專利名稱：大黃素作為過氧化物酶體增長因子活化受體γ激動劑的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種作為過氧化物酶體增長因子活化受體γ(PPARγ)激動劑的藥物，更具體指大黃素(emodin)；以及含有大黃素的藥物用于作為由PPARγ介導的代謝性疾病的預防和治療，如高脂血癥、糖尿病、肥胖癥等。
背景技術：
近年來，在我國隨著人們生活水平質量的不斷提高，飲食結構及生活方式的變化，患有血脂代謝異常的人數(shù)在逐年升高，由此而引發(fā)的高血壓病、高脂血癥、冠心病、糖尿病、肥胖癥等“富裕性疾病”的發(fā)病率亦明顯上升，同時，這類疾病還是威脅中老年人健康的第一大殺手，已經(jīng)引起了全社會的高度重視。有資料顯示，目前，高脂血癥、糖尿病、肥胖癥等密切相關的病癥，其相加總發(fā)病率已達10％。我國90年代初期與80年代相比，人群血脂水平明顯增加，尤其在北方大城市，約30～40％的人患有不同程度的超過邊緣性標準的血脂和血糖代謝異常。因此，在全社會范圍內(nèi)重視、控制這類疾病已勢在必行。
近十年來的研究表明，核受體PPAR(Peroxisome Proliferator-activated Receptors)又稱過氧化物酶體增長因子活化受體，是一類由配體激活的核轉錄因子，屬II型核受體超家族成員，能被脂肪酸以及外源性過氧化物酶體增殖劑(Peroxisome Proliferator，PP)激活。在兩棲類、嚙齒類動物及人類等PPAR s均有3種亞型，即PPARα、PPARβ(亦稱PPARδ或NUC1)和PPARγ。PPAR介導的效應主要包括脂類代謝、免疫反應等，因此，動脈粥樣硬化、肥胖、糖尿病、腫瘤以及炎癥性疾病等的發(fā)生發(fā)展與PPAR有密切關系。
PPAR的不同亞型具有不同的生物學作用，PPARα在肝臟脂類代謝中發(fā)揮重要作用，PPARβ在脂肪細胞分化中的作用還存在著爭議，而PPARγ參與脂肪形成和免疫反應，與脂肪細胞分化、肥胖及胰島素抵抗關系密切，被認為是治療糖尿病、肥胖癥、壞脂血癥、炎癥、高血壓和癌癥藥物設計的重要靶標分子，成為近年來研究熱點。
對于PPARγ激動劑的研究主要集中在其在治療II型糖尿病方面的應用。胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物(TZDs)作為PPARγ的一類激動劑可以明顯降低白色脂肪組織(WAT)中甘油三酯的含量，同時還可降低血漿中的葡萄糖，脂質和II型糖尿病實驗動物的胰島素水平。三類TZD類藥物羅格列酮rosiglitazone(Rezulin)，皮格列酮piogitazone(ACTOS)和曲格列酮Troglitazone(Avandia)已被FDA認證通過，作為治療II型糖尿病的藥物已經(jīng)在市場上銷售。至于PPARγ拮抗劑，理論上可減少脂肪、防治肥胖，但臨床尚未應用。
近年來，研究的熱點又集中在天然PPARγ激動劑的發(fā)現(xiàn)上。從傳統(tǒng)的中藥中發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑并作為治療相關性疾病的藥物是現(xiàn)在研究的另一個熱點。我們從中藥決明子的乙醇提取物中，采用硅膠層析，凝膠過濾等技術分離得到一個黃色粉末，通過波譜技術鑒定為大黃素；并采用酵母雙雜交技術對其進行了PPARγ激動劑的活性測試。
有關大黃素的活性報道比較多，其藥理作用廣泛，如瀉下作用，保肝作用，參與胰腺組織的再生和修復，利尿作用，抗菌，抗病毒，抗腫瘤，抗炎以及雌激素樣作用，并且能與雌激素受體有高度的親和力，激動受體產(chǎn)生生物效應，此外，大黃素還能抑制亞油酸系統(tǒng)的脂質過氧化作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供大黃素作為PPARγ激動劑的藥物。
本發(fā)明從中藥決明子Cassia obtusifolia L.中，經(jīng)有機溶劑回流，分離、純化得到一種黃色針狀結晶，經(jīng)紫外光譜、紅外光譜及核磁共振氫譜和碳譜鑒定為大黃素(emodin)，化學名為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌(1，3，8-trihydroxy-6-methyl lanthraquinone)，結構式如下 1.理化性質及波譜數(shù)據(jù)黃色針狀結晶，熔點255～257℃；IRmax(KBr)cm-13429，1684，1632，1558，1541，1485；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ12.18(1H，s，OH-8)，12.11(1H，s，OH-1)，10.82(1H，s，OH-6)，7.75(1H，s，H-5)，7.56(1H，s，H-4)，7.07(1H，s，H-2)，6.62(1H，s，H-7)，2.57(3H，s，MeO-3)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ161.7(C-1)，113.1(C-1a)，123.7(C-2)，147.5(C-3)，120.3(C-4)，132.6(C-4a)，108.6(C-5)，134.7(C-5a)，165.4(C-6)，107.8(C-7)，164.7(C-8)，189.8(C-9)，109.1(C-8a)，181.3(C-10).
經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)大黃素具有PPARγ激動劑的作用。因此本發(fā)明的技術方案如下大黃素作為PPARγ激動劑的應用。
2.基于表面膜共振生物傳感器技術對大黃素與PPARγ結合活性分析采用Biacore 3000對大黃素特異結合PPARγ的分析結果得到的其KD值(dissociationconstant)為3.28μM(見圖1)。這一結果說明大黃素能夠特異性與PPARγ結合。
3.采用酵母雙雜交技術分析大黃素對PPARγ激動活性關鍵的實驗操作方法酵母液體培養(yǎng)基(無亮氨酸和色氨酸)的制備參見酵母克隆手冊(www.clontech.com)；大黃素和陽性化合物皮格列酮溶于二甲亞砜濃度為10mM。酵母菌株AH109(plc2)包含兩個質粒，分別為pGADT7-CBP和PGBKT7-PPARγLBD。
接P1C2于T-L-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)過夜，T-L-液體培養(yǎng)基稀釋后，按1∶100分別加入羅格列酮(10mM)、DMSO以及待篩藥物大黃素(10mM)，30℃孵育12h后，進行α-半乳糖苷酶活性測定。
結果見圖2。由酵母篩選結果(圖2)可以看到大黃素對PPARγ有激動活性，并且呈現(xiàn)很好的量效關系曲線，其活性比陽性化合物皮格列酮略差些。
由以上的Biacore和酵母雙雜交實驗結果說明大黃素對PPARγ有結合活性并且能夠作為PPARγ的激動劑。鑒于PPARγ參與脂肪形成和免疫反應，與脂肪細胞分化、肥胖及胰島素抵抗關系密切，被認為是治療糖尿病、肥胖癥、壞脂血癥、炎癥、高血壓和癌癥藥物設計的重要靶標分子，所以大黃素可以作為預防和治療與PPARγ相關的代謝障礙疾病如糖尿病、肥胖癥、壞脂血癥、炎癥、高血壓等的藥物。


圖1 通過表面膜共振技術(Biacore 3000)對大黃素特異結合PPARγ分析。PPARγ耦聯(lián)于CM5芯片上，大黃素的濃度分別為0.625，1.25，2.5，5.0和10.0μM。配體注入時間為60秒，解離時間超過120秒。
圖2大黃素和陽性化合物皮格列酮的量效關系曲線。大黃素(■)，皮格列酮(▲)。每個濃度為3個重復。
具體實施例方式
下面具體實施例的方法已經(jīng)申請專利(PPARγ拮抗劑和激動劑的篩選方法，申請?zhí)?00310122706.7)。
1×10-62×10-66×10-68×10-61×10-51.5×10-52×10-52.5×10-53×10-5濃度 (M)下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括酵母菌株AH109(基因型為MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4，gal80 LYS2∷GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，MEL1UAS-MEL1TATA-MEL1，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3∷MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ)、酵母表達質粒pGBKT7和pGADT7為中科院上海生命科學學院龔毅教授惠贈；模板CMV-mCBP由M.G.Rosenfeld提供；
模板pCDNA3.1-PPARγ由成都地奧公司提供；限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶、dNTP等均購自TaKaRa公司；10×buffer隨pyrobestTMDNA聚合酶一起購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自華舜公司；氨芐西林、卡那霉素、LiAc、PEG 3500、PNP-α-Gal、各培養(yǎng)基的配制原料均購自sigma公司；SS-carrier DNA購自Strategene；DNA marker購自鼎國生物公司；引物合成與DNA測序由上海博亞公司完成；96孔板購自Nunclon公司。
下述實施例中常規(guī)的基因操作參照有關文獻，其中限制性酶切方法參照分子克隆第二版P259-P262；用T4DNA連接酶連接方法參照分子克隆第二版P282-P283；連接產(chǎn)物轉化入感受態(tài)細胞DH5α方法參照分子克隆第二版P55-P56；用酶切鑒定方法參照分子克隆第二版P259-P262；此外瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物方法參照(PCR方法參照分子克隆第二版P680-P682)；膠回收按照華舜公司的試劑盒說明書；質粒提取方法參照C.Hoffmanand F.Winston，Gene 57267；1987；LB培養(yǎng)基的配制方法參照分子克隆第二版P908；酵母各培養(yǎng)基的配制方法參照Yeast Protocol Handbook(CLONTECH)。
實施例1 CBP和酵母GAL4AD融合蛋白(pGADT7-CBP)的質粒構建1)以CMV-mCBP為模板，用PCR技術復制擴增獲得CBP(1-464aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)S66385(GENEBANK))引物設計FW5’AACATATGATGGCCGAGAACTTGCTGGACG 3’RV5’AAGGATCCCTGTTGCCCTGCACCAACAG 3’PCR擴增反應(100μl)CMV-mCBP模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；DNA聚合酶1μl；水71μl。
反應條件為95℃變性8min，開始循環(huán)95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min30s，重復30循環(huán)，72℃ 10min。
采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
2)將CBP(1-464aa)的PCR產(chǎn)物克隆到pGADT7載體上CBP(1-464aa)的PCR產(chǎn)物和pGADT7分別用Nde I和BamH I酶切；用試劑盒方法回收酶切產(chǎn)物，其中回收CBP(1-464aa)的PCR酶切產(chǎn)物近1400bp；pGADT7酶切產(chǎn)物近8.0kb；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉化入感受態(tài)細胞DH5α；涂布在含氨芐西林(100mg/l)的平板上；用酶切鑒定挑選正確的克隆(用酶切鑒定方法參照分子克隆第二版P259-P262)。
實施例2 PPARγLBD和酵母GAL4BD融合蛋白(pGBKT7-PPARγLBD)的構建以pCDNA3.1-PPARγ為模板，用PCR技術復制擴增獲得PPARγLBD(193aa-475aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)NM005037(GENEBANK))引物設計FW5’AACATATGGCGGAGATCTCCAGT 3’RV5’AAGTCGACCTAGTACAAGTCCTT 3’PCR擴增反應(100μl)pCDNA3.1-PPARγ模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；pyrobest聚合酶1μl；水71μl。
反應條件為95℃變性8min，開始循環(huán)95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min30s，重復30循環(huán)，72℃ 10min。
采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
2)將PPARγLBD的PCR產(chǎn)物克隆到pGBKT7載體上PPARγLBD的PCR產(chǎn)物和pGBKT7分別用Nde I和Sal I酶切；用試劑盒方法回收酶切產(chǎn)物(回收PPARγLBD的PCR酶切產(chǎn)物近850bp；pGBKT7酶切產(chǎn)物近7.3kb)；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉化入感受態(tài)細胞DH5α；涂布在含卡那霉素(50mg/l)的平板上用酶切鑒定，挑選正確的克隆用酶切鑒定挑選正確的克隆(用酶切鑒定方法參照分子克隆第二版P259-P262)。
實施例3 將pGADT7-CBP與pGBKT7-PPARγLBD分步轉入酵母細胞AH109中1)按LiAC法(參照分子克隆第二版)將質粒pGBKT7-PPARγLBD轉入酵母細胞AH109接種酵母菌株AH109于約3ml YPDA中，30℃、250rpm培養(yǎng)16-18h(OD600約為1.4)；菌液按1∶5轉接于新鮮的YPDA中，30℃、200rpm培養(yǎng)5-7h(OD600至0.8～1.2)；取10ml菌液，4000rpm*5min離心收集酵母細胞；棄上清，1ml無菌水重懸，轉移入另一離心管中，再加入約10ml無菌水，混勻；4000rpm*5min再次離心收集酵母細胞；棄上清，1ml無菌水重懸，轉移入1.5ml eppendorf管中；4000rpm*5min再次離心收集酵母細胞，小心吸去上清；依次加入240ul PEG 3500(50％W/V)、36ul 1.0M LiAc(pH7.5)、5ul煮沸的SS-carrier DNA(10mg/ml)、60ul無菌水和10ul待轉化質粒。
劇烈振蕩1min；30℃靜置30min；42℃水浴靜置30min，每隔5min顛倒混勻一次；4000rpm*5min離心收集轉化的酵母細胞；
吸去上清，1ml無菌水重懸，取200ul涂于涂布于色氨酸缺陷(以下簡稱為T-)的選擇平板上，30℃培養(yǎng)3-4d；2)鑒定攜帶pGBKT7-PPARγLBD質粒的陽性克隆以上T-選擇平板上長出的克隆中，挑取1-2號(pGADT7-CBP克隆1號；包含兩個質粒的-PPARγLBD&pGADT7-CBP陽性克隆2)至T-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)16-18h；收集酵母，提取質粒，PCR鑒定所提質粒引物序列FW5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’RV5’TCCGAGTCACTTTAAAATTTGTAT 3’PCR擴增反應(20μl)模板(所提質粒)14μl；10×buffer2μl；dNTP(2.5mM)2μl；FW1μl；RV1μl；taq DNA polymerase0.5μl。
反應條件為95℃變性5min，開始循環(huán)95℃ 45s；50℃ 45s；72℃ 1min，重復35循環(huán)，72℃變性10min。
3)PCR鑒定得到擁有pGBKT7-PPARγLBD質粒的陽性克隆1。
4)將質粒pGADT7-CBP轉入到上述1號克隆中接種1號克隆于約3ml T-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)16-18h (OD600約為1.4)；菌液按1∶5轉接于新鮮的T-液體培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)5-7h(OD600至0.8～1.2)；按以上所述步驟轉化1號克隆，最終涂布于色氨酸、亮氨酸雙缺陷(以下簡稱為T-L-)平板，30℃培養(yǎng)3-4d；5)PCR鑒定質粒pGADT7-CBP是否轉入1號克隆挑取T-L-平板上的1-3號克隆至T-L-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm，培養(yǎng)16-18h后提質粒(方法同前)，PCR鑒定引物序列FW5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’RV5’AGATGGTGCACGATGCACAGTT 3’PCR擴增反應(20μl)模板(所提質粒)14μl；10×buffer2μl；dNTP(2.5mM)2μl；FW1μl；RV1μl；taq DNA聚合酶0.5μl。
反應條件95℃變性5min，開始循環(huán)95℃ 45s；50℃ 45s；72℃ 1min，重復35循環(huán)；72℃變性10min6)鑒定得到擁有pGBKT7電泳鑒定-PPARγLBD & pGADT7-CBP兩個質粒的陽性克隆2。
實施例4篩選化合物
1、羅格列酮(陽性化合物)對CBP與PPARγ相互作用影響的鑒定1)將擁有pGBKT7-PPARγLBD質粒的1號克隆(以下簡稱為P1)和擁有雙質粒pGBKT7-PPARγLBD & pGADT7-CBP的2號克隆(以下簡稱P1C2)分別劃線于T-、T-L-平板，30℃培養(yǎng)3-4d后，取新鮮克隆(1-3周)，分別接種于2ml T-、T-L-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm，過夜培養(yǎng)16-18h；2)分別用T-、T-L-液體培養(yǎng)基稀釋P1、P1C2過夜菌(至OD600約0.3)，按1∶100加入羅格列酮(自制合成，溶于二甲亞砜(DMSO)，10mM)或DMSO，實驗分組情況如下表

*每組均設三份平行。
30℃培養(yǎng)6h后，測定α-半乳糖苷酶活性(按照Yeast Protocol Handbook(CLONTECH)進行)混勻酵母培養(yǎng)液，取200ul測定OD 600(HITACHI，分光光度計U-2010)；另取200ul菌液于1.5ml eppendorf管中，10,000rpm*5min離心；取16ul上清于96孔板中(T-、T-L-液體培養(yǎng)基分別用作空白對照)，每孔加入48μl分析緩沖液(100mM PNP-a-Gal水溶液與0.5M醋酸鈉，pH4.5按體積比1∶2混合)；30℃避光孵育30min；加入136ul 10X終止緩沖液(1M Na2CO3)，終止反應；測定410nm處的OD值(BIO-RAD酶標儀MODEL 550)。
α-半乳糖苷酶活性的計算公式為α-半乳糖苷酶活性[mIU/(ml×cell)]＝OD410×Vf×1,000/[(xb)×t×Vi×OD600]其中，t＝反應時間(分)Vf＝測值時的終體積(200ul)Vi＝加入酵母培養(yǎng)液上清的體積(16ul)OD600＝酵母培養(yǎng)液中酵母在600nm處的吸光度xb＝對-硝基苯酚在410nm處的摩爾吸光度×比色杯的底邊邊長(cm)＝10.5(ml/umol)(對于200ul菌液而言)按照試驗1所述的方法，測定各試驗組α-半乳糖苷酶活性，并計算α-半乳糖苷酶相對活性，其公式為
4、藥物篩選接P1C2于T-L-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)過夜，T-L-液體培養(yǎng)基稀釋后，按1∶100分別加入羅格列酮(10mM)、DMSO以及待篩藥物(10mM)，30℃孵育12h后，進行α-半乳糖苷酶活性測定。
權利要求
1.一種結構如下的大黃素及含有該化合物的提取物、組合物的用途在于a、制備由PPARγ介導的代謝性疾病的預防和治療藥物中應用；b、利用對α-半乳糖苷酶相對活性測定對PPARγ激動劑活性，篩選有效藥物；
2.根據(jù)權利要求1所述的大黃素及含有該化合物的提取物、組合物的用途，其特征在于PPARγ介導引起的代謝疾病II型糖尿病、肥胖癥、高脂血癥中應用。
3.根據(jù)權利要求1所述的大黃素及含有該化合物的提取物、組合物的用途，其特征在于利用對α-半乳糖苷酶相對活性測定篩選作為PPARγ激動劑的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及大黃素作為過氧化物酶體增長因子活化受體γ激動劑的應用。大黃素，以及含有該化合物的中藥的提取物、它們的各種組合物，用于制備作為由PPARγ介導的代謝性疾病的預防和治療藥物中應用以及利用對α－半乳糖苷酶相對活性測定對PPARγ激動劑活性篩選有效藥物。
文檔編號A61K31/122GK1709227SQ20041002527
公開日2005年12月21日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權日2004年6月18日
發(fā)明者沈建華, 沈旭, 蔣華良, 陳俊華, 陳晴, 杜毅, 李國偉, 陳凱先 申請人:中國科學院上海藥物研究所