專利名稱：含不同長度b細(xì)胞活化因子基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及五種含不同長度B細(xì)胞活化因子(BAFF)基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一類常見病、多發(fā)病，主要表現(xiàn)為B細(xì)胞過度增殖活化、產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體等多種自身抗體，并通過免疫復(fù)合物等途徑，造成幾乎周身每一系統(tǒng)、器官的受累。該病多發(fā)于20～50歲的中青年女性，據(jù)報(bào)道，我國SLE的患病率接近1‰，全國患病總?cè)藬?shù)高達(dá)100萬。如果診療不及時(shí)，70～80％的SLE患者將出現(xiàn)腎功能衰竭，嚴(yán)重影響了勞動(dòng)力質(zhì)量。
迄今為之，SLE的發(fā)病機(jī)理仍若明若暗，在醫(yī)學(xué)上尚缺乏特異、理想的診療方法，更無合理、有效的阻斷手段。近10年來隨著分子免疫病理學(xué)的發(fā)展，證實(shí)在眾多可能的發(fā)病機(jī)制中，B細(xì)胞過度激活是SLE發(fā)病的關(guān)鍵之所在。目前，作為一種新型的B淋巴細(xì)胞刺激分子，B細(xì)胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)對B細(xì)胞激活的調(diào)控作用已得到廣泛認(rèn)可。
B細(xì)胞活化因子又名B細(xì)胞刺激因子(B-Lymphocyte stimulator，BlyS)，是1999年發(fā)現(xiàn)的一種多功能的免疫新分子，屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族。BAFF主要特異表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等骨髓系細(xì)胞，以及K562、HL-60、THP-1等骨髓單核細(xì)胞起源的腫瘤細(xì)胞株；而且細(xì)胞因子INF-γ、IL-10、IL-4能顯著增強(qiáng)或抑制骨髓系細(xì)胞對BAFF的表達(dá)和分泌。BAFF通過它的三種特異性細(xì)胞膜受體，在促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化發(fā)育、激活和免疫球蛋白產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，特別是在SLE等自身免疫性疾病的發(fā)病過程中扮演著重要角色。由于BAFF對B細(xì)胞激活及SLE等自身免疫病的重要調(diào)控作用，從被發(fā)現(xiàn)至今，BAFF就一直是國際免疫學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。
但是，近幾年來國內(nèi)外有關(guān)BAFF的研究進(jìn)展和趨勢，主要集中于從蛋白質(zhì)和核酸水平對BAFF與SLE免疫病理的關(guān)系進(jìn)行探索，明顯缺乏有關(guān)BAFF基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能分析和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究。而啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的，它決定了外源基因表達(dá)的空間、時(shí)間和表達(dá)的強(qiáng)度等，啟動(dòng)子水平的任何結(jié)構(gòu)異常、或轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的變化，必將會(huì)直接影響mRNA轉(zhuǎn)錄的異常，導(dǎo)致下游蛋白質(zhì)水平的表達(dá)異常。
因此，在分子水平研究BAFF基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的準(zhǔn)確定位、及相應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白的鑒定，對于研究在不同條件下BAFF基因如何被激活轉(zhuǎn)錄，確切闡述BAFF對SLE的致病作用，尋找新的、有效阻斷乃至逆轉(zhuǎn)狼瘡病變的手段/方法有特別重要的意義。所以，制備BAFF基因啟動(dòng)子也具有特別重要的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供五種含不同長度B細(xì)胞活化因子(BAFF)基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒及其制備方法和用途。
本發(fā)明根據(jù)Genebank(AB730224)中的人BAFF基因上游5’側(cè)翼區(qū)-1349～-329bp的片段，經(jīng)程序DNAassist1.0模擬分析該序列可能存在的主要核因子位點(diǎn)后，選擇設(shè)計(jì)出5個(gè)不同長短的啟動(dòng)子，逐段研究人BAFF基因1020bp的啟動(dòng)子序列。以正常人全血基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，定向克隆入不含啟動(dòng)子，但含SV40增強(qiáng)子、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基因的pCAT3-Enhancer載體，構(gòu)建出3’系列缺失的重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109以擴(kuò)增，酶切、測序鑒定后，抽提質(zhì)粒DNA并定量，培養(yǎng)人骨髓白血病細(xì)胞株HL-60，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，將該重組體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中培養(yǎng)48小時(shí)，對細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白定量，用CAT報(bào)告基因ELISA檢測試劑盒測定重組體的CAT活性。
重組質(zhì)粒名稱啟動(dòng)子序列phBAFF1 -1349～-1099bpphBAFF2 -1349～-893bp
phBAFF3-1349～-743bpphBAFF4-1349～-431bpphBAFF5-1349～-329bp經(jīng)分析以上五個(gè)重組體的活性特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)全長型重組啟動(dòng)子phBAFF5(-1349～-329bp)的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)，其余各重組啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的強(qiáng)弱依次為phBAFF3、phBAFF4、phBAFF2、phBAFF1。
本發(fā)明所構(gòu)建的含不同長度BAFF基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒準(zhǔn)確、可靠，為進(jìn)一步研究人BAFF基因激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)；而且報(bào)告基因測活比較重組啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的方法簡單、可以定量，是一個(gè)在轉(zhuǎn)錄水平篩選拮抗/治療SLE的藥物的簡便方法，也為探索SLE的防治提供了新靶向。


圖1是本發(fā)明pCAT3-enhancer載體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)2-A、B、C、D、E是本發(fā)明五個(gè)重組質(zhì)粒酶切后電泳結(jié)果圖3-A、B、C、D、E是本發(fā)明五個(gè)重組質(zhì)粒的測序結(jié)果圖4是人BAFF基因的基因組結(jié)構(gòu)圖5是計(jì)算機(jī)模擬分析可能的主要核因子結(jié)合位點(diǎn)(DNAassist1.0)具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例及附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1含不同長度BAFF基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒的制備及其活性檢測國外研究報(bào)道，人的BAFF基因位于染色體13q34上，包括含285aa的編碼區(qū)、上游5’側(cè)翼區(qū)長約1020bp的啟動(dòng)子區(qū)域、3’和5’端的兩個(gè)非編碼區(qū)、六個(gè)外顯子。而且，BAFF啟動(dòng)子區(qū)域中還存在四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別位于-1283G＞A、-871C＞T、-514T＞C和-353G＞C(見圖4)。據(jù)此，本發(fā)明對人BAFF基因上游1020bp的啟動(dòng)調(diào)控序列進(jìn)行逐段的轉(zhuǎn)錄活性分析。本發(fā)明采用計(jì)算機(jī)軟件(DNA assist1.0)對Genebank所報(bào)道的1020bp的人BAFF基因啟動(dòng)子序列(AccessionAB730224)進(jìn)行主要核蛋白結(jié)合模擬分析提示，存在6個(gè)Sp-1(-329bp、-355bp、-521bp、-1157bp、-1323bp、-1349bp)、5個(gè)NF-1(-329bp、-362bp、-1316bp、-1332bp、-1349bp)、4個(gè)Ap-1(-329bp、-500bp、-1178bp、-1349bp)結(jié)合區(qū)(見圖5)，并考慮到已有報(bào)道的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)-1283G＞A、-871C＞T、-514T＞C和-353G＞C，以此將人BAFF基因上游5’側(cè)翼區(qū)-1349～-329bp的啟動(dòng)序列劃分為-1349～-1099bp、 -1349～-893bp、 -1349～-743bp、 -1349～-431bp、-1349～-329bp這5個(gè)不同長度的啟動(dòng)片段，與含報(bào)告基因CAT但不含啟動(dòng)子的載體組成五個(gè)不同長度的重組體，分別命名為phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5。通過基因轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因測定活性，比較各個(gè)重組體的啟動(dòng)子活性差異，尋找調(diào)控人BAFF基因的高啟動(dòng)活性片段，為研究人BAFF基因激活調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
材料與方法1材料1)主要試劑全血基因組DNA提取試劑盒、ProofSart高保真PCR試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒為美國QIAGEN公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶MluI、Xhol，T4DNA連接酶，DNAmarker均購自大連TakaRa生物工程公司；小量膠回收試劑盒購自MBI公司；Fugene6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、CAT ELISA檢測試劑盒為美國Roche公司產(chǎn)品；小牛血清、GI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，六、十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板為美國Corning公司產(chǎn)品；引物合成、DNA測序分析均由上海聯(lián)合基因生物技術(shù)公司完成。
2)載體、菌株、細(xì)胞株表達(dá)載體pCAT3-enhancer Vector、CAT表達(dá)陽性質(zhì)粒、β-gal質(zhì)粒、大腸桿菌JM109均購自美國Promega公司；人骨髓白血病細(xì)胞株HL-60購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。
3)主要儀器PE-9600 PCR擴(kuò)增儀(美國PE Biosystems公司)，紫外分光光度計(jì)Du-600(美國Backman公司)，水平電泳儀(瑞典Bio-Rad公司)，KUBOTA5420臺式高速離心機(jī)(日本Kubota公司)，550型酶聯(lián)免疫檢測儀(Model550 Microplate Reader，Bio-Rad公司生產(chǎn))。
2實(shí)驗(yàn)方法(一)含不同長度BAFF基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒的制備1)重組體的構(gòu)建pCAT3-enhancer Vector載體質(zhì)粒不含啟動(dòng)子，但含有SV增強(qiáng)子、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基因(見圖1)。重組體內(nèi)所插入的目的片段即為所要研究的BAFF的啟動(dòng)子片段。
2)引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank所報(bào)道的人BAFF的啟動(dòng)子序列(AccessionAB730224)，應(yīng)用程序DNA assist1.0模擬分析該序列可能存在的主要核因子位點(diǎn)、Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。
在引物的兩端分別加入限制性內(nèi)切酶MluI、Xhol的酶切位點(diǎn)，擬插入的片段長度分別為250bp、456bp、606bp、918bp、1020bp，依此構(gòu)建不同長短的人BAFF基因5’側(cè)翼序列(啟動(dòng)子)與pCAT3-enhancer連接的重組體phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5，分別相當(dāng)于人BAFF基因上游啟動(dòng)子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp序列。擴(kuò)增各重組啟動(dòng)子片段的3’端引物分別為phBAFF15’-ATGTCTACGCGTGCTGGTCGGGAGAAGAGG-3’phBAFF25’-ATGTCTACGCGTCGCAAAGCCACAGCGCATCT-3’phBAFF35’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’phBAFF45’-ATGTCTACGCGTAGATCGGCCTGCTGCTCC-3’phBAFF55’-ATGTCTACGCGTAGATCACTTTGGCTGCTGT-3’而5’端的共同引物為5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’引物的5’端分別含有6個(gè)保護(hù)堿基和限制性內(nèi)切酶MluI或Xhol識別位點(diǎn)(下劃線部分)。引物由聯(lián)合基因公司合成。
3)基因組DNA的提取取正常人全血200μl，按照QINGEN公司的“QIAamp DNA blood minikit”試劑盒說明書操作以提取基因組DNA，在紫外分光光度計(jì)上對提取的基因組DNA進(jìn)行定量，分裝-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)目的片段的獲得以基因組DNA為模板，用QINGEN公司的“ProofStart高保真PCR試劑盒”擴(kuò)增各重組體目的片段，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整，具體如下10×PCR buffer5μl2.5mM dNTP6μl10μM正向引物 5μl10μM反向引物 5μlProofStart DNA聚合酶 1μl人基因組DNA(100ng/μl)3μl共計(jì) 50μl反應(yīng)參數(shù) 5)PCR產(chǎn)物的純化PCR產(chǎn)物的純化按MBI公司“小量膠回收試劑盒”說明書操作，預(yù)先按標(biāo)簽提示在Washing Buffer液中加入19倍體積的無水乙醇。
A.DNA片段用1％瓊脂糖凝膠電泳分離；B.對應(yīng)分子量Marker，將欲回收片段的凝膠條切下，放入1.5ml離心管中，加入3倍體積的Bind Solution；C.55℃水浴5分鐘，每2分鐘混勻一次；D.按2μl懸液/μg DNA，加入Silica Powder Suspension懸液，55℃水浴5分鐘，每2分鐘渦懸一次；
E.高速離心1分鐘后，形成片狀沉淀，去除上清；F.加入500μl冰預(yù)冷的Washing Buffer，混勻后離心30秒，去除上清，重復(fù)三次；G.加入50μl TE液，溫和重懸沉淀后，55℃水浴5分鐘；H.離心30秒，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆?；I.取10μl DNA進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；取7μl DNA用純水稀釋10倍，用于紫外分光光度儀定量檢測。
6)酶切、連接目的片段和載體質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶MluI、Xhol同時(shí)用酶切各個(gè)目的片段產(chǎn)物和載體pCAT3-enhancer Vector，酶切反應(yīng)體系和參數(shù)如下DNA片段30μlMluI(10U) 2μlXhol(10U) 2μl10×Buffer 4μl去離子H2O 2μl共計(jì) 40μl載體質(zhì)粒 1μlMluI(10U) 2μlXhol(10U) 2μl10×Buffer 4μl去離子H2O 31μl共計(jì) 40μl37℃作用2小時(shí)，瓊脂糖電泳鑒定酶切效率后，切膠回收酶切后的質(zhì)粒和目的片段，定量。酶切后的目的片段和線性pCAT3-enhancer Vector具有相同的粘末端，經(jīng)T4連接酶連接。連接反應(yīng)體系T4DNA連接酶 1μl質(zhì)粒 300ng目的片段 150ng10×連接反應(yīng)緩沖液 2.5μl補(bǔ)足反應(yīng)體積(25μl)，16℃連接過夜。
7)感受態(tài)細(xì)菌的制備和轉(zhuǎn)化A.將大腸桿菌JM109接種于LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過夜；B.按1∶10比例接種過夜的細(xì)菌培養(yǎng)物于2ml LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3小時(shí)；8000g離心后棄上清，加入400μl 0.1mol/L CaCl2(初始培養(yǎng)物量的1/5)，混勻置冰上冰浴10min；C.4000g離心10min，小心棄去上清回收細(xì)菌。加入初始培養(yǎng)物體積的1/25的0.1mol/L CaCl2，分裝50μl/管；D.加入上述連接產(chǎn)物5μl，混勻，冰浴30分鐘；E.42℃沖擊90秒，冰浴5分鐘，加入800μl LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)40分鐘，振蕩培養(yǎng)3小時(shí)；F.離心，棄部分上清，剩余部分混勻，接種于含抗生素的LB平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h；G.同時(shí)作載體質(zhì)粒、無質(zhì)粒連接產(chǎn)物、酶切質(zhì)粒的對照。
8)重組質(zhì)粒、CAT陽性表達(dá)質(zhì)粒和載體質(zhì)粒的大量擴(kuò)增經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，小量MluI、Xhol雙酶切初步鑒定、基因測序正確后；將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒、CAT陽性表達(dá)質(zhì)粒、載體質(zhì)粒的大腸桿菌JM109在含有氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增陽性克隆。
9)重組質(zhì)粒、CAT陽性表達(dá)質(zhì)粒和載體質(zhì)粒的大量提取由于質(zhì)粒用于下述的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，因此，提取的過程需要嚴(yán)格無菌操作。用QIAGEN公司的“QIAfilter Plasmid Midi Kits”試劑盒大量提取各重組質(zhì)粒，操作均按說明進(jìn)行。預(yù)先將RNaseA加入P1液中至終濃度為100μg/ml，將P3液在4℃預(yù)冷。
A.以50ml無菌離心管收集LB菌液，4500rpm、4℃離心25min，倒盡管內(nèi)沉淀并扣干；B.各管中分別加入P1液4ml，反復(fù)吹打混勻；C.各管中分別加入P2液4ml，溫和顛倒混勻4～6次，室溫靜置5min；D.將QIAGEN收集管的管口用蓋子塞住，并將其放入一合適的離心管中，在含細(xì)菌裂解液的各管中分別加入P3液4ml，溫和顛倒混勻4～6次；E.立即將上述裂解液倒入準(zhǔn)備好的QIAGEN收集管中，室溫靜置10min；F.各用QBT液4ml平衡QIAGEN-tip100柱；G.待此柱完全瀝干時(shí)，取下收集管的蓋子，將收集管連接到QIAGEN-tip100柱上；H.以活塞加壓輕推收集管，使裂解液的上清部分完全流入tip100柱中；I.待裂解液完全從tip100柱中濾出，各用10ml的QC液分別洗脫tip柱兩次；J.換用15ml無菌離心管作收集管，以5ml的QF液洗脫tip柱；K.在上述各15ml無菌離心管中各加0.7倍體積的異丙醇沉淀DNA，混勻后4100rpm、4℃離心1小時(shí)，吸除上清；L.再分別用2ml的70％乙醇濃縮DNA，4100rpm、4℃離心1小時(shí)，仔細(xì)吸除上清，防止破壞DNA沉淀；M.在空氣中干燥10分鐘后，各用2ml的滅菌的TE液(pH8.0)溶解DNA；N.紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA定量。
(二)不同長度BAFF基因啟動(dòng)子的活性分析1)HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)人骨髓白血病細(xì)胞株HL-60用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，選擇第3～8代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2)重組DNA轉(zhuǎn)染DNA轉(zhuǎn)染采用FuGENE6(Roche)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑法，操作按試劑使用說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前一天，HL-60細(xì)胞以3×105細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板。細(xì)胞生長至60％～80％融合時(shí)，換新鮮培養(yǎng)基。將1μg上述5中重組質(zhì)粒、1μg作內(nèi)對照的β-gal陽性表達(dá)質(zhì)粒pSVβ-gal及FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑以復(fù)合物形式轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染1μg的CAT陽性表達(dá)質(zhì)粒作為陽性對照；1μg的pCAT3-enhancer載體質(zhì)粒作為陰性對照。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解、待測CAT報(bào)告基因活性。
3)蛋白定量HL-60細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組體后48h，終止培養(yǎng)的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌3遍，以裂解緩沖液(Roche)裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液以紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白定量。
4)β-gal活性測定100μl細(xì)胞裂解液中加入100μl“β-gal assay 2×buffer”(Promega)混勻，置37℃12小時(shí)，再加入1M碳酸鈉混勻，酶標(biāo)儀420nm測定光密度。
5)CAT活性測定以ELISA試劑盒(Roche)檢測CAT報(bào)告基因的活性，操作按使用說明進(jìn)行。將200μl細(xì)胞裂解液加入已包被抗體的96孔板，反應(yīng)結(jié)束后加入底物顯色，酶標(biāo)儀405nm和492nm測定光密度值。
6)數(shù)據(jù)處理所有CAT測定結(jié)果均用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的摩爾數(shù)、蛋白濃度和β-gal活性進(jìn)行校正，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，采用4次實(shí)驗(yàn)的均值計(jì)算各重組體的相對活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理均采用SAS6.12軟件，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)和方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3結(jié)果1)含不同長度BAFF基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒的鑒定以人BAFF基因上游5’側(cè)翼區(qū)-1349～-329bp片段為靶序列，模板采用正常健康人全血基因組DNA，PCR擴(kuò)增獲得5個(gè)具有相同5’端的長短分別為250bp、456bp、606bp、918bp、1020bp的片段分別作為啟動(dòng)子，與不含啟動(dòng)子的載體pCAT3-enhancer分別組成重組體phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5，這些重組體經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和Xhol酶切鑒定正確(見圖2-A、B、C、D、E)。即載體均為4.3kb的pCAT3-enhancer，插入啟動(dòng)子的長度分別為250bp、456bp、606bp、918bp、1020bp，相應(yīng)于人BAFF基因上游啟動(dòng)子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段。經(jīng)測序，插入片段與GenBank報(bào)道的序列(AccessionAB730224)完全一致(見圖3-A、B、C、D、E)。
圖2中相對分子量指示Marker均為wide range DNA marker(TakaRa)，A、B、C、D、E分別為phBAFF1(250bp)、phBAFF2(456bp)、phBAFF3(606bp)、phBAFF4(918bp)、phBAFF5(1020bp)陽性克隆經(jīng)MluI、Xhol雙酶切后的條帶。
圖3中A、B、C、D、E分別為重組體phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5的正向測序結(jié)果。
2)CAT報(bào)告基因分析不同長度BAFF基因啟動(dòng)子的活性人骨髓白血病細(xì)胞HL-60在轉(zhuǎn)染上述5種含長短不一的啟動(dòng)子的重組體轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，ELISA方法測定細(xì)胞CAT表達(dá)量。同時(shí)測定細(xì)胞裂解液的蛋白濃度及β-gal活性，β-gal活性作為內(nèi)對照以保持轉(zhuǎn)染效率相同條件下比較CAT表達(dá)量。CAT測定結(jié)果用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的摩爾數(shù)、蛋白濃度和β-gal活性校正后，以phBAFF5轉(zhuǎn)染細(xì)胞后CAT表達(dá)量為1，其余重組體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的CAT相對表達(dá)量的結(jié)果見表1。結(jié)果表明，全長型重組啟動(dòng)子phBAFF5(-1349～-329bp)的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)，其余各重組啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的強(qiáng)弱依次為phBAFF3、phBAFF4、phBAFF2、phBAFF1。而且重組體phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4與重組體phBAFF5相比，CAT表達(dá)活性的差異具有顯著性(P＜0.05)。
表1含不同啟動(dòng)子的重組體轉(zhuǎn)染人骨髓白血病細(xì)胞HL-60后CAT的相對表達(dá)量(n＝4，x±s)

權(quán)利要求
1.含B細(xì)胞活化因子基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，其特征在于它由人BAFF基因上游啟動(dòng)子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段和不含啟動(dòng)子、但含氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶CAT報(bào)告基因的載體組成。
2.權(quán)利要求1所述的含B細(xì)胞活化因子基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒的制備方法，包括如下步驟I.擴(kuò)增不同長度的、人B細(xì)胞活化因子基因上游啟動(dòng)子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段的引物設(shè)計(jì)正向引物為5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’反向引物分別為-1349～-1099bp5’-ATGTCTACGCGTGCTGGTCGGGAGAAGAGG-3’-1349～-893bp5’-ATGTCTACGCGTCGCAAAGCCACAGCGCATCT-3’-1349～-743bp5’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’-1349～-431bp5’-ATGTCTACGCGTAGATCGGCCTGCTGCTCC-3’-1349～-329bp5’-ATGTCTACGCGTAGATCACTTTGGCTGCTGT-3’引物的5’端分別含有6個(gè)保護(hù)堿基和限制性內(nèi)切酶Mlu I或Xhol識別位點(diǎn)，即下劃線部分；II.以正常人全血基因組DNA為模板，對人B細(xì)胞活化因子基因上游啟動(dòng)子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段的進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切及純化，將上述目的片段插入不含啟動(dòng)子，但含有SV增強(qiáng)子、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶CAT報(bào)告基因的pCAT3-enhancer Vector載體質(zhì)粒，構(gòu)建重組啟動(dòng)子質(zhì)粒。
3.權(quán)利要求1所述的含B細(xì)胞活化因子基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)錄水平篩選治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的含B細(xì)胞活化因子基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒在研究人B細(xì)胞活化因子基因激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。目前有關(guān)B細(xì)胞活化因子(BAFF)基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能分析和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究尚屬空白，本發(fā)明提供五種含不同長度B細(xì)胞活化因子(BAFF)基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，它由人BAFF基因上游啟動(dòng)子序列的－1349～－1099bp、－1349～－893bp、－1349～－743bp、－1349～－431bp、－1349～－329bp片段和不含啟動(dòng)子，但含氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶CAT報(bào)告基因的載體組成。本發(fā)明還提供了該重組質(zhì)粒的制備方法和用途。本發(fā)明構(gòu)建的含不同長度BAFF基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒準(zhǔn)確、可靠，為進(jìn)一步研究人BAFF基因激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)；而且報(bào)告基因測活比較重組啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的方法簡單、可以定量，是一個(gè)在轉(zhuǎn)錄水平篩選拮抗/治療SLE的藥物的簡便方法，也為探索SLE的防治提供了新靶向。
文檔編號A61P37/00GK1844400SQ200610025719
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月14日
發(fā)明者周琳, 仲人前, 孔憲濤, 王皓, 屠小卿, 朱燁, 郝婉瑩 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)