專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用病毒載體生產(chǎn)狂犬病活載體疫苗的方法，特別是一種利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法。
背景技術(shù)：
狂犬病(rabies)是由狂犬病毒引起的人獸共患病傳染病，一旦發(fā)病，則100％死亡。到目前為止無(wú)特效治療藥物，有效的辦法只有注射疫苗進(jìn)行預(yù)防，因此對(duì)狗、貓和野生動(dòng)物的大面積的預(yù)防免疫是控制和消滅狂犬病的根本措施。目前我國(guó)獸用的狂犬病疫苗主要有滅活苗和弱毒苗。盡管傳統(tǒng)疫苗在狂犬病預(yù)防控制中仍占主導(dǎo)地位，但由于生產(chǎn)成本昂貴，免疫期短，因滅活不徹底而造成散毒的潛在危險(xiǎn)等因素的存在，研制安全、高效的新型狂犬病分子疫苗仍顯得非常必要?？袢』蚬こ桃呙缇哂邪踩?、高效、生產(chǎn)費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，但目前尚未有狂犬病基因工程疫苗上市。綜合狂犬病分子疫苗的研究現(xiàn)狀，我們認(rèn)為以腺病毒為表達(dá)載體的基因工程重組狂犬病疫苗(或稱(chēng)活載體疫苗)具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，從而獲得安全、高效的狂犬病疫苗。
本發(fā)明的目的是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明為利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是1、它包括以下過(guò)程
一、制備目的基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增出狂犬病病毒(rabies virus，RV)抗原蛋白G基因與N基因；二、構(gòu)建重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體將所述的抗原蛋白G基因與N基因插入到復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體特異性啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)建成含有融合基因G+N的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV/G+N；三、獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒將獲得的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV/G+N與腺病毒骨架載體pAdEasy-1通過(guò)在大腸桿菌中質(zhì)粒間同源重組從而得到重組腺病毒質(zhì)粒；四、用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒，包括以下操作1)酶切，用Pac I酶切腺病毒質(zhì)粒，2)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，3)接種293細(xì)胞，4)凍存，將基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒凍存；將所述的重組腺病毒制成狂犬病活載體疫苗，直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫。
2、在所述的過(guò)程四之外，還有檢測(cè)過(guò)程五包括檢測(cè)抗原蛋白(G+N)基因已經(jīng)整合到腺病毒載體中，和檢測(cè)抗原蛋白(G+N)融合基因獲得表達(dá)。
3、在所述的過(guò)程一中所設(shè)計(jì)的抗原蛋白G基因與N基因的擴(kuò)增引物為，G15’Cgg gTA CCT CTA CCA Tgg TTC CTC Agg TT 3’Kpn I酶切位點(diǎn)
G25’ATg Cgg CCg CgC TCA Cag TCT gAT CTC 3’Not I酶切位點(diǎn)N15’AACg Cgg CCg CAC CCC TAC CAT ggA TgC C 3’Not I酶切位點(diǎn)N25’CggTCTA gAATT gCA CTC ggA T TAA CAA Ag 3’Xba I酶切位點(diǎn)其中，ATG為起始密碼子；分別以狂犬病毒CVS毒株為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
4、在所述的過(guò)程二中，所述的腺病毒載體啟動(dòng)子為CMV；終止子為polyA；所述的重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建包括以下操作1)將回收得到的目的基因G經(jīng)Kpn I、Not I雙酶切，目的基因N經(jīng)Not I、Xba I雙酶切后，形成帶有粘性末端的目的基因；2)同時(shí)，將腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV經(jīng)Kpn I、Xba I雙酶切，得到線(xiàn)性化的載體；3)使用T4 DNA連接酶對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行粘端連接；4)按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(JM109)，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒；5)采用酶切、PCR擴(kuò)增方法鑒定，得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV/G+N。
5、在所述的過(guò)程三中，所述的獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒的過(guò)程包括以下操作1)將重組穿梭載體分別用Pme I單酶切以線(xiàn)性化；
2)取pAdEasy-1與線(xiàn)性化重組穿梭載體混合，高壓電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183；3)電轉(zhuǎn)后將細(xì)胞在培養(yǎng)液中復(fù)蘇，取細(xì)胞涂入含卡那霉素的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)；4)挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析，并進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析；5)將所得的重組腺病毒質(zhì)粒以上述同樣條件電轉(zhuǎn)化入宿主菌，在此宿主菌中可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒，挑取目的克隆。
6、在所述的操作5)中，所述的宿主菌為DH10B(rec A，end A)。
7、在所述的過(guò)程四中，用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒的各操作的具體做法為1)酶切，取從DH10B中提取的各重組腺病毒質(zhì)粒，用Pac I酶切，完全消化以切去ori和kan抗性基因等質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列ITR；2)轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，在組織培養(yǎng)皿中接種293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；3)接種，取病毒上清接種293細(xì)胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，到293細(xì)胞完全病變；4)凍存，收集病毒感染的病變細(xì)胞，連同上清凍存(于-20℃)。
8、在所述的操作2)轉(zhuǎn)染中，所述的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染包括以下分操作①稀釋Pac I酶切線(xiàn)性化的重組腺病毒質(zhì)粒至DMEM培養(yǎng)液中；②然后將脂質(zhì)體(lipofectAMINE2000)懸液加至DMEM培養(yǎng)液中，充分將二者混勻，室溫下溫育；
③在此期間吸棄細(xì)胞原培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)液洗細(xì)胞一次；④往每平皿加DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，在5％CO2培養(yǎng)箱中溫育后吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，⑤補(bǔ)加含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融。
9、在所述的過(guò)程五中，所述的檢測(cè)基因已經(jīng)整合到腺病毒載體中，其做法是采用PCR和限制性?xún)?nèi)切酶鑒定，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè)。
10、在所述的過(guò)程五中，所述的檢測(cè)G+N融合基因獲得表達(dá)，其做法是采用觀測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)的辦法包括利用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞病變和熒光顯微鏡觀測(cè)報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)。
活載體疫苗是近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一，被認(rèn)為是一種很有開(kāi)發(fā)前景的疫苗。制苗時(shí)往活載體中插入外源保護(hù)性目的基因，由于外源基因已經(jīng)成為作為載體的病毒或細(xì)菌的自身結(jié)構(gòu)的一部分，故所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平通常不低于完整病毒或細(xì)菌相應(yīng)成分所引起的免疫強(qiáng)度。重組痘病毒載體和重組腺病毒載體具有宿主范圍廣，對(duì)外界有一定的抵抗力，被認(rèn)為是基因工程疫苗的優(yōu)良載體。雖然對(duì)重組痘病毒載體的研究起步最早，但由于痘苗病毒能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制，人們對(duì)它的生物安全性存在某種疑問(wèn)，擔(dān)心與天花病毒類(lèi)似的痘苗病毒在動(dòng)物上應(yīng)用會(huì)進(jìn)化出對(duì)人類(lèi)有致病性的新病毒。而復(fù)制缺陷型腺病毒常缺失對(duì)于病毒復(fù)制所必需的病毒早期基因E1區(qū)，使其在動(dòng)物體內(nèi)不能復(fù)制，因此研制重組復(fù)制缺陷型腺病毒狂犬病疫苗更為安全和有效。
狂犬病毒有5種結(jié)構(gòu)蛋白，其中糖蛋白G與病毒的感染和免疫有密切關(guān)系。研究表明G是唯一誘導(dǎo)中和抗體的蛋白，也能刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，可抵抗狂犬病毒外周和腦內(nèi)途徑的攻擊。近年來(lái)研制的狂犬病基因工程重組疫苗，大都以糖蛋白cDNA作為目的基因。這些重組疫苗雖然可以刺激特異性抗體的產(chǎn)生，并產(chǎn)生一定水平的保護(hù)力，但是，單一的糖蛋白G其總體誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平并不高，有待于提高其水平。
核蛋白N是另一種與免疫有關(guān)的蛋白，核蛋白N是除糖蛋白以外具有免疫原性的另一種重要結(jié)構(gòu)蛋白，可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體，并激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，抗核蛋白抗體還能抑制病毒在細(xì)胞間的傳播和在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。核蛋白N雖不能誘生中和抗體，但具有保護(hù)機(jī)體免于狂犬病毒侵擊的作用，也可刺激細(xì)胞免疫，并激活B細(xì)胞產(chǎn)生N抗體和促進(jìn)G產(chǎn)生抗體，使總體誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平顯著提高。因此，我們采用抗原蛋白G基因與N基因構(gòu)建了狂犬病毒CVS毒株G+N雙基因編碼的腺病毒穿梭載體。以總體誘導(dǎo)產(chǎn)生提高的抗體水平，保證重組疫苗的有效性和安全性。建立同時(shí)以糖蛋白G和核蛋白N為基礎(chǔ)的新型疫苗，在核蛋白N的參與下，不僅可以誘導(dǎo)體液免疫，而且還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，從而可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更為全面的免疫應(yīng)答，獲得更好的免疫效果。
構(gòu)建重組腺病毒工作中的限速步驟是將目的基因整合入腺病毒基因組，目前這一關(guān)鍵過(guò)程中大都是以哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組方式實(shí)現(xiàn)的，有一定的難度。同時(shí)，因重組效率不高，所得的重組病毒常常需要空斑純化，故實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，而且也不能保證重組腺病毒基因組結(jié)構(gòu)的均一性。我們利用生長(zhǎng)周期快，操作簡(jiǎn)便的大腸桿菌細(xì)菌實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒間同源，從而很快的獲得均一的重組腺病毒載體。
綜上所述，本發(fā)明重組復(fù)制缺陷型腺病毒狂犬病疫苗較之現(xiàn)有狂犬病疫苗更為安全和有效，制作周期較短。


圖1為重組穿梭載體pAdTrack-CMV/G+N酶切及PCR鑒定圖，圖2為重組腺病毒質(zhì)粒鑒定圖，圖3為利用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞病變圖，圖4為利用熒光顯微鏡觀測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)圖，圖5為表達(dá)重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建圖。
實(shí)施例用本方法制作可以直接接種動(dòng)物的狂犬病復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗。
包括以下過(guò)程參照?qǐng)D5，一、制備目的基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增出狂犬病病毒(rabies virus，RV)抗原蛋白G基因與N基因；在本過(guò)程一中所設(shè)計(jì)的抗原蛋白基因G和抗原蛋白基因N的擴(kuò)增引物為，G15’Cgg gTA CCT CTA CCA Tgg TTC CTC Agg TT 3’Kpn I酶切位點(diǎn)G25’ATg Cgg CCg CgC TCA Cag TCT gAT CTC 3’Not I酶切位點(diǎn)N15’AACg Cgg CCg CAC CCC TAC CAT ggA TgC C 3’Not I酶切位點(diǎn)N25’CggTCTA gAATT gCA CTC ggA T TAA CAA Ag 3’Xba I酶切位點(diǎn)其中，ATG為起始密碼子；分別以狂犬病毒CVS毒株為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
G1位于狂犬病毒CVS株全序列3318處；G2位于狂犬病毒CVS株全序列4893處；
N1位于狂犬病毒CVS株全序列62處；N2位于狂犬病毒CVS株全序列1547處。
二、構(gòu)建重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體將所述的抗原蛋白抗原蛋白G基因與N基因插入到復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體特異性啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)建成含有融合基因G+N的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV/G+N；在本過(guò)程二中，所述的腺病毒載體啟動(dòng)子為CMV；終止子為polyA；所述的重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建包括以下操作1)將回收得到的目的基因G經(jīng)Kpn I、Not I雙酶切，目的基因N經(jīng)Not I、Xba I雙酶切后，形成帶有粘性末端的目的基因；2)同時(shí)，將腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV經(jīng)Kpn I、Xba I雙酶切，得到線(xiàn)性化的載體；3)使用T4 DNA連接酶對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行粘端連接；4)按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒；5)采用酶切、PCR擴(kuò)增等方法鑒定，得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV/G+N。
三、獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒將獲得的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV/G+N與腺病毒骨架載體pAdEasy-1通過(guò)在大腸桿菌中質(zhì)粒間同源重組從而得到重組腺病毒質(zhì)粒；在本過(guò)程三中，所述的獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒的過(guò)程包括以下操作1)將重組穿梭載體分別用Pme I單酶切以線(xiàn)性化；
2)取0.1mg pAdEasy-1與1.0mg線(xiàn)性化重組穿梭載體混合，高壓電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183；3)電轉(zhuǎn)后將細(xì)胞在LB培養(yǎng)液中于37℃復(fù)蘇30min，取細(xì)胞涂入含50mg/ml卡那霉素的培養(yǎng)板中，于37℃培養(yǎng)16~20h；4)挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析，并進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析；5)將所得的重組腺病毒質(zhì)粒以上述同樣條件電轉(zhuǎn)化入宿主菌DH10B(rec A，end A)，在此宿主菌中可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒，挑取目的克隆。
四、用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒，包括以下操作1)酶切，取從DH10B中提取的各重組腺病毒質(zhì)粒4μg，用Pac I酶切，完全消化以切去ori和kan抗性基因等質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列ITR；2)轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，在35mm組織培養(yǎng)皿中接種293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所述的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染包括以下分操作①稀釋Pac I酶切線(xiàn)性化的重組腺病毒質(zhì)粒4μg至250ul DMEM培養(yǎng)液中；②然后將脂質(zhì)體lipofectAMINE2000懸液10μl加至250ul DMEM培養(yǎng)液中，充分將二者混勻，室溫下溫育20min；③在此期間吸棄細(xì)胞原培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)液洗細(xì)胞一次；④往每平皿加500ul DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中溫育3~5h后吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，⑤補(bǔ)加3ml含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次。
3)接種，取病毒上清接種293細(xì)胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變CPE，至293細(xì)胞完全病變；4)凍存，收集病毒感染的病變細(xì)胞，連同上清凍存于-20℃。
檢測(cè)過(guò)程五包括檢測(cè)抗原蛋白G+N基因已經(jīng)整合到腺病毒載體中，和檢測(cè)抗原蛋白G+N融合基因獲得表達(dá)。
所述的檢測(cè)G+N基因已經(jīng)整合到腺病毒載體中，采用PCR和限制性?xún)?nèi)切酶鑒定，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。將所獲得的含有目的基因G+N的重組穿梭載體pAdTrack-CMV/G+N經(jīng)Kpn I、Xba I雙酶切鑒定可切出約3.0KB的目的片段(圖1A)。同時(shí)PCR鑒定也可擴(kuò)增出大小相符的G基因和N基因目的片段(圖1B)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)比可判斷。同源重組后檢測(cè)目的基因已經(jīng)整合入腺病毒載體，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析可見(jiàn)重組質(zhì)粒明顯落后于骨架載體(圖2A)，限制性?xún)?nèi)切酶酶切后可見(jiàn)約4.5KB和33KB的條帶，其結(jié)果與預(yù)期相符(圖2B)。
所述的檢測(cè)G+N融合基因獲得表達(dá)，采用觀測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)的辦法包括利用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞病變，可見(jiàn)對(duì)照細(xì)胞正常生長(zhǎng)(圖3A)，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(圖3B)。利用熒光顯微鏡可直接觀測(cè)到報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)。其結(jié)果圖4所示。
將經(jīng)檢測(cè)合格的重組腺病毒制成狂犬病活載體疫苗，直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫。
權(quán)利要求
1.一種利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是它包括如下過(guò)程一、制備目的基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增出狂犬病病毒(rabies virus，RV)抗原蛋白G基因與N基因；二、構(gòu)建重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體將所述的抗原蛋白G基因與N基因插入到復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體特異性啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)建成含有融合基因(G+N)的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體(pAdTrack-CMV/G+N)；三、獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒將獲得的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體(pAdTrack-CMV/G+N)與腺病毒骨架載體(pAdEasy-1)通過(guò)在大腸桿菌中質(zhì)粒間同源重組從而得到重組腺病毒質(zhì)粒；四、用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒，包括以下操作1)酶切，用Pac I酶切腺病毒質(zhì)粒，2)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，3)接種293細(xì)胞，4)凍存，將基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒凍存；將所述的重組腺病毒制成狂犬病活載體疫苗，直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的過(guò)程四之外，還有檢測(cè)過(guò)程五包括檢測(cè)抗原蛋白(G+N)基因已經(jīng)整合到腺病毒載體中，和檢測(cè)抗原蛋白(G+N)融合基因獲得表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的過(guò)程一中所設(shè)計(jì)的抗原蛋白基因G和抗原蛋白基因N的擴(kuò)增引物為，G15’Cgg gTA CCT CTA CCA Tgg TTC CTC Agg TT 3’KpnI酶切位點(diǎn)G25’ATg Cgg CCg CgC TCA Cag TCT gAT CTC 3’NotI酶切位點(diǎn)N15’AACg Cgg CCg CAC CCC TAC CAT ggA TgC C 3’NotI酶切位點(diǎn)N25’CggTCTA gAATT gCA CTC ggA T TAA CAA Ag 3’XbaI酶切位點(diǎn)其中，ATG為起始密碼子；分別以狂犬病毒CVS毒株為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的過(guò)程二中，所述的腺病毒載體啟動(dòng)子為CMV；終止子為polyA；所述的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體的構(gòu)建包括以下操作1)將回收得到的目的基因(G)經(jīng)Kpn I、Not I雙酶切，目的基因(N)經(jīng)NotI、XbaI雙酶切后，形成帶有粘性末端的目的基因；2)同時(shí)，將腺病毒穿梭載體(pAdTrack-CMV)經(jīng)Kpn I、Xba I雙酶切，得到線(xiàn)性化的載體；3)使用T4 DNA連接酶對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行粘端連接；4)按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(JM109)，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質(zhì)粒；5)采用酶切、PCR擴(kuò)增方法鑒定，得到陽(yáng)性重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體(pAdTrack-CMV/G+N)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的過(guò)程三中，所述的獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒的過(guò)程包括以下操作1)將重組穿梭載體分別用Pme I單酶切以線(xiàn)性化；2)取pAdEasy-1與線(xiàn)性化重組穿梭載體混合，高壓電轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BJ5183)；3)電轉(zhuǎn)后將細(xì)胞在培養(yǎng)液中復(fù)蘇，取細(xì)胞涂入含卡那霉素的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)；4)挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析，并進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析；5)將所得的重組腺病毒質(zhì)粒以上述同樣條件電轉(zhuǎn)化入宿主菌，在此宿主菌中可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒，挑取目的克隆。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的操作5)中，所述的宿主菌為DH10B(rec A，end A)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的過(guò)程四中，用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒的各操作的具體做法為1)酶切，取從DH10B中提取的各重組腺病毒質(zhì)粒，用Pac I酶切，完全消化以切去ori和kan抗性基因等質(zhì)粒構(gòu)件，并暴露其反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITR)；2)轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，在組織培養(yǎng)皿中接種293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；3)接種，取病毒上清接種293細(xì)胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，到293細(xì)胞完全病變；4)凍存，收集病毒感染的病變細(xì)胞，連同上清凍存(于-20℃)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的操作2)轉(zhuǎn)染中，所述的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染包括以下分操作①稀釋Pac I酶切線(xiàn)性化的重組腺病毒質(zhì)粒至DMEM培養(yǎng)液中；②然后將脂質(zhì)體(lipofectAMINE2000)懸液加至DMEM培養(yǎng)液中，充分將二者混勻，室溫下溫育；③在此期間吸棄細(xì)胞原培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)液洗細(xì)胞一次；④往每平皿加DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，在5％CO2培養(yǎng)箱中溫育后吸棄含DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)液，⑤補(bǔ)加含10％小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的過(guò)程五中，所述的檢測(cè)基因已經(jīng)整合到腺病毒載體中，其做法是采用PCR和限制性?xún)?nèi)切酶鑒定，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，其特征是在所述的過(guò)程五中，所述的檢測(cè)G+N融合基因獲得表達(dá)，其做法是采用觀測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)的辦法包括利用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞病變和熒光顯微鏡觀測(cè)報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)。
全文摘要
一種利用腺病毒載體表達(dá)狂犬病病毒雙基因制備狂犬病活載體疫苗的方法，包括如下過(guò)程一、制備目的基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出狂犬病病毒(rabies virus，RV)抗原蛋白G基因與N基因；二、構(gòu)建腺病毒穿梭載體將抗原蛋白G基因與N基因插入到復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體特異性啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)建成含有融合基因(G+N)的腺病毒穿梭載體(pAdTrack－CMV/G+N)；三、獲得腺病毒質(zhì)粒將獲得的重組復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭載體(pAdTrack－CMV/G+N)與腺病毒骨架載體(pAdEasy－1)通過(guò)同源重組得到重組腺病毒質(zhì)粒；四、用重組腺病毒質(zhì)粒產(chǎn)生基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒，將重組腺病毒制成狂犬病活載體疫苗。本發(fā)明較之現(xiàn)有狂犬病疫苗更為安全和有效，制作周期較短。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1651080SQ200410039540
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2004年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月5日
發(fā)明者柳紀(jì)省, 殷相平, 白銀梅, 胡永浩, 李志勇, 張興旺, 王輝, 蘭喜, 李寶玉, 劉兆弼 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所