專利名稱：肽磺酰胺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式I的新的肽R1-Arg-X-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-R2I其中R1表示H、乙酰基或?；襌2表示-OH、OR3NH2、NHR3、N(R3)2，R3表示烷基、芳烷基、芳基、Het且X 表示式II的氨基酸 其中A 表示(CH2)n，R4表示H、烷基、芳烷基或芳基，且n 表示1、2、3、4、5或6，且式II的氨基酸通過α-氨基的肽鍵與相鄰的Arg相連接，并通過α-羧基的肽鍵與相鄰的Asp的α-氨基相連接。
本發(fā)明還涉及式I化合物的可藥用的前藥、衍生物、溶劑化物和立體異構(gòu)體以及它們的鹽，包括其所有比例的混合物。
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)具有有價值的特性的新化合物，特別是可用于制備藥物的新化合物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的式I化合物及其鹽具有非常有價值的藥理學(xué)性質(zhì)，且耐受性良好。
本發(fā)明的式I化合物是血小板整聯(lián)蛋白GPIIbIIIa和αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和αvβ3整聯(lián)蛋白的配體，因此被用作治療各種疾病和病理發(fā)現(xiàn)的激動劑和/或拮抗劑。它們還被用作診斷劑或診斷試劑。
整聯(lián)蛋白αvβ6的其它抑制劑在DE 19858857中有描述，并被S.Kraft等在J.Biol.Chem.274，1979-85(1999)中描述。
整聯(lián)蛋白屬于雜二聚體I類跨膜受體家族，其在許多細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞粘著過程中發(fā)揮重要作用(Tuckwell等，1996，Symp.Soc.Exp.Biol.47)。整聯(lián)蛋白可大致分為三類為胞外基質(zhì)受體的β1整聯(lián)蛋白，可在白細(xì)胞上被活化且在炎癥過程中被觸發(fā)的β2整聯(lián)蛋白和在創(chuàng)傷愈合及其它病理過程中影響細(xì)胞應(yīng)答的αv整聯(lián)蛋白(Marshall和Hart，1996，Semin.Cancer Biol.7，191)。
α5β1、αIIbβ3、α8β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ8和αvβ6整聯(lián)蛋白均與天然配體如例如纖連蛋白或玻連蛋白中的Arg-Gly-Asp(RGD)肽序列結(jié)合?？扇苄缘暮琑GD的肽能抑制這些整聯(lián)蛋白中的每一種與相應(yīng)天然配體的相互作用。
αvβ6是一種較稀少的整聯(lián)蛋白(Busk等，1992，J.Biol.Chem.267(9)，5790；Breuss等，1993，J.Histochem.Cytochem.41(10)，1521)，在修復(fù)過程中其在上皮組織中的形成增加，且優(yōu)先與天然基質(zhì)分子纖連蛋白和肌腱蛋白結(jié)合(Wang等，1996，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15(5)，664；Huang等，1998，J.Cell Sci.111，2189)。αvβ6的生理學(xué)和病理學(xué)功能目前尚不非常清楚，但認(rèn)為這種整聯(lián)蛋白在涉及上皮細(xì)胞的生理過程和疾病(例如炎癥、創(chuàng)傷愈合、腫瘤)中發(fā)揮重要作用(Breuss等，1995，J.Cell Sci.108，2241)。因此，αvβ6在傷口的角質(zhì)形成細(xì)胞上被表達(dá)(Haapasalmi等，1996，J.Invest.Dermatol.106(1)，42；Cass等，1998，J.Pediatr.Surg.33(2)，312)，由此可以認(rèn)為除了創(chuàng)傷愈合過程和炎癥以外，皮膚的其它病理事件如例如銀屑病可能也被所述整聯(lián)蛋白的激動劑或拮抗劑影響。
另外，與正常對比組織相比較，口腔、唇、舌和生殖器的粘膜上的皮膚角化病癥、即所謂的粘膜白斑病顯示整聯(lián)蛋白αvβ6的表達(dá)增加。還發(fā)現(xiàn)經(jīng)扁平苔蘚到鱗狀細(xì)胞癌，粘膜白斑病的表達(dá)頻率和水平增加，即αvβ6的表達(dá)可能與粘膜白斑病的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)(Hamidi等，2000，Br.J.Cancer.82(8)，1433；Ramos等，1997，Int.J.Cancer.72(2)，369；Thomas等，2001，J.Inv.Dermatol.117(1)，67；Koivisto等，2000，Exp.Cell Res.255(1)，10)。
另外，αvβ6在呼吸道上皮中發(fā)揮作用(Weinacker等，1995，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.12(5)，547)，意即該整聯(lián)蛋白的相應(yīng)激動劑/拮抗劑可被成功地用于呼吸道疾病，如支氣管炎、哮喘、肺纖維化和呼吸道腫瘤(Huang等，1998，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.19(4)，636；Pilewski等，1997，Am.J.Physiol.273，L256；Kaminski等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97(4)，1778)。
已知纖維化不僅發(fā)生在肺(支氣管)，而且也發(fā)生在其它器官，意即整聯(lián)蛋白αvβ6在其中也發(fā)揮作用；實(shí)例有病理性結(jié)締組織增生，例如皮膚、肝臟(直至肝硬化)、腎和膀胱、心臟和胰腺(囊性纖維化)的病理性組織增生(Mutsaers等，1997，J.Int.J.Biochem.Cell Biol.29(1)，5；Dalton SL，1999，J.Am.Acad.Dermatol 41，457；Kropf等，1991，Z.Med.Laboratoriumsdiagn.32(3/4)，150；Schnee等，2000，Cardiovasc.Res.46(2)，264；Sime，P.J.1999 Curr.Opin.Anti-inflammatory ImmunomodulatoryInvest.Drugs 1(5)，423；Housset等，1999，J.Pathol.Biol.47(9)，886；Norman等，1999，Exp.Nephrol.7(2)，167；Nahas等，1997，Int.J.Biochem.Cell Biol.29(1)，55)。
同樣已知αvβ6在腸上皮中也發(fā)揮作用，意即相應(yīng)的整聯(lián)蛋白激動劑/拮抗劑可被用于治療胃/腸道的炎癥、腫瘤和創(chuàng)傷。有跡象表明整聯(lián)蛋白αvβ6還影響基質(zhì)金屬蛋白酶如例如明膠酶B(MMP-9)的分泌(Agrez等，1994，J.Cell.Biol.127(2)，547；Niu等，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.249(1)，287)。
腫瘤細(xì)胞將MMP活性(可能是不同的MMP)作為其密度的函數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)也是使細(xì)胞在腫瘤塊生長過程中能通過周圍基質(zhì)的蛋白水解進(jìn)一步創(chuàng)造增殖和遷移空間的機(jī)理。αvβ6的表達(dá)、細(xì)胞密度和MMP活性之間的這種聯(lián)系在文獻(xiàn)中有所提及(Niu等，2001，Int.J.Cancer 92(1)，40；Agrez等，1999，Int.J.Cancer 81(1)，90；Thomas等，2001，J.Inv.Dermatol.116(6)，898；Thomas等，2001，Int.J.Cancer 92(5)，641)。
由于整聯(lián)蛋白αvβ6與感染過程有關(guān)，所以認(rèn)為其激動劑/拮抗劑可用于微生物(原生動物、微植物、細(xì)菌、病毒、酵母菌和真菌)感染。已知的實(shí)例有用于柯薩奇病毒或用于口蹄疫病毒(FMDV)對宿主細(xì)胞的感染，其αvβ3依賴性地進(jìn)行，但也可αvβ6依賴性地發(fā)生(Agrez等，1997，Virology.239(1)，71；Jackson等，2000，J.Virol.74(11)，4949；Miller等，2001，J.Virol.75(9)，4158；Neff等，2001，J.Virol.75(1)，527；Neff等，1998，J.Virol.72(5)，3587；Jackson等，1997，J.Virol.71(11)，8357)。
HIV感染(AIDS)也依賴于αv整聯(lián)蛋白，這在多年前已經(jīng)被證明(Ruoslahti等，WO 92/14755)。
根據(jù)更新的知識，炭疽桿菌分泌的毒素由三種蛋白組成，其中之一、即所謂的PA或保護(hù)性抗原與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，且此處所述的ATR(炭疽毒素受體)是具有馮·維勒布蘭德因子A類胞外域的I型膜蛋白。整聯(lián)蛋白也含有該類vWFA結(jié)構(gòu)域。這可以通過在Swiss Prot數(shù)據(jù)庫中對整聯(lián)蛋白αvβ6(http//www.expasy.ch/cgi-bin/niceprot.pl？P18564；此處的序列β6(131-371))和αvβ3(http//www.expasy.ch/cgi-bin/niceprot.pl？P05106；β3(135-377))進(jìn)行同源分析來理解。因此本發(fā)明的激動劑/拮抗劑也可用于肺、皮膚和腸的炭疽(Bradley等，2001，Nature 414，225；Tuckwell等，1999，Biochem.Soc.Trans.27(6)，835)。
對于細(xì)菌和酵母菌(芽殖真菌、念珠菌屬)，宿主細(xì)胞感染對其粘著受體的依賴性也已有描述(Kerr，JR.1999，Medical Microbiology，Manchester Royal Infirmary，UK，MOLECULAR PATHOLOGY，52(4)，220；Dehio等，1998，F(xiàn)EBS LETT.424(1-2)，84；Stockbauer等，1999，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.96(1)，242；Santoni等，2001，Microbial Pathogen.31(4)，159)。
整聯(lián)蛋白αvβ6與TGF-β的相互作用以及由此引起的活化已經(jīng)被證實(shí)(Dalton，SL.1999，J.Am.Acad.Dermatol 41，457；Munger等，1999，Cell 96，319)。
已有報道稱潛伏的TGF-β1(即前體之一)與整聯(lián)蛋白αvβ6結(jié)合，然后通過蛋白水解被活化。本發(fā)明的化合物能夠抑制TGF-β(前體、LAP肽、LAP-TGFβ、潛伏的TGF)與整聯(lián)蛋白結(jié)合，因此整聯(lián)蛋白αvβ6的激動劑/拮抗劑能防止TGF-β1和其它亞型的活化。因此有助于TGFβ的調(diào)控。
迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3種人TGFβ同工型，其在許多生長和分化過程中發(fā)揮作用，特別是在炎癥過程、纖維化、創(chuàng)傷愈合、骨生長、免疫功能調(diào)節(jié)、血管生成和瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用(Rifkin等，1993，70，177；Hata等，1998，Mol.Med.Today 257；Sheppard，D.2001，Chest.120(增刊1)，49S；Wickstom等，1998，Prostate 37，19)。可以認(rèn)為作為αvβ6的激動劑/拮抗劑，本發(fā)明的化合物也可用于這些過程。
強(qiáng)調(diào)αvβ6在免疫學(xué)過程中的作用的其它論文描述了肺化學(xué)損傷后嗜中性粒細(xì)胞的流入(Miller等，2001，J.Histochem.Cytochem.49(1)，41)。
P.C.Brooks，R.A.Clark和D.A.Cheresh在Science 264，569(1994)中描述了血管生成的發(fā)生對血管整聯(lián)蛋白與胞外基質(zhì)蛋白之間相互作用的依賴性。
因此，除了目前已知的在治療上和診斷上難以處理的天然高分子量配體和抗體外，目的是尋找不僅可用于所述治療領(lǐng)域、而且可用作診斷劑或診斷試劑的血小板整聯(lián)蛋白GPIIbIIIa和αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和αvβ3的有效的、特異性的和/或選擇性的低分子量肽配體。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的肽化合物及其鹽對血小板整聯(lián)蛋白GPIIbIIIa和αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和αvβ3整聯(lián)蛋白或?qū)в羞@些整聯(lián)蛋白的細(xì)胞具有作用，或者，如果它們結(jié)合在表面上，則代表與離體GPIIbIIIa或離體αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和αvβ3整聯(lián)蛋白或細(xì)胞的GPIIbIIIa-或αv-促進(jìn)官能團(tuán)(promoted function)結(jié)合的合成配體。特別地，它們作為GPIIbIIIa整聯(lián)蛋白、αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和/或αvβ3整聯(lián)蛋白的抑制劑發(fā)揮作用，特別是抑制受體與其它配體的相互作用，如例如與纖連蛋白的結(jié)合。該作用可以例如通過Smith等在J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)中描述的方法來檢測。
還發(fā)現(xiàn)該新物質(zhì)具有非常有價值的藥理學(xué)性質(zhì)，且耐受性良好，可被用作藥物。這一點(diǎn)在下文中有更詳細(xì)的描述。
如WO 01/00660和WO 01/05810中所述，即使非X位的氨基酸被替代和/或直鏈化合物被環(huán)化，也仍然具有這些性質(zhì)。
如果按照現(xiàn)有技術(shù)為其提供相應(yīng)的標(biāo)記分子，本發(fā)明的肽化合物還可被用作診斷劑用于檢測和定位體內(nèi)上皮系統(tǒng)的病理情況。適用于此目的的有例如生物素(例如用于親和目的)或用于診斷和成像方法的各種熒光標(biāo)記物或放射性同位素復(fù)合物。本發(fā)明的化合物也可以帶有錨定官能團(tuán)以便與工件如例如生物植入物、微量滴定板或顆粒的表面共價偶聯(lián)。
本發(fā)明還包括與至少一種其它活性成分的組合和/或與其它活性成分如細(xì)胞毒性活性成分的軛合物以及與用于X-射線治療或PET診斷的放射性標(biāo)記物的軛合物，還包括與標(biāo)記蛋白如GFP或抗體或與治療蛋白如IL-2的融合蛋白。
對于本發(fā)明的目的，烷基表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個碳原子的直鏈或支鏈或環(huán)狀烷基，其可以被取代，例如被鹵化、被羥基化、被氨基化，可以是部分不飽和的或被雜原子如N、S或O中斷。如果烷基被鹵素取代，則根據(jù)烷基的碳原子數(shù)，其優(yōu)選具有1、2、3、4或5個鹵素原子。因此，例如甲基可以被鹵素單-、二-或三取代，而乙基可以被鹵素原子單-、二-、三-、四-或五取代。烷基優(yōu)選代表甲基、乙基、三氟甲基、五氟乙基或丙基，特別優(yōu)選代表異丙基、丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，但也代表正戊基、新戊基或異戊基。
術(shù)語“芳基”包括未取代的或者單取代或多取代的芳族單-、二-或三環(huán)烴基，如例如苯環(huán)或蒽、菲或萘環(huán)體系。合適的取代基的實(shí)例包括NO2-、F-、Cl-、Br-、I-、HO-、H2N-、R3HN-、(R3)2N-、烷基-、烷基-O-、CF3-O-、烷基-CO-、芳基-、芳基-O-、芳基-CO-、芳基-CONH-、芳基SO2-、芳基SO2-HN-，其中取代基可以彼此獨(dú)立地出現(xiàn)0至5次。
術(shù)語“Het”包括未取代的或者單取代或多取代的、飽和的、不飽和的或芳族的單-、二-或三環(huán)雜環(huán)基。作為雜原子，S、N或O可以出現(xiàn)1至3次。合適的取代基的實(shí)例包括NO2-、F-、Cl-、Br-、I-、HO-、H2N-、R3HN-、(R3)2N-、烷基-、烷基-O-、CF3-O-、烷基-CO-、芳基-、芳基-O-、芳基-CO-、芳基-CONH-、芳基SO2-、芳基SO2-HN-，其中取代基可以彼此獨(dú)立地出現(xiàn)0至5次。
術(shù)語“芳烷基”優(yōu)選包括與以上所定義的烷基相連接的以上所定義的芳基。合適的芳烷基的實(shí)例包括但不限于芐基、苯丙基、苯丁基等。
本發(fā)明中的術(shù)語αv整聯(lián)蛋白包括整聯(lián)蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8，但優(yōu)選αvβ6和αvβ3整聯(lián)蛋白。
本發(fā)明特另涉及選自式Ia)-Io)的肽化合物Ia)Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ib)Ac-Arg-Dap(F5-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ic)Ac-Arg-Dap(2-NO2-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Id)Ac-Arg-Dap(4-NO2-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ie)Ac-Arg-Dap(2，4-NO2-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，If)Ac-Arg-Dap(6-OMe-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ig)Ac-Arg-Dap(2-CF3-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ih)Ac-Arg-Dap(3-CF3-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ii)Ac-Arg-Dap(Me5-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ij)Ac-Arg-Dap(4-tBu-PSA)-Asp-Leu-Asp-Serr-Leu-Arg-NH2，Ik)Ac-Arg-Dap(BSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Il)Ac-Arg-Dap(iPrs)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Im)Ac-Arg-Dap(1-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，In)Ac-Arg-Dap(2-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Io)Ac-Arg-Dap(4-Ph-Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，和其可藥用的前藥、衍生物、溶劑化物和立體異構(gòu)體以及它們的鹽，包括其所有比例的混合物，其中式Ia)-Io)中括號中所用的縮寫代表下列基團(tuán)
Psa苯磺?；鵉5-PSA 五氟苯磺酰基2-NO2-PSA 2-硝基苯磺?；?-NO2-PSA 4-硝基苯磺?；?，4-NO2-PSA 2，4-二硝基苯磺酰基6-OMe-PSA 6-甲氧基苯磺?；?-CF3-PSA 2-三氟甲基苯磺酰基3-CF3-PSA 3-三氟甲基苯磺?；鵐e5-PSA 五甲基苯磺酰基4-tBu-PSA 4-叔丁基苯磺?；鵅sa芐基磺酰基iPrs 異丙基磺?；?-Nap 1-萘基磺?；?-Nap 2-萘基磺?；?-Ph-Psa 4-苯基苯磺?；舷挛闹刑峒暗陌被釟埢目s寫代表下列氨基酸殘基Asp或D 天門冬氨酸Arg或R 精氨酸Dap2，3-二氨基丙酸Leu或L 亮氨酸Ser或S 絲氨酸Thr或T 蘇氨酸另外，上下文中的下列縮寫具有以下含義Ac 乙?；鵅OC叔丁氧羰基BSA牛血清白蛋白CBZ或Z 芐氧羰基DCCI 二環(huán)己基碳二亞胺
DCM 二氯甲烷DIEA 二異丙胺DMA N，N-二甲基乙酰胺DMF 二甲基甲酰胺EDCI N-乙基-N，N′-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺Et 乙基FCA 熒光素甲酸FITC 異硫氰酸熒光素Fmoc 9-芴基甲氧基羰基Fmoc-Dap(ivDde) N-α-Fmoc-N-γ-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)己-1-亞基)-3-甲基丁基二氨基丙酸FTH 熒光素硫脲HOBt 1-羥基苯并三唑Me 甲基MBHA 4-甲基二苯甲胺Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；鵑MP N-甲基吡咯烷酮HONSuN-羥基琥珀酰亞胺OBut 叔丁基酯Oct 辛酰基OMe 甲基酯OEt 乙基酯Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；鵓mc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基POA 苯氧基乙?；鵖al 鄰羥苯甲酰TBS++含有二價陽離子的Tris緩沖的鹽水TBSA TBS+BSA
TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽TFA 三氟乙酸TIS 三異丙胺Trt 三苯甲基(三苯基甲基)如果上面提及的氨基酸存在多種對映體形式，則所有這些對映體形式以及它們的混合物(例如DL形式)均包括在上下文中。另外，氨基酸也可以具有本身已知的相應(yīng)的保護(hù)基。
本發(fā)明的化合物還包括所謂的前藥衍生物，即被例如烷基或?；?、糖或寡肽修飾的化合物，它們在生物體內(nèi)迅速裂解產(chǎn)生本發(fā)明的有效化合物。這些前藥衍生物還包括本發(fā)明的化合物的生物可降解的聚合物衍生物，例如Int.J.Pharm.115，61-67(1995)中所述的那些。
所述的氨基酸和氨基酸殘基如例如NH官能團(tuán)或羧基端酰胺官能團(tuán)也可以被衍生化，優(yōu)選N-甲基、N-乙基、N-丙基、N-芐基或Cα-甲基衍生物。另外，可能出現(xiàn)Asp的衍生物，特別是具有側(cè)鏈羧基的甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯、叔丁基酯、新戊基酯或芐基酯的那些，此外還有Arg的衍生物，其可以在-NH-C(＝NH)-NH2基團(tuán)上被乙?；?、苯甲?；?、甲氧基羰基或乙氧基羰基取代。
除了在氨基端帶有乙?；氖絀化合物外，本發(fā)明的化合物還包括其中Ac被其它?；倌軋F(tuán)如例如丙?；⒍□；虮郊柞；娲幕衔?。
另外，本發(fā)明的化合物還包括由被已知的標(biāo)記分子衍生化的本發(fā)明的實(shí)際化合物組成的衍生物，所述的標(biāo)記分子使得這些肽可被容易地檢測。這種衍生物的實(shí)例有放射性標(biāo)記的、生物素化的或熒光標(biāo)記的肽。
熒光染料基團(tuán)優(yōu)選表示7-乙酰氧基香豆素-3-基、熒光素-5-(和/或6-)基、2′，7′-二氯熒光素-5-(和6-)基、二氫四甲基rosamin-4-基、四甲基羅丹明-5-(和/或6-)基、4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacen-3-乙基或4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacen-3-乙基。
可用作制備本發(fā)明的式I化合物的試劑的合適的官能化熒光染色基團(tuán)有例如″Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，第5版，1992-1994，R.P.Haughland，Molecular Probes，Inc.″中所述的那些。
一般而言，本發(fā)明的肽是直鏈的，但它們也可以被環(huán)化。本發(fā)明不僅包括所述的肽，而且還包括除了本發(fā)明的這些化合物以外還包含其它藥理學(xué)活性成分或輔劑的混合物和組合物，所述的其它藥理學(xué)活性成分或輔劑能以所希望的方式影響本發(fā)明的肽的主要藥理學(xué)作用。
另外，本發(fā)明的化合物和用于制備它們的起始原料通過本身已知的方法制備并被頻繁使用，如文獻(xiàn)(例如標(biāo)準(zhǔn)著作，如Houben-Weyl，Methodender organischen Chemie[有機(jī)化學(xué)方法]，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart)中所述。確切地說，在已知的和適于所述反應(yīng)的反應(yīng)條件下被制備和使用。在此也可以使用本身已知的變體。
優(yōu)選地，本發(fā)明的肽可通過例如Jonczyk和Meienhofer(Peptides，Proc.8th Am.Pept.Symp.，V.Hruby和D.H.Rich編著，Pierce Comp.III，73-77頁，1983或Angew.Chem.104，1992，375)中所述的固相合成并隨后進(jìn)行裂解和純化的方法來制備或通過Merrifield(J.Am.Chem.Soc.94，1972，3102)的方法來制備。
本發(fā)明的肽可通過具有酸不穩(wěn)定性側(cè)保護(hù)基的Fmoc策略在固相上(手動或在自動合成器中)制備，并通過RP-HPLC方法純化。可通過RP-HPLC檢測峰的一致性，通過FAB-MS進(jìn)行物質(zhì)鑒定。
另外，肽可以通過氨基酸和肽合成的常規(guī)方法制備，例如由Novabiochem-1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook ofCalbiochem-Novabiochem GmbH，D-65796 Bad Soden和許多標(biāo)準(zhǔn)著作以及公開的專利申請中可獲知的方法。
也可使用逐步偶聯(lián)和片段縮合。可以使用各種氨基端、羧基端和側(cè)保護(hù)基，優(yōu)選選擇這些基團(tuán)以便它們可被互不相關(guān)地除去?？梢杂枚喾N縮合劑如碳二亞胺、碳二咪唑(carbodiimidazole)、脲鎓類縮合劑如TBTU、混合酸酐方法和?；u或活性酯方法進(jìn)行偶聯(lián)步驟。
具有側(cè)保護(hù)基的直鏈前體分子的環(huán)化也可以用例如DE 43 10 643中或Houben-Weyl，I.c.，15卷/II，1-806頁(1974)中所述的該類縮合反應(yīng)進(jìn)行。
在固相肽合成中可以使用各種樹脂和錨定官能團(tuán)。樹脂可基于例如聚苯乙烯或聚丙烯酰胺，錨定官能團(tuán)如Wang，鄰-氯三苯甲基可用于制備肽酸，氨基呫噸氧基錨定點(diǎn)例如可用于制備肽酰胺。(參見Principles ofPeptide Synthesis，M.Bodansky編著，Springer Verlag Berlin 1984；HoubenWeyl Methoden der organischen Chemie[有機(jī)化學(xué)方法]，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart；Calbiochem/Novabiochem Catalogue and SynthesisHandbook 1999，Synthesis Notes；肽合成方案，M.W.Pennington和B.M.Dunn編著，Methods in Molecular Biology 35卷，Humana Press Totowa N.J.1994)。
生物素化的或熒光標(biāo)記的肽/蛋白質(zhì)同樣可用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如E.A.Bayer和M.Wilchek的Methods of Biochemical Analysis，26卷，抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物作為分子生物學(xué)工具的用途；和Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，第6版，1996，R.P.Haugland編著，Molecular Probes，Inc.；或者WO 97/14716)制備。
本發(fā)明的肽當(dāng)然也可以通過其官能衍生物的溶劑解、特別是水解或通過氫解被釋放。用于溶劑解或氫解的優(yōu)選起始原料是含有相應(yīng)的被保護(hù)的氨基和/或羥基而非一個或多個游離氨基和/或羥基的那些物質(zhì)，優(yōu)選帶有氨基保護(hù)基而不是與N原子相連接的H原子的那些物質(zhì)，或者優(yōu)選帶有羥基保護(hù)基而不是羥基H原子的那些物質(zhì)。相應(yīng)的情況適用于羧酸，其可以通過用保護(hù)基取代它們的-CO-OH的羥基官能團(tuán)而被保護(hù)，例如以酯的形式被保護(hù)。
術(shù)語“氨基保護(hù)基”是眾所周知的，涉及適于保護(hù)(阻斷)氨基使其不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、但在所需的化學(xué)反應(yīng)于分子其它部位發(fā)生后可容易地被除去的基團(tuán)。術(shù)語“羥基保護(hù)基”同樣是眾所周知的，涉及適于保護(hù)(阻斷)羥基使其不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、但在所需的化學(xué)反應(yīng)于分子其它部位發(fā)生后可容易地被除去的基團(tuán)?？梢詫⒒衔飶乃鼈兊墓倌苎苌镏嗅尫懦鰜?，根據(jù)所用的保護(hù)基，例如用強(qiáng)酸釋放，優(yōu)選用TFA、HBr或高氯酸，也可使用其它強(qiáng)無機(jī)酸如鹽酸或硫酸、強(qiáng)有機(jī)羧酸如三氯乙酸或磺酸如苯磺酸或?qū)妆交撬??？蓺浣獬サ谋Ｗo(hù)基(例如CBZ或芐基)可通過例如在催化劑(例如貴金屬催化劑如鈀，優(yōu)選在載體例如碳上)存在下用氫處理除去。
用于氨基端和用于凸出氨基的典型保護(hù)基是Z、BOC、Fmoc，用于羧基端或Asp側(cè)鏈的保護(hù)基是O-伯烷基(例如OMe或OEt)、O-叔烷基(例如OBut)或O-芐基。對于Arg的胍基官能團(tuán)，適合的是例如Z、BOC、NO2、Mtr、Pmc或Pbf。醇官能團(tuán)可以用叔烷基、芐基或三苯甲基保護(hù)。
基團(tuán)BOC、OBut和Mtr可以例如優(yōu)選用在二氯甲烷中的TFA或用約3至5n的在二噁烷中的HCl于15-30℃下除去，F(xiàn)MOC基團(tuán)可以優(yōu)選用約5至50％的二甲胺、二乙胺或哌啶的DMF溶液于15-30℃下除去。
可氫解除去的保護(hù)基(例如CBZ或芐基)可以例如通過在催化劑(例如貴金屬催化劑如鈀，優(yōu)選在載體例如碳上)存在下用氫處理除去。此處適宜的溶劑是上述那些溶劑，特別是例如醇如甲醇或乙醇、酯如THF或二噁烷或者酰胺如DMF、DMA或NMP。氫解一般在約0-100℃的溫度下和約1-200巴的壓力下進(jìn)行，優(yōu)選在20-30℃和1-10巴下進(jìn)行。CBZ基團(tuán)的氫解例如在以下條件下可成功進(jìn)行在5-10％Pd/C上于甲醇中或使用甲酸銨(代替氫)在Pd/C上于甲醇/DMF中、在20-30℃下。
正如已經(jīng)提及的那樣，本發(fā)明還包括式I化合物的鹽和式I化合物的可使用的前藥、衍生物、溶劑化物和立體異構(gòu)體的鹽。可通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備這些物質(zhì)。因此，利用酸可將本發(fā)明的化合物的堿轉(zhuǎn)化成相關(guān)的酸加成鹽，例如通過使等量的堿和酸在惰性溶劑如乙醇中反應(yīng)、然后蒸發(fā)來實(shí)現(xiàn)。用于該反應(yīng)的合適的酸特別是那些生成生理學(xué)可接受的鹽的酸。因此，可以使用無機(jī)酸，例如硫酸、硝酸、氫鹵酸如鹽酸或氫溴酸、磷酸如正磷酸、氨基磺酸，還可以使用有機(jī)酸，特別是脂族、脂環(huán)族、芳脂族、芳族或雜環(huán)族的一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸或乙磺酸、乙烷二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、萘磺酸和萘二磺酸、十二烷基硫酸。與生理學(xué)不可接受的酸的鹽例如苦味酸鹽可用于分離和/或純化本發(fā)明的化合物。另一方面，可通過與堿反應(yīng)將本發(fā)明化合物的酸轉(zhuǎn)化為它的生理學(xué)可接受的金屬鹽或銨鹽之一。此處合適的鹽特別是鈉、鉀、鎂、鈣和銨鹽，還有取代的銨鹽，例如二甲基-、二乙基-或二異丙基銨鹽、單乙醇-、二乙醇-或二異丙基銨鹽、環(huán)己基-、二環(huán)己基銨鹽、二芐基乙二銨鹽，還有例如與精氨酸或賴氨酸所成的鹽。
正如已經(jīng)提及的那樣，本發(fā)明的肽化合物可用作用于預(yù)防和/或治療的人用藥和獸用藥的藥物活性成分。這里應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)的是循環(huán)系統(tǒng)疾病、肺栓塞、血栓形成，特別是深靜脈血栓形成、心肌梗塞、動脈硬化、夾層動脈瘤(aneurysma dissecans)、短暫性缺血發(fā)作、卒中、心絞痛，特別是不穩(wěn)定型心絞痛、器官的病理性結(jié)締組織增生或纖維化，特別是肺纖維化，還有囊性纖維化、皮膚纖維化、肝纖維化、肝硬化、尿道纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、嬰兒心內(nèi)膜纖維化、胰腺纖維化、皮膚的角化病癥、粘膜白斑病、扁平苔癬和鱗狀細(xì)胞癌、腫瘤疾病如實(shí)體瘤和血液或免疫系統(tǒng)的瘤發(fā)生、瘤血管生成或瘤轉(zhuǎn)移，例如皮膚腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、血管腫瘤、胃腸道腫瘤、肺腫瘤、乳腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、脾腫瘤、胰腺腫瘤、腦腫瘤、睪丸腫瘤、卵巢腫瘤、子宮腫瘤、陰道腫瘤、肌肉腫瘤、骨腫瘤以及喉和頭部的腫瘤、溶骨性疾病如骨質(zhì)疏松、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、佩吉特病、惡性高鈣血癥、血型不相容性輸血、病理性血管生成疾病如例如炎癥、眼科疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、近視、角膜移植、紅眼性青光眼(rubeotic glaucoma)、眼組織胞漿菌病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、動脈粥樣硬化、銀屑病、再狹窄，特別是血管成形術(shù)后再狹窄、多發(fā)性硬化、妊娠、absumptio placentaris、病毒感染、細(xì)菌感染、酵母菌感染和真菌感染、口蹄疫、HIV、炭疽、白色念珠菌、急性腎衰竭，并在創(chuàng)傷愈合中用于支持愈合過程。
因此，本發(fā)明涉及上下文中和權(quán)利要求中所定義的各式的肽化合物，包括其生理學(xué)可接受的鹽，它們用作藥物、診斷劑或診斷試劑。
特別地，本發(fā)明涉及相應(yīng)的作為抑制劑用于對抗以上所提及的其中涉及GPIIbIIIa、αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和/或αvβ3整聯(lián)蛋白的疾病的藥物，因此，特別是用于對抗循環(huán)系統(tǒng)疾病、器官的病理性結(jié)締組織增生和纖維化、角化病癥、腫瘤疾病、溶骨性疾病、病理性血管生成疾病、感染和用于影響創(chuàng)傷愈合過程的藥物。
本發(fā)明還涉及相應(yīng)的藥物組合物，其包含至少一種式I化合物或其生理學(xué)上可接受的前藥、衍生物、溶劑化物或立體異構(gòu)體或它們的鹽，任選地以及賦形劑和/或輔劑。
本發(fā)明還涉及由獨(dú)立包裝的以下物質(zhì)組成的組合包裝(藥盒)(a)有效量的式I化合物和/或其可藥用的衍生物、溶劑化物和立體異構(gòu)體以及它們的鹽，包括其所有比例的混合物，和(b)有效量的其它藥物活性成分。
組合包裝包括合適的容器如盒子或紙板盒、獨(dú)立的瓶、小袋或安瓿。組合包裝可以包括例如獨(dú)立的安瓿，每個安瓿包含有效量的式I化合物和/或其可藥用的衍生物、溶劑化物和立體異構(gòu)體以及它們的鹽，包括其所有比例的混合物，以及有效量的溶解或凍干形式的其它藥物活性成分。
本發(fā)明還涉及式I化合物和式I化合物的可藥用的前藥、衍生物、溶劑化物和立體異構(gòu)體以及它們的鹽、包括其所有比例的混合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于對抗以上所提及的GPIIbIIIa、αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和/或αvβ3整聯(lián)蛋白在其中發(fā)揮作用的疾病，因此，特別是用于對抗循環(huán)系統(tǒng)疾病、器官的病理性結(jié)締組織增生和纖維化、角化病癥、腫瘤疾病、溶骨性疾病、病理性血管生成疾病、感染和用于影響創(chuàng)傷愈合過程。
本發(fā)明的藥物和包含它們的藥物組合物可被用于人用藥或獸用藥中。它們可以通過局部或全身、口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮、經(jīng)鼻、口含或離子滲透途徑被施用，包括混懸劑、乳劑或溶液劑、脂質(zhì)體、軟膏劑、糊劑、生物可降解的聚合物形式的制劑或納米粒、片劑、膠囊劑或丸劑、顆粒劑或散劑形式、用于吸入的氣霧劑形式、鼻內(nèi)滴劑或噴霧劑形式的制劑。也可以與其它技術(shù)如手術(shù)、放射、診斷、放射療法、光動力療法和基因療法組合使用以及與其它藥物組合使用。該類藥物可來自例如心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腫瘤學(xué)領(lǐng)域。它們可以是抗腫瘤劑如血管生成抑制劑或細(xì)胞抑制劑、來自烷化劑、抗生素、抗代謝物、生物制劑和免疫調(diào)節(jié)劑、激素和其拮抗劑、芥子氣衍生物、生物堿的化療劑等，其中這些物質(zhì)可以是低分子量的也可以是高分子量的。它們可以是脂類、碳水化合物、蛋白質(zhì)。這些物質(zhì)尤其包括細(xì)胞抑制劑、毒素、融合蛋白、單克隆抗體和疫苗。
用于本發(fā)明的藥物組合物的合適的賦形劑是適于經(jīng)腸(例如口服)、胃腸外、局部施用或適于以吸入噴霧劑形式施用的并且不與所述的新化合物發(fā)生相互作用的有機(jī)物或無機(jī)物，例如水、植物油、芐醇、烷撐二醇、聚乙二醇、甘油三乙酸酯、明膠、碳水化合物如乳糖或淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、凡士林。適于口服施用的制劑特別是片劑、丸劑、包衣片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、汁劑或滴劑，適于直腸施用的制劑是栓劑，適于胃腸外施用的制劑是溶液劑，優(yōu)選油性或水性溶液劑，此外還有混懸劑、乳劑或植入劑，適于局部應(yīng)用的制劑是軟膏劑、乳膏劑或散劑。也可以將所述的新化合物冷凍干燥，獲得的凍干物可用于例如制備注射用制劑。所述組合物可以被滅菌和/或包含輔劑，如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或潤濕劑、乳化劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖物質(zhì)、染料、矯味劑和/或一種或多種其它活性成分，例如一種或多種維生素。
對于吸入噴霧劑形式的施用，可使用其中活性成分溶解或混懸在拋射氣體或拋射氣體混合物(例如CO2或含氯氟烴)中的噴霧劑。在此活性成分可有利地以微粉化形式使用，在這種情況下可存在一種或多種另外的生理學(xué)可接受的溶劑例如乙醇。吸入溶液可在常規(guī)吸入器的幫助下施用。
本發(fā)明的物質(zhì)一般可以通過與其它已知的市售可得的肽相類似的方法施用(例如如US-A-4,472,305中所述)，優(yōu)選以每劑量單位約0.05至500mg、尤其是0.5至100mg的劑量施用。日劑量優(yōu)選為約0.01至2mg/kg體重。但是，每名患者的具體劑量取決于多種因素，例如所用的具體化合物的功效、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用時間和方式、排泄速率、聯(lián)合用藥以及所治療的具體疾病的嚴(yán)重程度。優(yōu)選胃腸外施用。
式I的新化合物還可用于分析生物學(xué)和分子生物學(xué)。
包含熒光染料基團(tuán)的式I化合物可被用作體外和體內(nèi)FACS(熒光活化細(xì)胞分類儀)技術(shù)和熒光顯微鏡術(shù)的診斷標(biāo)記物。
標(biāo)記化合物在熒光顯微鏡術(shù)中的用途例如被Y.-L.Wang和D.L.Taylor在″Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture，Part A+B，Academic Press，Inc.1989″中進(jìn)行了描述。體內(nèi)用途的另一個實(shí)例公布在M.Dellian等，Am.J.Pathol.149，59-71(1996)中。
本發(fā)明的化合物還可以作為整聯(lián)蛋白配體用于制備在整聯(lián)蛋白純化中使用的親和色譜法的色譜柱。包含抗生物素蛋白-衍生的載體材料例如瓊脂糖和所述新化合物的復(fù)合物通過本身已知的方法制備(例如E.A.Bayer和M.Wilchek，Methods of Biochemical Analysis 26卷抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物作為分子生物學(xué)工具的用途)。此處合適的聚合物載體材料是肽化學(xué)中本身已知的聚合物固相，優(yōu)選具有親水性能的聚合物固相，例如交聯(lián)多糖如纖維素、瓊脂糖或交聯(lián)葡聚糖(SephadexR)、丙烯酰胺、基于聚乙二醇的聚合物或TentakelpolymereR。
實(shí)施例在上下文中，所有溫度均以℃給出。
在下列系統(tǒng)中進(jìn)行HPLC分析(保留時間Rt)色譜柱5μm，LichroSpher 60 RP-Select B(250-4)，50分鐘的梯度為0-80％的乙腈水溶液/0.1％三氟乙酸，流速為1ml/分鐘，在215nm處檢測。
質(zhì)譜(MS)EI(電子碰撞電離)M+FAB(快原子轟擊)(M+H)+實(shí)施例1Ac-Arg-Dap-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2的合成a)將1g氨基呫噸基樹脂(Novabiochem)與Fmoc-Arg(Pbf)/HOBt/DIC一起在10ml DMF中溶脹并在室溫下振搖2小時。對于后處理，將固相濾出并用二氯甲烷、DMF、二氯甲烷和甲醇各洗3次，減壓干燥。
b)將固相混懸在DMF中，然后加入50％的哌啶的DMF溶液，將該混合物在室溫下振搖15分鐘。然后濾出固相，將相同的操作重復(fù)2次。最后，將固相用DMF、二氯甲烷和甲醇各洗3次，在室溫下減壓干燥。
c)對于氨基酸衍生物1.Fmoc-Leu，F(xiàn)moc-Ser(But)，F(xiàn)moc-Asp(OBut)，F(xiàn)moc-Leu，F(xiàn)moc-Asp(OBut)，F(xiàn)moc-Dap(Boc)和7.Fmoc-Arg(Pbf)，使Arg(Pbf)-NH-呫噸基樹脂依次進(jìn)行步驟a和b，得到Arg(Pbf-Dap(Boc)-Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-呫噸基樹脂。
d)將肽基樹脂在10ml DMF/吡啶/乙酸酐(15∶3∶2，體積比)中溶脹，在室溫下15分鐘后將其濾出。對于后處理，將樹脂用DMF、二氯甲烷和甲醇各洗3次，減壓干燥過夜，得到Ac-Arg(Pbf)-Dap(Boc)-Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-呫噸基樹脂。
e)將在氨基端上乙酰化的側(cè)鏈保護(hù)的肽基樹脂與20ml 98％的TFA的水溶液混合，在室溫下振搖3小時。濾出固相，將濾液在37℃下減壓蒸發(fā)至干，用水吸收后將其冷凍干燥，得到絮狀固體形式的所需產(chǎn)物Ac-Arg-Dap-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2。
f)將1e)的粗產(chǎn)物通過RP-HPLC在Lichroprep RP 18上進(jìn)行純化，使用含1-80％2-丙醇的水/0.1％TFA進(jìn)行梯度洗脫。以高純度獲得所需產(chǎn)物，其具有預(yù)期的質(zhì)量，(M+H)+＝1001g/mol。
實(shí)施例2Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2的合成從Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-呫噸基樹脂上裂解出Fmoc，以雙偶聯(lián)方式偶聯(lián)Fmoc-Dap(ivDde)(來自Novabiochem)(2/1當(dāng)量；20/40分鐘)。帽化并洗滌后，用嗎啉/DMF(1∶1)(100ml，在25分鐘內(nèi))裂解出Fmoc保護(hù)基，以所述方式偶聯(lián)Fmoc-Arg(Pbf)。
正常地裂解出Fmoc，進(jìn)行帽化(乙?；?和洗滌。Kaiser試驗(yàn)顯陰性。用2％的在DMF中的肼裂解ivDde保護(hù)基10分鐘(10ml/分鐘)Kaiser試驗(yàn)顯陽性。進(jìn)行洗滌和干燥；產(chǎn)量為2.19g。
將部分側(cè)保護(hù)的Ac-Arg(Pbf)-Dap-Asp(OBut)-Leu-Asp(OBut)-Ser(But)-Leu-Arg(Pbf)-NH-呫噸基樹脂等分成16份，每份130mg，用DCM短暫溶脹。
在Eppendorf管中，將相應(yīng)的磺酰氯溶于1.5ml DCM，加入5當(dāng)量DIEA。將該溶液加入樹脂中。如果1小時后Kaiser試驗(yàn)仍略顯陽性，則濾出樹脂，以相同方式進(jìn)行洗滌和重新偶聯(lián)。用DMF、DCM和異丙醇充分洗滌并干燥。
在每種情況下用6ml TFA/水/TIS(94/3/3)裂解2小時、過濾并用RP-HPLC純化，得到游離的肽衍生物；例如使用苯磺酰氯時，得到產(chǎn)物Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2。
實(shí)施例3類似于實(shí)施例2，還制備了下列產(chǎn)物，因?yàn)橥ㄟ^使用相應(yīng)的Fmoc-氨基酸衍生物代替Fmoc-Dap(ivDde)和使用相應(yīng)的酰化試劑代替苯磺酰氯獲得了肽Ac-Arg-X-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2的2位上的氨基酸X。在肽合成中，它們也可以通過使用現(xiàn)成的氨基酸衍生物如Fmoc-Dap(SO2Ph)-OH(和其類似物)來制備。
根據(jù)Eur.J.Biochem.138，9-37(1984)命名氨基酸DHPLC系統(tǒng)溶劑A＝0.1％TFA；B＝80％乙腈/0.1％TFA；梯度1％B至99％B，在50分鐘內(nèi)；柱Merck，LiChrosphere 60250-4，RP-select B5μm；流速1ml/分鐘；檢測215nm。
實(shí)施例4可溶性物質(zhì)對生物素化纖連蛋白與αvβ6結(jié)合的影響在溶液中將根據(jù)本發(fā)明制得的肽以及競爭性纖連蛋白與固定的αvβ6受體結(jié)合，測定Q值，作為供試肽與αvβ6結(jié)合的選擇性的量度。由供試肽和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的IC50值的比值計算得到Q值。所用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是直鏈Ac-RTDLDSLR-NH2(WO01/00660；Pytela等，1986，Science 231，1559)。
如以下所詳細(xì)描述的那樣進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)通過用TBS++稀釋蛋白質(zhì)溶液、然后在4℃下溫育過夜將αvβ6在微量滴定板上固定(100μl/孔)。通過用3％(重量/體積)BSA的TBS++溶液(200μl/孔)溫育(2小時；37℃)阻斷非特異性結(jié)合點(diǎn)。通過用TBSA++洗滌3次除去過量的BSA。用TBSA++將肽連續(xù)稀釋(1∶10)，與具有固定整聯(lián)蛋白的生物素化纖連蛋白(2μg/ml)一起溫育(50μl肽+50μl配體/孔；2小時；37℃)。
通過用TBSA++洗滌3次除去未結(jié)合的纖連蛋白和肽。通過與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗生物素抗體(1∶20000，在TBSA++中；100μl/孔)一起溫育(1小時；37℃)檢測結(jié)合的纖連蛋白。用TBSA++洗滌3次后，通過與底物溶液(5mg磷酸硝基苯酯，1ml乙醇胺，4ml H2O(100μl/孔))一起溫育(10-15分鐘；25℃；在暗處)進(jìn)行比色測定。通過加入0.4M NaOH(100μ/孔)停止酶反應(yīng)。用ELISA測定儀器在405nm處測定顯色強(qiáng)度并用空白值進(jìn)行校正。所用的空白值是未被受體包被的那些孔的值。每個實(shí)驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是IC50值＜100nM的Ac-RTDLDSLR-NH2。
由圖表讀出供試肽的IC50值，由該值和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的IC50值確定肽的Q值。
在這些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)所合成的許多化合物對整聯(lián)蛋白αvβ6具有亞微摩爾至毫微摩爾的親和力(見表1)。
表1
表1Q值＝供試肽的IC50/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的IC50將重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Q值求平均值下列實(shí)施例涉及藥物組合物實(shí)施例A注射小瓶用2N鹽酸將100g本發(fā)明的式I化合物和5g磷酸氫二鈉在3升重蒸水中的溶液調(diào)至pH6.5，無菌過濾，轉(zhuǎn)入注射小瓶中，在無菌條件下冷凍干燥并在無菌條件下封口。每個注射小瓶含有5mg活性成分。
實(shí)施例B栓劑將20g本發(fā)明的式I化合物與100g大豆卵磷脂和1400g可可脂融化，倒入模具中并使其冷卻。每枚栓劑含有20mg活性成分。
實(shí)施例C溶液劑制備1g本發(fā)明的式I化合物、9.38g NaH2PO4·2H2O、28.48gNa2HPO4·12H2O和0.1g苯扎氯銨在940ml重蒸水中的溶液。將pH值調(diào)至6.8，將溶液定容至1升并輻射滅菌。該溶液可以以滴眼劑形式使用。
實(shí)施例D軟膏劑將500mg本發(fā)明的式I化合物與99.5g凡士林在無菌條件下混合即得。
實(shí)施例E片劑將1kg本發(fā)明的式I化合物、4kg乳糖、1.2kg馬鈴薯淀粉、0.2kg滑石粉和0.1kg硬脂酸鎂的混合物用常規(guī)方法壓制得到片劑，這樣，每片含有10mg活性成分。
實(shí)施例F包衣片劑類似于實(shí)施例E壓制片劑，之后用常規(guī)方法以蔗糖、馬鈴薯淀粉、滑石粉、西黃蓍膠和染料包衣液進(jìn)行包衣。
實(shí)施例G膠囊劑將2kg本發(fā)明的式I化合物用常規(guī)方法灌裝入硬明膠膠囊中，這樣，每粒膠囊含有20mg活性成分。
實(shí)施例H安瓿劑將1kg本發(fā)明的式I化合物在60升重蒸水中的溶液無菌過濾，在無菌條件下轉(zhuǎn)入安瓿中、冷凍干燥，并在無菌條件下封口。每支安瓿含有10mg活性成分。
實(shí)施例I吸入噴霧劑將14g本發(fā)明的式I化合物溶解在10升等張的NaCl溶液中，將該溶液轉(zhuǎn)入市售可得的帶有泵機(jī)制的噴霧容器中。該溶液可噴入口或鼻中。一次噴射(約0.1ml)相當(dāng)于約0.14mg劑量。
權(quán)利要求
1.式I的肽化合物R1-Arg-X-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-R2I其中R1表示H、乙酰基或?；?，且R2表示-OH、OR3NH2、NHR3、N(R3)2，R3表示烷基、芳烷基、芳基、Het且X表示式II的氨基酸 其中A表示(CH2)n，R4表示H、烷基、芳烷基或芳基，且n表示1、2、3、4、5或6，且式II的氨基酸通過α-氨基的肽鍵與相鄰的Arg相連接，并通過α-羧基的肽鍵與相鄰的Asp的α-氨基相連接，和其可藥用的前藥、衍生物、溶劑化物、立體異構(gòu)體以及它們的鹽，包括其所有比例的混合物。
2.權(quán)利要求1的肽化合物，其選自Ac-Arg-Dap(Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(F5-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(2-NO2-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(4-NO2-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(2，4-NO2-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(6-OMe-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(2-CF3-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(3-CF3-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(Me5-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(4-tBu-PSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(BSA)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(iPrs)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(1-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(2-Nap)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，Ac-Arg-Dap(4-Ph-Psa)-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2，和其可藥用的前藥、衍生物、溶劑化物、立體異構(gòu)體以及它們的鹽，包括其所有比例的混合物。
3.用作藥物的權(quán)利要求1或2之一的式I化合物。
4.一種藥物，其包含有效量的權(quán)利要求1或2之一的式I化合物，還任選地包含一種或多種惰性的賦形劑、輔劑和/或稀釋劑。
5.權(quán)利要求4的藥物，其特征在于存在至少一種其它藥物活性成分。
6.制備權(quán)利要求4或5的藥物的方法，其特征在于通過非化學(xué)方法將權(quán)利要求1或2之一的式I化合物和任選地其它藥物活性成分摻入一種或多種惰性的賦形劑和/或稀釋劑中。
7.權(quán)利要求1或2之一的式I化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防和/或治療血小板整聯(lián)蛋白GPIIbIIIa和/或αv整聯(lián)蛋白、優(yōu)選αvβ6和/或αvβ3整聯(lián)蛋白在其中發(fā)揮作用的疾病。
8.權(quán)利要求7的式I化合物的用途，其特征在于所述的疾病選自循環(huán)系統(tǒng)疾病如肺栓塞、血栓形成，特別是深靜脈血栓形成、心肌梗塞、動脈硬化、夾層動脈瘤、短暫性缺血發(fā)作、卒中、心絞痛，特別是不穩(wěn)定型心絞痛、器官的病理性結(jié)締組織增生或纖維化，特別是肺纖維化，還有囊性纖維化、皮膚纖維化、肝纖維化、肝硬化、尿道纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、嬰兒心內(nèi)膜纖維化、胰腺纖維化、皮膚的角化病癥、粘膜白斑病、扁平苔癬和鱗狀細(xì)胞癌、腫瘤疾病如實(shí)體瘤和血液或免疫系統(tǒng)的瘤發(fā)生、瘤血管生成或瘤轉(zhuǎn)移，例如皮膚腫瘤、鱗狀細(xì)胞癌、血管腫瘤、胃腸道腫瘤、肺腫瘤、乳腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、脾腫瘤、胰腺腫瘤、腦腫瘤、睪丸腫瘤、卵巢腫瘤、子宮腫瘤、陰道腫瘤、肌肉腫瘤、骨腫瘤以及喉和頭部的腫瘤、溶骨性疾病如骨質(zhì)疏松、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、佩吉特病、惡性高鈣血癥、血型不相容性輸血、病理性血管生成疾病如例如炎癥、眼科疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、近視、角膜移植、紅眼性青光眼、眼組織胞漿菌病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、動脈粥樣硬化、銀屑病、再狹窄，特別是血管成形術(shù)后再狹窄、多發(fā)性硬化、妊娠、absumptio placentaris、病毒感染、細(xì)菌感染、酵母菌感染和真菌感染、口蹄疫、HIV、炭疽、白色念珠菌、急性腎衰竭，并在創(chuàng)傷愈合中用于支持愈合過程。
9.由獨(dú)立包裝的以下物質(zhì)組成的藥盒(a)有效量的權(quán)利要求1或2之一的式I化合物，和(b)有效量的其它藥物活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的肽，其具有作為血小板整聯(lián)蛋白GPIIbIIIa和α
文檔編號A61K38/08GK1747966SQ200480003483
公開日2006年3月15日 申請日期2004年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月6日
發(fā)明者A·約恩齊克, U·格羅特, G·齊斯恩斯基 申請人:默克專利有限公司