(fā)生混合物時沒有觀察到細胞形態(tài)變化。除了形態(tài)變化以外，細胞還表達上皮細胞標志物，包括細胞角蛋白和關閉帶蛋白-1(ZO-1)(圖3A和3B)。Pax-2是只在腎發(fā)育的特定階段表達的發(fā)育調(diào)節(jié)基因，在成體腎中幾乎沒有表達[37]。當來源于Pax-2-eGFP小鼠的MRPC生長于培養(yǎng)物中時，沒有觀察到Pax-2表達。當這些細胞與腎發(fā)生混合物一道孵育時，細胞聚集并表達與Pax-2表達一致的eGFP(圖4A-4D)。需要重要說明的是，來源于成體骨髓的MAPC對腎發(fā)生性生長因子應答時不改變形態(tài)，也不表達上皮細胞標志物，因此MAPC和MRPC不可能是相同的細胞。
大鼠MRPC表達Oct-4，它是一種多能性標志物。為確定大鼠MRPC是否能分化成其它細胞譜系，MRPC在促進分化成所有三種生殖層細胞的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，所述三種生殖層即中胚層(內(nèi)皮細胞)、外胚層(神經(jīng)元)和內(nèi)胚層(肝)(圖5)。通過使MRPC生長于含10ng/ml血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的纖連蛋白(FN)包被孔中，可以誘導內(nèi)皮(中胚層)分化。通過使MRPC生長于含100ng/ml bFGF但缺少PDGF-BB和EGF的FN包被孔中，可以誘導神經(jīng)元(外胚層)分化。通過使MRPC生長于含10ng/ml FGF-4和20ng/ml肝細胞生長因子的MatrigelTM上，可以誘導肝細胞(內(nèi)胚層)分化。因此，本發(fā)明人已經(jīng)分離并表征了來自成體腎的多能祖細胞。這些細胞是急性腎衰后再生細胞的來源。
實施例5.大鼠MRPC的轉(zhuǎn)染和體外分化大鼠MRPC用MSCV-eGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染，通過FACS選擇表達高水平GFP表達的細胞。這些細胞被稱為eMRCP。如圖9所示，eGFP容易借助直接熒光和抗GFP抗體檢測。用處處所述選擇培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染eGFP的細胞也能分化成其它細胞類型。例如，圖9表示分化成內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元細胞的eMRPC的形態(tài)。因此，MRPC可以被有效轉(zhuǎn)染并在轉(zhuǎn)染后仍維持分化成不同細胞譜系的能力。
實施例6.腎祖細胞的體內(nèi)定位收獲來自Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的腎，并通過免疫組化和原位β-半乳糖苷酶活性檢測確定成體腎中是否存在表達Oct-4的細胞。因為Oct-4是多能干細胞的標志物，在腎中發(fā)現(xiàn)表達Oct-4的細胞將提供支持MRPC存在于腎中的細胞分離研究的證據(jù)。在該轉(zhuǎn)基因大鼠中，Oct-4基因的啟動子和增強子元件驅(qū)動lacZ報告基因的表達。用Invitrogen提供的β-gal染色試劑盒在pH7.4染色組織切片的β-半乳糖苷酶活性。間隙中的細胞染成藍色，這指示β-半乳糖苷酶活性(圖6A)。用HRP標記的、以DAB顯色的抗β-半乳糖苷酶抗體進行免疫組化，觀察到相似定位(圖6B)。來自非轉(zhuǎn)基因大鼠的對照腎是陰性。
因此，分離表現(xiàn)為腎干細胞的獨特腎細胞(MRPC)。MRPC具有與骨髓來源MAPC相似的形態(tài)特征和標志物，但如上述，對腎發(fā)生性生長因子有不同反應。這些細胞可被誘導成上皮細胞表型和所有三種生殖細胞層的細胞。
實施例7.未誘導和誘導MRPC的基因表達模式進行另外的研究以表征小鼠和大鼠MRPC，集中于未分化和分化條件下細胞的基因表達模式，以及MRPC和骨髓來源MAPC的基因表達模式。這些研究的主要目的是確定未誘導和誘導MRPC中表達什么基因，以進一步表征所述細胞并將它們與其它干細胞尤其是MAPC進行比較。
對未分化條件下和用“腎發(fā)生性混合物”誘導7天后的分離大鼠和小鼠MRPC進行微陣列基因分析，所述腎發(fā)生性混合物中含F(xiàn)GF2(50ng/ml)、TGF-β(0.67ng/ml)和LIF(20ng/ml)。這種因子組合已證明可引起后腎間充質(zhì)中的腎小管發(fā)生[38-43]。如上所述，這種因子組合誘導MRPC的表型變化，包括凝縮、細胞角蛋白和ZO-1表達以及Pax-2的表達。從三次獨立的實驗中從未誘導和誘導小鼠與大鼠MRPC分離RNA，并在Affymetrix Mouse U74Av2 GeneChip上進行表達分析，或?qū)τ诖笫蠹毎贏ffymetrix GeneChip Rat Expression Set 230上進行表達分析。通過用Agilent Bioanalyzer 2100 LabOnChip系統(tǒng)測定28S∶18S比值＞2.0評價RNA樣品質(zhì)量。用Affymetrix方法制備用于微陣列分析的探針。對陣列進行整體信號強度、背景信號、內(nèi)標性能和缺少表面缺陷方面的評分。用Affymetrix MieroArraySuite 5.0用靶強度為1500的All Probe Sets評分表分析所得芯片圖像。在Silicon Genetics的GeneSpring v4.2.1中分析數(shù)據(jù)。
實施例8.MRPC分化為成體腎不同細胞譜系所需的因子還進行了確定誘導MRPC的細胞譜系變化所需要的必要因子是什么的研究。本發(fā)明人已經(jīng)證明FGF-2、TGF-β和LIF的組合導致上皮細胞表型。按不同順序和濃度測試了不同候選分子誘導MRPC表型變化的能力，主要關注因子誘導腎小管發(fā)生或特定腎小管細胞形成的能力。
大鼠和小鼠MRPC與不同候選分子如FGF-2、TGF-β和LIF、HGF、Wnt-4、TIMP-2共同孵育；或與大鼠輸尿管芽細胞系(RUB-1)處理的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，已經(jīng)證明這種培養(yǎng)基誘導腎的后腎間充質(zhì)中形成腎單位[40]；或與RUB-1細胞、后腎間充質(zhì)細胞或表達不同wnt蛋白的轉(zhuǎn)基因細胞共培養(yǎng)，結果表現(xiàn)為形態(tài)變化和特異性腎小管細胞標志物的表達。在不同時間加入不同的候選分子以優(yōu)化分化結果。例如，可以在加入其它生長因子后0或24h、48h或72h加入TGF-β?！胺只旌衔铩钡钠渌煞挚梢宰兓?，如HGF、EGF和TGF-α的誘導腎小管發(fā)生的組合。另外，細胞外基質(zhì)可以變化，包括將細胞培養(yǎng)在纖連蛋白、IV型膠原、matrigel或I型膠原上，以誘導腎小管發(fā)生或其它期望的分化。另外，可以使用條件培養(yǎng)基，如泌尿芽細胞系RUB1條件處理的培養(yǎng)基，其已經(jīng)證明可以誘導后腎間充質(zhì)中形成腎小管[40]。
實施例9.MRPC存在于成體腎中并能在急性腎衰后分化成不同細胞譜系如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明他們能從成體小鼠和大鼠腎分離MRPC。在Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠中，在間隙中檢測到表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶免疫活性和酶活性的細胞，表明這些細胞表達Oct-4并且它們是成體腎中存在的多能祖細胞。這些細胞負責ATN后受破壞腎小管的再生。
以下研究在未損傷小鼠和大鼠腎中進行。對于大鼠研究，通過幾種方法檢查來源于Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的腎的冷凍切片中的Oct-4表達。因為Oct-4啟動子驅(qū)動β-半乳糖苷酶報告基因表達，用FITC或德克薩斯紅標記的兔抗β-半乳糖苷酶多克隆抗體(Rockland)檢查相同或連續(xù)切片中的β-半乳糖苷酶免疫活性；用Invitrogen的β-gal染色試劑盒在pH7.4檢查β-半乳糖苷酶活性。此外，根據(jù)制造商方法(GeneDetect，Aukland，New Zealand)，用GreenStarTM FITC標記的寡核苷酸探針進行β-半乳糖苷酶mRNA的原位雜交。用抗Oct-4抗體(Active Motif)進行免疫組化，作為Oct-4表達的另外證據(jù)。最后，用地高辛標記的反義核糖核酸探針進行原位雜交，所述探針以小鼠cDNA序列為模板合成。具體的說，用對應GenBank登錄號X52437的951-489位核苷酸的Stu1片段使用Buehr等人所述的方案[36]。檢查來源于Oct4ΔPEGFP小鼠的小鼠腎中表達Oct-4的細胞，其中綠色熒光蛋白在截短型Oct-4啟動子控制下表達[44]。經(jīng)熒光顯微鏡(450nm)和使用抗eGFP抗體(Rockland)的免疫組化檢測GFP表達。確認性研究包括如上述對Oct-4的免疫組化和原位雜交。
然后在誘導急性腎衰后檢測Oct4ΔPEGFP小鼠中Oct-4的表達。研究兩種模型。1)缺血/再灌注，其中夾住兩根腎動脈維持30分鐘，然后在6、18、24和48小時后收獲腎(每個時間點n＝3)。對照是偽手術小鼠。2)第二種模型是腹膜內(nèi)注射葉酸(125mg/kg)誘導的葉酸腎病，在6、18、24和48小時后收獲腎(每個時間點n＝3)。對照是注射NaHCO3賦形劑的小鼠。用上述技術確認Oct-4表達是否上調(diào)。此外，通過檢測eGFP表達跟蹤來源于表達Oct-4細胞的細胞譜系，因為eGFP在來源于表達Oct-4細胞的后代細胞中表達并在細胞中持續(xù)幾周。為確定來源于Oct-4細胞的腎單位節(jié)段，使用下表2所述的一系列腎小管細胞標志物。在所有研究中通過測量一系列血清肌酸酐水平確認急性腎衰。
表2
表達Oct-4的細胞在成體腎中發(fā)現(xiàn)，表明成體腎中存在多能祖細胞。在急性腎衰之后出現(xiàn)這些細胞的上調(diào)，并且來源于表達Oct-4細胞(MRPC)的細胞產(chǎn)生不同的腎小管細胞譜系，這是受損傷腎再生應答的一部分。
實施例10.囊下注射后大鼠MRPC的體內(nèi)分化在兩種不同模型中將eMRPC(轉(zhuǎn)染MSCV-eGFP的MRPC)注射入Fisher大鼠。第一個模型中，eMRPC注射到腎囊下。三周后，收獲腎并用共聚焦顯微鏡檢測。如圖10A所示，在注射部位的囊下形成GFP陽性的細胞結節(jié)，還包括囊樣結構。此外，圖10B證明一些GFP陽性細胞被摻入腎小管中。因此，腎囊下注射后MRPC摻入腎小管中，這提示這些細胞遷移到更遠位點并參與腎小管細胞的正常更替。
實施例11.注射的MRPC參與急性腎衰后的腎修復這些研究表明急性腎衰后注射MRPC導致這些細胞歸巢到腎，還表明這些細胞參與腎修復應答。本發(fā)明人實驗室和其它實驗室的研究已經(jīng)證明腎外細胞有助于ATN后的腎小管再生。研究兩個已建立的ATN模型(缺血/再灌注和葉酸腎病)以獲得關于損傷特異性應答的信息。使用鑒定注射細胞的多種方法來減少假陽性結果。
通過腹膜內(nèi)注射葉酸(125mg/kg)或通過雙側(cè)腎動脈夾持30分鐘誘導ATN。如下注射干細胞。連續(xù)測量血清肌酸酐以確認ATN。損傷后6、24和48小時對大鼠進行安樂死，收獲腎并檢測MRPC和從其來源的細胞譜系的存在。在雌性Fisher大鼠中誘導ATN以避免與注射細胞相關的組織相容性問題。選擇雌性大鼠是因為容易鑒定注射的Y染色體陽性的MRPC。
如上述分離來源于雄性Oct-4β-Geo轉(zhuǎn)基因大鼠的MRPC，并經(jīng)尾靜脈注射或直接注射到腎動脈。接受尾靜脈注射的大鼠中，在誘導ATN后6小時或誘導ATN后6、24和48小時給予106細胞。對于腎動脈注射，損傷后6小時給予106細胞。細胞數(shù)目基于初步劑量-效應曲線。
用幾種方法鑒定再生腎中的MRPC，包括Y染色體FISH、β-半乳糖苷酶基因FISH以及β-半乳糖苷酶和新霉素基因的定量PCR。泛細胞角蛋白免疫組化染色鑒定上皮細胞，同時用上述標志物檢測特異性腎小管節(jié)段。
MRPC標志物在再生腎小管中的存在表明MRPC在再生腎中重新形成群體。
實施例12.大鼠MRPC在腎缺血/再灌注后的體內(nèi)分化Fisher大鼠接受雙側(cè)腎動脈夾持誘導缺血40分鐘。40分鐘結束時，松開夾子，向腎上大動脈注射1×106eMRPC(轉(zhuǎn)染MSCV-eGFP的MRPC)，暫時夾住遠端大動脈以確保將細胞遞送到腎。缺血后10天收獲腎并用共聚焦顯微鏡檢測。通過測量血清肌酸酐確認腎損傷和恢復。如圖11A和B所示，一些GFP陽性細胞(MRPC)作為細胞管型被發(fā)現(xiàn)，而一些細胞駐留在腎小球。注射MRPC摻入腎小管的證據(jù)在腎的很多區(qū)域可見，實例表示于圖11C-F。在一些區(qū)域，腎小管的所有細胞都是GFP陽性，而在另一些區(qū)域僅一些細胞呈陽性。
這些細胞對增殖細胞核抗原(PCNA)染色陽性(圖12)。所述細胞也染上緊密連接蛋白關閉帶蛋白-1(ZO-1)，這是分化的標志物(圖13)。間隙中染成綠色的細胞呈波形蛋白陽性，所述波形蛋白是一種間充質(zhì)細胞標志物(圖14)。摻入腎小管后所述MRPC喪失波形蛋白表達，這提供上皮細胞分化的證據(jù)(圖14)。摻入后的細胞染上近端腎小管標志物PHE-A(圖15)，有些情況下也染上遠端腎小管標志物凝集素(PNA)(圖16)和THP(圖17)，這提供注射細胞進一步分化的證據(jù)。
因此，缺血/再灌注以后，發(fā)生了MRPC的廣泛摻入和分化，證明MRPC能參與腎損傷后的再生應答。這對MRPC在腎病細胞治療方面的應用提供支持。
實施例13.腎來源干細胞在藥物發(fā)現(xiàn)中的應用腎來源的干細胞用于篩選具有促進損傷腎再生能力的藥劑。認為腎來源的干細胞存在于腎中并且在損傷時或需要細胞更替時被動員。然后這些未分化的干細胞分化成腎的不同細胞譜系。這些干細胞分化成腎小管細胞的能力可用于藥物發(fā)現(xiàn)。這種快速藥物發(fā)現(xiàn)的模型示于圖18。
在此模型中，用不同基因的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)染MRPC，選擇的基因在腎單位形成過程中依序激活。每種啟動子驅(qū)動不同顏色報告基因的表達，包括GFP(綠色)、YFP(黃色)和RFP(紅色)。以適當密度將細胞鋪于96孔板上。單獨、組合或依次向細胞中加入不同藥劑，并培養(yǎng)細胞約3小時-約24小時的不同時間段。如果所述藥劑激活啟動子，則對應基因的顏色將被誘導并用熒光微板閱讀儀檢測到。該系統(tǒng)允許利用MRPC能分化成腎小管的能力高通量篩選多種藥劑。也可以使用逆向策略，其從分化的腎小管細胞開始，并檢測這些細胞脫分化成更原始細胞的能力。
因此，這種篩選工具的應用將導致鑒定能動員或促進駐留于腎中干細胞分化的藥物化合物，或鑒定促進成熟細胞脫分化的藥物化合物，然后這些脫分化細胞繼續(xù)增殖并再分化成多種腎小管細胞。
參考各種具體和優(yōu)選的實施方案和技術描述了本發(fā)明。然而，應該明白，可以進行很多變化和修改，而仍保持它們位于本發(fā)明范圍內(nèi)。所有引用的出版物、專利和專利文獻都通過引用并入此處，就象通過引用獨自并入一樣。
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1.分離或純化的哺乳動物多能腎祖細胞(MRPC)，所述細胞對波形蛋白和Oct-4呈抗原陽性，對關閉帶、細胞角蛋白和主要組織相容性I與Il類分子呈抗原陰性。
2.權利要求1的分離的細胞，其中所述細胞對CD90和CD44呈抗原陽性。
3.權利要求1或2的分離的細胞，其中所述細胞對SSEA-1、NCAM、CD11b、CD45、CD31和CD106呈抗原陰性。
4.權利要求1-3中任意一項的分離或純化的細胞，其中所述細胞是非胚胎的、非生殖細胞系的細胞。
5.權利要求1-4中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞有能力被誘導分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細胞類型。
6.權利要求1-6中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞有能力被誘導分化形成至少腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細胞類型的細胞。
7.權利要求5或6的分離的細胞，其中分化在體內(nèi)或活體外誘導。
8.權利要求1-7中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞是人細胞。
9.權利要求1-7中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞是小鼠細胞。
10.權利要求1-7中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞是大鼠細胞。
11.權利要求1-10中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞來自胎兒、新生兒、兒童或成體。
12.權利要求1-11中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞來自新生兒、兒童或成體。
13.權利要求1-12中任意一項的分離的細胞，其中所述細胞表達高水平端粒酶并在體外繼續(xù)培養(yǎng)以后維持長端粒。
14.權利要求13的分離的細胞，其中所述細胞在體外繼續(xù)培養(yǎng)以后維持長約23Kb的端粒。
15.包含成群的權利要求1-14中任意一項的MRPC和培養(yǎng)基的組合物，其中所述MRPC在所述培養(yǎng)基中擴張。
16.權利要求15的組合物，其中所述培養(yǎng)基包含血小板來源的生長因了(PDGF-BB)、表皮生長因了(EGF)和白血病抑制因了(子IF)。
17.權利要求15或16的組合物，其中所述MRPC能分化形成中胚層、外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細胞類型。
18.從權利要求1-14中任意一項的分離MRPC獲得的分化后代細胞，其中所述后代細胞是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細胞。
19.權利要求18的分化的后代細胞，其中所述腎細胞是腎小管細胞。
20.包含權利要求1-14中任意一項的分離MRPC的分離或純化的轉(zhuǎn)基因哺乳動物多能腎祖細胞(MRPC)，其中通過插入預選的分離DNA、通過用預選的分離DNA替換所述細胞基因組的節(jié)段、或通過刪除或滅活所述細胞基因組的至少一部分而改變所述細胞的基因組。
21.權利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中所述基因組通過病毒轉(zhuǎn)導而被改變。
22.權利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中所述基因組通過病毒載體整合插入DNA而被改變。
23.權利要求21或22的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中所述基因組通過使用DNA病毒、RNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而被改變。
24.權利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中使用序列與待滅活細胞基因組的所述部分的序列互補的反義核酸分了滅活細胞基因組的所述部分。
25.權利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中使用針對待滅活細胞基因組的所述部分的序列的核酶序列滅活細胞基因組的所述部分。
26.權利要求20的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中使用針對待滅活細胞基因組的所述部分的序列的siRNA序列滅活細胞基因組的所述部分。
27.權利要求20-26中任意一項的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中所述改變的基因組含有編碼選擇或篩選標志物的基因序列，所述標志物的表達使得具有改變基因組的祖細胞或其后代能與具有未改變基因組的祖細胞區(qū)分開。
28.權利要求27的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中所述標志物是綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)、二氫葉酸還原酶(DHFRm)或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)。
29.權利要求20-28中任意一項的分離的轉(zhuǎn)基因細胞，其中所述細胞表達能被誘導型啟動了或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、酶或其它細胞產(chǎn)物表達的其它控制機制調(diào)節(jié)的基因。
30.分離多能腎祖細胞(MRPC)的方法，包括(a)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)腎細胞約四周，所述培養(yǎng)基基本由DMEM-LG、MCDB-201、胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白—硒(ITS)、地塞米松、抗壞血酸2-磷酸、青霉素、鏈霉素和胎牛血清(FCS)以及血小板來源的生長因了(PDGF-BB)、表皮生長因了(EGF)與白血病抑制因了(LIF)組成。
31.權利要求30的方法，其中所述細胞培養(yǎng)約4-6周。
32.權利要求30或31的方法，其中所述細胞培養(yǎng)在纖連蛋白上。
33.權利要求30-32中任意一項的方法，其中所述細胞維持于約2-5×102細胞/cm2的濃度。
34.由權利要求30-33中任意一項的方法分離的腎細胞。
35.根據(jù)權利要求30-33中任意一項的方法分離的哺乳動物多能腎祖細胞的培養(yǎng)的克隆群體。
36.活體外分化MRPC的方法，包括在預選分化因了存在下培養(yǎng)通過權利要求30-33中任意一項的方法獲得的細胞。
37.權利要求36的方法，其中所述分化因了選自FGF2、TGF-β、LIF、VEGF、bFGF、FGF-4、肝細胞生長因了或其組合。
38.由權利要求36或37的方法獲得的分化細胞。
39.權利要求38的分化細胞，其中所述細胞是外胚層、中胚層或內(nèi)胚層細胞。
40.權利要求38的分化細胞，其中所述細胞是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細胞類型的。
41.權利要求40的分化細胞，其中所述腎細胞是腎小管細胞。
42.體內(nèi)分化MRPC的方法，包括根據(jù)權利要求30-33中任意一項的方法分離MRPC，體外擴張所述細胞并將所擴張細胞給予對象，其中所述細胞被移植并體內(nèi)分化成組織特異性細胞，從而使由于損傷或疾病而有缺陷的細胞或器官的功能第一次被提高、重構或提供。
43.權利要求42的方法，其中所述組織特異性細胞是腎、內(nèi)皮、神經(jīng)元或肝細胞類型的。
44.權利要求43的方法，其中所述組織特異性細胞是腎細胞類型的。
45.由權利要求42-44中任意一項的方法獲得的分化細胞。
46.治療方法，包括向需要治療的對象給予治療有效量的權利要求1-14中任意一項的細胞或其后代。
47.權利要求46的方法，其中所述后代能進一步分化。
48.權利要求46的方法，其中所述后代是終末分化的。
49.權利要求46的方法，其中所述MRPC或其后代歸巢到所述對象的一種或多種器官并被移植到其中或其上，從而使由于損傷或疾病而缺陷的所述器官的功能第一次被提高、重構或提供。
50.使用權利要求1-14中任意一項的分離細胞的方法，包括宮內(nèi)移植成群的所述細胞以形成細胞或組織的嵌合體，從而在移植后的出生前或出生后人或動物中產(chǎn)生人細胞，其中所述細胞在所述人或動物中產(chǎn)生治療產(chǎn)物以治療遺傳缺陷。
51.使用權利要求1-14中任意一項的分離細胞對需要治療處理的對象進行基因治療的方法，包括(a)通過將編碼期望基因產(chǎn)物的分離的預選DNA導入所述細胞中從而遺傳改變所述細胞，(b)培養(yǎng)擴張所述細胞；和(c)將所述細胞給予所述對象以產(chǎn)生期望基因產(chǎn)物。
52.修復需要這種修復的對象中的損壞組織的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)擴張權利要求1-14中任意一項的分離MRPC；和(b)將有效量的所述擴張細胞給予所述具有損壞組織的對象。
53.權利要求51或52的方法，其中在給予外源分了后內(nèi)源性MRPC被刺激增殖并分化成腎的不同細胞譜系。
54.修復需要這種修復的對象中的損壞組織的方法，包括將外源分了給予對象使得內(nèi)源性MRPC被刺激增值并分化成腎的不同細胞譜系。
55.在對象中誘導對傳染性因了的免疫應答的方法，包括(a)提供遺傳改變的、培養(yǎng)擴張的權利要求1-14中任意一項的多能腎祖細胞的克隆群體以表達一種或多種預選抗原性分了，所述抗原性分了引起抗傳染性因了的保護性免疫應答，和(b)向所述對象給予有效誘導所述免疫應答的量的所述遺傳改變的細胞。
56.使用MRPC鑒定與生理異常相關的遺傳多態(tài)性的方法，包括(a)從統(tǒng)計學顯著的、可獲得表型數(shù)據(jù)的個體群中分離MRPC，(b)培養(yǎng)擴張來自所述統(tǒng)計學顯著的個體群的MRPC以建立MRPC培養(yǎng)物，(c)在培養(yǎng)的MRPC中鑒定至少一種遺傳多態(tài)性，(d)誘導所述培養(yǎng)的MRPC分化，和(e)通過比較具有正?；蛐偷腗RPC表現(xiàn)的分化模式與具有鑒定的遺傳多態(tài)性的MRPC表現(xiàn)的分化模式，表征與所述至少一種遺傳多態(tài)性相關的異常代謝過程。
57.治療對象中癌癥的方法，包括(a)提供表達殺腫瘤蛋白、抗血管生成蛋白或與刺激抗原免疫應答相關蛋白一起在腫瘤細胞表面表達的蛋白的、遺傳改變的權利要求1-14中任意一項的多能腎祖細胞，和(b)向?qū)ο蠼o予有效抗癌量的所述遺傳改變的多能成體干細胞。
58.使用MRPC表征對生物或藥理因了的細胞應答的方法，包括(a)培養(yǎng)擴張從統(tǒng)計學顯著的個體群分離的MRPC以建立多種MRPC培養(yǎng)物，(b)使所述MRPC培養(yǎng)物與一種或多種生物或藥理因子接觸，(c)鑒定對所述一種或多種生物或藥理因子的一種或多種細胞應答，和(d)比較來自所述統(tǒng)計學顯著群體中個體的MRPC培養(yǎng)物的所述一種或多種細胞應答。
59.生物人工腎裝置，其包含權利要求1-14中任意一項的分離MRPC或從其分化的細胞和裝置。
60.從對象血液中除去毒素的方法，包括使血液在活體外與權利要求1-14中任意一項的分離的MRPC或從其分化的細胞接觸，其中所述細胞內(nèi)襯于中空纖維基裝置。
61.權利要求42或49的方法，其中所述損傷是腎損傷。
62.權利要求42、45、51-52、55和57中任意一項的方法，其中所述細胞與藥學上可接受的基質(zhì)一起給予。
63.權利要求62的方法，其中所述基質(zhì)是可生物降解的。
64.權利要求62或63的方法，其中所述基質(zhì)植入物提供另外的遺傳物質(zhì)、細胞因子、生長因子或促進細胞生長和分化的其它因子。
65.權利要求42、45、51-52、55、57和64-66中任意一項的方法，其中所述細胞在給予之前被膠囊化。
66.權利要求65的方法，其中所述膠囊化的細胞包含于聚合物膠囊中。
67.權利要求42、45、51-52、55、57和64-68中任意一項的方法，其中所述給予是經(jīng)過局部注射、全身注射、口服給予或?qū)m內(nèi)注射給胚胎。
68.權利要求42、46、51-52、54-55、57和62中任意一項的方法，其中所述對象是哺乳動物。
69.權利要求68的方法，其中所述哺乳動物是人。
70.鑒定促進腎細胞譜系進程的藥物因子的方法，包括以下步驟(a)用在腎單位形成過程中被活化的基因的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)染權利要求1-14中任意一項的MRPC，其中所述啟動子區(qū)可操作的連接到受體基因；(b)使(a)中的轉(zhuǎn)染細胞與藥物因子接觸；和(c)檢測表達的、由所述標志物基因編碼的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的檢測鑒定藥物因子是否能促進腎細胞譜系進程。
71.權利要求70的方法，其中所述受體基因編碼綠色、紅色或黃色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT)、二氫葉酸還原酶(DHFRm)或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)。
全文摘要
本發(fā)明大體涉及分離和培養(yǎng)腎干細胞的方法、由所述方法分離的細胞及所述細胞的治療用途。
文檔編號A61K48/00GK1845987SQ200480024990
公開日2006年10月11日 申請日期2004年8月30日 優(yōu)先權日2003年8月29日
發(fā)明者馬克·E·羅森堡, 桑迪普·古普塔 申請人:明尼蘇達大學董事會