專利名稱：具有抗癌作用的反義寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗癌作用，例如抑制癌細(xì)胞生長的作用，及治療或預(yù)防癌癥等作用的反義寡核苷酸，以及包含該反義寡核苷酸的癌細(xì)胞生長抑制劑及治療或預(yù)防癌癥的制劑。
背景技術(shù)：
信號識別顆粒(SRPs)參與動物細(xì)胞中分泌性蛋白的合成。整個SRP的沉降系數(shù)是11S，由7SL RNA和6種蛋白質(zhì)組成。
分泌性蛋白的合成從其mRNA結(jié)合到自由核糖體上開始。核糖體是蛋白合成的場所，由rRNA和多種核糖體蛋白組成。在真核生物中，整個核糖體的沉降系數(shù)是80S，進一步可分為沉降系數(shù)分別是60S和40S的兩個顆粒，前者含有5S、5.8S和28S的rRNAs各一分子，而后者含有一分子18S rRNA的分子。
SRP可識別延伸到核糖體外面的分泌性蛋白前體的N-末端或N-末端附近由疏水性氨基酸序列組成的信號肽，并與之結(jié)合成蛋白/核糖體復(fù)合物。從而終止隨后的蛋白質(zhì)翻譯過程。SRP將復(fù)合物轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并與存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)側(cè)的SRP受體蛋白結(jié)合。當(dāng)SRP-結(jié)合復(fù)合物結(jié)合到膜上時，翻譯的抑制作用被取消，從而使SRP解離，而將核糖體固定在膜上。然后繼續(xù)進行翻譯，使多肽鏈穿過膜，從而產(chǎn)生成熟的分泌性蛋白。
另一方面，在真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，不僅mRNA等參與如上所述的蛋白質(zhì)翻譯過程，而且一組約100到300個堿基長度的稱作小核RNAs的RNAs也被合成出來。通常，它們與蛋白質(zhì)結(jié)合而成為核糖核蛋白。例如，已知稱作U1、U2、U3、U4、U5或U6的RNAs是小核RNAs。對于小核RNAs的功能，已發(fā)現(xiàn)U1、U2、U4、U5和U6參與mRNA前體的拼接過程，但其它功能還不清楚。
雖然對小核RNAs的功能還有很多方面了解的不清楚，但已報道U5RNA可通過轉(zhuǎn)染使培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生癌化作用(參見非專利文獻(xiàn)1)。而且也發(fā)現(xiàn)將poly(A)加到核苷酸序列為SEQ ID NO2的U5 RNA二級結(jié)構(gòu)的第一個莖的3’末端的、依賴于RNA聚合酶II進行轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物(轉(zhuǎn)化RNA)，也同樣具有癌化作用(參見非專利文獻(xiàn)2)。該癌化作用依賴于轉(zhuǎn)化RNA中的特定核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
在用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物進行蛋白合成的實驗中，轉(zhuǎn)化RNA可抑制分泌性蛋白的合成(參見非專利文獻(xiàn)3)。具有SEQ ID NO4所示核苷酸序列的寡脫氧核苷酸(ODN)在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物中也抑制分泌性蛋白的合成。另外，也發(fā)現(xiàn)ODN中特定部分的核苷酸序列(SEQ IDNO5)可與核糖體28S RNA結(jié)合。另一方面，已報道ODN的反義寡脫氧核苷酸(反義ODN；SEQ ID NO6)可與SRP中的7SL RNA結(jié)合，并可降低分泌性蛋白合成的抑制作用(導(dǎo)致分泌性蛋白合成的增加)，而且反義ODN中特定部分的核苷酸序列(SEQ ID NO7)可與7SL RNA中48到51位的核苷酸序列(SEQ ID NO8)結(jié)合(參見

圖1)。
這些報道表明U5 RNA中的核苷酸序列具有癌化作用和抑制分泌性蛋白合成的新功能，而針對U5 RNA中推測參與癌化或類似作用的核苷酸部分的反義ODN則具有抑制U5 RNA癌化及類似作用的功能，但仍不清楚哪個元件是必需的，并足以抑制U5 RNA的癌化及類似作用。
非專利文獻(xiàn)1Mol.Cell Biol.，9，4345-4356(1989)非專利文獻(xiàn)2Mol.Carcinog.20，175-188(1997)非專利文獻(xiàn)3J.Biol.Chem.274(22)，15786-15796(1999)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種具有抗癌作用，例如抑制癌細(xì)胞生長及治療或預(yù)防癌癥等疾病的反義寡核苷酸，以及含有該反義寡核苷酸的癌細(xì)胞生長抑制劑和治療或預(yù)防癌癥的制劑。
技術(shù)方案如上所述，已表明針對U5 RNA中推測參與癌化及類似作用的核苷酸序列部分的反義ODN具有抑制U5 RNA癌化及類似作用的功能，但仍不清楚哪個元件是必需的，并足以抑制U5 RNA的癌化及類似作用。
因此，本發(fā)明人進行了深入研究，并首次發(fā)現(xiàn)針對信號識別顆粒(SRP)的7SL RNA中47到51位核苷酸序列的反義寡核苷酸，對抑制U5 RNA的癌化及類似作用具有出人意料的顯著效果，從而完成了本發(fā)明。
特別地，基于闡明U5 RNA和來源于U5 RNA的轉(zhuǎn)化RNA的癌化作用相關(guān)的原始功能，本發(fā)明要尋找并揭示一種以拮抗方式作用，從而顯示致死作用，即抑制人癌細(xì)胞生長等作用的物質(zhì)。
本發(fā)明提供[1]一種反義寡核苷酸，其針對信號識別顆粒(SRP)7SL RNA中47到51位核苷酸序列，[2]上述[1]中所述的反義寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，[3]一種癌細(xì)胞生長抑制劑，其包含上述[1]或[2]中定義的反義寡核苷酸，[4]一種癌癥治療或預(yù)防制劑，其包含上述[1]或[2]中定義的反義寡核苷酸，[5]上述[4]中所述的治療或預(yù)防制劑，其中反義寡核苷酸存在于脂質(zhì)體中，[6]上述[4]或[5]中所述的治療或預(yù)防制劑，其中反義寡核苷酸連接到載體上，及[7]一種用上述[1]或[2]中所述的反義寡核苷酸生產(chǎn)上述[3]中定義的癌細(xì)胞生長抑制劑或上述[4]到[6]中任何一個定義的治療或預(yù)防制劑的方法。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的反義寡核苷酸可用于抑制癌細(xì)胞生長或殺死癌細(xì)胞，減輕或改善癌癥癥狀，治療或預(yù)防癌癥等。
附圖的簡要描述[圖1]是來源于兔細(xì)胞SRP的7SL RNA的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中的數(shù)字表明堿基位置(除3’和5’之外)。
是實施例中制備的反義寡核苷酸1到5對人癌細(xì)胞生長的影響的圖表。
是寡核苷酸3對人癌細(xì)胞生長濃度依賴性影響的圖表。
是寡核苷酸1到5對人癌細(xì)胞中細(xì)胞DNA合成的影響的圖表。
是寡核苷酸3對人癌細(xì)胞死亡的影響的圖表。
是以劑量為20μg/g(體重)進行靜脈內(nèi)注射的情況下，寡核苷酸3對鼠體重增加的影響的圖表。
發(fā)明的優(yōu)選實施方案在本發(fā)明中，“核苷酸”包括DNA和RNA?！胺戳x寡核苷酸”是指具有互補于特定核苷酸序列(以下稱為有意序列)的核苷酸序列并能與有意序列雜交的寡核苷酸。
對應(yīng)于本發(fā)明中的反義寡核苷酸的有意序列是SRP 7SL RNA中47到51位的核苷酸序列。圖1所示的是來源于兔細(xì)胞SRP的7SL RNA的結(jié)構(gòu)示意圖。作為7SL RNA的核苷酸序列，已知有來源于多種動物細(xì)胞的核苷酸序列。例如，上述來源于兔細(xì)胞的核苷酸序列在J.Biol.Chem.274(22)，15786-15796(1999)中有描述，來源于人細(xì)胞的SRP7SL RNA的核苷酸序列在Ullu，E.，和Wiener，A.M.，EMBO J.，3，3303-3310(1984)中有描述。來源于其它動物的7SL RNA的核苷酸序列在例如Larzen，N.，和Zwieb，C.，Nucleic Acids Res.，19，209-215(1991)中有描述。至少來源于哺乳動物細(xì)胞的核苷酸序列在7SL RNA中47到51位具有相同的核苷酸序列。
本發(fā)明的反義寡核苷酸具有抗癌作用，例如抑制癌細(xì)胞生長的作用，治療或預(yù)防癌癥的作用等。特別地，包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的反義寡核苷酸是有作用的。對癌細(xì)胞生長的抑制作用也包括殺死癌細(xì)胞的作用。推測本發(fā)明的反義寡核苷酸的任何作用都是基于對U5 RNA癌化及類似作用的抑制作用。此處本發(fā)明的反義寡核苷酸對癌細(xì)胞生長的抑制作用可通過下述實施例中描述的方法進行驗證。
合成本發(fā)明中的反義寡核苷酸的方法沒有特別限定，可使用已知的寡核苷酸合成儀，通過例如phosphoroamidite法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法等方法進行合成。
為了增加本發(fā)明中的反義寡核苷酸的穩(wěn)定性和其對細(xì)胞的親和性，可在不顯著降低其活性的前提下通過用另一種更穩(wěn)定的基團替換磷酸基或核糖部分中的羥基所得的衍生物。這種反義寡核苷酸衍生物的特定實施例包括用硫替代磷酸基、甲基磷酸基團等替代磷酸基，或核糖部分的羥基被烷氧基例如甲氧基、烯丙氧基等或氨基、氟原子等替代的衍生物。
在本發(fā)明的反義寡核苷酸的分子設(shè)計中，組成反義寡核苷酸的核苷酸序列是很重要的，寡核苷酸除了包括天然存在的核酸分子及上述非天然的修飾寡核苷酸外，也可以是肽核酸類的修飾化合物(PNAs)。本發(fā)明中的反義寡核苷酸優(yōu)選地是在其結(jié)構(gòu)中具有糖(優(yōu)選地是戊糖)結(jié)構(gòu)，因為這樣利于穿過細(xì)胞膜，核膜等結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中的反義寡核苷酸可以是DNA型或RNA型，但從對給藥后保持較高穩(wěn)定性的角度來說，DNA是優(yōu)選的。
本發(fā)明中的反義寡核苷酸也可以單獨使用。因此，本發(fā)明提供癌癥細(xì)胞生長抑制劑和癌癥的治療或預(yù)防制劑(下文中有時指所有藥物制品)可以由所述的反義寡核苷酸組成，但優(yōu)選地是通過已知方法將反義寡核苷酸與藥學(xué)上接受的物質(zhì)混合，從而形成混合物而得到的藥物制劑。此處，雖然癌細(xì)胞生長抑制劑與癌癥治療或預(yù)防制劑沒有在組成、生產(chǎn)過程等方面進行特別區(qū)分，但二者是不同的，因為癌細(xì)胞生長抑制劑除了用于減輕或改善癌癥癥狀或治療或預(yù)防癌癥外，還用于抑制癌細(xì)胞生長，例如在通常的實驗過程中作為普通的試劑。藥物制劑可通過下述方式進行制備。
例如，注射劑可通過將本發(fā)明中的反義寡核苷酸溶解到水、生理鹽水、葡萄糖溶液等溶劑中而進行制備，如果需要，可含有緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑等物質(zhì)。
藥膏可通過將本發(fā)明中的反義寡核苷酸溶解或分散在脂油性、乳劑性或水溶性物質(zhì)中而進行制備，如果需要，可含有穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、可塑劑、乳化劑、表面活性劑、增溶劑、保濕劑、防腐劑、殺菌劑、溶劑、吸收加速劑等物質(zhì)。
乳劑、洗劑等可通過將本發(fā)明中的反義寡核苷酸溶解或分散到水相中，然后用油相成分，例如烴或高級醇乳化而進行制備，如果需要，可含有穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、可塑劑、乳化劑、表面活性劑、增溶劑、保濕劑、防腐劑、殺菌劑、溶劑、吸收加速劑等物質(zhì)。
本發(fā)明中的細(xì)胞生長抑制劑可制備成干燥型產(chǎn)品，當(dāng)加入溶劑，例如作為通用溶劑的水后則可很容易地形成溶液。
當(dāng)需要將本發(fā)明中的反義寡核苷酸更有效地整合到活體中或期望具有持續(xù)作用時，則反義寡核苷酸優(yōu)選地與藥學(xué)上接受的已知載體一起形成藥物制劑。載體包括例如基于脂類例如脂質(zhì)體的載體、脂肪乳化劑及微囊，肽類載體例如多聚賴氨酸，多聚鳥氨酸合成的多聚體載體例如聚乙烯亞胺及聚乳酸/乙二醇共聚物。特別地，與脂質(zhì)體聯(lián)合的藥物制劑是優(yōu)選的。在藥物制劑中，本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選地以包埋在脂質(zhì)體中的形式存在。可通過已知方法用這些載體進行配制。
例如，用脂質(zhì)體配制的方法在Gregory，G.(ed)，LiposomeTechnologyLiposome Preparation and Related Techniques，2ndEd.，CRC Pr.，1992等中進行了描述。與脂質(zhì)體聯(lián)合的藥物制劑不僅可以包括通常用于形成脂質(zhì)體的脂類，例如磷脂、糖脂和中性脂，而且也可以包括提供陽離子電荷以形成脂質(zhì)體的物質(zhì)，例如聯(lián)十六烷基磷酸、硬脂酰胺等，及防止脂質(zhì)體氧化的物質(zhì)，例如α-生育酚等。對于增強對細(xì)胞的整合和增強對靶向細(xì)胞的導(dǎo)向性的目的，可以使用修飾后的上述載體。
此處，這些藥物制劑可以包括其它已知具有抗癌作用的組分。
在上述藥物制劑中，本發(fā)明中的反義寡核苷酸可在連接到載體上，例如整合到任意載體上后進行使用。在這種情況下，反義寡核苷酸優(yōu)選地是可操作地連接到合適的啟動子上。術(shù)語“可操作地”是指反義寡核苷酸(RNA)可在該啟動子的作用下在活體細(xì)胞中進行表達(dá)。載體包括但不限于，例如腺病毒載體、痘病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。這些載體可用作基因治療的載體。對于構(gòu)建這些載體的方法、其特定的用途等可參考文獻(xiàn)例如Sambrook，J.，et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual；2ndEd.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989等。
本發(fā)明的藥物制劑中的反義寡核苷酸含量沒有特別限定，可以進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整以達(dá)到每種藥物制劑所需的效果。通常含量約為質(zhì)量的1％到10％是合適的。
本發(fā)明中的癌細(xì)胞生長抑制劑和癌癥治療或預(yù)防制劑可通過上述方法獲得。因此，用本發(fā)明中的反義寡核苷酸生產(chǎn)本發(fā)明中的癌細(xì)胞生長抑制劑和癌癥治療或預(yù)防制劑的方法作為本發(fā)明的另一個實施方案進行提供。
對活體施用本發(fā)明中的癌癥治療或預(yù)防制劑的方法根據(jù)治療或預(yù)防制劑的形式可包括但不特別限定于，例如口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、局部給藥、腹膜內(nèi)給藥等。作為給藥本發(fā)明的癌癥治療或預(yù)防制劑的方法，更有效的方法可根據(jù)個體和疾病的狀況進行選擇，通常靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的。癌癥治療或預(yù)防制劑的給藥劑量根據(jù)癥狀等進行確定，并不特別限定。在靜脈內(nèi)給藥的情況下，癌癥治療或預(yù)防制劑的劑量以本發(fā)明中的反義寡核苷酸的量來說，優(yōu)選地是每人每天0.1到1mg/(體重)kg，更優(yōu)選地是0.1到0.5mg/(體重)kg?？梢悦刻煲淮谓o藥或每天多次分部給藥。給藥周期也不進行特別限定。
此處，給藥本發(fā)明中的癌癥治療或預(yù)防制劑的活體并不限定于上述的人，而且包括例如哺乳動物等其它動物。本發(fā)明中的癌細(xì)胞生長抑制劑也與本發(fā)明中的癌癥治療或預(yù)防制劑的使用方式相同。
作為本發(fā)明的癌細(xì)胞生長抑制劑和癌癥治療或預(yù)防制劑靶點的癌細(xì)胞的部位無特別限定，特別優(yōu)選地是癌細(xì)胞來源于身體表面例如皮膚；消化道例如食道、胃和大腸；抑制劑或制劑可進行動脈內(nèi)施用于肝臟等部位。
此處，在下述參考實施例1中表明本發(fā)明中的反義寡核苷酸沒有特別的毒性。
實施例在下文中，本發(fā)明通過參考實施例進行描述，但本發(fā)明不被這些實施例1由于轉(zhuǎn)化RNA參與細(xì)胞的癌化過程和分泌性蛋白合成的抑制作用，因此推測分泌性蛋白的抑制作用參與細(xì)胞的癌化過程。另一方面，反義ODN(SEQ ID NO6)可降低分泌性蛋白合成的抑制作用，因此希望反義ODN能具有抗癌化作用。
因此，合成了針對包含幾個殘基，其中心序列是來源于兔細(xì)胞SRP7SL RNA中48到51位核苷酸序列(SEQ ID NO8)的反義寡核苷酸(硫代磷酸酯類寡核苷酸)，并通過從細(xì)胞外整合來檢測其對人癌細(xì)胞的作用。已知來源于人細(xì)胞的7SL RNA的核苷酸序列與來源于兔細(xì)胞的7SL RNA具有相同的核苷酸序列。
通過TAKARA BIO INC制備了核苷酸序列如下述表1所示的反義寡核苷酸(DNAs)。在表中，寡核苷酸1到5是反義寡核苷酸的名稱，括號中的數(shù)字表示在7SL RNA核苷酸序列中的對應(yīng)位置。寡核苷酸5是不依賴于7SL RNA核苷酸序列而隨機制備的反義寡核苷酸的混合物，N代表A、C、G或T。


對每個寡核苷酸對細(xì)胞生長的影響進行了檢測。特別地，將培養(yǎng)在含10％加熱滅活的胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中的人癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞以1500細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)液換成含濃度10μM的每種寡核苷酸及1％FCS的培養(yǎng)液。細(xì)胞在CO2存在下，在37℃進行培養(yǎng)。此后，在4天內(nèi)以24小時的時間間隔通過改良的MTT方法(WST-1+1-甲氧基PMS)用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(由DOJINDO生產(chǎn))檢測活細(xì)胞的比例[細(xì)胞的存活率(％)](吸收峰450 to 650nm)。此處，用不含任何寡核苷酸的培養(yǎng)液作為對照(下同)。
圖2所示的是每種寡核苷酸對人癌細(xì)胞生長的影響。實驗重復(fù)三次。在圖中，每個數(shù)據(jù)以平均值±SD表示(下同)。在寡核苷酸3中，細(xì)胞的存活率最低，表明對人癌細(xì)胞生長的抑制作用最高。與對照相比，在第1、2、3、4天的細(xì)胞存活率分別是49.6％、62.7％、71.6％及71.1％。
然后以同樣方式進行實驗，設(shè)定寡核苷酸3在培養(yǎng)液中的濃度分別為2.5、5、10和20μM，從而檢測對人癌細(xì)胞生長的抑制作用與濃度的關(guān)系。
圖3所示的是寡核苷酸3對人癌細(xì)胞生長的濃度依賴性的影響?？梢钥吹剑押塑账?對人癌細(xì)胞生長的抑制作用隨濃度成比例地增加。與對照相比，在第1、2、3、4天的細(xì)胞存活率分別是44.4％、45.1％、55.5％和63.8％。
通過[3H]-甲基胸腺嘧啶對細(xì)胞的整合作用檢測每種寡核苷酸對細(xì)胞DNA合成的影響。特別地，細(xì)胞以上述相同的方式培養(yǎng)24小時，然后將培養(yǎng)液換成含濃度為5、10或20μM的每種寡核苷酸和0.1％FCS。18小時后，向培養(yǎng)液中加入1μCi/mL[3H]-甲基胸腺嘧啶，然后將細(xì)胞再培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)后，通過液體閃爍計數(shù)器測定預(yù)處理后的細(xì)胞的特定放射性。
圖4所示的是在人癌細(xì)胞中每種寡核苷酸對細(xì)胞DNA合成的影響?？梢钥吹?，寡核苷酸3將[3H]-甲基胸腺嘧啶對細(xì)胞的整合作用抑制到最低水平，因此寡核苷酸3對人癌細(xì)胞生長的抑制作用是最強的。與對照相比，存在濃度為5、10和20μM的寡核苷酸3時對人癌細(xì)胞[3H]-甲基胸腺嘧啶的整合率分別為57.5％、32.0％和16.6％。
另外檢測了寡核苷酸3對人癌細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用。特別地，將3,000個HeLa細(xì)胞接種到載玻片上。培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)液換成含濃度20μM的寡核苷酸3的培養(yǎng)液。在加入寡核苷酸3培養(yǎng)18小時后，用立體顯微鏡(100倍放大率，由Olympus公司生產(chǎn))觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，從而可觀察到從細(xì)胞收縮到死亡的過程。另外，在加入寡核苷酸3培養(yǎng)24小時后，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，然后進行Giemsa染色，以確定活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)目，以從獲得的細(xì)胞數(shù)目中測定細(xì)胞的存活率(％)。此處，將寡核苷酸5也作為對照。
圖5所示的是寡核苷酸3對人癌細(xì)胞死亡的影響。寡核苷酸3的細(xì)胞存活率為30.8％，而對照和寡核苷酸5的細(xì)胞存活率分別是98.5％和98.7％，這表明寡核苷酸3的細(xì)胞存活率顯著低于其它對照，因此寡核苷酸3對人癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡有強烈的誘導(dǎo)作用。
可以看出，針對SRP 7SL RNA中48到51位核苷酸序列的反義寡核苷酸3(SEQ ID NO1)可抑制癌細(xì)胞的生長，并可誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。因此，預(yù)期寡核苷酸3具有制癌作用。
參考實施例1對寡核苷酸3的毒性作用進行了檢測。特別地，將寡核苷酸3溶解在生理鹽水中，使其濃度為1mg/mL，然后以每克體重20μg的劑量靜脈內(nèi)給藥雌鼠(5周齡)。給藥后，測定每只鼠在給藥當(dāng)天(0天)，第2、5、10、12和14天的體重。
圖6所示的是寡核苷酸3在靜脈內(nèi)給藥20μg/(體重)g的劑量對鼠體重增加的影響。在圖中，每個數(shù)據(jù)以平均值±SE表示。此處，分別從施用寡核苷酸3的7只鼠和施用對照的6只鼠中獲得數(shù)據(jù)。
如圖6所示，寡核苷酸3和對照對體重增加的影響沒有區(qū)別。而且在二者之間也沒有觀察到后代癥狀有顯著差別。從這些結(jié)果中可以認(rèn)為寡核苷酸3沒有表現(xiàn)出顯著的毒性作用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種具有抗癌作用，例如抑制癌細(xì)胞生長及治療或預(yù)防癌癥的反義寡核苷酸，以及一種包含該反義寡核苷酸的癌細(xì)胞生長抑制劑和治療或預(yù)防癌癥的制劑。這些發(fā)明對癌癥治療領(lǐng)域具有重要意義。
文本形式的序列列表SEQ ID NO1是針對7SL RNA中47到51位核苷酸序列的反義寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO3是轉(zhuǎn)化RNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO4是相應(yīng)于轉(zhuǎn)化RNA的部分核苷酸序列制備的寡脫氧核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO5是寡脫氧核苷酸的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO6是針對寡脫氧核苷酸的核苷酸序列的反義寡脫氧核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO7是反義寡脫氧核苷酸的部分核苷酸序列。
序列表<110>GOOD WILL OKINAWA CO.，LTD<120>具有抗癌作用的反義寡核苷酸<130>04-069-PCTJP<150>JP 2004-014883<151>2004-01-22<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>針對7SL RNA中47-51位核苷酸序列的反義寡核苷酸<400>1cctca 5<210>2<211>29<212>RNA<213>人<400>2gauuuccgug gagaggaaca acucugagu 29<210>3<211>9<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>轉(zhuǎn)化RNA的部分核苷酸序列
<400>3ggagaggaa 9<210>4<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>針對轉(zhuǎn)化RNA的部分核苷酸序列的寡脫氧核苷酸<400>4ggagaggaa 9<210>5<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡脫氧核苷酸的部分核苷酸序列<400>5ggag 4<210>6<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>針對寡脫氧核苷酸的核苷酸序列的反義寡脫氧核苷酸<400>6ttcctctcc 9<210>7
<211>4<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡脫氧核苷酸的部分核苷酸序列<400>7cctc 4<210>8<211>4<212>RNA<213>兔<400>8gagg 權(quán)利要求
1.一種反義寡核苷酸，其針對信號識別顆粒(SRP)7SL RNA中47到51位核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1中的反義寡核苷酸，其包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種癌細(xì)胞生長抑制劑，其包含權(quán)利要求1或2中定義的反義寡核苷酸。
4.一種癌癥治療或預(yù)防制劑，其包含權(quán)利要求1或2中定義的反義寡核苷酸。
5.權(quán)利要求4中的治療或預(yù)防制劑，其中反義寡核苷酸存在于脂質(zhì)體中。
6.權(quán)利要求4或5中的治療或預(yù)防制劑，其中反義寡核苷酸連接到載體上。
7.一種用權(quán)利要求1或2中的反義寡核苷酸生產(chǎn)權(quán)利要求3中定義的癌細(xì)胞生長抑制劑或權(quán)利要求4到6中任意一項中定義的治療或預(yù)防制劑的方法。
全文摘要
提供了一種具有抗癌作用，例如抑制癌細(xì)胞生長及治療或預(yù)防癌癥等作用的反義寡核苷酸，以及一種包含該反義寡核苷酸的癌細(xì)胞生長抑制劑和治療或預(yù)防癌癥的制劑。一種針對信號識別顆粒(SRP)7SLRNA中47到51位核苷酸序列的反義寡核苷酸，一種包含該反義寡核苷酸的癌細(xì)胞生長抑制劑，及一種包含該反義寡核苷酸的癌癥治療或預(yù)防制劑。
文檔編號A61K31/7088GK1816626SQ20048001873
公開日2006年8月9日 申請日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月22日
發(fā)明者濱田勝友 申請人:有限會社琉球信譽