專利名稱：喜樹堿和氟嘧啶的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及改善治療藥物組合傳遞的組合物和方法。更具體的說，本發(fā)明涉及提供嘧啶和喜樹堿藥劑及其衍生物組合的傳遞系統(tǒng)。
背景技術：
許多威脅生命的疾病如癌癥、艾滋病、感染性疾病、免疫病癥和心血管疾病的進程受多種分子機制的影響。由于這種復雜樣性，用單一藥劑治療獲得的成功是有限的。因此，常常使用藥劑組合來對抗疾病，尤其是治療癌癥。似乎給予藥劑的數(shù)量與癌癥，如急性淋巴細胞白血病與轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌之間具有強相關性(Frei，等，Clin.Cancer Res.(1998)42027-2037；Fisher，M.D.，Clin Colorectal Cancer(2001)Aug；1(2)85-86)。尤其是，已用嘧啶類似物和喜樹堿衍生物的組合成功治療胃癌和結(jié)腸直腸癌，并且，研究其對食管癌的作用。臨床試驗利用嘧啶類似物、氟尿嘧啶(5-FU)與喜樹堿(伊立替康)和甲酰四氫葉酸治療晚期結(jié)腸直腸癌，證明超過僅用5-FU的提高的存活率(Fisher，M.D.(上述)；和美國專利6,403,569)。Fisher還指出，在5-FU首次治療后發(fā)展的5-FU抗藥性結(jié)腸直腸癌的患者，用5-FU、伊立替康(CPT-11)和甲酰四氫葉酸聯(lián)合治療，也顯示存活率增加，因而證明這些藥物組合在治療耐藥癌癥中的其它潛在用途。
喜樹堿是在中國喜樹和亞洲殷柴龍(nothapodytes)樹的樹皮中發(fā)現(xiàn)的基于喹啉的生物堿。喜樹堿的許多衍生物，包括半合成和合成衍生物如托泊替康和伊立替康，具有抑制拓撲異構(gòu)酶I的獨特能力，使它們稱為高度活化的細胞致死劑。拓撲異構(gòu)酶I是負責DNA纏繞和解旋的細胞酶。當DNA不能解旋時，DNA信使的轉(zhuǎn)錄不能發(fā)生，蛋白質(zhì)不能合成，最終導致細胞死亡。高速分裂的細胞如癌細胞，對喜樹堿衍生物尤其敏感，因其DNA不斷解旋以復制子細胞。在開放狀態(tài)，已顯示DNA易受喜樹堿藥物的插入，最終導致DNA斷裂和細胞死亡。
嘧啶類似物，如5-FU和阿糖胞苷(阿糖胞苷或araC)，是類似嘧啶核苷酸的抗代謝物。大多數(shù)抗代謝劑物具有不同的作用方式。例如，5-FU起胸苷酸合酶的自殺失活劑作用，共價修飾酶的活性部位。胸苷酸合酶是DNA從頭合成中限速的不可逆步驟，催化dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP。該步驟的暫時阻斷導致細胞死亡。相反，阿糖胞苷被細胞酶生物活化為araCMP，使其與DNA聚合酶的交替底物CTP競爭。araCMP摻入DNA中，因而抑制增長的DNA鏈的進一步合成。這種抗增殖特性使抗代謝物能夠有效地治療結(jié)腸、乳房、頭、頸、胃和胰的癌癥，因為快速分裂細胞對這些藥物的作用高度敏感。
雖然大約40年前臨床試驗中已引入5-FU，但是直到二十世紀九十年代早期才研究了涉及喜樹堿衍生物與嘧啶類似物的組合的試驗(Furuta，T.和Yokokura，T.，Gan To Kagaku Ryoho(1991)Mar；18(3)393-402)。多年來，研究者繼續(xù)證明，通過給予多種嘧啶/喜樹堿組合的游離藥物混合物，有希望改善癌癥的治療。(參見PCT專利申請WO 00/66125和WO 01/62235)。盡管使用嘧啶/喜樹堿藥物混合物有優(yōu)勢，但是也存在各種缺點限制治療應用。例如，給予游離藥物混合物常常導致一種或所有藥物在到達腫瘤部位前快速清除。由于這個原因，許多藥物已摻入設計的傳遞載體中，以“保護”藥物不受導致其從血流清除的機制的影響。
眾所周知，脂質(zhì)體具有提供“保護”作用的能力，它們能延長治療藥物的半衰期。包封于合理設計的傳遞載體中也能產(chǎn)生協(xié)調(diào)的包封藥物的藥物動力學。然而，已證明特殊藥物或多于一種藥物配制入傳遞載體中是困難的，因為載體的脂質(zhì)組合物常常特異地影響個別藥物的藥物動力學。因此，適合于一種藥物的保留和釋放的組合物可能不適用于第二種藥物的保留和釋放。近來，雖然在臨床試驗中成功利用了許多活性嘧啶/喜樹堿藥物組合，但是尚未描述設計了一種能夠控制兩種藥物的藥物動力學，因而腫瘤傳遞的藥物制劑。例如，授權于W.Achterrath，公開于2002年6月11日的美國專利6,403,569聲稱假如有至少200mg/m2甲酰四氫葉酸，通過給予喜樹堿衍生物、5-FU和甲酰四氫葉酸(與維生素葉酸有關的化合物，5-FU治療期間的標準治療實踐)的協(xié)同量治療癌癥的方法，但是沒有提及保證傳遞和/或增加循環(huán)持續(xù)時間的藥物制劑。
本發(fā)明研究人員已鑒定容納嘧啶和喜樹堿衍生物所需的具體傳遞載體制劑，得到每個藥劑較高的載藥量和持久的藥物釋放。他們還闡明，如果包封于脂質(zhì)體，這些藥物的協(xié)同比例在血流房室中可維持一段時間，與游離藥物混合物相比，效果提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定地結(jié)合至少一種氟嘧啶和一種水溶性喜樹堿的脂質(zhì)體載體，給予有效量的氟嘧啶/喜樹堿藥物組合的組合物和方法。組合物以合適的的方式，使兩種或多種藥物傳遞至病變部位，因而保證在病變部位存在所需比例的藥物。無論藥物是共包封于基于脂質(zhì)的傳遞載體中，或是分別包封于單個基于脂質(zhì)的傳遞載體中以使在病變部位維持所需比例，都可得到此結(jié)果。通過基于脂質(zhì)的傳遞載體本身控制組合物的藥物動力學(PK)，以達到合適的傳遞(假設傳遞系統(tǒng)的PK是可比較的)。
因此，一方面，本發(fā)明提供非腸道給藥的脂質(zhì)體組成，該組合物含有至少一種氟嘧啶和一種水溶性喜樹堿，它們以治療有效比例結(jié)合脂質(zhì)體能產(chǎn)生所需、優(yōu)選是非拮抗效果。通過在濃度范圍內(nèi)，評價藥物對相關細胞培養(yǎng)或無細胞體系，以及個體患者活組織檢查的腫瘤細胞勻漿的生物活性或作用來確定藥物的治療有效比例。優(yōu)選的組合物是伊立替康和氟尿嘧啶(5-FU)或伊立替康和氟脫氧尿苷(FUDR)。可使用能夠確定維持所需療效的藥物比例的任何方法。
組合物含有至少一種氟嘧啶和一種水溶性喜樹堿，氟嘧啶與水溶性喜樹堿的摩爾比能夠?qū)ο嚓P培養(yǎng)細胞或無細胞體系和腫瘤細胞勻漿顯示所需，優(yōu)選非拮抗的生物效應?！跋嚓P”細胞，申請者是指適用于測試所需生物效應的至少一種細胞培養(yǎng)或細胞系。當這些藥物用作抗腫瘤藥時，“相關”細胞是由國立癌癥研究所(NCI)/國立衛(wèi)生研究院(NIH)的發(fā)展治療規(guī)劃(Developmental Therapeutics Program)(DTP)鑒定，作為適用于抗癌藥物發(fā)現(xiàn)計劃的細胞系。目前，DTP篩選使用60中不同的人腫瘤細胞系。需要證明關于至少一種該細胞系的所需活性。“腫瘤細胞勻漿”，申請者是指患者活組織檢查或形成全細胞樣品的腫瘤的機械或化學破裂產(chǎn)生的細胞。合格醫(yī)師可通過標準醫(yī)學技術提取整體腫瘤或腫瘤活組織檢查，在實驗室中采用許多本領域公知的方法將組織勻漿成單一的全細胞。
另一方面，本發(fā)明涉及通過施用本發(fā)明組合物將治療有效量的氟嘧啶/水溶性喜樹堿組合傳遞至所需靶點的方法。
本發(fā)明還涉及通過給予穩(wěn)定地結(jié)合第一傳遞載體的氟嘧啶和穩(wěn)定地結(jié)合第二傳遞載體的水溶性喜樹堿，傳遞治療有效量的氟嘧啶/水溶性喜樹堿藥物組合方法。第一和第二傳遞載體可包含于獨立小瓶中，同時或相繼給予患者小瓶的內(nèi)容物。在一個實施例中，施用氟嘧啶與水溶性喜樹堿的比例是非拮抗的。
本發(fā)明另一方面，與本發(fā)明組合物一起給予甲酰四氫葉酸(與葉酸有關的化合物)，以穩(wěn)定體內(nèi)氟嘧啶。
另一方面，本發(fā)明涉及包含脂質(zhì)體的治療組合物，所述脂質(zhì)體含有至少一種氟嘧啶和一種水溶性喜樹堿的比例，以提供所需療效的制備方法，該方法包括提供一組至少一種氟嘧啶和一種水溶性喜樹堿，其中，該組含有至少一種，但優(yōu)選多種比例的所述藥物；在一定濃度范圍內(nèi)，測定該組成員對相關培養(yǎng)細胞或無細胞體系和腫瘤細胞勻漿產(chǎn)生生物效應的能力；選擇該組的一個成員，其中，在合適的濃度范圍內(nèi)，該比例提供對所述培養(yǎng)細胞或無細胞體系產(chǎn)生所需療效；和該組的成功成員所代表的藥物比例穩(wěn)定結(jié)合進入基于脂質(zhì)的藥物傳遞載體。在優(yōu)選的實施例中，上述所需療效是非拮抗的。
如下文進一步描述，在優(yōu)選的實施例中，在設計與上述方法一致的合適的組合中，選擇具有組合指數(shù)(CI)≤1.1的非拮抗比例。在進一步的實施例中，設計合適的脂質(zhì)體制劑，使其穩(wěn)定包含有效量的氟嘧啶/水溶性喜樹堿組合，并且，體內(nèi)兩種藥物持久釋放。優(yōu)選的制劑含有至少一種負電荷脂質(zhì)如磷脂酰甘油，并含有至少一種固醇如膽固醇。
附圖簡要說明

圖1是在50℃，含100mMCu(葡糖酸)2，220mM TEA，pH7.4和被動包封FUDR的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體中載入伊立替康(CPT-11)一定時間的圖。
圖2A是在50℃，比較含100mM葡糖酸銅，220mM TEA，pH7.4或100mM CuSO4，265mM TEA，pH7.4，和被動包封FUDR的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體中載入CPT-11一定時間的圖。
圖2B是在50℃，比較使用含100mM葡糖酸銅，220mM TEA，pH7.4或100mM CuSO4、265mM TEA，pH7.4和使用pH 7.4的HBS作為外部緩沖液被動包載FUDR的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體中FUDR保留一定時間(CPT載入后)的圖。
圖3是在比較含100mM葡糖酸銅，220mM TEA，pH 7.4或150mM葡糖酸銅，20mM Hepes，pH 7.4和使用pH 7.4的HBS作為外部緩沖液被動包載FUDR的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體中載入CPT-11時間的圖。
圖4A是比較隨著脂質(zhì)體-膽固醇的量從5摩爾％增加到20摩爾％，CPT-11在載有CPT-11和FUDR的DSPC/DSPG/Chol脂質(zhì)體中保留一定時間的圖。FUDR被動包封于含250mM CuSO4的脂質(zhì)體中，然后，在給予和測定CPT-11水平之前主動包載CPT-11。
圖4B是比較隨著脂質(zhì)體-膽固醇的量從5摩爾％增加到20摩爾％，F(xiàn)UDR在包載CPT-11和FUDR的DSPC/DSPG/Chol脂質(zhì)體中保留一定時間的圖。FUDR被動包封于含250mM CuSO4的脂質(zhì)體中，然后，在給予和測定FUDR水平之前主動包封CPT-11。
圖5A是受不同摩爾比的FUDR∶CPT-11組合的作用10∶1(實心正方形)、5∶1(實心圓形)、1∶1(實心三角形)、1∶5(實心反三角形)和1∶10(空心圓形)，組合指數(shù)(CI)作為HT-29人結(jié)腸直腸細胞分數(shù)的函數(shù)繪制的圖。
圖5B是受不同摩爾比的FUDR∶CPT-11組合的作用10∶1(實心正方形)、5∶1(實心圓形)、1∶1(實心三角形)、1∶5(實心反三角形)和1∶10(空心圓形)，組合指數(shù)(CI)對H-460人大細胞癌細胞分數(shù)的函數(shù)繪制的圖。
圖5C是受不同摩爾比的FUDR∶CPT-11組合的作用10∶1(實心正方形)、5∶1(實心圓形)、1∶1(實心三角形)、1∶5(實心反三角形)和1∶10(空心圓形)，組合指數(shù)(CI)對HCT-116人結(jié)腸直腸癌細胞分數(shù)的函數(shù)繪制的圖。
圖5D是FUDR∶CPT-11的摩爾比為1∶5、1∶1和1∶10時，各種腫瘤型的編集數(shù)據(jù)與其相對協(xié)同值的函數(shù)繪制的圖。
圖6A是靜脈給予CD-1鼠以CPT-11和FUDR的雙載藥脂質(zhì)體和游離藥物混合物后，血漿中CPT-11/FUDR比(摩爾/摩爾)作為時間函數(shù)的圖。
圖6B是靜脈給予SCID-Rag2M鼠以CPT-11/FUDR雙載藥脂質(zhì)體后，血漿中CPT-11/FUDR比(摩爾/摩爾)作為時間函數(shù)的圖。
圖7是顯示同時將CPT-11(實心圓形)和FUDR(空心圓形)包載入含葡糖酸銅的DSPC/DSPG/Chol(7∶2∶1)脂質(zhì)體的圖。50℃，脂質(zhì)體存在下，通過加熱藥物混合物包載兩種藥物。2小時時間過程內(nèi)監(jiān)測包載。
圖8A是給予生理鹽水(對照，實心圓形)、1∶1協(xié)同比例的CPT-11∶FUDR的游離藥物混合物(空心方塊和實心三角形)和1∶1協(xié)同比例的CPT-11∶FUDR的脂質(zhì)體制劑(空心反三角形)后，用人HT-29結(jié)腸腺癌細胞接種腫瘤細胞后，瘤重對時間的圖。
圖8B是給予鹽水(對照，實心圓形)、1∶1協(xié)同比例的CPT-11∶FUDR的游離藥物混合物(實心三角形)和1∶1協(xié)同比例的CPT-11∶FUDR的脂質(zhì)體制劑(空心方塊)后，用人HCT116結(jié)腸腺癌細胞接種腫瘤細胞后，瘤重對時間的圖。
圖8C是給予鹽水(對照，實心圓形)、1∶1協(xié)同比例的CPT-11/FUDR的游離藥物混合物(空心方塊和反實心三角形)和1∶1協(xié)同比例的CPT-11/FUDR的脂質(zhì)體制劑(空心反三角形)后，用人Capan-1胰腺腫瘤細胞接種腫瘤細胞后，瘤重對時間的圖。
實施本發(fā)明的模式1本發(fā)明提供組合物，該組合物含有穩(wěn)定結(jié)合至少一種氟嘧啶和一種水溶性喜樹堿的脂質(zhì)體，其中，存在氟嘧啶和水溶性喜樹堿的氟嘧啶/喜樹堿摩爾比，顯示對相關細胞或腫瘤細胞勻漿所需的細胞毒性、細胞生長抑制或生物效應。
優(yōu)選地，本文提供的脂質(zhì)體組成包括穩(wěn)定結(jié)合至少一種氟嘧啶和一種水溶性喜樹堿的脂質(zhì)體，氟嘧啶/水溶性喜樹堿的摩爾比顯示對相關細胞或腫瘤細胞勻漿的非拮抗效應。
優(yōu)選地，本發(fā)明脂質(zhì)體組成包括穩(wěn)定結(jié)合5-FU或FUDR和伊立替康的脂質(zhì)體。更優(yōu)選地，5-FU或FUDR和伊立替康將以5-FU(或FUDR)∶伊立替康的摩爾比在100∶1和1∶100之間，更優(yōu)選5-FU或FUDR與伊立替康的摩爾比在10∶1和1∶1的范圍內(nèi)，存在于本發(fā)明組合物中。
在本發(fā)明再一個實施例中，上述基于脂質(zhì)的傳遞載體包括第三或第四試劑。可包括任何治療、診斷或化妝試劑。
本發(fā)明的另一方面，提供了含有固醇的脂質(zhì)體。優(yōu)選固醇是膽固醇。
本發(fā)明基于脂質(zhì)的傳遞載體不僅可用于非腸道給藥，而且可用于局部、鼻、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、氣霧劑或口服傳遞、或在治療目的或醫(yī)療顯像等的靶部位或附近的天然或合成可植入裝置上或內(nèi)應用傳遞載體。優(yōu)選地，基于脂質(zhì)的本發(fā)明傳遞載體用于非腸道給藥，最優(yōu)選靜脈給藥。在另一個本發(fā)明實施例中，與本發(fā)明組合物一起給予甲酰四氫葉酸，在體內(nèi)穩(wěn)定氟嘧啶。
1縮寫DSPC二硬脂酰卵磷脂；PG磷脂酰甘油；DSPG二硬脂酰磷脂酰甘油；PI磷脂酰肌醇；Chol膽固醇；CH或CHE膽固醇基十六烷基醚；DAPC二花生四烯?；字Ｄ憠A(diarachidonoylphosphatidylcholine)SUV小單室脂質(zhì)體；LUV大單室脂質(zhì)體；MLV多室脂質(zhì)體；MTT3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H溴化四唑溴鹽；EDTA乙二胺四醋酸；HEPESN-[2-羥乙基]-哌嗪-N-[2-乙磺酸]；HBSHEPES緩沖鹽水(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)；SHE300mM蔗糖，20mM HEPES，30mM EDTA；TEA三乙醇胺；CI組合系數(shù)；fa作用分數(shù)本文所描述的優(yōu)選實施例不是為了無遺漏地或限制本發(fā)明范圍至具體公開形式。選擇和描述它們是為了更好地解釋本發(fā)明的原理及其應用和實際使用，以使其它本領域技術人員理解本說明。
水溶性喜樹堿喜樹堿是一類高活性抗癌藥物。大部分藥物是在中國喜樹和亞洲殷柴龍樹的樹皮中發(fā)現(xiàn)的天然來源的“喜樹堿”的半合成或合成衍生物。報道喜樹堿是通過抑制拓撲異構(gòu)酶I，一種參與DNA的合成和復制的細胞中發(fā)現(xiàn)的酶的作用而起效的。發(fā)現(xiàn)與正常細胞相比，該酶在許多類型的癌細胞中具有顯著較高量且降解更慢。由于尚未完全理解喜樹堿的作用機理和微水溶性，喜樹堿的臨床應用受到限制。幾乎所有的天然來源的喜樹堿是微水溶性的；此性質(zhì)使其制劑或給藥困難，在許多情況下不可能。因此，許多市售或研發(fā)中的喜樹堿已制備成水溶性的。本領域技術人員普遍接受的是，水溶性喜樹堿包括在生理pH條件下帶電的喜樹堿衍生物。例如，通過在喜樹堿A環(huán)的9、10或11位引入親水性羥基或硝基，可有效增加水溶性。相似地，在9位引入正電荷的二甲基氨基甲基，證明水溶性增加。
喜樹堿的水溶性衍生物具有抗人腫瘤的廣譜活性。由于這個原因，美國食品與藥品管理局(FDA)已批準水溶性喜樹堿制劑伊立替康、托泊替康和勒托替康用于人臨床應用。認為伊立替康(CPT-11)的抗腫瘤活性證明是通過其代謝物SN-38產(chǎn)生的。
本發(fā)明“水溶性喜樹堿”是指在水中充分溶解的喜樹堿衍生物或其制劑。水溶性喜樹堿包括，但不限于伊立替康(CPT-11)、SN-38、托泊替康、9-氨基喜樹堿、勒托替康和這些藥物的前藥、前體、代謝產(chǎn)物；以及水不溶性喜樹堿的親水鹽衍生物如母體混合物的鈉鹽，喜樹堿(Camptothecin)。用于本發(fā)明優(yōu)選的水溶性喜樹堿是伊立替康、托泊替康、9-氨基喜樹堿或勒托替康。最優(yōu)選的水溶性喜樹堿是伊立替康。
氟嘧啶尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶，以及相應核苷的氟嘧啶類似物是眾所周知的抗癌藥物。許多這種嘧啶類似物或衍生物作為抗代謝物接近類似必需代謝物，因此干擾有關的生理反應。嘧啶類似物的一般作用機制是抑制酶，即胸苷酸合酶。這種抑制作用防止dUMP的甲基化(脫氧尿苷單磷酸)，結(jié)果產(chǎn)生二氫葉酸和胸苷酸，其是DNA合成中的必需前體。這種干擾的結(jié)果是抑制DNA生物合成。在脫氧核苷酸的合成中，胸苷酸合酶的作用使其成為癌癥化療中的關鍵靶酶，最特別是結(jié)腸直腸癌和其它腫瘤。尤其感興趣的是氟化嘧啶類似物或″氟嘧啶″，如氟尿嘧啶(5-FU)和氟脫氧尿苷(氟尿苷或FUDR)，已表明在人中具有明顯的抗腫瘤活性。
″氟嘧啶″正如其名稱所暗示的，是指氟原子衍生的嘧啶類似物。本領域認為本發(fā)明氟嘧啶是5-FU或FUDR的同等物，包括但不限于UFT(尿嘧啶-替加氟)、卡培他濱、喃氟啶(FT-207)和5-FU或FUDR的前藥、前體、代謝產(chǎn)物如FdUMP(5氟-脫氧尿苷單磷酸)和FUTP(氟尿苷三磷酸)等。
在臨床試驗中使用尿嘧啶和替加氟(UFT)的組合治療癌癥已有20多年。替加氟體內(nèi)代謝形成5-FU而尿嘧啶與替加氟相互作用，且防止5-FU的斷裂。在一些情況下，口服給予UFT有希望替代5-FU的治療，因其常常能增加活性和降低毒性。
卡培他濱是前藥，被胸腺嘧啶磷酸化酶選擇性地腫瘤激活至其細胞毒部分，氟尿嘧啶。在正常和腫瘤細胞內(nèi)，氟尿嘧啶進一步代謝形成兩個活性代謝物5-氟-2-氟脫氧尿苷單磷酸(FdUMP)和5-氟尿苷三磷酸(FUTP)。FdUMP通過還原正常胸腺嘧啶產(chǎn)生抑制DNA合成，而FUTP通過與尿苷三磷酸競爭抑制RNA和蛋白質(zhì)合成。
優(yōu)選地，本發(fā)明使用的氟嘧啶是5-FU、FUDR或替加氟/尿嘧啶。更優(yōu)選地，氟嘧啶是FUDR或5-FU。最優(yōu)選地，氟嘧啶是FUDR?？山Y(jié)合本發(fā)明組合物給予甲酰四氫葉酸。此混合物沒有抗腫瘤活性；但是，因為它導致5-FU的生存時間明顯增加，所以是FDA批準的用5-FU治療患者的標準護理實踐。甲酰四氫葉酸通過使5-FU(和FUDR)穩(wěn)定結(jié)合靶酶(胸苷酸合酶)而起作用，因而保護其免受從血液中清除的機制。氟嘧啶的清除降低使其顯示較高的細胞毒作用。
在本發(fā)明脂質(zhì)體中，結(jié)合喜樹堿和嘧啶類似物的效果將至少抑制拓撲異構(gòu)酶I和胸苷酸合酶，因此，導致在治療過度增生性疾病如癌癥中關鍵的DNA合成抑制作用增加。
體外非拮抗的喜樹堿/氟嘧啶比例的確定本發(fā)明的又一方面，喜樹堿和氟嘧啶將以協(xié)同或累加(即非拮抗)的比例包封于脂質(zhì)體中。在以下所述實驗數(shù)據(jù)類型的基礎上，使用各種算法可確定顯示協(xié)同或累加組合作用的藥劑的比例。這些方法包括輻射熱量法(Loewe等，Arzneim-Forsch(1953)3285-290；Steel等，Int.J.Radiol.Oncol.Biol.Phys.(1979)527-55)，分數(shù)產(chǎn)物法(Webb，《酶和代謝抑制劑》(Enzymeand Metabolic Inhibitors)(1963)卷1，1-5頁.New YorkAcademic Press)，基于Chou，J.Theor.Biol.(1976)39253-276所述方程的蒙特卡羅模擬法、CombiTool、ComboStat和Chou-Talalay半數(shù)效應法；和Chou，Mol.Pharmacol.(1974)10235-247)。替代方法包括生存分數(shù)法(Zoli等，Int.J.Cancer(1999)80413-416)，與對照相比，粒細胞/巨噬細胞菌落形成單位的百分比反應(Pannacciulli等，Anticanzcer Res.(1999)19409-412)及其它(Berenbaum，Pharmacol.Rev.(1989)4193-141；Greco等，Pharmacol Rev.(1995)47331-385)。
優(yōu)選Chou-Talalay半數(shù)效應法。利用方程分析，其中產(chǎn)生特殊效應的劑量，fa由以下方程給出D＝Dm[fa/(1-fa)]1/m其中，D是所用藥物的劑量，fa是該劑量作用的細胞分數(shù)，Dm是半數(shù)效應的劑量表示效果，m是表示劑量-效應曲線形狀的系數(shù)(一級反應m是1)。
如Chou和Talalay，Adv.Enzynze Reg.(1984)2227-55；和Chou等，《化療中的協(xié)同作用和拮抗作用》(Synergism and Antagonism in Chemotherapy)，Chou和Rideout編，Academic PressNew York 1991223-244所述，在多藥物效應方程的基礎上，該方程還可用于計算組合指數(shù)(CI)。在Chou和Chou(“用微型計算機進行劑量效應分析定量ED50、LD50、協(xié)同作用、拮抗作用、低劑量風險、受體配基結(jié)合和酶動力學”″Dose-effect analysis withmicrocomputersquantitation of ED50，LD50，synergism，antagonism，low-doserisk，receptor ligand binding and enzyme kinetics″CalcuSyn手冊和軟件；CambridgeBiosoft 1987)中發(fā)現(xiàn)此計算的計算機程序(CalcuSyn)。
組合指數(shù)方程是基于來自酶動力學模型的Chou-Talalay的多藥物-效應方程的。該方程只確定累加效應而不是協(xié)同作用和拮抗作用。然而，根據(jù)CalcuSyn程序，協(xié)同作用定義為大于預期的累加效應，拮抗作用定義為小于預期的累加效應。Chou和Talalay在1983年建議定義CI＝1為累加效應，因此，從兩種藥物的多藥物效應方程，對于具有相同或近似的作用方式的相互排斥的藥物，我們得到CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2[方程1]對于具有完全獨立的作用方式的相互不排斥的藥物，還提出CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+((D)1)(D)2)/(Dx)1(Dx)2[方程2]CI＜1，＝1和＞1分別表示協(xié)調(diào)作用、累加效應和拮抗作用。方程1或方程2要求，在實際實驗中，藥物1，(D)1和藥物2，(D)2，(在分子中)的組合抑制x％。因此，實驗觀察到的x％抑制作用可能不是整數(shù)，最常見是小數(shù)。方程1和2的(Dx)1和(Dx)2(在分母中)分別是藥物1和藥物2的劑量，抑制x％。
為了簡化，當組合中涉及多于兩種藥物時，通常假定是相互排斥的(CalcuSyn手冊和軟件；CambridgeBiosoft 1987)。
還可使用兩種藥物組合作為單一藥物單元，以確定與第三種藥物的協(xié)同或累加相互作用。此外，可使用三種藥物組合作為一個單元，以確定與第四種藥物的非拮抗相互作用，等等。
通常使用細胞培養(yǎng)或無細胞體系確定基本實驗數(shù)據(jù)。優(yōu)選地，如圖5A-5C所示，組合指數(shù)(CI)對作用細胞分數(shù)的函數(shù)(fa)作圖，如上所述，是濃度范圍的替代參數(shù)。藥物的優(yōu)選組合是那些在fa值實際范圍內(nèi)，顯示協(xié)同或累加效應的組合。選擇至少5％濃度范圍內(nèi)顯示協(xié)同作用的藥物的組合，其中，大于1％的細胞受損，即fa范圍大于0.01。優(yōu)選地，大部分整體濃度顯示有利的CI；例如，5％的fa范圍為0.2-1.0。更優(yōu)選地，10％的該范圍顯示有利的CI。甚至更優(yōu)選地，20％的fa范圍，優(yōu)選50％，最優(yōu)選至少超過70％的fa值0.2-1.0應用于組合物中。在多種藥物比例下，再次評價在fa值實際范圍內(nèi)顯示協(xié)同性的組合，以確定最佳比例，增加非拮抗相互作用的強度并觀察到在fa值范圍內(nèi)協(xié)同作用增加。
雖然希望在受損細胞的整個濃度范圍內(nèi)具有協(xié)同作用，但已觀察到，在許多情況下，更多可靠的結(jié)果是fa范圍0.2-0.8。因此，雖然提及的本發(fā)明組合顯示的協(xié)同作用在0.01或更大的廣闊范圍內(nèi)存在，優(yōu)選在fa0.2-0.8范圍內(nèi)建立協(xié)同作用。然而，可使用其它更靈敏的試驗，fa值大于0.8時評價協(xié)同作用，例如生物發(fā)光或克隆發(fā)生試驗。
最佳組合比例還可用作單一藥物單元，以確定與第三種藥物的協(xié)同或累加相互作用。此外，三種藥物組合可用作一個單元，以確定與第四種藥物的非拮抗相互作用，等等。
如上所述，用“相關”細胞進行的細胞培養(yǎng)的體外試驗。細胞的選擇取決于藥物的預期治療用途。只有一種相關細胞系或細胞培養(yǎng)類型需要顯示所需非拮抗作用，以提供本發(fā)明范圍內(nèi)組合物的基礎。
例如，在一個優(yōu)選的本發(fā)明實施例中，藥物組合用于抗癌治療。然后適當選擇試驗細胞和試驗的性質(zhì)。尤其是，合適的受試對象是腫瘤細胞系，合適的終點是測定細胞死亡或細胞停滯。以下將進一步討論，在發(fā)現(xiàn)其它適應癥的合適的非拮抗組合的嘗試中，可采用除了細胞毒性或細胞停滯以外的其它靶細胞和標準。
為了確定有關的抗腫瘤藥物，細胞系可從標準細胞系儲庫(例如NCI或ATCC)得到，可從科研機構(gòu)或其它組織包括商業(yè)來源得到。優(yōu)選的細胞系包括一種或多種選自NCI/NIH的發(fā)展治療規(guī)劃鑒定的細胞系。目前，該規(guī)劃使用的腫瘤細胞系篩選鑒定了60種不同的腫瘤細胞系，代表白血病、黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、腦癌、卵巢癌、乳房癌、前列腺癌和腎癌。在所需濃度范圍內(nèi)，只有一種細胞類型顯示所需的非拮抗效應；然而，優(yōu)選的是至少兩種細胞系顯示該效應，更優(yōu)選三種細胞系，更優(yōu)選五種細胞系，更優(yōu)選十種細胞系。細胞系可以是已建立的腫瘤細胞系或來自患者樣本的原代培養(yǎng)細胞。細胞系可來自任何物種，但優(yōu)選來自哺乳動物，特別是人。通過在各種實驗條件下選擇，和/或外源性遺傳物質(zhì)的加入或缺失，可遺傳改變細胞系。細胞系可通過任何基因轉(zhuǎn)染技術轉(zhuǎn)染，包括但不限于基于病毒或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染技術。修飾作用可包括編碼特殊蛋白質(zhì)或肽表達的cDNA，調(diào)節(jié)因子如啟動子或增強子序列或反義DNA或RNA的轉(zhuǎn)染?；蚬こ探M織培養(yǎng)細胞系可包括含或不含腫瘤抑制基因的細胞系，即基因如p53、pTEN和p16；以及通過使用顯性陰性方法，基因插入方法和其它選擇方法產(chǎn)生的細胞系。為了試驗抗腫瘤藥物，可使用優(yōu)選的組織培養(yǎng)細胞系定量細胞生存力，包括但不限于，H460、MCF-7、SF-268、HT29、HCT-116、LS180、B16-F10、A549、Capan胰腺、CAOV-3、IGROV1、PC-3、MX-1和MDA-MB-231。
在一個優(yōu)選的實施例中，給定的作用(fa)是指細胞毒試劑應用于細胞培養(yǎng)后的細胞死亡或細胞停滯。例如，使用以下方法可測定細胞死亡或生存力。

優(yōu)選“MTT”試驗。
可確定兩種或多種藥物的非拮抗比例治療除癌癥外的疾病適應癥，該信息可用于制備治療這些疾病的兩種或多種藥物的治療性制劑。對于體外試驗，假設許多可測定的終點與具體疾病的治療相關，可選擇該終點以定義藥物的協(xié)同作用。
如上所述，采用“相關”細胞進行細胞培養(yǎng)體外試驗。細胞的選擇取決于藥物的預期治療應用。由機械或化學破裂腫瘤樣本為單一、全細胞產(chǎn)生的“腫瘤細胞勻漿”進行個體患者活組織檢查或整體腫瘤的體外研究。
在一個優(yōu)選的實施例中，給定作用(fa)是指細胞毒試劑應用于“相關”細胞培養(yǎng)或“腫瘤細胞勻漿”后的細胞死亡或細胞停滯(見實施例4)?？墒褂迷S多本領域已知方法測定細胞死亡或生存力。優(yōu)選″MTT″試驗(Mosmann，J.ImmunoL Methods(1983)65(1-2)55-63)，如實施例4所述。
基于脂質(zhì)的傳遞載體的制備用于本發(fā)明優(yōu)選的脂質(zhì)載體是脂質(zhì)體。如《脂質(zhì)體合理的設計》(LiposomesRational Design)(A.S.Janoff編，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)所述，或通過本領域技術人員已知的附加技術制備脂質(zhì)體。適用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體包括大單室脂質(zhì)體(LUVs)、多室脂質(zhì)體(MLVs)、小單室脂質(zhì)體(SUVs)和交指型融合脂質(zhì)體。
本發(fā)明使用的脂質(zhì)體可由“低膽固醇”制備。這種脂質(zhì)體是“無膽固醇”，或“大體上不含膽固醇”，或“基本上沒有膽固醇”的。本文所用關于脂質(zhì)體的術語“無膽固醇”是指在沒有膽固醇情況下制備的脂質(zhì)體。術語“大體上不含膽固醇”可存在的膽固醇的量不足以明顯改變脂質(zhì)體的相轉(zhuǎn)變性質(zhì)(一般小于20摩爾％膽固醇)。脂質(zhì)體中少于20摩爾％膽固醇的摻入，當用大于20摩爾％膽固醇制備脂質(zhì)體時不能最佳保持藥物的保留。優(yōu)選地，本發(fā)明脂質(zhì)體含有一些膽固醇。此外，用少于20摩爾％膽固醇制備的脂質(zhì)體顯示窄的相轉(zhuǎn)變溫度，可利用該性質(zhì)制備由于應用熱而釋放包載藥物的脂質(zhì)體(熱敏脂質(zhì)體)。本發(fā)明脂質(zhì)體還含有治療脂質(zhì)，例子包括醚脂質(zhì)、磷脂酸、磷酸酯、神經(jīng)酰胺和神經(jīng)酰胺類似物、鞘氨醇和鞘氨醇類似物和含絲氨酸脂質(zhì)。
也可用表面穩(wěn)定的親水性聚合物-脂質(zhì)綴合如聚乙二醇-DSPE制備脂質(zhì)體，以增加循環(huán)時間。也可在脂質(zhì)體制劑中加入負電荷脂質(zhì)如磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)，以增加載體的循環(huán)時間?？刹捎眠@些脂質(zhì)代替親水性聚合物-脂質(zhì)綴合作為表面穩(wěn)定劑。本發(fā)明優(yōu)選實施例使用含PG或PI的低膽固醇脂質(zhì)體來防止聚集，因而增加了載體的血液保留時間。
在一個實施例中，本發(fā)明脂質(zhì)體組成優(yōu)選用于治療癌癥，包括多藥抗性的癌癥如5-FU抗性的結(jié)腸直腸癌。通過給予本發(fā)明脂質(zhì)體使包載的藥物傳遞至腫瘤部位。優(yōu)選脂質(zhì)體直徑小于300nm。最優(yōu)選脂質(zhì)體直徑小于200nm。由于開窗術或內(nèi)皮中的缺口，腫瘤血管系統(tǒng)通常比正常血管系統(tǒng)滲漏。這就使200nm或更小直徑的傳遞載體透過不連續(xù)的內(nèi)皮細胞層和環(huán)繞供血血管的下層基底膜至腫瘤。滲過后傳遞載體在腫瘤部位中的選擇性聚積可增加抗癌藥物的傳遞和療效。
可采用多種方法包封活性藥物到脂質(zhì)體中?！鞍狻卑ㄋ幬锱c基于脂質(zhì)的傳遞載體的共價或非共價結(jié)合。例如，這可通過藥物與脂質(zhì)體外層或脂質(zhì)層或脂質(zhì)體內(nèi)包封的藥物的相互作用，脂質(zhì)體的不同部分之間達到平衡。因此，共價或非共價的相互作用，藥物的包封可通過結(jié)合藥物通過與脂質(zhì)體的雙層的相互作用，通過與脂質(zhì)成分或脂質(zhì)體內(nèi)水相中包載或內(nèi)部水相或雙層之間的平衡?！拜d藥”是指將一種或多種藥物包封入傳遞載體的作用。
可通過包封于不同的傳遞載體或包封于相同的傳遞載體中，包封所需的組合物。當需要包封于不同的脂質(zhì)體中時，每個脂質(zhì)體的脂質(zhì)組成可明顯不同，以得到合適的藥物動力學。通過改變載體組成，包封藥物的釋放速率可使所需比例的藥物傳遞至腫瘤部位。改變釋放速率的方法包括增加脂質(zhì)載體的?；滈L度，以改善藥物保留；控制表面移植的親水性聚合物如脂質(zhì)體膜外的PEG的交換；和摻入膜穩(wěn)定劑如固醇或鞘磷脂到膜中。如果希望以具體的藥物比例給予第一和第二種藥物，如果第二種藥物在第一種藥物的脂質(zhì)體組成(例如DMPC/Chol)中保留較差，那么可通過將第二種藥物包封于由增加的酰基鏈長度的脂質(zhì)組成(例如DSPC/Chol)的脂質(zhì)體中，以改善藥物動力學，這對于本領域技術人員是顯而易見的。當包封于不同的脂質(zhì)體時，應該承認對于個體患者，在給藥前，通過結(jié)合每種脂質(zhì)體包封藥物合適的量，得到水溶性喜樹堿與氟嘧啶的比例，該比例在患者特異性基礎上以提供最佳治療活性時已經(jīng)確定。另一方面，兩種或多種藥物可包封于相同的脂質(zhì)體內(nèi)。
包封技術取決于傳遞載體的性質(zhì)。例如，可使用被動和主動包載方法將治療藥物包載于脂質(zhì)體中。包封活性藥物進入脂質(zhì)體的被動方法涉及在脂質(zhì)體制備期間包封藥物。這包括如Bangham等(J.Mol.Biol.(1965)12238)所述的被動包載方法。該技術形成多室脂質(zhì)體(MLVs)，多室脂質(zhì)體擠壓后可轉(zhuǎn)化為大單室脂質(zhì)體(ULVs)或小單室脂質(zhì)體(SUVs)。被動包封其它合適的方法包括如Deamer和Bangham(Biochim.Biophys.Acta(1976)443629)所述的醚注射技術和如Szoka和Paphadjopoulos(P.N.A.S.(1978)754194)所述的反相蒸發(fā)技術。
主動包封方法包括美國專利5,616,341、5,736,155和5,785,987所述的pH梯度包載技術和主動金屬包載方法。pH梯度載藥優(yōu)選的方法是基于檸檬酸的載藥方法，利用檸檬酸作為pH4.0的內(nèi)相緩沖液和一種中性外相緩沖液。建立和維持穿過脂質(zhì)體的pH梯度所采用的其它方法涉及使用離子載體，離子載體可插入脂質(zhì)體膜，轉(zhuǎn)運離子穿過膜以交換質(zhì)子(見美國專利5,837,282)。也可使用最新技術，該技術在沒有離子載體的情況下，通過絡合利用過渡金屬驅(qū)動藥物吸收入脂質(zhì)體中。該技術依賴于形成藥物-金屬絡合物而不是建立pH梯度來驅(qū)動藥物的吸收。
基于金屬的主動載藥一般使用具有被動包封金屬離子的脂質(zhì)體(有或沒有主動包載治療藥物)。使用金屬離子的各種鹽，假定鹽是藥學上可接受的鹽并且溶于水性溶液。選擇主動包載的藥物，該藥物能夠與金屬離子形成絡合物，因而在脂質(zhì)體內(nèi)絡合時保留，但不與金屬離子絡合時也能載入脂質(zhì)體中。能與金屬協(xié)同的藥物一般包含配位點如胺、羰基、醚、酮、酰基、乙炔、鏈烯基、巰基、羥基、鹵素基團或其它能夠供給電子至金屬離子而與金屬離子形成絡合物的合適的基團。結(jié)合金屬的活性藥物的例子包括但不限于喹諾酮如氟喹諾酮；喹諾酮如萘啶酮酸；蒽環(huán)類抗生素如阿霉素、柔紅霉素和伊達比星；氨基糖苷如卡那霉素；和其它抗生素如博來霉素、絲裂霉素C和四環(huán)素；氮芥類如環(huán)磷酰胺、縮氨基硫脲、吲哚美辛、硝普鹽；喜樹堿如托泊替康、伊立替康、勒托替康、9-氨基喜樹堿、9-硝基喜樹堿和10-羥基喜樹堿；鬼臼毒素如依托泊苷。外部介質(zhì)中加入藥物后，在合適的溫度下孵育混合物，可建立藥物的攝取。取決于脂質(zhì)體的組成、外部介質(zhì)的溫度和pH、藥物的化學性質(zhì)，藥物的攝取可在幾分鐘或幾小時內(nèi)發(fā)生。確定在脂質(zhì)體內(nèi)藥物和金屬之間的協(xié)同是否發(fā)生的方法包括本領域技術人員已知的分光光度分析和其它常規(guī)技術。優(yōu)選地，本發(fā)明脂質(zhì)體含有金屬離子溶液。優(yōu)選金屬離子是銅。
也可以結(jié)合被動和主動包封方法，以制備含有多于一種包封藥物的脂質(zhì)體制劑。
體內(nèi)給予本發(fā)明的組合物如上所述，本發(fā)明傳遞載體組合物可給予溫血動物，包括人和家禽類。對于治療人體疾病，合格的醫(yī)師將利用已建立的方案，確定如何施用本發(fā)明組合物的劑量、方案和給藥途徑。也可應用劑量按比例上升，使包封在本發(fā)明傳遞載體組合物中的藥物對受試者健康組織的毒性降低。
優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物非腸道給藥，即如動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。更優(yōu)選地，通過推注靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥本發(fā)明藥物組合物。例如，見Rahman等，美國專利3,993,754；Sears，美國專利4,145,410；Papahadjopoulos等，美國專利4,235,871；Schneider，美國專利4,224,179；Lenk，等，美國專利4,522,803；和Fountain等，美國專利4,588,578，參考包括于此。
在其它方法中，本發(fā)明藥物或化妝品制劑也可通過將制劑直接應用于組織使其接觸靶組織?？赏ㄟ^局部“開放式”或“封閉式”方案進行應用?！熬植俊笔侵笇⒍喾N藥物制劑直接應用到暴露于環(huán)境的組織如皮膚、口咽、外聽覺道等?！伴_放式”方案包括切開患者的皮膚，使施加藥物制劑的下面的組織直接可見。這通常是通過外科手術實現(xiàn)的，例如胸廓切開術到達肺、腹部剖腹術到達腹部內(nèi)臟或其它直接手術方法以到達靶組織。“封閉式”方案是侵入性方案，其內(nèi)部的靶組織不直接可見，但通過皮膚上的小傷口插入裝置才能到達靶組織。例如，通過針灌洗將制劑施用到腹膜。另一方面，制劑可通過內(nèi)窺鏡裝置施用。
根據(jù)標準技術制備含有本發(fā)明傳遞載體的藥物組合物，可包括水、緩沖液、0.9％鹽水、0.3％甘氨酸、5％葡萄糖等，包括糖蛋白如白蛋白、脂蛋白、球蛋白，以增加穩(wěn)定性?？赏ㄟ^常規(guī)、眾所周知的滅菌技術消毒這些組合物。得到的水性溶液包裝后使用或在無菌狀態(tài)下過濾并凍干，凍干制劑在施用前結(jié)合無菌水溶液。組合物可包含藥學上可接受的附加物質(zhì)，以接近生理狀態(tài)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、滲透性調(diào)節(jié)劑等，例如，醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。另外，傳遞載體混懸液可包含脂質(zhì)保護劑，在儲存中保護脂質(zhì)免受自由基和脂質(zhì)過氧化的損傷。親脂性自由基淬滅劑如α生育酚和水溶性鐵離子特異螯合劑如鐵氧胺是合適的。還可以通過標準技術結(jié)合本發(fā)明組合物給予甲酰四氫葉酸，以增加給予的氟嘧啶的壽命。
在藥物制劑中傳遞載體的濃度可廣泛變化，例如從小于約0.05重量％，通常在或至少約2-5重量％到10-30重量％，并且，根據(jù)選擇的給藥的具體方式，主要根據(jù)液體體積、粘度等選擇濃度范圍。例如，可增加濃度以降低與治療相關的液體負荷。另一方面，可稀釋由刺激性脂質(zhì)組成的傳遞載體至低濃度，以緩解給藥部位的炎癥。對于診斷而言，給予的傳遞載體的量取決于所用的具體標記、所診斷的疾病狀態(tài)以及臨床醫(yī)師的判斷。
優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物靜脈內(nèi)給藥。傳遞載體制劑的劑量將取決于藥脂比以及基于患者的年齡、體重和狀態(tài)的給藥醫(yī)師的觀點。
除了藥物組合物，還可以制備合適的獸醫(yī)用制劑，以適合于受試動物的方式給藥。優(yōu)選的獸醫(yī)受試動物包括哺乳動物類，例如除人外的靈長類動物，狗、貓、牛、馬、羊和家禽。受試動物還包括實驗室動物，例如，尤其是大鼠、兔子、小鼠和豚鼠。
試劑盒可分別在治療藥物與合適的傳遞載體可穩(wěn)定結(jié)合的各個組合物中配制本發(fā)明組合物中的治療藥物?？蓪⑦@些組合物分別給予受試者，以協(xié)調(diào)傳遞載體的藥物動力學，維持在治療靶點給予的治療藥物的比例。因此，可構(gòu)建試劑盒，包括在不同的容器中，含有與至少一種第一治療劑穩(wěn)定結(jié)合傳遞載體的第一種組合物，在第二個容器中，含有與至少一種第二治療劑穩(wěn)定結(jié)合傳遞載體的第二種組合物。然后容器可包裝于試劑盒中。
試劑盒也可包括關于組合物對受試者的給藥方式的使用說明，至少包括要給予的每種組合物的量的比例的說明。另外，或此外，預先測定每個容器中的組合物量，以使一個容器的內(nèi)容物與另一個容器的內(nèi)容物組合代表正確的比例，構(gòu)建試劑盒。另外，或此外，用量尺標記容器，根據(jù)可見的刻度分配合適的用量。容器本身可用于給藥；例如，試劑盒可包含注射器中的合適量的每個組合物。還可包裝含有預先配制正確比例的治療藥物的制劑，從預包裝于試劑盒中的注射器中直接施用制劑。
提供以下實施例是為了說明而非限制本發(fā)明。
實施例大單室脂質(zhì)體的制備方法除非另有說明，脂質(zhì)溶解于氯仿溶液中，接著在氮氣下干燥并置于真空泵，以除去溶劑。加入痕量的放射性脂質(zhì)14C-CHE以定量脂質(zhì)。將得到的脂質(zhì)膜置于高真空下最少2小時。在指定溶液中水解脂質(zhì)膜，形成大單室脂質(zhì)體(MLVs)。所得制劑使用擠壓裝置(Lipex Biomembranes，Vancouver，BC)擠壓通過疊加的聚碳酸酯濾膜10次，得到平均脂質(zhì)體粒徑為80-150nm。脂質(zhì)體的所有組成脂質(zhì)以摩爾％記錄。
載藥量的定量方法在載藥開始后的不同的時間點，移去等分部分并通過Sephadex G-50自旋柱，從包封藥物中分離游離藥物。對于特定體積的洗脫劑，加入TritonX-100或N-ocyl β-D-葡糖吡喃糖苷(OGP)溶解脂質(zhì)體。加入洗滌劑后，加熱混合物至洗滌劑的濁點，室溫下冷卻后測定吸光度或熒光。與標準曲線比較，計算藥物濃度。液相閃爍計數(shù)儀測定脂質(zhì)水平。
實施例1ACPT-11和FUDR雙包載脂質(zhì)體中(脂質(zhì)膜法)為了確定是否能產(chǎn)生含有水溶性喜樹堿和氟嘧啶的可使用的脂質(zhì)體，含有被動包載的FUDR的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體主動包載CPT-11。
在氯仿中溶解DSPC至50mg/ml，膽固醇至50mg/ml，在氯仿/甲醇/水(50/10/1)中溶解DSPG至25mg/ml，制備脂質(zhì)膜?；旌现|(zhì)，除去溶劑后，得到的脂質(zhì)膜用由pH 7.4的100mM葡糖酸銅、220mM三乙醇胺(TEA)和30mg/mL(122mM)的FUDR(含痕量3H-FUDR)組成的溶液在70℃下水解。在70℃下擠壓所得MLVs，形成LUVs。用QELS(準彈性光散射)分析測定所得脂質(zhì)體的平均粒徑約為100nm+/-20nm。接著，使用手提式切向流柱將脂質(zhì)體緩沖交換入pH 7.4的300mM蔗糖、20mM Hepes、30mMEDTA(SHE)，然后進入生理鹽水，因而除去任何未包封的FUDR和Cu(葡糖酸)2。
這些脂質(zhì)體中加入CPT-11，以使FUDR與CPT-11的摩爾比為1∶1。以起始CPT-11與脂質(zhì)比為0.1∶1，50℃下樣品孵育10分鐘，促進CPT-11包載入脂質(zhì)體。載藥后，冷卻至室溫，樣品交換入鹽水(0.9％氯化鈉注射液，USP；pH 5.5，Baxter)，切向流透析除去EDTA和未包封藥物。370nm處測定吸收度，對照標準曲線得到CPT-11的載藥程度。液相閃爍計數(shù)測定各個時間點的藥脂比，確定脂質(zhì)濃度(14C-CHE)和FUDR濃度(3H-FUDR)。
圖1顯示50℃，CPT-11載藥過程中，各個時間點的平均藥/脂比(+/-標準差)。由圖1可見，以起始CPT-11與脂質(zhì)的比例為0.1∶1，CPT-11可主動包載入DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體中，包含被動包載FUDR，最終的CPT-11與脂質(zhì)比約為0.8∶1。這些結(jié)果證明，包封有FUDR的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體可有效地雙包載CPT-11。
實施例1B有機乳化法制備CPT-11和FUDR包載入脂質(zhì)體中稱量所需量的脂質(zhì)DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10)，溶解于二氯甲烷/甲醇/水混合液(93/5/2)中，最終濃度為125mg/mL。溶解的脂質(zhì)置于玻璃Applikon生物反應器中，混合液中緩緩通入氮氣。Applikon生物反應器中泵入100mM葡糖酸銅/180mM TEA緩沖液，以使最終脂質(zhì)濃度為75mg/mL。銅緩沖液泵入生物反應器的同時，連續(xù)通入氮氣下，用重型漩渦混合器攪拌整個混合液最少90分鐘。整個過程中，通過用鉤鉤住生物反應器的外部水浴使生物反應器的溫度維持在70℃。
然后，通過溫度，肉眼觀察混合物尋找脂質(zhì)體形成，按順序是油包水乳劑、“半流體”相、半流體相的“破裂”和建立均質(zhì)脂質(zhì)體混懸液。70℃加壓下，粗脂質(zhì)體擠壓通過0.1μm孔徑的濾膜，直到平均脂質(zhì)體粒徑小于150nm，優(yōu)選在110到125nm之間，90％＜200nm(動態(tài)光散射分析)。室溫下，使用切向流中空纖維柱，用10體積的蔗糖磷酸鹽EDTA緩沖液，過濾除去外部的銅。
氟尿苷和伊立替康HCl三水合物的共包載要求在pH7.0將氟尿苷溶解于蔗糖磷酸鹽EDTA緩沖液中，然后，劇烈攪拌下，在溶解的氟尿苷中加入伊立替康HCl三水合物，如果需要可加熱至50℃以溶解伊立替康HCl三水合物。在玻璃容器中，在所需的濃度下，將溶解于緩沖液中的藥物加入到脂質(zhì)體中。連續(xù)攪拌該系統(tǒng)，50℃下載藥進行1小時。脂質(zhì)體-藥物混合物冷卻至室溫，然后過濾。室溫下，使用切向流中空纖維柱，用10體積的蔗糖磷酸鹽緩沖液過濾除去未包封的藥物。
用蔗糖磷酸鹽緩沖液稀釋載藥脂質(zhì)體，至5mg/mL伊立替康HCl三水合物與氟尿苷的摩爾比為1∶1。然后，稀釋液無菌過濾通過0.2μm的膜。
實施例2使用不同組成的脂質(zhì)體內(nèi)相溶液制備雙載藥脂質(zhì)體為了檢測脂質(zhì)體內(nèi)相溶液對雙載藥的影響，制備了含有各種銅溶液的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體。測定FUDR被動包載和CPT-11的載藥程度。
如上所述制備脂質(zhì)膜，除了脂質(zhì)膜的水化是用1mL的100mM葡糖酸銅，220mM TEA，pH 7.4；100mM CuSO4，265mM TEA，pH 7.4；或含有大約25mg/ml FUDR(含痕量3H-FUDR)的150mM酒石酸銅，20mM Hepes，pH7.4。70℃擠壓得到的MLVs。通過QELS(準彈性光散射)分析測定每個樣品的平均粒徑約為100nm+/-20nm。使用手提式切向流柱將脂質(zhì)體緩沖交換進入SHE，pH 7.4，然后交換入HBS，pH 7.4。
如上所述進行CPT-11的攝取實驗。以起始CPT-11與脂質(zhì)摩爾比為0.1∶1，加入CPT-11。50℃下預熱樣品1分鐘促進載藥。使用液相閃爍計數(shù)儀測定脂質(zhì)濃度(14C-CHE)和FUDR濃度(3H-FUDR)，產(chǎn)生各個時間點的藥脂比。370nm處測定吸光度，由標準曲線以得到CPT-11的濃度。
圖2A表明，含有被動包載FUDR的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體，使用葡糖酸銅或硫酸銅作為脂質(zhì)體內(nèi)相溶液，顯示足夠的CPT-11載藥。然而，葡糖酸銅似乎是主動包載CPT-11入這種脂質(zhì)體的稍稍更有效的溶液。相似地，從雙載藥脂質(zhì)體中FDUR隨時間的釋放與用葡糖酸銅或硫酸銅制備的脂質(zhì)體類似(圖2B)，兩者都顯示藥物的梯度釋放。
如圖3所示，僅有酒石酸銅不適合作為雙包載CPT-11進入含F(xiàn)UDR的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體內(nèi)相溶液。由圖3明顯可見，CPT-11不能包載入含有被動包封FUDR和150mM酒石酸銅的DSPC/DSPG/Chol脂質(zhì)體。
實施例3膽固醇的存在對CPT-11和FUDR的血漿濃度的影響本領域已知膽固醇和其它固醇常規(guī)用于傳遞載體的制劑，如脂質(zhì)體，以擴大相轉(zhuǎn)變溫度的范圍，降低脂質(zhì)聚集，可能改變傳遞載體的循環(huán)時間。通常認為，在脂質(zhì)體制劑中，需要大于30mol％的膽固醇以達到此固醇的益處。為了研究膽固醇含量對雙載藥脂質(zhì)體的藥物保留和藥物動力學的影響，使用各種膽固醇量制備了DSPC/DSPG/Chol脂質(zhì)體。首先，被動包載氟嘧啶進入各個脂質(zhì)體，然后，主動包載水溶性喜樹堿。確定Balb/c小鼠血漿中每種藥物的藥脂比，以測定體內(nèi)每種制劑脂質(zhì)體藥物保留一定時間的程度。
DSPC和膽固醇溶解于氯仿，DSPG溶解于氯仿/甲醇/水(16/8/1)，制備脂質(zhì)膜。加入痕量14C-CHE作為脂質(zhì)體脂質(zhì)標記，以摩爾比DSPC/Chol/DSPG(75∶5∶20)，DSPC/Chol/DSPG(70∶10∶20)，DSPC/Chol/DSPG(65∶15∶20)和DSPC/Chol/DSPG(60∶20∶20)，混合脂質(zhì)。除去溶劑后，在含有25mg/ml FUDR(含痕量3H-FUDR)的250mM CuSO4中水化脂質(zhì)膜。70℃下擠壓所得MLVs。用QELS(準彈性光散射)分析測定每個樣品的平均粒徑約為100nm+/-20nm。然后，使用手提式切向流柱使脂質(zhì)體緩沖交換進入SHE，pH 7.4。
類似于上述方法，50℃下，脂質(zhì)體包載CPT-115分鐘。如實施例1所示，測定CPT-11、FUDR和脂質(zhì)水平。包載CPT-11后，冷卻至室溫，雌性Balb/c小鼠尾靜脈注射340μlmol脂質(zhì)/kg、34μmol FUDR/kg和34μmolCTP-11/kg的等分樣品。靜脈內(nèi)給藥后1、4和24小時，心臟穿刺收集血液并置于涂有EDTA的微容器中。各個時間點用3只小鼠。樣品離心分離血漿并小心將血漿轉(zhuǎn)移至另一個試管中。由液相閃爍計數(shù)儀測定血漿脂質(zhì)和FUDR濃度，由高效液相色譜法(HPLC)測定血漿CPT-11的濃度。
圖4A說明靜脈內(nèi)給予Balb/c小鼠以包封CPT-11和FUDR的脂質(zhì)體后，CPT-11與脂質(zhì)的比例(+/-標準差)作為時間的函數(shù)。該圖表明，隨著脂質(zhì)體膽固醇濃度的增加，體內(nèi)CPT-11的脂質(zhì)體保留相應增加，除了20摩爾％膽固醇例外，與15摩爾％相比，CPT-11水平降低，釋放較快。圖4B結(jié)果顯示在特定時間，相應的FUDR與脂質(zhì)的比例(+/-標準差)作圖，表明隨著膽固醇含量從5增加到20摩爾％，10摩爾％膽固醇比5摩爾％保留更佳，體內(nèi)FUDR保留顯著降低。這些結(jié)果還表明，使用約15摩爾％膽固醇時，含有FUDR和CPT-11的DSPC/DSPG/Chol脂質(zhì)體顯示最佳的CPT-11血漿水平，使用約15摩爾％膽固醇時，F(xiàn)UDR血漿濃度最佳。因此，為了共配制DSPC/DSPG脂質(zhì)體以促進高濃度的FUDR和CPT-11傳遞至腫瘤部位，似乎需要約10-15摩爾％膽固醇以維持FUDR和CPT-11合適的藥物保留和持久的藥物釋放。
實施例4顯示非拮抗和拮抗效應的CPT-11和FUDR的組合兩種或多種藥物的許多組合具有顯示協(xié)同作用的能力。相似地，相同兩種或多種藥物的組合可顯示累加或拮抗的相互作用，視所用的藥物的濃度而定。為了確定產(chǎn)生協(xié)同作用的水溶性喜樹堿與氟嘧啶的比例，體內(nèi)試驗了FUDR和CPT-11各種組合的細胞毒效應。更具體地說，在寬的藥物濃度范圍內(nèi)，鑒定了顯示協(xié)同作用的組合。
在HT-29人結(jié)腸直腸腺癌細胞、H460人大細胞癌細胞和HCT-116人結(jié)腸直腸癌細胞中，以10∶1、5∶1、1∶1、1∶5和1∶10摩爾比，用FUDR/CPT-11進行累加、協(xié)同和拮抗效應的測定。使用標準基于四氮唑鹽的比色MTT存活率試驗(Mosmann等，J.Immunol Methods(1983)65(1-2)55-63)測定受損細胞的讀數(shù)。簡單地說，活細胞還原四氮唑鹽，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H四唑溴鹽(MTT)形成藍色甲，甲可用分光光度法讀數(shù)。細胞，如本文所用HT-29細胞系，在25cm2培養(yǎng)瓶中生長和傳代(代數(shù)＜20)，重懸于新鮮細胞培養(yǎng)基中，以1000細胞/孔，100μL/孔濃度加到96-孔培養(yǎng)板中。37℃，5％CO2下培養(yǎng)細胞24小時。用已知技術勻漿組織，從患者腫瘤或活細胞檢查也可制備所述單細胞懸液。第二天，在12孔細胞培養(yǎng)板中準備連續(xù)的藥物稀釋液。用新鮮細胞培養(yǎng)液稀釋前準備的各種溶液。使用拉丁方設計或″棋盤″稀釋方法，在雙藥物組合的特定固定比例下，將藥物施加到每個藥物(20μL)的合適或特定的孔中?？偟目左w積用新鮮培養(yǎng)液加到200μL。藥物接觸為72小時。
接觸藥物后，以50μL/孔，每個孔中加入MTT試劑(1mg/mL于RPMI中)，培養(yǎng)3-4小時。然后，吸出每孔中的內(nèi)容物，每孔中加入150μL二甲基亞砜(DMSO)以破裂細胞并溶解細胞內(nèi)的甲沉淀。在板振蕩器上振蕩96孔板，在波長570nm處微型板分光光度儀上讀數(shù)。記錄光密度(OD)讀數(shù)，所有含細胞的孔減去空白孔(只含有培養(yǎng)液)的OD值。接觸藥物后的細胞存活率基于對照孔(未接觸藥物的細胞)的百分率。所有孔為三復孔進行并計算平均值。
使用Calcusyn測定每個FUDR/CPT-11劑量的組合指數(shù)。Calcusyn是基于Chou和Talalay的劑量-效應分析理論，其中，使用“半數(shù)效應方程”計算許多本領域中廣泛使用的生物化學方程。該方程的衍生產(chǎn)生高階方程如用于計算組合指數(shù)(CI)的方程。如上所述，CI可用于確定多于一種藥物的組合以及每種組合的不同比例是否是拮抗的(CI＞1.1)，累加的(0.9≤CI≥1.1)或協(xié)同的(CI＜0.9)。典型的CI圖以CI為y軸，以受損細胞的比例或受影響的分數(shù)(fa)為x軸。圖5中的數(shù)據(jù)，以CI對受損的HT-29細胞的分數(shù)作圖，清楚地表明FUDR和CPT-11的特定組合是拮抗的，而另一些是協(xié)同或累加的。當FUDR∶CPT-11比為5∶1或1∶1時，在受作用分數(shù)值(0.2-0.8)的整個范圍內(nèi)觀察到協(xié)同作用。這表明5∶1或1∶1比例是協(xié)同的，與所用每個藥物的濃度無關。然而，在fa值低于0.76時10∶1的比例是非拮抗的，fa值小于0.62時，1∶5摩爾比的FUDR/CPT-11是非拮抗的，因而表明觀察到這些比例的協(xié)同作用依賴于所用藥物的濃度。在相當大的fa值范圍內(nèi)(大于50％)，F(xiàn)UDR∶CPT-111∶10的比例是拮抗的。
用于確定最佳藥物比例的進一步表示，制得相對協(xié)同作用圖，圖5D。該分析方法用于從許多細胞類型確定一般協(xié)同的藥物∶藥物比例。圖5D由多種細胞類型以1∶5、1∶1和1∶10摩爾比匯制的數(shù)據(jù)集構(gòu)成。橫坐標顯示的相對協(xié)同作用值以得自CalcuSyn的CI值計算，通過從原始CI值減去1歸一化為0，即CI值為0、1和2分別等于相對協(xié)同作用值-1、0和1。這種數(shù)據(jù)形式更清楚地表明，在一些細胞類型中，在所評價的比例下，觀察到協(xié)同作用(向左側(cè)延伸的柱條)，而另一些則是拮抗的(向右側(cè)延伸的柱條)。此外，該分析方法有利于確定在1∶1比例下，顯示相似協(xié)同反應的腫瘤類型，即用結(jié)腸直腸細胞系，結(jié)腸-26，HCT-116，HT-29和LS180觀察到相似水平的相對協(xié)同作用?；谶@些結(jié)果，在以下實施例中選擇1∶1摩爾比的FUDR∶CPT-11進行藥物動力學和效果研究，因為此比例顯示不依賴于濃度的協(xié)同作用。這是重要的，因為體內(nèi)給藥后藥物的濃度可能變化。
實施例5維持體內(nèi)藥物比例雙載藥脂質(zhì)體中，為了確定體內(nèi)是否能夠維持水溶性喜樹堿和氟嘧啶的協(xié)同作用比例，小鼠靜脈內(nèi)給予含包封的FUDR和CPT-11的DSPC/DSPG/Chol脂質(zhì)體，監(jiān)測一定時間內(nèi)血漿藥物/藥物比。
如上所述，在實施例4中鑒定了在1∶1摩爾比下是協(xié)同的，所以，將FUDR和CPT-11配制入DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體中。在由100mM Cu(葡糖酸)2，220mM TEA，pH 7.4和30mg/mL FUDR(含痕量3H-FUDR)組成的溶液中水化脂質(zhì)膜。70℃下擠壓得到的MLVs。接著，將脂質(zhì)體緩沖交換入SHE，pH 7.4，通過切向流透析，除去任何未包封的FUDR和Cu(葡糖酸)2。
以起始CPT-11與脂質(zhì)的比例為0.12∶1，將CPT-11加到脂質(zhì)體中。50℃孵育樣品10分鐘，促進CPT-11包載入脂質(zhì)體中。載藥后，樣品交換入鹽水(0.9％氯化鈉注射液，USP；pH 5.5，Baxter)，通過切向流透析除去EDTA和未包封的藥物。370nm處測定吸光度，由標準曲線得到CPT-11的載藥量。用液相閃爍儀測定FUDR和脂質(zhì)的水平。
CD-1或SCID-Rag2M小鼠尾靜脈注射上述制劑。脂質(zhì)體制劑的劑量為8.38mg/kg的FUDR和20mg/kg的CPT-11。對于CD-1小鼠，在FUDR和CPT-111∶1下，還進行了雙載藥脂質(zhì)體與游離藥物混合物的比較。給予小鼠前，用鹽水稀釋游離藥物混合物。在靜脈內(nèi)給藥后的指定時間點，心穿刺收集血樣(每個時間點3個小鼠)并裝入涂有EDTA的微型容器中。離心樣品以分離血漿，血漿轉(zhuǎn)移至另一個試管中。用液相閃爍計數(shù)儀定量血漿中放射性標記的脂質(zhì)和FUDR。用HPLC定量CPT-11的血漿水平。
圖6A顯示，靜脈內(nèi)給予CD-1小鼠上述脂質(zhì)體后，不同時間點FUDR的血漿水平約等于CPT-11的血漿水平，F(xiàn)UDR和CPT-11的血漿水平能有效維持在1∶1摩爾比。相反，F(xiàn)UDR/CPT-11的游離藥物混合物給藥后，從起始1∶1摩爾比快速變化。圖6B相似地表明，給予SCID-Rag2M小鼠后，F(xiàn)UDR和CPT-11的血漿水平一定時間內(nèi)維持在1∶1摩爾比。數(shù)據(jù)點代表在特定時間點測定的血漿中CPT-11/FUDR的摩爾比(+/-標準差)。這些結(jié)果清楚地表明，F(xiàn)UDR和CPT-11包載入本發(fā)明脂質(zhì)體中，使血漿中這些藥物的協(xié)同作用比有效地維持一定時間，而游離藥物混合物則導致從協(xié)同殺死癌細胞所需的最佳比例快速和無控制地改變藥物/藥物比例。因此，為了體內(nèi)充分傳遞所需比例的FUDR和CPT-11，最好將這些藥物配制入基于脂質(zhì)的傳遞載體中。
實施例6同時包封CPT-11和FUDR開發(fā)了共包封CPT-11和FUDR的可選方法，用于同時包載兩種藥物。DSPC和膽固醇各自以50mg/ml溶解于氯仿中，DSPG以25mg/ml溶解于氯仿/甲醇/水(50/10/1)中，制備脂質(zhì)膜。然后，脂質(zhì)以合適的量結(jié)合在一起，產(chǎn)生DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)混合物，用14C-CHE標記。N2氣流下除去溶劑，直到很少的溶劑殘留。然后，將脂質(zhì)膜置于真空泵在真空下過夜，除去任何殘留溶劑。70℃下，在4mL 100mM Cu(葡糖酸)2，220mMTEA，pH 7.4中再水化脂質(zhì)膜，得到的MLVs70℃下擠壓通過兩層100nm濾膜共8次。擠壓前取等分試樣，測定脂質(zhì)制劑的比活。QELS(準彈性光散射)分析測定每個樣品的平均粒徑為100nm+/-20nm。然后，使用切向流柱，將脂質(zhì)體緩沖交換入150mM NaCI，20mM Hepes，pH 7.4(HBS)。
以下進行了CPT-11/FUDR的攝取實驗25μmol脂質(zhì)，3μmol CPT-11和60μmol FUDR(含痕量3H-FUDR)各自在50℃下孵育，然后，混合至總體積500μL。在混合后的各時間點，移去等分部分并用1mL Sephadex G-50柱將外相脂質(zhì)體溶液交換為鹽水。使用雙標記液相閃爍計數(shù)儀測定洗脫液的藥脂比，以確定脂質(zhì)和FUDR濃度。370nm處測定吸收度，由標準曲線定量CPT-11。CPT-11的UV測定條件如下每個脂質(zhì)體樣品的100μL等分試樣溶解于100μL 10％Triton X-100+800μL 50mM檸檬酸三鈉/檸檬酸，15mM EDTA，pH 5.5，然后，沸水加熱至100℃直到混濁。樣品冷卻至室溫后，讀取吸光度。CPT-11和FUDR的同時載藥如圖7所示。
實施例7包封藥物的脂質(zhì)體顯示超過協(xié)同藥物混合物的增強效果今天，許多療法，尤其是組合化療，依賴于給予游離藥物混合物。本發(fā)明研究者希望確定，與相同組合游離藥物混合物相比，在包封藥物的脂質(zhì)體組合中是否能觀察到效果增加。還比較了雙載藥脂質(zhì)體的效果與每種藥物分別包載于如脂質(zhì)體中的療效。
如實施例1所述，以1∶1的協(xié)同摩爾比，制備了共包封FUDR和CPT-11的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體。如實施例1所述，除了分別使用前述包載方法，每個脂質(zhì)體只包載一種藥物，制備了含有FUDR或CPT-11的DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10摩爾比)脂質(zhì)體。100mM Cu(葡糖酸)2，220mM TEA，pH 7.4中水化脂質(zhì)膜。水化后，脂質(zhì)體外相緩沖液交換為SHE，pH 7.4；CPT-11載藥后，外相緩沖液再次交換為0.9％生理鹽水。
簡單地說，為了進行小鼠的腫瘤研究，用腫瘤細胞接種動物，腫瘤長到足夠大小。用28g針，第0天小鼠皮下接種50μL 1-2×106腫瘤細胞(一次接種/小鼠)。
當腫瘤達到所定義的大小約100mm3到200mm3時，處理前一天或處理當天，測量所有腫瘤。選擇合適的腫瘤大小，排除太小或太大的腫瘤之后，隨機分配腫瘤(n＝6)并測定組的平均腫瘤體積。將小鼠編入由對照和治療組構(gòu)成的合適的處理組中，例如，鹽水對照，脂質(zhì)體對照，陽性對照和受試樣品的各種稀釋液。
小鼠靜脈內(nèi)注射所需體積的樣品，在個體小鼠重量的基礎上給予動物處方劑量(如建議10μL/g)。
從處理日開始，用游標卡尺監(jiān)測腫瘤生長大小。腫瘤長度大小(mm)由最長軸和垂直于該軸的寬度大小(mm)構(gòu)成。由長度和寬度測量，根據(jù)方程L×W2/2計算腫瘤體積(cm3)。在腫瘤測量時間點采集動物重量和生命觀察數(shù)據(jù)。
在發(fā)病率和死亡率的預處理和處理期間，觀察所有動物至少每天一次，如果需要則更多次。尤其是，不健康的體征基于體重減輕、胃口改變、表皮粗糙、理毛行為喪失、行為改變?nèi)绮綉B(tài)改變、嗜睡和應激的明顯表現(xiàn)?？吹絿乐氐亩拘曰蚰[瘤相關疾病的癥狀時，處死該動物(CO2窒息)并進行尸體解剖評價其它毒性癥狀。出于人道的考慮處死瀕死的動物，處死的決定是研究主管/管理人和動物護理技術人員的慎重考慮結(jié)果。記錄任何或所有這些結(jié)果作為原始數(shù)據(jù)，死亡的時間將記為第二天。
在本研究中，如上所述進行，在側(cè)邊皮下接種2×106人HT-29或HCT116結(jié)腸腺癌，2×106人Capan-1胰腺腫瘤細胞或1×106鼠結(jié)腸-26腺癌的雌性SCID-Rag2M小鼠中進行效果試驗。使異種移植的腫瘤生長直至約為150mg(150mm3)大小，鼠腫瘤生長至約為100mg(100mm3)，這時注射指定的制劑。直接用游標卡尺測量確定腫瘤生長。用多劑量方案的鹽水、1∶1摩爾比的游離藥物混合物、獨立的游離藥物、CPT-11∶RUDR 1∶1、1∶10和10∶1摩爾比的脂質(zhì)體制劑和也個別地施用FUDR和CPT-11脂質(zhì)體制劑處理小鼠(圖8A、8B和8C中箭頭代表處理的天數(shù))，以比較單載藥脂質(zhì)體(″FUDR脂質(zhì)體″和″CPT-11脂質(zhì)體″)與雙載藥脂質(zhì)體(″CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體″)的效果。計算百分腫瘤生長延遲和log細胞殺死，定量抗腫瘤活性。定義百分腫瘤生長延遲是處理腫瘤達到特定評價大小所需的時間天數(shù)作為對照的百分比(T-C/C×100)，其中，T是處理腫瘤的天數(shù)，C是對照腫瘤的天數(shù)。Log細胞殺死是處理結(jié)束時估計log10單位的細胞殺死的數(shù)量，定義為[T-C/(3.32)(Td)]，其中，T-C是處理引起的腫瘤達到特定評價大小的延遲，Td是腫瘤倍增時間的天數(shù)。log細胞殺死為0，表明處理結(jié)束時細胞數(shù)量與處理開始時的數(shù)量相同。log細胞殺死為+6，表明細胞數(shù)量降低99.9999％。
圖8A的結(jié)果表明，與游離藥物混合物劑量為25∶9.25mg/kg和最大耐受劑量(MTD)100∶37mg/kg或鹽水處理動物相比，給予包封于DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10)脂質(zhì)體、劑量25∶9.25mg/kg(相當于脂質(zhì)劑量278mg/kg)下1∶1摩爾比的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體可提供顯著更佳的治療活性(降低人結(jié)腸直腸HT-29腫瘤大小)。圖8B表明，與最大耐受劑量(MTD)100∶37mg/kg下的游離藥物混合物或鹽水處理動物相比，給予包封于DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10)脂質(zhì)體、劑量25∶9.25mg/kg(相當于脂質(zhì)劑量278mg/kg)下1∶1摩爾比的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體可提供顯著更佳的治療活性(降低人結(jié)腸直腸HCT116腫瘤大小)。類似于圖8A的結(jié)果，圖8C表明，給予包封于DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10)脂質(zhì)體中，1∶1摩爾比的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體降低來自人Capan-1胰腺腫瘤細胞的小鼠腫瘤的腫瘤大小，降低的程度大于CPT-11∶FUDR游離藥物混合物或鹽水。數(shù)據(jù)點代表平均腫瘤大小+/-平均值的標準誤(SEM)。并且，這些結(jié)果強烈表明，需要包封氟嘧啶和水溶性喜樹堿進入合理設計的傳遞載體中，以達到最佳治療活性。
下表1A表示給予1∶1摩爾比和10∶1摩爾比的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體、FUDR脂質(zhì)體、CPT-11脂質(zhì)體、1∶1摩爾比的游離藥物混合物CPT-11∶FUDR和游離藥物CPT-11和游離FUDR后，在人HT-29結(jié)腸直腸異種移植模型中，列表定量抗腫瘤效果的數(shù)據(jù)。
表1A治療組HT-29抗腫瘤活性的定量分析(Q7D×3治療方案)

*Log細胞殺死＝[T-C/(3.32)(Td)]，其中，T-C是處理引起的腫瘤到達400mg的延遲(天數(shù))，Td是腫瘤倍增時間的天數(shù)。對照腫瘤到達400mg的天數(shù)＝26天。
表1A表示的結(jié)果闡明定量分析給定治療組的HT-29抗腫瘤活性。給予18.5mg/kg劑量的FUDR(L-Flox)脂質(zhì)體，腫瘤生長延遲僅12％，log細胞殺死為0.14。劑量50mg/kg的CPT-11(L-Irino)脂質(zhì)體具有高度活性，腫瘤生長延遲為127％，log細胞殺死為1.51。給予劑量為50∶18.5mg/kg(相當于脂質(zhì)劑量556mg/kg)、1∶1摩爾比的包封于DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10)脂質(zhì)體中的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體(CPX-1)最有效，腫瘤生長延遲為142％，log細胞殺死為1.71。劑量為50∶1.85mg/kg(拮抗的)、拮抗的10∶1摩爾比的包封于DSPC/DSPG/Chol(70∶20∶10)脂質(zhì)體中，CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體不如1∶1摩爾比的有效，腫瘤生長延遲為123％，log細胞殺死為1.48。最大耐受劑量(MTD)100∶37mg/kg的游離藥物混合物顯示，19％腫瘤生長延遲，log細胞殺死為0.23。劑量分別為100和250mg/kg的游離CPT-11和游離FUDR具有8％的腫瘤生長延遲，log細胞殺死為0.09。
表1B治療組Capan-1抗腫瘤活性的定量分析(Q7D×3治療方案)

*Log細胞殺死＝[T-C/(3.32)(Td)]，其中，T-C是處理引起的腫瘤到達500mg的延遲(天數(shù))，Td是腫瘤倍增時間的天數(shù)。對照腫瘤到達500mg的天數(shù)＝43天。
**用Student-Newman-Keuls分析來自所有其它組的統(tǒng)計學差異(p＜0.05)類似于表1A的結(jié)果，表1B列出的結(jié)果表明，劑量為25∶9.25mg/kg(相當于脂質(zhì)劑量278mg/kg)的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體(CPX-1)在人Capan-1胰腺異種移植模型中，顯示優(yōu)異的抗腫瘤活性，腫瘤生長延遲為98％，log細胞殺死為1.98，與分別顯示腫瘤生長延遲為79％和16％，log細胞殺死為1.46和0.30的CPT-11脂質(zhì)體(25mg/kg)(L-Irino)和FUDR脂質(zhì)體(9.25mg/kg)(L-Flox)相比，具有統(tǒng)計學顯著性。
表C1表示給予1∶1摩爾比的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體、FUDR脂質(zhì)體和CPT-11脂質(zhì)體后，在鼠Colon-26模型中，列表定量抗腫瘤效果的數(shù)據(jù)。
表1C治療組Colon-26抗腫瘤活性的定量分析(Q7D×3治療方案)

*Log細胞殺死＝[T-C/(3.32)(Td)]，其中，T-C是處理引起的腫瘤到達500mg的延遲(天數(shù))，Td是腫瘤倍增時間的天數(shù)。對照腫瘤到達500mg的天數(shù)＝19天。
**用Student-Newman-Keuls分析來自所有其它組的統(tǒng)計學差異(p＜0.05)表1C表明，劑量為20∶7.4mg/kg(相當于脂質(zhì)劑量160mg/kg)的CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體(CPX-1)在鼠Colon-26結(jié)腸直腸模型中顯示優(yōu)異的抗腫瘤活性，腫瘤生長延遲53％，log細胞殺死為2.47。CPT-11脂質(zhì)體(20mg/kg)(L-Irino)和FUDR脂質(zhì)體(7.4mg/kg)(L-Flox)的腫瘤生長延遲分別為13.9％和14.8％，log細胞殺死分別為0.65和0.69。如預期的，兩種單載藥脂質(zhì)體都比鹽水對照具有更強的活性，CPT-11∶FUDR脂質(zhì)體最有效，與CPT-11和FUDR脂質(zhì)體相比，降低腫瘤大小具有統(tǒng)計學顯著性。
權利要求
1.一種包含脂質(zhì)體的組合物，所述脂質(zhì)體以對相關細胞或腫瘤細胞勻漿具有所需的細胞毒性、細胞停滯或生物效應的喜樹堿/氟嘧啶摩爾比，穩(wěn)定結(jié)合至少一種水溶性喜樹堿和至少一種氟嘧啶。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述對相關細胞或腫瘤細胞勻漿的所需細胞毒性、細胞停滯或生物效應是非拮抗的。
3.如權利要求1所述的組合物，還包含足以穩(wěn)定所述氟嘧啶的甲酰四氫葉酸。
4.如權利要求2所述的組合物，還包含足以穩(wěn)定所述氟嘧啶的甲酰四氫葉酸。
5.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述水溶性喜樹堿是伊立替康(CPT-11)、托泊替康、9-氨基喜樹堿或勒托替康。
6.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述水溶性喜樹堿是水不溶性喜樹堿的親水鹽。
7.如權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述水溶性喜樹堿是伊立替康(CPT-11)或托泊替康。
8.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述氟嘧啶是氟尿苷、氟尿嘧啶或UFT(替加氟/尿嘧啶)。
9.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體包括含磷脂酰膽堿的脂質(zhì)。
10.如權利要求9所述的組合物，其特征在于，所述含磷脂酰膽堿的脂質(zhì)是DSPC或DAPC。
11.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇。
12.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，所述磷脂酰甘油是DSPG或DMPG。
13.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有固醇。
14.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述固醇是膽固醇。
15.如權利要求14所述的組合物，其特征在于，所述膽固醇存在的量小于20mol％。
16.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有金屬離子溶液。
17.如權利要求16所述的組合物，其特征在于，所述金屬離子是銅。
18.如權利要求17所述的組合物，其特征在于，所述金屬離子溶液是Cu(葡糖酸)2或CuSO4。
19.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述水溶性喜樹堿和氟嘧啶是共包封的。
20.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述水溶性喜樹堿是伊立替康或托泊替康，所述氟嘧啶是氟尿苷或5-FU。
21.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有DSPC。
22.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有DSPG。
23.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有膽固醇。
24.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有Cu(葡糖酸)2或CuSO4。
25.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述脂質(zhì)體含有三乙醇胺(TEA)。
26.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，與以相同的比例給予但不穩(wěn)定結(jié)合脂質(zhì)體的所述水溶性喜樹堿和所述氟嘧啶得到的結(jié)果相比，給予受試者所述組合物后，可提供較大的治療活性。
27.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有第三種藥物。
28.一種制備含有脂質(zhì)體的組合物的方法，所述脂質(zhì)體以非拮抗的摩爾比穩(wěn)定結(jié)合至少一種水溶性喜樹堿和一種氟嘧啶，該方法包括a)在相關細胞培養(yǎng)試驗、無細胞試驗或腫瘤細胞勻漿中測定生物活性，所述水溶性喜樹堿和氟嘧啶的摩爾比在至少5％濃度范圍內(nèi)是非拮抗的，所述范圍內(nèi)大于1％的細胞受所述比例藥物的作用(fa＞0.01)，和b)將步驟a)中測定的非拮抗摩爾比的水溶性喜樹堿與氟嘧啶包封于所述脂質(zhì)體內(nèi)。
29.一種在受試者中治療疾病的方法，所述方法包括給予需要這種治療的受試者以治療有效量的如權利要求1所述的組合物。
30.如權利要求29所述的方法，還包括給予所述受試者甲酰四氫葉酸。
31.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述受試者是人。
32.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述受試者是人類以外的哺乳動物或禽類。
33.一種傳遞治療有效量的氟嘧啶/水溶性喜樹堿藥物組合的方法，該方法包括給予穩(wěn)定結(jié)合第一種傳遞載體的氟嘧啶和穩(wěn)定結(jié)合第二種傳遞載體的水溶性喜樹堿，其特征在于，給予的氟嘧啶和水溶性喜樹堿的比例是非拮抗的。
全文摘要
包含具有穩(wěn)定結(jié)合喜樹堿和氟嘧啶的脂質(zhì)體的組合物，當給予這些藥物的組合時，該組合物用于增強療效。
文檔編號A61K9/127GK1798544SQ200480012351
公開日2006年7月5日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權日2003年4月2日
發(fā)明者L·邁耶, M·巴利, M·韋伯, P·塔蒂, S·約翰斯通 申請人:塞拉特藥物股份有限公司