專利名稱：噬菌體溶菌素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型細菌病毒(噬菌體)溶菌素(lysin)和含有該溶菌素的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及治療與病原性梭菌屬(Clostridium)細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostrdium perfringens)相關(guān)的疾病的方法。
本發(fā)明還涉及破壞病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法。
本發(fā)明還涉及用含有編碼噬菌體溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明還涉及檢測樣品中的梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起包括壞死性腸炎，氣性壞疽和食物中毒的各種疾病的病原性細菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌主要是一種土壤微生物。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的病原性厭氧菌。在體內(nèi)有一些生境(例如，在腸道和口腔)通常是缺氧的，其中可發(fā)現(xiàn)專性厭氧細菌是正常菌群的一部分。然而，引起損傷位置供血減少的組織損傷或外傷可導致身體的其它部位變成缺氧的，然后該缺氧位置可變成適合于諸如產(chǎn)氣莢膜梭菌等專性厭氧菌定居。
動物腸道中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌可導致例如，壞死性腸炎，食物中毒和生長遲緩。具體地說，家禽，特別是雞(broiler chicken)的腸道存在產(chǎn)氣莢膜梭菌與諸如腸損害和壞死性腸炎的各種病癥相聯(lián)系，且可導致家禽生長顯著下降。
另外，產(chǎn)氣莢膜梭菌是氣性壞疽的病原體，它由組織損傷或外傷且因此形成適合于諸如產(chǎn)氣莢膜梭菌等專性厭氧菌定居的缺氧環(huán)境而造成。
總體上與病毒一樣，噬菌體可分為具有RNA基因組(大多數(shù)為小的單鏈)的噬菌體，具有小DNA基因組(一般小于10kb，大多數(shù)為單鏈)的噬菌體和具有中到大型DNA基因組(30-200kb)的噬菌體。
噬菌體的基因聚集成早期和晚期基因。
在烈性噬菌體中，其產(chǎn)物為噬菌體DNA合成和宿主DNA裂解所必需的基因，包括介導核苷酸新陳代謝的基因和組成復制復合體的蛋白質(zhì)都是感染后立即表達的。隨著時間的延續(xù)，早期合成關(guān)閉且編碼病毒體成份的其它基因和裂解基因活化。早期基因的關(guān)閉在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都得以實現(xiàn)。
在溫和噬菌體中，噬菌體可進行溶原化，其中在感染時啟動基因，導致噬菌體整合進宿主基因組使得噬菌體以該方式間接繁殖。溶原性狀態(tài)一旦形成就相當穩(wěn)定。損害溶原性細菌宿主的環(huán)境事件可引起溶原性狀態(tài)破壞并可觸發(fā)整合噬菌體的裂解生活周期。此時，噬菌體啟動可引起裂解生活周期的基因(早期和晚期基因)。
在烈性和溫和噬菌體中一旦表達晚期基因，就開始了裝配病毒體的階段。分別產(chǎn)生頭，尾，尾絲和可溶性蛋白催化的尾絲添加。頭和尾一般首先組合形成復合體，最后將尾絲添加到復合體上。
該周期的最后階段是細胞裂解，將病毒體釋放進介質(zhì)中。裂解通常需要兩個基因產(chǎn)物即溶菌素，它攻擊堅硬的胞壁層中連接N-乙酰葡糖胺的鍵；和成孔素(holin)，它在內(nèi)膜上形成孔，允許溶菌素到達其底物。
因此，噬菌體溶菌素是噬菌體編碼的細胞壁水解酶，它在噬菌體復制的裂解周期中的晚期基因表達期間合成并通過細菌肽聚糖的降解介導從感染細胞中釋放后代病毒體。
EP 0 510 907公開了來自單核細胞增多性利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)噬菌體的溶菌素和基本上不含噬菌體本身的該溶菌素的配制品，以及消滅單核細胞增多性利斯特氏菌(L.monocytogenes)的方法。盡管EP 0 510 907還建議使用來自酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)噬菌體的溶菌素，但是說明書沒有顯示如何獲得該分離的溶菌素或其序列。
WO00/11472教導了使用蛋白質(zhì)和/或酶的細胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的檢測方法。
在本發(fā)明之前，對感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體的裂解周期很少有研究。
本文使用的術(shù)語“細菌噬菌體”認為可與術(shù)語“噬菌體”互換。
發(fā)明簡述本發(fā)明的創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)是鑒定和測序編碼溶菌素的核苷酸序列，該溶菌素來自能夠定居于病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體，以及該溶菌素裂解病原性梭菌屬細菌，特別是病原性產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌的用途。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明涉及可從能夠定居于產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體獲得的溶菌素。優(yōu)選，所述的溶菌素是基本上純的形式。
本發(fā)明還涉及含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基本純的溶菌素或其變體，同源物或衍生物。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有編碼包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列的核酸或其變體，同源物或衍生物。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有編碼溶菌素的核苷酸序列的核酸或其變體，同源物或衍生物，該核苷酸序列以SEQ ID No.1表示。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有選自如下的核苷酸序列的核酸(a)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；(b)是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的變體，同源物，衍生物或片段的核苷酸序列；(c)是SEQ ID No.1所示核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列；(d)是SEQ ID No.1所示核苷酸序列的變體，同源物，衍生物或片段的互補序列的核苷酸序列；(e)能夠與SEQ ID No.1所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(f)能夠與SEQ ID No.1所示核苷酸序列的變體，同源物，衍生物或片段雜交的核苷酸序列；(g)是能夠與SEQ ID No.1所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列；(h)是能夠與SEQ ID No.1所示核苷酸序列的變體，同源物，衍生物或片段雜交的核苷酸序列的互補序列的核苷酸序列；(i)能夠與SEQ ID No.1所示核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列；(j)能夠與SEQ ID No.1所示核苷酸序列的變體，同源物，衍生物或片段的互補序列雜交的核苷酸序列；(k)含有(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)，和/或(j)中任何一個的核苷酸。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有編碼溶菌素的核苷酸序列的核酸，該核苷酸序列選自由如下組成的組中(a)含有SEQ ID No.1所示序列的核苷酸序列；(b)與在高度和/或中度嚴格條件下與SEQ ID No.1所示序列雜交的核苷酸序列互補的核苷酸序列；和(c)基于遺傳密碼簡并性而與核苷酸序列SEQ ID No.1相關(guān)的核苷酸序列。
在另一方面，本發(fā)明涉及從含有根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的核酸表達可獲得或者已獲得的基本上純的溶菌素。
在另一方面，本發(fā)明提供了用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
EP 0 510 907公開了用表達單核細胞增多性利斯特氏菌噬菌體溶菌素的方式轉(zhuǎn)化的微生物宿主。EP 0 510 907的教導可適用于本發(fā)明。
本發(fā)明的另一方面提供了用含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核酸或其變體，同源物或衍生物轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明還提供了從培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主產(chǎn)生的溶菌素。優(yōu)選，該溶菌素是基本上純的形式。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，優(yōu)選一種藥用組合物，包含根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主作為藥物的用途。
在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主在制備治療與病原性梭菌屬種類，優(yōu)選與病原性產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的病癥，疾病或癥狀的藥物中的用途。
在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主在制備治療由家禽，優(yōu)選雞腸道中的病原性梭菌屬種類，優(yōu)選病原性產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的體重增長下降的藥物中的用途。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的基本上純化形式的溶菌素在制備治療由家禽，優(yōu)選雞腸道中的病原性梭菌屬種類，優(yōu)選病原性產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的體重增長下降的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及一種藥物，它含有根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明還涉及一種藥物，它含有含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的基本上純化形式的溶菌素和/或用含有編碼包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療需要治療的受試者的病癥，疾病或癥狀的方法，該方法包括給所述的受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或有效量的用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主或者根據(jù)本發(fā)明的組合物。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療家禽，優(yōu)選雞的體重增長下降的方法，該方法包括給所述的家禽施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或有效量的用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主或者根據(jù)本發(fā)明的組合物。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療家禽，優(yōu)選雞的體重增長下降的方法，該方法包括給所述的家禽施用有效量的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的基本上純化形式的溶菌素和/或用含有編碼包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明還涉及包含一個或多個區(qū)室(compartments)的藥物包，其中至少一個區(qū)室包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或一種或多種用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主或者根據(jù)本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明還涉及包含一個或多個區(qū)室的藥物包，其中至少一個區(qū)室包含一種或多種以基本上純化形式的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素和/或一種或多種用含有編碼包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備藥物組合物的方法，所述的方法包括將一種或多種根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或一種或多種用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主與可藥用的稀釋劑，賦形劑或載體混合。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備藥物組合物的方法，所述的方法包括將一種或多種以基本上純化形式的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素和/或一種或多種用含有編碼包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主與可藥用的稀釋劑，賦形劑或載體混合。
本發(fā)明還涉及消滅梭菌屬的病原菌的方法，該方法包括用以基本上純化形式的含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素或含有所述溶菌素的組合物裂解病原性梭菌屬細菌。
在另一方面，本發(fā)明還提供了含有一種核酸的表達載體，該核酸包含根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列和與其相連的用于在合適的宿主中表達該編碼序列的調(diào)控區(qū)。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主在制備用于治療家禽生長病癥的藥物中的用途，該生長病癥由產(chǎn)氣莢膜梭菌在家禽腸道或其局部定居引起。
本發(fā)明還提供了使用根據(jù)本發(fā)明的溶菌素或其模擬物為基礎(chǔ)的診斷標記檢測樣品中的病原性梭菌屬細菌，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法。
本發(fā)明還提供了使用含有SEQ ID No.2所示氨基酸序列或與其具有至少80％同源性的氨基酸序列的溶菌素或其模擬物為基礎(chǔ)的診斷標記檢測樣品中的病原性梭菌屬細菌，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法。
本文使用的術(shù)語“基于”是指該診斷標記含有根據(jù)本發(fā)明的溶菌素或其一部分。合適的是，可使用根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的至少裂解部分和細胞壁結(jié)合區(qū)部分。在這種情況下，其裂解部分可以是完全有功能的，即能夠裂解細菌細胞，或者可以通過修飾來改變和/或關(guān)閉溶菌素的該裂解功能。修飾所述溶菌素的合適方法可以通過使用隨機和/或定點誘變。合適的診斷標記可僅包含溶菌素的細胞壁結(jié)合區(qū)部分或其片段。
診斷標記可包含容易鑒定的標記。合適的標記包括報道分子，包括在本文題為“報道分子”部分詳細描述的報道分子。該標記可直接或間接與溶菌素或其部分結(jié)合。僅作為舉例，合適的報道分子可包括熒光蛋白。報道分子可與溶菌素或其部分直接或者間接偶連。
在細菌細胞被診斷標記裂解的情況下，可監(jiān)測到一個或多個細菌細胞的裂解。例如可通過光學方法監(jiān)測該裂解。通過測量細菌細胞裂解釋放的細胞內(nèi)成份可監(jiān)測該裂解，例如可通過生物發(fā)光測量ATP的釋放。
診斷標記可包含直接或間接附著到溶菌素或其部分上的固相(例如，但不僅僅是，活化的聚苯乙烯，活化的玻璃，硅或玻璃樣材料，活化的膠乳，金或金化合物，各種鐵磁性載體材料，疏水或帶電荷的合成材料)。這樣能夠與所述的溶菌素或其部分結(jié)合的細胞可以固定到所述的固相上。
根據(jù)本發(fā)明的檢測方法的優(yōu)點是它不是種特異性的，比產(chǎn)生抗梭菌屬細菌的抗體更容易，和/或容易完成結(jié)合和檢測。
在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的細胞壁結(jié)合區(qū)部分或其片段在給藥中的用途。
在另一方面，本發(fā)明提供了篩選數(shù)據(jù)庫中用于根據(jù)本發(fā)明的用途的替代肽的方法，其中所述的方法包含使用SEQ ID No.2所示的氨基酸序列篩選數(shù)據(jù)庫，并選擇與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列同源的一個或多個氨基酸序列。優(yōu)選，該序列與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少80％的同源性。
在另一方面，本發(fā)明提供了修飾根據(jù)本發(fā)明的溶菌素以改變該溶菌素對一種或多種細菌種類的裂解活性的方法。
可修飾根據(jù)本發(fā)明的溶菌素以便擴大該溶菌素對其有活性的細菌譜。作為選擇，可修飾該溶菌素以集中其對特異性細菌種類和/或菌株的活性；換句話說，增強其宿主特異性。
為了便于引用，現(xiàn)在在合適的章節(jié)標題下討論本發(fā)明的這些方面和其它方面。然而，在各章節(jié)中的教導不必局限于各具體章節(jié)。
優(yōu)選方面優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的核酸是基本上純的形式。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的核酸是分離的形式。
優(yōu)選，含有根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的核酸可從能夠感染和/或定居產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體獲得。
合適的是，根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或溶菌素從能夠感染和/或定居產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體獲得。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的核酸從感染和/或定居于產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體可獲得或者已獲得。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或溶菌素從噬菌體φ3626或噬菌體φ8533可獲得或者已獲得。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物還含有可藥用的稀釋劑，賦形劑或載體。
優(yōu)選，該病癥，疾病和/或癥狀是與病原性梭菌屬種類，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的。
例如，合適的病癥，疾病和/或癥狀包括例如，壞死性腸炎，氣性壞疽，食物中毒，腸損傷和體重增長下降等。
如上所述，與未感染的動物相比在某些動物，特別是家禽，例如雞的腸道中的梭菌屬種類，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌與在這些動物中生長潛力下降相關(guān)。如果腸道中的細菌數(shù)超過閾值水平時該效果最顯著。例如，該閾值水平一般是大約106-108cfu/g。根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或含有根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的宿主可用于治療該生長潛力下降。換句話說，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或含有根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的宿主可用于控制動物，特別是家禽，例如雞的腸道中的細菌數(shù)，從而提高所述動物中的體重增長。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或含有根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的宿主可完全消除所述動物腸道中的所述細菌。在另一實施方案中，該溶菌素和/或宿主可將所述的細菌數(shù)降低到閾值水平，即導致動物中體重增長降低的水平以下。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的宿主是微生物宿主。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的宿主是食品級(food-grade)的微生物。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的宿主是定居于腸道的生物體。
合適的是，該宿主可以是公認為安全(GRAS)的生物體，優(yōu)選微生物。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的微生物宿主是來自下列屬的一種或多種微生物埃希氏菌屬(Escherichia)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，乳球菌屬(Lactococcus)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，片球菌屬(Pediococcus)。
在一個優(yōu)選的方面，該微生物宿主是來自一個或多個下列種的細菌大腸桿菌(Escherichia coli)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)或相關(guān)種類。
優(yōu)選，在所述宿主中的核酸含有指導本發(fā)明的溶菌素編碼序列通過宿主細胞膜分泌的一個或多個信號序列。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素是基本上純化的形式。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素是分離的形式。
優(yōu)選，本文提及的梭菌屬細菌屬于產(chǎn)氣莢膜梭菌種類。
優(yōu)選，本文提及的梭菌屬細菌在受試者腸道中。
合適的是，該梭菌屬細菌可以在食品或飲料中。
合適的是，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素可以是修飾的，例如通過隨機或定點誘變修飾的。
發(fā)明詳述盡管一般來說本文提及的任何分子技術(shù)都是本領(lǐng)域熟知的，但是尤其可參考Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley& Sons，Inc.。
溶菌素本文使用的術(shù)語“溶菌素”與術(shù)語“內(nèi)溶菌素”同義。本文使用的術(shù)語“溶菌素”是指能夠裂解細胞的任何試劑，例如酶或毒素。
試劑本文使用的術(shù)語“試劑”是指根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主。
藥物本文使用的術(shù)語“藥物”包含在人類和獸醫(yī)醫(yī)學中用于人類和動物用途的藥物。另外，本文使用的術(shù)語“藥物”包括設(shè)計成摻入動物飼料，特別是家禽飼料中的產(chǎn)品。
治療應認識到本文所有提及的治療包括治愈性，緩解性和預防性治療。
重組方法一般來說本發(fā)明的核苷酸序列可通過重組DNA技術(shù)制備。
氨基酸序列本文使用的術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。在某些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。
氨基酸序列可通過從合適的來源分離來制備或者可通過合成制備或者可通過使用重組DNA技術(shù)制備。
在一個方面，本發(fā)明提供了一種氨基酸序列，它是能夠水解病原性梭菌屬細菌，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌細胞壁的溶菌素。
優(yōu)選，該溶菌素包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其變體，衍生物或同源物。
優(yōu)選，該溶菌素是分離的溶菌素和/或是基本上分離的溶菌素和/或是純化的和/或是基本上純化的和/或是非天然的。因此，該溶菌素可以是純的或基本上純的形式。
應明白根據(jù)本發(fā)明的溶菌素可與不干擾溶菌素目的用途的載體或稀釋劑混合且仍然認為是純的和/或分離的。
核苷酸序列本文使用的術(shù)語“核苷酸序列”與術(shù)語“多核苷酸”同義。
核苷酸序列可以是基因組或合成或重組來源的DNA或RNA。核苷酸序列可以是雙鏈或單鏈，不論它代表有義或反義鏈或其組合。
對于某些應用，該核苷酸序列優(yōu)選是DNA。
對于某些應用，該核苷酸序列優(yōu)選通過使用重組DNA技術(shù)(例如，重組DNA)制備。
對于某些應用，該核苷酸序列優(yōu)選是cDNA。
對于某些應用，該核苷酸序列優(yōu)選在該方面與天然存在的形式相同。
在本發(fā)明的一個方面，該核苷酸序列編碼能夠水解梭菌屬細菌，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌的細胞壁的溶菌素。
技術(shù)人員會明白由于遺傳密碼的簡并性許多不同的核苷酸序列可編碼相同的溶菌素。另外，技術(shù)人員應明白可使用常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生基本上不影響本發(fā)明的核苷酸序列編碼的活性的核苷酸取代以反映表達該目的產(chǎn)物的任一具體宿主生物的密碼子習慣。因此，與所附序列表列出的核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語“變體”，“同源物”或“衍生物”包括對該序列的一個(或多個)核苷酸的任何取代，變異，修飾，更換，缺失或添加，前提是所得的核苷酸序列編碼根據(jù)本發(fā)明的功能性溶菌素。
如上所述，對于序列同源性，優(yōu)選與本文所示的SEQ ID No.1有至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％的同源性。更優(yōu)選，有至少95％，更優(yōu)選至少98％的同源性。核苷酸同源性比較可按下述進行。優(yōu)選的序列比較程序是上述的GCG Wisconsin Bestfit程序。默認的記分矩陣對于每個相同的核苷酸匹配值為10且對于每個錯配其值為-9。對于每個核苷酸，默認的間隔產(chǎn)生罰分為-50，默認的間隔延長罰分為-3。
本發(fā)明還包含能夠與本文序列，或其任何變體，片段或衍生物，或者上述任一序列的互補序列選擇性雜交的核苷酸序列。核苷酸序列優(yōu)選至少15個核苷酸長，更優(yōu)選至少20，30，40或50個核苷酸長。這些序列可在諸如診斷試劑盒等中用作探針。
變體/同源物/衍生物除了本文提及的具體核苷酸和氨基酸序列和可從所述核苷酸序列得出的氨基酸序列外，本發(fā)明還包含其變體，同源物和衍生物的使用。在此，術(shù)語“同源性”可等同于“相同性”。
在本說明書中，采用同源性序列包括具有至少75，85，或90％相同性，優(yōu)選至少95或98％相同性的氨基酸序列或核苷酸序列。具體地說，同源性一般應考慮已知對活性必需的序列區(qū)域。盡管同源性也可認為是相似性(即，具有相似化學特性/功能的氨基酸殘基)，但是在本發(fā)明說明書中，優(yōu)選將同源性表示為序列相同性。
在一個優(yōu)選的方面，該變體，同源物或衍生物是與SEQ ID No.1具有至少75，85或90％相同性，優(yōu)選至少95或98％相同性的核苷酸序列。
在另一方面，該變體，同源物或衍生物是與SEQ ID No.1所示序列中編碼細胞壁結(jié)合區(qū)的片段具有至少75，85或90％相同性，優(yōu)選至少95或98％相同性的核苷酸序列。
在一個優(yōu)選的方面，該變體，同源物或衍生物是與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少75，85或90％相同性，優(yōu)選至少95或98％相同性的氨基酸序列。
在另一方面，該變體，同源物或衍生物是與SEQ ID No.2所示序列的細胞壁結(jié)合區(qū)具有至少75，85或90％相同性，優(yōu)選至少95或98％相同性的氨基酸序列。
同源性比較可通過眼觀察，或者更常見的是借助于容易獲得的序列比較程序進行。這些商業(yè)上可獲得的計算機程序可計算兩個或多個序列之間的同源性％。
同源性％可對連續(xù)的序列進行計算，即將一個序列與另一序列對位排列(alignment)且將一個序列中的每個氨基酸與另一序列中的相應氨基酸一次一個殘基地直接比較。這稱為“無間隔的”對位排列。一般來說，該無間隔的對位排列僅對較少數(shù)目的殘基進行。
盡管這是非常簡單和一致的方法，但是它不能考慮到例如，對于不完全配對的序列，一個插入或缺失可引起隨后的氨基酸殘基不能進行對位排列，因此在進行全局對位排列時可能導致同源性％大量降低。因此，大多數(shù)序列比較方法設(shè)計成產(chǎn)生最佳對位排列，使得可能的插入和缺失不會過分影響總體同源性得分。這點可通過在序列對位排列中插入“間隔”以使得局部同源性最大化來實現(xiàn)。
然而，這些更復雜的方法給在對位排列中出現(xiàn)的各間隔設(shè)定“間隔罰分”以便對于相同數(shù)目的相同氨基酸，具有盡可能少間隔的序列對位排列(反映兩個比較序列之間相關(guān)性更高)將比具有許多間隔的序列得到更高的記分。一般使用“親緣(Affine)間隔成本(gap cost)”使得存在一個間隔罰分較高，而該間隔中各隨后的殘基罰分較低。這就是最常用的間隔記分系統(tǒng)。高間隔罰分當然產(chǎn)生間隔更少的最優(yōu)化對位排列。大多數(shù)對位排列程序允許修改間隔罰分。然而，使用該軟件進行序列比較時優(yōu)選使用該默認值。例如，當使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包(見下文)時，氨基酸序列的默認間隔罰分為一個間隔是-12且每個延長(extention)為-4。
因此計算最大同源性％首先需要考慮間隔罰分后產(chǎn)生最佳的對位排列。進行該對位排列的合適的計算機程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(美國威斯康星大學；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)?？蛇M行序列比較的其它軟件的例子包括，但不限于，BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999，出處同上，第18章)，F(xiàn)ASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS程序組的比較工具。BLAST和FASTA可用于脫機和聯(lián)機檢索(參見Ausubel等，1999，出處同上，第7-58至7-60頁)。然而，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。一種稱為BLAST2 Sequences的新工具也可用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(參見FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
盡管最終的同源性％可按相同性測量，但是對位排列方法本身一般不按照全或無(all or nothing)進行配對比較。相反，一般使用分級相似性記分矩陣，根據(jù)化學相似性或進化距離給每對比較設(shè)定得分。常用的該矩陣的一個例子是BLOSUM62矩陣，即BLAST程序組的默認矩陣。GCG Wisconsin程序一般使用公開的默認值或者如果提供了的話使用定制的符號比較表(詳情參見用戶手冊)。對于GCG軟件包優(yōu)選使用公開的默認值，或者對于其它軟件，使用默認矩陣，例如BLOSUM62。
一旦該軟件產(chǎn)生了最佳對位排列，可計算同源性％，優(yōu)選序列相同性％。該軟件一般將這點作為序列比較的一部分且產(chǎn)生一個數(shù)值結(jié)果。
該序列也可具有產(chǎn)生沉默改變并產(chǎn)生一個功能上相當?shù)奈镔|(zhì)的氨基酸殘基缺失，插入或取代。根據(jù)殘基的極性，電荷，可溶性，疏水性，親水性，和/或兩親性特性可作出有意的氨基酸取代，前提是保留該物質(zhì)的二級結(jié)合活性。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的具有不帶電荷的極性頭部基團的氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸，和酪氨酸。
例如，可按照下表作出保守取代。在第二列同一行中且優(yōu)選在第三列同一行中的氨基酸可進行互相取代

本發(fā)明還包含可發(fā)生同源性取代(取代和代替在本文中都用于指已有氨基酸殘基用另一殘基交換)，即相似取代相似，例如堿性取代堿性，酸性取代酸性，極性取代極性等。也可發(fā)生非同源性取代，即從一類殘基取代成另一類殘基或者任選涉及包含非天然氨基酸，例如鳥氨酸(下文稱為Z)，二氨基丁酸鳥氨酸(下文稱為B)，正亮氨酸鳥氨酸(下文稱為O)，pyriylalanine，噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
取代也可用非天然氨基酸進行，該非天然氨基酸包括α*和α-二取代*的氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的鹵化衍生物，例如三氟酪氨酸*，對-Cl-苯丙氨酸*，對-Br-苯丙氨酸*，對-I-苯丙氨酸*，L-丙烯基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基異丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正纈氨酸*，對-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羥脯氨酸#，L-硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，例如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-異丙基)*，L-Tic(1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-芐基)*。對于上文討論的論題(涉及同源性或非同源性取代)，使用符號*表示衍生物的疏水特性，使用#表示衍生物的親水特性，#*表示兩親性特性。
變異氨基酸序列可包括插入該序列的任何兩個氨基酸殘基之間的合適的間隔區(qū)基團，除了諸如甘氨酸或β-丙氨酸殘基的氨基酸間隔區(qū)外還包括諸如甲基，乙基或丙基基團等烷基基團。另一變異形式包括存在類肽形式的一個或多個氨基酸殘基，它是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。為避免疑問，“類肽形式”用于指變異氨基酸殘基，其中α-碳取代基團在該殘基的氮原子上而不是在α-碳上。制備類肽形式的肽的方法是本領(lǐng)域已知的，例如參見Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。
雜交本文使用的術(shù)語“雜交”包括“核苷酸序列的一條鏈與互補鏈通過堿基配對結(jié)合的方法”以及在聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)中進行的擴增方法。
能夠與本文提供的核苷酸序列或與其互補序列選擇性雜交的本發(fā)明的核苷酸序列與本文提供的相應互補核苷酸序列在至少20，優(yōu)選至少25或30，例如至少40，60或100或更多個連續(xù)核苷酸的區(qū)域內(nèi)一般具有至少75％，優(yōu)選至少85％或90％且更優(yōu)選至少95％或98％的同源性。
術(shù)語“可選擇性雜交的”是指用作探針時該核苷酸序列在在這樣的條件下使用，即在該條件下發(fā)現(xiàn)靶核苷酸序列以明顯高于背景的水平與該探針雜交。由于在例如，篩選的cDNA或基因組DNA文庫中存在其它核苷酸序列，因此可發(fā)生背景雜交。在該事件中，背景是指該探針和文庫中的非特異性DNA成員之間相互作用產(chǎn)生的信號水平，它比用靶DNA觀察到的特異性相互作用的強度低10倍，優(yōu)選低100倍。該相互作用的強度可通過例如，用諸如32P放射性標記該探針進行測量。
雜交條件按Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中的教導以核苷酸結(jié)合復合物的解鏈溫度(Tm)為基礎(chǔ)，且提供按下文說明限定的“嚴格條件”。
最高嚴格條件一般在大約Tm-5℃下發(fā)生(該探針的Tm下5℃)；高度嚴格條件在Tm下大約5℃至10℃；中等嚴格條件在Tm下大約10℃至20℃；低度嚴格條件在Tm下大約20℃至25℃。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，可使用最高嚴格雜交來鑒定或檢測相同的核苷酸序列，而可使用中等(或低度)嚴格雜交來鑒定或檢測相似或相關(guān)的多核苷酸序列。
在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的變體，同源物或衍生物在高度嚴格和/或中等嚴格條件下與SEQ ID No 1所示的核苷酸序列雜交。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的變體，同源物或衍生物能夠與SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或與其互補序列在高度嚴格和/或中等嚴格條件下選擇性地雜交，且在至少20，優(yōu)選至少25或30，例如至少40，60或100或更多個連續(xù)核苷酸的區(qū)域內(nèi)與相應互補的核苷酸序列SEQ ID No.1一般具有至少75％，優(yōu)選至少85或90％且更優(yōu)選至少95％或98％的同源性。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明包含在嚴格條件下(例如，65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M檸檬酸三鈉，pH 7.0))能與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。如果本發(fā)明的核苷酸序列是雙鏈，則本發(fā)明包含單獨的或結(jié)合的該雙螺旋的兩條鏈。如果該核苷酸序列是單鏈，應明白該核苷酸序列的互補序列也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
以許多種方式可獲得與本發(fā)明的序列不是100％同源但落在本發(fā)明范圍內(nèi)的核苷酸序列。本文所述序列的其它變體可通過例如探測從各種來源制備的DNA文庫來獲得。另外，可獲得其它病毒/細菌，或細胞同源物，特別是在哺乳動物細胞(例如，大鼠，小鼠，牛和靈長類細胞)中發(fā)現(xiàn)的細胞同源物且該同源物及其片段一般能夠與本文序列表中所示的序列選擇性雜交。該序列可通過探測從其它動物種類制備的cDNA文庫或基因組DNA文庫，并用含有全長或部分本文所列核苷酸序列的探針在中等到高度嚴格條件下探測該文庫來獲得。類似的考慮可應用于獲得本發(fā)明的氨基酸和/或核苷酸序列的種同源物和等位基因變體。
變體和菌株/種同源物也可使用簡并PCR獲得，其中使用的引物設(shè)計成靶向變體和同源物內(nèi)編碼本發(fā)明序列內(nèi)的保守氨基酸序列的序列。保守序列可通過例如，對位排列幾個變體/同源物的氨基酸序列來推測。序列對位排列可使用本領(lǐng)域已知的計算機軟件進行。例如，GCG Wisconsin PileUp程序是廣泛使用的。簡并PCR中使用的引物含有一個或多個簡并位置且在比用針對已知序列的單一序列引物克隆序列中所用的條件更低的嚴格條件下使用。
作為選擇，通過定點誘變鑒定的序列，例如本發(fā)明序列表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列可獲得該核苷酸序列。它可用于這樣的情況下，即例如，需要對序列進行沉默密碼子改變以優(yōu)化對將要表達該核苷酸序列的特定宿主細胞的密碼子偏好。為了導入限制性酶識別位點，或者改變該核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)活性，可能需要其它的序列改變。
本發(fā)明的核苷酸序列可用于產(chǎn)生引物，例如，PCR引物，用于其它擴增反應的引物，探針，例如使用放射性或非放射性標記通過常規(guī)方法用顯示性標記物標記的探針，或者該核苷酸序列可克隆進載體中。該引物，探針和其它片段為至少15，優(yōu)選至少20，例如至少25，30或40個核苷酸長，且也包含在本文使用的術(shù)語本發(fā)明的核苷酸序列中。
諸如根據(jù)本發(fā)明的DNA多核苷酸和探針等核苷酸序列可通過重組，合成，或者通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員可獲得的任何方法產(chǎn)生。它們也可通過標準技術(shù)克隆。
一般來說，引物通過合成方法產(chǎn)生，它包含一次一個核苷酸逐步制備所需核苷酸序列的方法。使用自動合成技術(shù)實現(xiàn)這點的技術(shù)是本領(lǐng)域容易獲得的。
更長的核苷酸序列一般使用重組方法產(chǎn)生，例如，使用PCR(聚合酶鏈式反應)克隆技術(shù)產(chǎn)生。它包括制備需要克隆的靶序列側(cè)翼區(qū)域的引物對(例如，具有大約15到30個核苷酸)，使得該引物與從動物或人細胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在導致所需區(qū)域擴增的條件下進行聚合酶鏈式反應(PCR)，分離該擴增的片段(例如，通過在瓊脂糖凝膠上純化該反應混合物)并回收該擴增的DNA。該引物可設(shè)計成含有合適的限制性酶識別位點以便可將擴增的DNA克隆進合適的克隆載體中。
由于遺傳密碼的內(nèi)在簡并性，可使用編碼基本上相同或功能上相當?shù)陌被嵝蛄械钠渌麯NA序列克隆并表達該靶序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應明白，對于某些表達系統(tǒng)，用非天然存在的密碼子生產(chǎn)該靶序列可能具有優(yōu)勢。例如，可選擇具體原核或真核宿主優(yōu)選的密碼子(Murray E等(1989)NucAcids Res 17477-508)以增強靶表達率或者產(chǎn)生具有所需特性，例如比天然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子具有更長半壽期的重組RNA轉(zhuǎn)錄子。
基本上純的形式和/或分離的形式優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素或含有編碼它的核苷酸序列的核苷酸是基本上純化的形式或是分離的形式。
術(shù)語“基本上純化的形式”用于表示該成份，例如根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或含有根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的核苷酸以高水平存在。該成份，即根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核苷酸需要是組合物中存在的主要成分。優(yōu)選，它以超過30％，超過50％，超過75％，超過90％，或甚至超過95％的水平存在，所述的水平按干重/所考慮的總組合物干重來測定。
在極高的水平下(例如，在超過90％，超過95％或超過99％的水平下)，該成份可認為是“分離的”。本發(fā)明的生物學活性物質(zhì)(包括多肽，核酸分子，通過篩選鑒定的/可鑒定的半分子，等)以基本上不含可能與該物質(zhì)結(jié)合的一種或多種污染物的形式提供。因此，例如，它們可以基本上不含一種或多種可能的污染多肽和/或核酸分子。它們可以基本上不合其它細胞成份(例如細胞膜，細胞質(zhì)的成份，等)的形式提供。當組合物基本上不合給定的污染物時，該污染物以低水平存在(例如，按上述的干重/干重以不超過10％，不超過5％或不超過1％的水平存在)。
可藥用的鹽根據(jù)本發(fā)明的溶菌素可以是可藥用的鹽(例如加酸鹽或堿性鹽)或包括其水合物的其溶劑化物的形式和/或以該形式給藥。合適的鹽的綜述參見Berge等，J.Pharm.Sci.，1977，66，1-19。
一般來說，可藥用的鹽如果合適可通過使用所需的酸或堿輕易地制備。該鹽可從溶液中沉淀并通過過濾收集或者通過蒸發(fā)溶劑回收。
合適的加酸鹽從形成無毒鹽的酸形成，其例子有鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硫酸鹽，重硫酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，磷酸氫鹽，乙酸鹽，馬來酸鹽，延胡索酸鹽，乳酸鹽，酒石酸鹽，檸檬酸鹽，葡萄糖酸鹽，琥珀酸鹽，蔗糖鹽，苯甲酸鹽，甲磺酸鹽，乙磺酸鹽，苯磺酸鹽，對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(pamoate)。
合適的堿性鹽從形成無毒鹽的堿形成，其例子有鈉，鉀，鋁，鈣，鎂，鋅，二羥胺(diolamine)，羥胺(olamine)，乙二胺，氨丁三醇，膽堿，megulamine和二乙醇胺鹽。合適的藥用鹽的綜述參見Berge等，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)；Gould P.L.，International J.of Pharmaceutics，33(1986)，201-217；和Bighley等，Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology，Marcel Dekker Inc.，New York(1996)，第13卷，第453-497頁。
本發(fā)明的化合物，即溶菌素的可藥用的溶劑化物包括其水合物。
在下文中，在本發(fā)明的任一方面(除了化學過程中的中間體化合物)限定的化合物，包括根據(jù)本發(fā)明的溶菌素或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主，其可藥用的鹽，其溶劑化物和多態(tài)型，都稱為“本發(fā)明的化合物”或“本發(fā)明的試劑”。
多態(tài)性形式/不對稱碳諸如溶菌素等試劑可以多態(tài)性形式存在。
該試劑可含有一個或多個不對稱碳原子，因此以兩種或多種立體異構(gòu)形式存在。如果試劑含有鏈烯基(alkenyl)或亞烯基(alkenylene)，還可能存在順式(E)和反式(Z)異構(gòu)現(xiàn)象。本發(fā)明包括該試劑的單個立體異構(gòu)體，且如果合適，還包括其單個互變異構(gòu)形式，及其混合物。
非對映異構(gòu)體或順式及反式異構(gòu)體的分離可通過常規(guī)技術(shù)完成，例如通過對該試劑或其合適的鹽或衍生物進行分級結(jié)晶，色譜法或H.P.L.C.完成。從相應的光學上純的中間體或者通過拆分(resoluteion)，例如適當?shù)厥褂煤线m的手性載體對相應的消旋體進行H.P.L.C.，或者通過對相應的外消旋體與合適的光學活性酸或堿反應形成的非對映異構(gòu)鹽進行分級結(jié)晶也可制備該試劑的單個對映體。
同位素變體本發(fā)明還包含溶菌素或其可藥用的鹽的所有合適的同位素變體。本發(fā)明的溶菌素或其可藥用的鹽的同位素變體定義為至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量不同于通常在自然界發(fā)現(xiàn)的該原子質(zhì)量的原子取代的變體?？蓳饺朐撛噭┗蚱淇伤幱玫柠}中的同位素的例子包括氫，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯的同位素，分別例如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F和36Cl。該試劑及其可藥用的鹽的某些同位素變體，例如，摻入了諸如3H或14C的放射性同位素在藥物和/或底物的組織分布研究中是有用的。同位素氚，即3H，和碳-14，即14C是特別優(yōu)選的，因為它們?nèi)菀字苽浜湍軌驒z測。另外，用諸如氘，即，2H等同位素取代由于代謝更穩(wěn)定可產(chǎn)生某些治療優(yōu)勢，例如體內(nèi)半壽期增加或劑量需求降低，且因此在某些情況下可能是優(yōu)選的。溶菌素及其可藥用的鹽的同位素變體一般可使用合適試劑的適當同位素變體通過常規(guī)方法來制備。
前藥(Prodrugs)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將預料到本發(fā)明的溶菌素可由前藥產(chǎn)生。前藥的例子包括具有某些保護基團的實體，它本身不具有這種藥理學活性，但是在某些情況下，給藥(例如通過口服或腸胃外途徑)后在體內(nèi)代謝形成具有藥理學活性的試劑。
本發(fā)明化合物的所有保護的衍生物和前藥都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
前體半分子(Pro-Moieties)還可預料到稱為“前體半分子”的某些半分子，例如在H.Bundgaard，Elsevier所著的“前藥的設(shè)計”，1985(本文引用其公開內(nèi)容以供參考)中所述，可賦予該試劑合適的功能。該前藥也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
藥用組合物本發(fā)明還提供了一種藥用組合物，它含有治療有效量的本發(fā)明的試劑，即根據(jù)本發(fā)明的溶菌素，和可藥用的載體，稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。
該藥用組合物可以在人類和獸醫(yī)醫(yī)學中用于人類或動物用途且一般包含任意一種或多種可藥用的稀釋劑，載體，或賦形劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，該藥用組合物可用于家禽，特別是雞。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑是制藥領(lǐng)域熟知的，且在例如，Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述。藥用載體，賦形劑或稀釋劑的選擇可根據(jù)計劃的給藥途徑和標準制藥慣例來選擇。該藥用組合物可包含作為載體，賦形劑或稀釋劑的或者除此之外的任何合適的粘合劑，潤滑劑，懸浮劑，包衣劑，助溶劑。
在該藥用組合物中可提供防腐劑，穩(wěn)定劑，染料和甚至調(diào)味劑。防腐劑的例子包括苯甲酸鈉，山梨酸和對羥基苯甲酸的酯。也可使用抗氧化劑和懸浮劑。
根據(jù)不同的給藥系統(tǒng)有不同的組合物/劑型要求。作為例子，本發(fā)明的藥用組合物可配制成使用微型泵給藥或者通過粘膜途徑，例如作為用于吸入的鼻內(nèi)噴霧劑和氣溶膠或者可吞食的溶液，或者通過腸胃外給藥，在腸胃外途徑中，該組合物配制成可注射形式用于通過例如，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)或皮下途徑給藥。作為選擇，該劑型可設(shè)計成通過兩種途徑給藥。
如果該試劑通過胃腸粘膜進行粘膜給藥，則在通過胃腸道運輸期間它應當能夠保持穩(wěn)定；例如，應當對蛋白水解降解有抗性，在酸性pH下穩(wěn)定且對膽汁的去污效應具有抗性。
如果合適，該藥用組合物可以通過吸入給藥，采用栓劑或陰道栓的形式，一般采用洗劑，溶液，乳膏，軟膏或撒布粉末的形式，通過使用皮膚貼片局部給藥，采用含有諸如淀粉或乳糖等賦形劑的片劑形式，或采用單獨或與賦形劑混合的膠囊或卵狀體，或者采用含有調(diào)味劑或染色劑的酏劑，溶液或懸液的形式口服，或者它們可通過腸胃外注射，例如，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，或皮下注射。對于腸胃外給藥，該組合物最好以含有其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖以使得該溶液與血液等滲的無菌水溶液的形式使用。對于口腔或舌下給藥，該組合物可按常規(guī)方式配制成片劑或錠劑的形式。
對于一些實施方案，本發(fā)明的試劑也可與環(huán)糊精組合使用。已知環(huán)糊精可與藥物分子形成包涵和非包涵絡(luò)合物。藥物-環(huán)糊精絡(luò)合物的形成可修飾藥物分子的溶解度，溶解率，生物可利用率和/或藥物分子的穩(wěn)定性特性。藥物-環(huán)糊精絡(luò)合物一般用于大多數(shù)劑型和給藥途徑。作為對與藥物直接絡(luò)合的替代，環(huán)糊精可用作輔助添加劑，例如，作為載體，稀釋劑或助溶劑。α-，β-和γ-環(huán)糊精是最常用的且合適的例子在WO-A-91/11172，WO-A-94/02518和WO-A-98/55148中描述。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑可全身性給藥(例如口服，頰面(buccally)，舌下)，更優(yōu)選口服。
因此，優(yōu)選的是該試劑是適合于口服給藥的形式。
給藥術(shù)語“給藥”包括通過病毒或非病毒技術(shù)傳遞。病毒傳遞機制包括但不限于腺病毒載體，腺伴隨病毒(AAV)載體，皰疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，和桿狀病毒載體。非病毒傳遞機制包括脂類介導的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，脂轉(zhuǎn)染劑，陽離子表面兩親物(CFAs)及其組合。
本發(fā)明的試劑，即本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主可單獨給藥，但是一般作為藥用組合物，例如將該試劑與根據(jù)計劃的給藥途徑和標準制藥慣例選擇的合適的藥用賦形劑，稀釋劑或載體混合時給藥。
例如，該試劑以可含有調(diào)味劑或染色劑的片劑，膠囊，卵狀體，酏劑，溶液或懸液的形式給藥(例如，口服或局部)用于立即-，延遲-，改良-，持久-，脈沖-或受控-釋放應用。
該片劑可含有諸如微晶纖維素，乳糖，檸檬酸鈉，碳酸鈣，磷酸氫鈣和甘氨酸等賦形劑，諸如淀粉(優(yōu)選玉米，馬鈴薯或木薯淀粉)，淀粉乙醇酸鈉(sodium starch glycolate)，交聯(lián)甲羧纖維素鈉(croscarmellose sodium)和某些硅酸鹽絡(luò)合物等崩解劑，和諸如聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，羥丙基纖維素(HPC)，蔗糖，明膠和阿拉伯膠等制粒粘合劑。另外，可包括諸如硬脂酸鎂，硬脂酸，甘油榆樹酸酯和滑石等潤滑劑。
也可采用相似類型的固體組合物作為明膠膠囊的填充劑。在這方面優(yōu)選的賦形劑包括乳糖，淀粉，纖維素，奶糖或高分子量聚乙二醇。對于含水懸液和/或酏劑，該試劑可與各種甜味劑或調(diào)味劑，染色物質(zhì)或染料，與乳化和/或懸浮劑及與諸如水，乙醇，丙二醇和甘油，及其組合進行混合。
該試劑，即本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主可在動物飼料或草料中給藥，或者作為動物飼料或草料的添加劑。具體地說，本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主可摻入或加入家禽飼料中。
給藥(遞送)途徑包括，但不限于下列一種或多種途徑口服(例如，作為片劑，膠囊，或者作為可吞食的溶液)，局部，粘膜(例如，作為鼻內(nèi)噴霧或吸入的氣溶膠)，鼻內(nèi)，腸胃外(例如，通過可注射的形式)，胃腸，脊柱內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，子宮內(nèi)，眼內(nèi)，真皮內(nèi)，顱內(nèi)，氣管內(nèi)，陰道內(nèi)，大腦室內(nèi)，大腦內(nèi)，皮下，眼用(包括玻璃體內(nèi)或眼房內(nèi))，經(jīng)皮膚，直腸，口腔，陰莖，陰道，硬膜外，舌下。
應明白根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主不必以相同的途徑給藥。同樣，如果該組合物包含一種以上活性成份，那么這些成份可通過不同的途徑給藥。
如果本發(fā)明的試劑以腸胃外給藥，那么該給藥的例子包括一種或多種下列途徑靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，尿道內(nèi)，胸骨內(nèi)，顱內(nèi)，肌肉內(nèi)或皮下施用該試劑；和/或通過使用輸注技術(shù)。
對于腸胃外給藥，該試劑最好以含有其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或葡萄糖以使得該溶液與血液等滲的無菌水溶液的形式使用。如果需要，該水溶液應適當緩沖(優(yōu)選pH從3到9)。通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標準制藥技術(shù)容易實現(xiàn)在無菌條件下制備合適的腸胃外劑型。
正如所述，本發(fā)明的試劑可以鼻內(nèi)給藥或吸入給藥，采用干粉吸入劑或由合適推進劑從加壓容器，泵，噴霧器或霧化器中送出的氣溶膠噴霧形式便于運送，所述推進劑例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，諸如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA134ATM)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA227EATM)等氟代烷烴，二氧化碳或其它合適的氣體。對于加壓氣溶膠，通過裝備定量給藥的閥門可測定劑量單位。加壓容器，泵，噴霧器或霧化器可含有活性化合物的溶液或懸液，例如，使用乙醇和推進劑作為溶劑的混合物，另外它可含有潤滑劑，例如山梨聚糖三油酸酯。用于吸入器或吹入器的藥艙和藥筒(例如由明膠制成)可配制成含有該試劑和諸如乳糖或淀粉等合適粉末基質(zhì)的粉末混合物。
作為選擇，本發(fā)明的試劑可以栓劑或陰道栓的形式給藥，或者可以凝膠，水凝膠，洗劑，溶液，乳膏，軟膏或撒布粉末的形式局部使用。本發(fā)明的試劑也可在皮膚上或者經(jīng)皮膚給藥，例如，通過使用皮膚貼片。它們也可通過肺部或直腸途徑給藥。它們還可通過眼途徑給藥。對于眼科用途，該化合物可配制成在等滲，調(diào)節(jié)過pH的無菌鹽水中的微粉化懸液，或者優(yōu)選配制成在等滲，調(diào)節(jié)過pH的無菌鹽水中的溶液，任選與諸如苯扎氯銨(benzylalkonium chloride)等防腐劑混合。作為選擇，它們可配制成諸如凡士林等軟膏。
對于皮膚的局部應用，本發(fā)明的試劑可配制成合適的軟膏，它含有懸浮于或溶解于例如混合物中的活性化合物，該混合物含有下列一種或多種成份礦物油，液態(tài)凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，乳化蠟和水。作為選擇，它可配制成懸浮于或溶解于例如，一種混合物中的合適的洗劑或乳膏，該混合物含有下列一種或多種成份礦物油，山梨聚糖一硬脂酸酯，聚乙二醇，液體石蠟，聚山梨醇酯60，鯨蠟酯蠟，cetearyl alcohol，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
本發(fā)明的組合物可通過直接注射給藥。
對于一些應用，該試劑優(yōu)選口服給藥。
劑量水平一般來說，醫(yī)師或獸醫(yī)醫(yī)師會測定最適合于個體受試者的實際劑量。對于任一具體受試者的具體劑量水平和給藥頻率可能會有變化且依賴于各種因素，包括使用的具體化合物的活性，該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用的時間長度，年齡，體重，一般健康狀況，性別，飲食，給藥的方式和時間，排泄率，藥物組合，具體癥狀的嚴重性，和受試者進行的治療。本發(fā)明的試劑和/或藥用組合物可按每天1至10次的方案給藥，例如每天一次或兩次。
對于人或動物的口服和腸胃外給藥，該試劑的每日劑量水平可以是單次或分開的劑量。
根據(jù)需要，該試劑可按從0.01到30mg/kg體重，例如從0.1到10mg/kg，更優(yōu)選從0.1到1mg/kg體重的劑量給藥。實際上，本文提及的劑量是舉例性的平均情況。當然也存在采用更高或更低劑量范圍的個體情況。
一般來說，每天的口服劑量可以是例如，20-1000mg之間，例如優(yōu)選50-300mg。
合適的劑量包括使得梭菌屬病原菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量治療性降低的劑量。
劑型本發(fā)明的試劑可通過例如，與一種或多種合適的載體，稀釋劑或賦形劑混合，通過使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)配制成藥用組合物。
受試者本文使用的術(shù)語“受試者”是指脊椎動物，特別是哺乳動物種類的成員。該術(shù)語包括但不限于馴養(yǎng)動物，運動場動物，農(nóng)業(yè)家畜，靈長類和人。術(shù)語“農(nóng)業(yè)家畜”包括家禽，例如雞。
生物可利用率優(yōu)選，本發(fā)明的化合物(和組合)是口服可生物利用的。口服生物可利用率是指口服給藥的藥物到達系統(tǒng)循環(huán)的比例。決定藥物的口服生物可利用率的因素是溶解作用，膜透性和代謝穩(wěn)定性。一般來說，使用先在體外然后在體內(nèi)的篩選級聯(lián)技術(shù)可測定口服生物可利用率。
溶解作用，胃腸道(GIT)含水成份對該藥物的溶解，可通過在模擬GIT的合適pH進行體外溶解實驗來推測。優(yōu)選，本發(fā)明化合物的最小溶解度為50mcg/ml。溶解度可通過本領(lǐng)域已知的標準方法測定，例如在Adv.DrugDeliv.Rev.23，3-25，1997中所述的方法。
膜透性是指該化合物對GIT細胞的穿透。親油性是判定膜透性的關(guān)鍵特征且可通過使用有機溶劑和緩沖液測量體外Log D7.4來確定。優(yōu)選，本發(fā)明化合物的LogD7.4為-2至+4，更優(yōu)選-1至+2。log D可通過本領(lǐng)域已知的標準方法來測定，例如，在J.Pharm.Pharmacol.1990，42144中所述的方法。
實質(zhì)性增加細胞單層試驗如CaCO2，來預測在諸如p-糖蛋白等流出運載蛋白存在下優(yōu)選膜(favourable membrane)的透性，即所謂的caco-2通量(flux)。優(yōu)選，本發(fā)明的化合物具有高于2×10-6cms-1的caco-2通量，更優(yōu)選高于5×10-6cms-1。caco通量可通過本領(lǐng)域已知的標準方法來測定，例如按J.Pharm.Sci，1990，79，595-600所述的方法。
代謝穩(wěn)定性描述了在吸收過程期間GIT或肝臟代謝化合物的能力即最初通過效應(the first pass effect)。諸如微粒體，肝細胞等的測定系統(tǒng)可預測代謝傾向。優(yōu)選，本發(fā)明的試劑在測定系統(tǒng)中表現(xiàn)出代謝穩(wěn)定性，與不超過0.5倍的肝提取值相當。測定系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理的例子在Curr.Opin.DrugDisc.Devel.，201，4，36-44，Drug Met.Disp.，2000，28，1518-1523中描述。
由于上述過程的相互影響，進一步支持了藥物在人體中是口服可生物利用的，這可通過體內(nèi)動物實驗獲得。通過口服途徑單獨或以混合物施用該試劑可在這些實驗中測定絕對生物可利用率。對于絕對測定值(吸收％)，也可采用靜脈內(nèi)途徑。評估動物口服生物可利用率的例子可參見Drug Met.Disp.，2001，29，82-87；J.Med Chem，1997，40，827-829，Drug Met.Disp.，1999，27，221-226。
化學合成方法根據(jù)本發(fā)明的溶菌素可通過化學合成技術(shù)制備。
使用化學方法合成整體或部分該試劑可生產(chǎn)該溶菌素或其變體，同源物，衍生物，片段或模擬物。例如，通過固相技術(shù)合成該肽，從樹脂上裂解下來，并通過制備型高效液相色譜純化(例如，Creighton(1983)ProteinsStructures And Molecular Principles，WH Freeman and Co，New York NY)。通過氨基酸分析或測序(例如，Edman降解法；Creighton，出處同上)可證實該合成肽的組成。
該溶菌素或其變體，同源物，衍生物，片段或模擬物的直接合成可使用各種固相技術(shù)(Roberge JY等(1995)Science 269202-204)進行和使用例如，ABI 43 1A肽合成儀(Perkin Elmer)按照廠商提供的說明書可實現(xiàn)自動合成。另外，在直接合成期間可改變該試劑或其任一部分包含的氨基酸序列和/或使用化學方法與來自其它亞基或其任一部分的序列結(jié)合以產(chǎn)生變體試劑。
在本發(fā)明的另一實施方案中，可使用本領(lǐng)域熟知的化學方法整體或部分合成該溶菌素或其變體，同源物，衍生物，片段或類似物的編碼序列(參見Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23，Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
模擬物本文使用的術(shù)語“模擬物”涉及任一化學品，包括，但不限于，肽，多肽，抗體或與對照化學試劑具有相同定性活性或效應的其它有機化學品。即模擬物可以是已知試劑的功能等價物。
化學衍生物本文使用的術(shù)語“衍生物”或“衍生化”包括對試劑的化學修飾。該化學修飾的例證是用鹵素基團，烷基基團，?；鶊F或氨基基團取代氫。
化學修飾在本發(fā)明的一個實施方案中，該溶菌素可以是化學修飾的溶菌素。
溶菌素的化學修飾可增強或降低氫鍵相互作用，電荷相互作用，疏水相互作用，范德華相互作用或該試劑與靶之間的偶極相互作用。
在一個方面，該鑒定的溶菌素可用作開發(fā)其它化合物的模型(例如，模板)。
載體在本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素可給受試者直接給藥。
在本發(fā)明的另一方面，可給受試者施用一種含有核酸的載體，該核酸包含編碼本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列。
優(yōu)選，使用遺傳載體制備該重組試劑和/或?qū)⑵鋫鬟f到靶位點。
正如本領(lǐng)域熟知的，載體是允許或幫助一種實體從一種環(huán)境轉(zhuǎn)移到另一環(huán)境的工具。根據(jù)本發(fā)明，作為例子，在重組DNA技術(shù)中使用的一些載體允許諸如DNA片段等實體(例如異源性DNA片段，異源性cDNA片段)轉(zhuǎn)移進宿主和/或靶細胞用于復制含有本發(fā)明核苷酸序列的載體和/或表達由本發(fā)明的核苷酸序列編碼的本發(fā)明蛋白質(zhì)。重組DNA技術(shù)中使用的載體的例子包括但不限于質(zhì)粒，染色體，人工染色體或病毒。
術(shù)語“載體”包括表達載體和/或轉(zhuǎn)化載體。
術(shù)語“表達載體”是指能夠體內(nèi)或體外/離體表達的構(gòu)建體。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化載體”是指能夠從一個物種轉(zhuǎn)移到另一個物種的構(gòu)建體。
裸DNA含有編碼本發(fā)明溶菌素的核苷酸序列的載體可直接作為“裸核酸構(gòu)建體”給藥，該載體優(yōu)選還含有與宿主細胞基因組同源的側(cè)翼序列。
本文使用的術(shù)語“裸DNA”是指含有編碼本發(fā)明試劑的核苷酸序列以及控制其生產(chǎn)的短啟動子區(qū)的質(zhì)粒。它稱為“裸”DNA是因為該質(zhì)粒不在任何傳遞載體中攜帶。當該DNA質(zhì)粒進入宿主細胞，例如真核或原核細胞時，它編碼的蛋白質(zhì)(例如本發(fā)明的試劑)在該細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯。
非病毒傳遞另外，含有本發(fā)明核苷酸序列的載體或本發(fā)明的溶菌素可使用諸如轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化，電穿孔和基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化等本領(lǐng)域已知的各種非病毒技術(shù)導入合適的宿主細胞中。
本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指使用非病毒載體將基因傳遞進靶哺乳動物細胞的過程。
典型的轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔，DNA基因槍，脂類介導的轉(zhuǎn)染，致密DNA介導的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，脂轉(zhuǎn)染劑，陽離子劑介導，陽離子表面兩親物(CFAs)(Nature Biotechnology 1996 14；556)，多價陽離子，例如精胺，陽離子脂類或聚賴氨酸，1，2，-雙(油酰氧)-3-(三甲銨)丙烷(DOTAP)-膽固醇復合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16421)及其組合。
哺乳動物細胞對裸核酸構(gòu)建體的吸收可通過一些已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)增強，例如包括使用轉(zhuǎn)染劑的技術(shù)。這些試劑的例子包括陽離子劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和脂轉(zhuǎn)染劑(例如lipofectamTM和transfectamTM)。一般來說，將核酸構(gòu)建體與轉(zhuǎn)染劑混合產(chǎn)生一種組合物。
病毒載體作為選擇，含有本發(fā)明試劑或本發(fā)明核苷酸序列的載體可使用本領(lǐng)域已知的各種病毒技術(shù)導入合適的宿主細胞中，例如用諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒，單純皰疹病毒和腺病毒等重組病毒載體感染。
優(yōu)選，該載體是重組病毒載體。合適的重組病毒載體包括但不限于腺病毒載體，腺伴隨病毒(AAV)載體，皰疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，桿狀病毒載體，痘病毒載體或細小病毒載體(參見Kestler等，1999Human Gene Ther 10(10)1619-32)。對于病毒載體，含有編碼本發(fā)明試劑的核苷酸序列的核酸的傳遞可通過病毒感染靶細胞來介導。
靶向載體術(shù)語“靶向載體”是指這樣一種載體，即其感染/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導細胞或在宿主和/或靶細胞中表達的能力局限于宿主生物內(nèi)某些細胞類型，通常是具有共同或相似表型的細胞。
復制載體含有編碼本發(fā)明溶菌素的核苷酸序列的核酸可插入重組可復制載體中。該載體可用于在相容性宿主細胞中復制該核苷酸序列。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過將含有本發(fā)明核苷酸序列的核酸導入復制載體中，將該載體導入相容性宿主細胞中，并在引起該載體復制的條件下培養(yǎng)該宿主細胞來制備含有本發(fā)明核苷酸序列的核酸的方法。該載體可從該宿主細胞中回收。
表達載體優(yōu)選，本發(fā)明溶菌素或插入載體中的本發(fā)明核苷酸序列可與能夠?qū)е滤拗骷毎磉_該編碼序列的調(diào)控序列可操作地相連，即該載體是表達載體。術(shù)語“可操作地相連”是指所述元件以允許它們以其目的方式發(fā)揮功能的關(guān)系并排。調(diào)控序列與編碼序列“可操作地相連”是以這樣的方式連接，即在與該調(diào)控序列相容的條件下實現(xiàn)該編碼序列的表達。術(shù)語“調(diào)控序列”包括啟動子和增強子以及其它表達調(diào)控信號。
增強編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達也可通過選擇異源性調(diào)控區(qū)，例如啟動子，分泌前導和終止子區(qū)來實現(xiàn)，所述調(diào)控區(qū)用于增強表達和增加所需表達宿主的目的蛋白的分泌水平和/或用于提供本發(fā)明多肽表達的誘導型控制。
根據(jù)所用的序列和/或載體，可以使宿主重組細胞產(chǎn)生的本發(fā)明溶菌素分泌或者包含在細胞內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白，含有本發(fā)明試劑編碼序列的表達載體可設(shè)計成具有指導本發(fā)明溶菌素編碼序列通過特定原核或真核細胞膜分泌的信號序列。
啟動子除了本發(fā)明多肽基因天然的啟動子外，可使用其它啟動子指導本發(fā)明多肽的表達。
可選擇具有指導本發(fā)明多肽在目的表達宿主中表達的效力的啟動子。
在另一實施方案中，可選擇組成型啟動子指導本發(fā)明的目的多肽的表達。優(yōu)選用于真菌表達宿主的強組成型和/或誘導型啟動子的例子是可從木聚糖酶(xlnA)，植酸酶，ATP-合成酶，亞基9(oliC)，丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)，乙醇脫氫酶(AdhA)，α-淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-來自glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)等真菌基因獲得的啟動子。
強酵母啟動子的例子是可從乙醇脫氫酶，乳糖酶，3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得的啟動子。
強細菌啟動子的例子是α-淀粉酶和SP02啟動子以及來自細胞外蛋白酶基因的啟動子。
也可使用雜交啟動子改進表達構(gòu)建體的誘導型調(diào)控。
體外表達本發(fā)明的載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進下文所述的合適的宿主細胞和/或靶細胞中以用于表達本發(fā)明的溶菌素。該方法包括在用于編碼本發(fā)明溶菌素的編碼序列的載體表達的條件下培養(yǎng)用表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞和/或靶細胞并任選回收表達的本發(fā)明試劑。例如，該載體可以是質(zhì)?；虿《据d體，前提是它們具有復制起點，任選表達所述多核苷酸的啟動子和任選該啟動子的調(diào)控序列。該載體可含有一個或多個選擇標記基因，例如對于細菌質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因或?qū)τ诓溉閯游镙d體的新霉素抗性基因。本發(fā)明試劑或本發(fā)明目的產(chǎn)物的表達可以是組成型的，以便它們可不斷產(chǎn)生，或者可以是誘導型的，需要刺激物來起動表達。對于誘導型表達，當按需要例如，向培養(yǎng)基中加入誘導劑物質(zhì)，例如地塞米松或IPTG時可起動本發(fā)明試劑或目的產(chǎn)物的生產(chǎn)。
分泌前導序列通常，需要將本發(fā)明的多肽從表達宿主分泌進培養(yǎng)基中，從其中可更容易地回收本發(fā)明的多肽。根據(jù)本發(fā)明，可使用本發(fā)明多肽的天然分泌前導序列以實現(xiàn)表達的本發(fā)明多肽的分泌。然而，本發(fā)明多肽表達的提高有時導致蛋白質(zhì)的生產(chǎn)水平超出該表達宿主能夠加工和分泌的水平，即產(chǎn)生一個瓶頸，使得該蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細胞內(nèi)積聚。因此，本發(fā)明還提供了異源性前導序列用于從選定的表達宿主中最有效地分泌本發(fā)明的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，該分泌前導序列可根據(jù)目的表達宿主進行選擇?？蛇x擇與該表達構(gòu)建體的其它調(diào)控區(qū)同源的異源性分泌前導序列。例如，高分泌的淀粉葡糖苷酶(AG)蛋白的前導序列可與淀粉葡糖苷酶(AG)啟動子本身結(jié)合，以及與其它啟動子結(jié)合來使用。在本發(fā)明中也可使用雜交信號序列。
優(yōu)選的異源性分泌前導序列的例子是來源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如，來自于曲霉屬的glaA-18和24個氨基酸的形式)，α-因子基因(酵母，例如糖酵母屬(Saccharomyces)和克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces))或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)的前導序列。
融合蛋白本發(fā)明的溶菌素可作為融合蛋白表達以幫助提取和純化和/或本發(fā)明的溶菌素給受試者的給藥。融合蛋白配偶體的例子包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄活化區(qū))和β-半乳糖苷酶。方便的是在該融合蛋白配偶體和目的蛋白序列之間也可包含一個蛋白水解的裂解位點以允許切除融合蛋白序列。優(yōu)選，該融合蛋白不妨礙該溶菌素的活性。
該融合蛋白可含有與本發(fā)明物質(zhì)融合的抗原或抗原決定簇。在該實施方案中，融合蛋白可以是非天然存在的融合蛋白，它含有用作佐劑的物質(zhì)用于非特異性刺激免疫系統(tǒng)。
抗原或抗原決定簇可附著到該物質(zhì)的氨基或羧基末端。
在本發(fā)明的另一實施方案中，該氨基酸序列可連接到異源性序列上以編碼融合蛋白。例如，為了篩選肽文庫中能夠影響該物質(zhì)活性的試劑，它可用于編碼表達異源性表位的嵌合物質(zhì)，該表位可被商業(yè)上可獲得的抗體識別。
宿主細胞可采用廣泛的宿主細胞表達編碼本發(fā)明溶菌素的核苷酸序列。這些細胞可以是原核和真核宿主細胞。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了制備根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法，它包含在用于編碼該多肽的編碼序列的載體表達的條件下培養(yǎng)用上述表達載體轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，并回收該表達的多肽。合適的宿主細胞包括細菌，例如大腸桿菌，乳桿菌屬種類，芽孢桿菌屬種類，和乳球菌屬種類，酵母，絲狀真菌，昆蟲細胞，哺乳動物細胞，一般是永生化的，例如小鼠，CHO，人和猴細胞系及其衍生物。
該載體可以是例如，質(zhì)粒，病毒或噬菌體載體，前提是它們具有復制起點，任選表達所述多核苷酸的啟動子和任選該啟動子的調(diào)控序列。該載體可含有一個或多個選擇標記基因。用于工業(yè)微生物的最合適的選擇系統(tǒng)是由一組選擇標記形成的系統(tǒng)，它不需要在宿主生物中進行突變。真菌選擇標記的例子是乙酰胺酶(amdS)，ATP合成酶，亞基9(oliC)，乳清酸核苷-5′-磷酸-脫羧酶(pvrA)，腐草霉素(phloemycin)和苯菌靈(benomyl)抗性(benA)的基因。非真菌選擇標記的例子是細菌G418抗性基因(它也可用于酵母，但不能用于真菌)，氨芐青霉素抗性基因(大腸桿菌)，新霉素抗性基因(芽孢桿菌屬)和大腸桿菌uidA基因，它編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。該載體可用于體外，例如生產(chǎn)RNA或者用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。
本發(fā)明的另一實施方案提供了用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。優(yōu)選所述的多核苷酸攜帶在載體中用于復制和表達所述的多核苷酸。該細胞可選擇與所述的載體相容的且可以是例如原核的(例如細菌)，真菌的，酵母或植物細胞。
來自芽孢桿菌屬和乳桿菌屬的細菌非常適合于作為異源性宿主，因為它們具有將蛋白質(zhì)分泌進培養(yǎng)基的能力。適合于作為宿主的其它細菌是來自乳球菌屬的細菌。
根據(jù)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的特性，和/或表達的蛋白質(zhì)對進一步加工的需求，優(yōu)選諸如酵母或真菌等真核宿主。一般來說，酵母細胞相對于真菌細胞是優(yōu)選的，因為它們更容易操作。然而，一些蛋白質(zhì)難以從酵母細胞中分泌，或者在一些情況下不能進行適當?shù)募庸?例如，酵母中的高糖基化)。在這些情況下，應選擇真菌宿主生物。
也可選擇異源性宿主，其中以基本上不含其它溶菌素的形式產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。通過選擇正常情況下不產(chǎn)生這類試劑的宿主可實現(xiàn)這點。
在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的表達宿主的例子是諸如曲霉屬(Aspergillus)種類和木霉屬(Trichoderma)種類的真菌；諸如芽孢桿菌屬種類和乳桿菌屬種類的細菌；和諸如克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)種類和糖酵母屬(Saccharomyces)種類的酵母。
特別優(yōu)選的表達宿主可選自黑曲霉(Aspergillus niger)，黑曲霉變種(Aspergillus niger var.tubigenis)，黑曲霉變種(Aspergillus niger var.awamori)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatis)，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，Trichoderma reesei，嗜酸乳桿菌，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，地衣型芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
根據(jù)本發(fā)明，通過在常規(guī)營養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)用本發(fā)明的一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)化的微生物表達宿主可實現(xiàn)本發(fā)明多肽的生產(chǎn)。
發(fā)酵培養(yǎng)基可包含已知培養(yǎng)基，該已知培養(yǎng)基含有碳源(例如，葡萄糖，麥芽糖，糖蜜，等)，氮源(例如，硫酸銨，硝酸銨，氯化銨，等)，有機氮源(例如，酵母提取物，麥芽汁，蛋白胨，等)和無機營養(yǎng)源(例如，磷酸鹽，鎂，鉀，鋅，鐵，等)。任選可加入誘導物。
可根據(jù)表達宿主的選擇和/或根據(jù)表達構(gòu)建體的調(diào)控需要來選擇合適的培養(yǎng)基。這培養(yǎng)基是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。如果需要，該培養(yǎng)基可含有相對于其它可能的污染微生物有利于轉(zhuǎn)化的表達宿主的添加成份。
發(fā)酵后，可借助于離心或過濾從發(fā)酵肉湯中取出該細胞。取出細胞后，隨后回收本發(fā)明的變體多肽，且如果需要，可通過常規(guī)方法純化和分離。
生物體與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“生物體”包括可含有一種核酸和/或從其獲得的產(chǎn)物的任何生物，所述的核酸含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列，其中當在該生物體中存在時轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可允許表達根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。合適的生物體可包括原核生物，真菌，酵母或植物。優(yōu)選的生物體可以是細菌，優(yōu)選乳桿菌屬的細菌，更優(yōu)選嗜酸乳桿菌。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”包括可含有一種核酸和/或從其獲得的產(chǎn)物的任何生物，所述的核酸含有編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可允許在該生物體中表達根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。優(yōu)選，該核苷酸序列可插入該生物體的基因組中。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”不包括在其天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列，其中它們在其天然啟動子的控制下，該啟動子也在其天然環(huán)境中。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物包括這樣的生物，它含有編碼根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列的核苷酸序列，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體(包括其組合)，根據(jù)本發(fā)明的載體，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒，根據(jù)本發(fā)明的細胞，根據(jù)本發(fā)明的組織或其產(chǎn)物中的任一種或其組合。該轉(zhuǎn)化細胞或生物體可制備容易從該細胞或生物中回收的可接受量的目的化合物。
宿主細胞/宿主生物的轉(zhuǎn)化如上所述，該宿主生物可以是原核或真核生物。合適的原核宿主的例子包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌或嗜酸乳桿菌。轉(zhuǎn)化原核宿主的教導在本領(lǐng)域已充分公開，例如參見Sambrook等(Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。
如果使用原核宿主，那么該核苷酸序列需要在轉(zhuǎn)化前通過例如，去掉內(nèi)含子進行適當?shù)男揎棥?br> 在另一實施方案中，該轉(zhuǎn)基因生物可以是酵母。在這點上，酵母已被廣泛用作異源性基因表達的載體。啤酒糖酵母種的工業(yè)用途，包括其用于異源性基因表達的用途具有很長的歷史。在啤酒糖酵母中表達異源性基因的綜述參見Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等，編，第401-429頁，Allen and Unwin，London)和King等(1989，Molecular and CellBiology of Yeasts，E F Walton和G T Yarronton，編，第107-133頁，Blackie，Glasgow)。
由于一些原因，啤酒糖酵母非常適合于異源性基因表達。首先，它對人體不致病且它不能產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，根據(jù)幾個世紀的各種目的的商業(yè)開發(fā)，其具有很長的安全使用歷史。這導致了廣泛的公眾可接受性。第三，對該生物體廣泛的商業(yè)應用和研究導致對于啤酒糖酵母的遺傳學和生理學以及大規(guī)模發(fā)酵特性積累了豐富的知識。
關(guān)于啤酒糖酵母中異源性基因表達的原理和基因產(chǎn)物的分泌的綜述由E Hinchcliffe E Kenny提供(1993，“酵母作為異源性基因表達的載體”，Yeasts，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison，編，第2版，AcademicPress Ltd.)。
一些類型的酵母載體是可獲得的，包括需要與宿主基因組重組以便于其維持的整合性載體，和自主復制的質(zhì)粒載體。
為了制備轉(zhuǎn)基因酵母，表達構(gòu)建體可通過將本發(fā)明的核苷酸序列插入為在酵母中表達而設(shè)計的構(gòu)建體中來制備。已經(jīng)開發(fā)了一些類型的構(gòu)建體用于異源性表達。該構(gòu)建體含有與本發(fā)明的核苷酸序列融合的在酵母中有活性的啟動子，通常使用酵母來源的啟動子，例如GAL1啟動子。通常使用酵母來源的信號序列，例如編碼SUC2信號肽的序列。在酵母中有活性的終止子終止該表達系統(tǒng)。
對于酵母的轉(zhuǎn)化，已經(jīng)開發(fā)了一些轉(zhuǎn)化方法。例如，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母可按照Humen等(1978，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教導來制備。
轉(zhuǎn)化的酵母細胞可使用各種選擇性標記來選擇。用于轉(zhuǎn)化的標記中有許多營養(yǎng)缺陷型標記，例如LEU2，HIS4和TRP1，和顯性抗生素抗性標記，例如氨基苷類抗生素標記，例如G418。
另一宿主生物是植物。構(gòu)建遺傳修飾的植物的基本原則是在植物基因組中插入遺傳信息以達到穩(wěn)定維持插入的遺傳物質(zhì)。已有一些技術(shù)用于插入遺傳信息，兩個主要的原則是直接導入遺傳信息和通過使用載體系統(tǒng)導入遺傳信息。常規(guī)技術(shù)的綜述可參見Potrykus(Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol 42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-TechMarch/April 1994 17-27)的文章。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的進一步教導可參見EP-A-0449375。
報道分子在本發(fā)明的檢測方法和測定方法(以及篩選)中可使用多種報道分子，優(yōu)選的報道分子可提供方便的可檢測信號(例如，通過光譜學)。作為例子，報道基因可編碼催化改變光吸收特性的反應的一種酶。
報道分子的例子包括但不限于β-半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化酶，綠色熒光蛋白，螢光素酶，氯霉素，乙酰轉(zhuǎn)移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，外切葡聚糖酶和葡糖淀粉酶。作為選擇，可將放射性標記的或熒光標記-標記的核苷酸摻入新生轉(zhuǎn)錄子中，然后在與寡核苷酸探針結(jié)合時可鑒定該轉(zhuǎn)錄子。
在本發(fā)明的檢測方法中，溶菌素或其部分可通過遺傳翻譯的融合蛋白直接或間接與報道分子，合適的是熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白)結(jié)合。
通過例如，使用對該蛋白質(zhì)特異性的多克隆或單克隆抗體的檢測和測量蛋白質(zhì)表達的各種方法是本領(lǐng)域已知的。其例子包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，放射免疫測定(RIA)和熒光激活細胞分類術(shù)(FACS)。優(yōu)選使用與多肽上兩個無干擾表位反應的單克隆抗體的基于單克隆抗體的兩點免疫測定法，但是也可采用競爭性結(jié)合試驗。這些和其它測定法在Hampton R等(1990，Serological Methods，A Laboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和MaddoxDE等(1983，J Exp Med 1581211)中和其它文獻中都有描述。
報道分子的生產(chǎn)可通過諸如β-半乳糖苷酶等報道基因產(chǎn)物的酶活性來測量。
廣泛的各種標記和偶聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的且可用于各種核酸和氨基酸試驗中。產(chǎn)生標記的雜交或PCR探針用于檢測靶多核苷酸序列的方法包括使用標記的核苷酸進行寡聚標記，切口平移，末端標記或PCR擴增。作為選擇，可將編碼序列，或其任一部分克隆進載體中用于產(chǎn)生mRNA探針。該載體是本領(lǐng)域已知的，商業(yè)上可獲得的，且可通過加入諸如T7，T3或SP6等合適的RNA聚合酶和標記的核苷酸用于體外合成RNA探針。
諸如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和USBiochemical Corp(Cleveland，OH)等許多公司提供用于這些方法的商品試劑盒和操作方案。合適的報道分子或標記包括放射性核素，酶，熒光劑，化學發(fā)光劑，或顯色劑以及底物，輔因子，抑制劑，磁性顆粒等。教導使用該標記的專利包括US-A-3817837；US-A-3850752；US-A-3939350；US-A-3996345；US-A-4277437；US-A-4275149和US-A-4366241。另外，可按US-A-4816567所述生產(chǎn)重組免疫球蛋白。
定量特定分子表達的其它方法包括放射性標記(Melby PC等，1993 JImmunol Methods 159235-44)或生物素標記(Duplaa C等1993 Anal Biochem229-36)核苷酸，對照核酸的共擴增，插入實驗結(jié)果的標準曲線。通過以ELISA形式進行試驗可加速多個樣品的定量，其中目的寡聚體以各種稀釋度存在且分光光度測定或測熱反應得到迅速定量。
盡管存在/不存在標記基因表達表明也存在目的基因，但是應證實其存在和表達。例如，如果在標記基因序列內(nèi)插入該核苷酸序列，那么通過標記基因功能的喪失可鑒定含有該核苷酸序列的重組細胞。作為選擇，標記基因可與靶編碼序列在單個啟動子的控制下串聯(lián)排列。標記基因?qū)φT導或選擇產(chǎn)生反應而進行表達通常表明該靶序列也表達。
作為選擇，以本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法可鑒定含有靶編碼序列且表達該靶編碼區(qū)的宿主細胞。這些方法包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物測定或免疫測定技術(shù)，包括基于膜，基于溶液，或基于芯片的技術(shù)，用于檢測和/或定量該核酸或蛋白質(zhì)。
篩選可使用任意一種或多種合適的靶，例如含有一種或多種病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品，以各種藥物篩選技術(shù)中的任一種鑒定根據(jù)本發(fā)明的溶菌素。所述試驗中使用的靶可游離于溶液中，固定在固相支持物上，在細胞表面攜帶，或位于細胞內(nèi)。該靶甚至可在動物模型內(nèi)，其中所述的靶可以是外源性靶或者導入的靶。該動物模型可以是非人動物模型?？蓽y量靶活性的消失或靶與待測溶菌素之間結(jié)合復合物的形成。
預期本發(fā)明的測定方法適合于小規(guī)模和大規(guī)模篩選試驗化合物以及定量試驗。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的篩選包含至少下列步驟(不必以該相同連續(xù)的順序)(a)進行體外篩選以測定候選溶菌素是否具有相關(guān)活性(例如裂解一種或多種病原性梭菌屬細菌，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌的能力)；和(b)用所述的候選溶菌素進行體內(nèi)篩選(例如，使用功能性動物模型)。一般來說，如果所述的候選試劑通過篩選(a)，然后進行篩選(c)。
診斷學本發(fā)明還提供了診斷組合物或試劑盒用于檢測一種靶，即病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌。在該方面，該組合物或試劑盒可含有以根據(jù)本發(fā)明的溶菌素為基礎(chǔ)的診斷標記，它能夠顯示試驗樣品中是否存在一種或多種梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌。合適的是，該試驗樣品可以是食品，消化產(chǎn)物(digesta)，或者可從例如，受試者腸道獲得的試驗樣品。
該診斷組合物或試劑盒可用于檢測一種靶，即在例如食品，消化產(chǎn)物等中的病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌。
該診斷組合物或試劑盒可用于診斷由存在病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的病癥，例如壞死性腸炎，食物中毒或壞疽。
可改造(tailor)該診斷試驗以評估特定治療方案或特定溶菌素的效力且可用于動物試驗，臨床試驗，或監(jiān)測受試者的治療。為了提供診斷疾病的依據(jù)，可建立正常或標準分布圖。通過將從動物或者人的正常(即未感染的)受試者獲取的體液或細胞提取物或其它樣品與本發(fā)明的溶菌素組合可實現(xiàn)這點。如果確認疾病，可施用治療劑，即，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主，并產(chǎn)生治療分布圖或治療值。最后，定期重復該試驗以評估該值是向前進行還是回歸到正常或標準圖型，即在其治療期間，在諸如家禽腸道等樣品中細菌的量是否降低和/或消滅。使用連續(xù)治療分布圖顯示在幾天或幾個月期間的治療效力。
診斷試驗為了提供疾病診斷的依據(jù)，應確定樣品中病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌量的正?；驑藴手怠＠?，在受試者腸道中所述細菌的某一水平可能不會必然對該個體有害。只有當該細菌數(shù)增加到超過某一閾值水平時，才可能觀察到有害影響且形成疾病狀態(tài)。因此，該診斷試驗能夠鑒定樣品中病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在，但是也能夠定量該感染水平。通過將它與加入了已知量細菌的陽性對照的系列稀釋樣品比較可定量樣品中的細菌量。
探針本發(fā)明的另一方面是提供核酸雜交或PCR的探針，它們能夠檢測(特別是能夠選擇性選擇)多核苷酸序列，包括編碼根據(jù)本發(fā)明溶菌素的編碼核苷酸序列的基因組序列，或諸如等位基因等近親分子。該探針的特異性，即它是來自于高度保守的，保守的還是來自于非保守的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，和雜交或擴增的嚴格性(高度，中等或低度)將決定該探針是僅鑒定天然存在的編碼本發(fā)明溶菌素的核苷酸序列，還是鑒定相關(guān)序列。用于檢測相關(guān)核酸序列的探針選自靶家族成員保守的或高度保守的核苷酸區(qū)且該探針可用于簡并探針庫。對于相同核酸序列的檢測，或者如果需要最大的特異性，核酸探針可選自靶多核苷酸的非保守核苷酸區(qū)或者特有區(qū)。本文使用的術(shù)語“非保守核苷酸區(qū)”是指本文公開的溶菌素編碼序列特有的且在相關(guān)家族成員中不存在的核苷酸區(qū)。
US-A-4683195，US-A-4800195和US-A-4965188中所述的PCR提供了基于該核苷酸序列的寡核苷酸的其它用途。該寡聚體一般是化學合成的，但是它們也可酶促產(chǎn)生或從重組來源生產(chǎn)。在鑒定特定基因或狀況的優(yōu)化條件下使用的寡聚體一般含有兩個核苷酸序列，一個具有有義方向(5′-＞3′)且一個具有反義方向(3′＜-5′)。可在較低嚴格條件下使用相同的兩個寡聚體，嵌套的寡聚體組，或者甚至寡聚體的簡并庫來檢測和/或定量近親DNA或RNA序列。
也可使用根據(jù)本發(fā)明溶菌素的核酸序列來產(chǎn)生上述雜交探針，用于定位內(nèi)源性基因組序列。使用熟知技術(shù)可將該序列定位于具體染色體上或者染色體的特定區(qū)域上。它們包括與下列物質(zhì)的原位雜交染色體涂片(Verma等(1988)Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York City)，流式分類染色體標本，或人工染色體構(gòu)建體，例如YACs，細菌人工染色體(BACs)，細菌PI構(gòu)建體或單染色體cDNA文庫。
對染色體標本的原位雜交和使用確定的染色體標記進行的諸如連鎖分析等物理作圖技術(shù)在擴展遺傳圖譜中是無價的。遺傳圖譜的例子可參見Science(1995；270410f和1994；2651981f)。通常將基因定位于另一哺乳動物種類的染色體上可揭示出相連的標記，即使具體人染色體的編號或臂是未知的。通過物理作圖可將新序列定位到染色體臂，或其片段上。這給研究人員使用定位克隆或其它基因探索技術(shù)尋找疾病基因提供了有價值的信息。一旦通過遺傳連鎖將一種疾病或綜合征粗略定位于特定的基因組區(qū)域，對該區(qū)域的任何序列圖譜可提供相關(guān)或調(diào)控的基因用于進一步研究。本發(fā)明的核苷酸序列也可用于檢測由于易位，倒位等在正常，攜帶者或患病個體之間染色體位置的差異。
用途一般來說，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主可用于制備治療病癥的藥物，該病癥與存在病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌細菌相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主可用于檢測和/或消滅病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌。
具體地說，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主可用于動物飼料或者作為動物飼料添加劑以降低動物腸道中病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌的總數(shù)。因此，可預防和/或治療由存在病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的諸如體重增長下降和壞死性腸炎等病癥。
根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主也可用于預防和/或治療壞疽和與存在病原性梭菌屬細菌，特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的其它疾病。
另外或者作為選擇，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主可在測定法中使用以試驗和檢測食品中毒爆發(fā)中的病原體和/或預防或治療個體的食物中毒和/或作為診斷劑用于研究目的。
制備食品根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主可用于食品，包括動物飼料。
在一個實施方案中，本發(fā)明的食品和/或飼料添加劑可通過將根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主與食品和/或飼料添加劑直接混合來制備。作為例子，根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主可與諸如磨細的小麥，玉米或大豆粉等谷類食品和/或飼料添加劑(例如，通過噴灑)接觸。
也可將根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主摻入第二種(和不同的)食品和/或飼料或飲用水中，然后將其加入本發(fā)明的食品和/或飼料添加劑中。因此，將根據(jù)本發(fā)明的溶菌素和/或用含有編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主摻入谷類食品和/或飼料添加劑本身中不是必需的，盡管該摻入方法形成本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的方面。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可將食品和/或飼料添加劑與其它食品和/或飼料成份混合以產(chǎn)生谷類食品和/或飼料。該其它食品和/或飼料成份可包含一種或多種其它(優(yōu)選耐熱的)酶添加劑，維生素食品和/或飼料添加劑，礦質(zhì)食品和/或飼料添加劑和氨基酸食品和/或飼料添加劑。然后可將包含可能的幾種不同類型化合物的所得的(組合)食品和/或飼料添加劑以合適的量與諸如谷類和蛋白質(zhì)添加劑等其它食品和/或飼料成份混合以形成人食品和/或動物飼料。
現(xiàn)在參考下列附圖以實施例的方式進一步描述本發(fā)明


圖1顯示的是核苷酸序列；圖2顯示的是氨基酸序列；圖3顯示的是基因組圖譜；圖4顯示的是圖譜；和圖5顯示的是圖譜。
更詳細地說圖1顯示了編碼根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的核苷酸序列(SEQ ID No.1)；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的溶菌素的氨基酸序列(SEQ ID No.2)；圖3顯示了來自產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體(φ3626)的基因組圖譜；圖4顯示了使用生產(chǎn)φ3626溶菌素的大腸桿菌的粗提物(RE)裂解培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株NCTC3110的圖譜；和圖5顯示了來自產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體φ3626的溶菌素對各種細菌種和屬的底物特異性圖譜。
實施例實施例1從產(chǎn)氣莢膜梭菌分離和純化噬菌體方法按Loessner等(1990 Appl.Environ.Microbiol，56，1912-8)所述通過紫外照射技術(shù)篩選從各種來源分離的51個梭菌菌株的溶原性。指數(shù)生長的梭菌(10ml)暴露于紫外光(254nm，0.0132J cm-2)5分鐘。在黑暗中培養(yǎng)3小時(37℃)后離心(10分鐘，8000g)該培養(yǎng)物并無菌過濾。對所有產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株通過在菌苔上點樣的方法檢測噬菌體活性。
使用Adams所述的軟瓊脂層技術(shù)(1959 Methods of study of bacterialviruses p443-457 Bacteriophages，Intersciences Publishers Inc.NY)純化和增殖噬菌體。向表現(xiàn)出裂解活性的上清稀釋液中加入以0.1ml合適的繁殖菌株的指數(shù)生長培養(yǎng)物接種的3.5ml熔化的軟瓊脂。將該軟瓊脂倒在TY平板上并培養(yǎng)過夜。用無菌巴斯德吸管挑出單個完全分離的噬菌斑并放入0.45ml的TY培養(yǎng)基中。4℃下培養(yǎng)4小時后，將含有該噬菌斑的溶液無菌過濾并用于第二輪純化。
為了從噬菌體分離DNA，高滴度原種(109pfu/ml)是必需的。通過液體培養(yǎng)物將該噬菌體繁殖成高滴度。向合適的宿主培養(yǎng)物(OD600nm為0.1)中以大約1的感染復數(shù)加入噬菌體溶液。通過光度測定法監(jiān)測感染培養(yǎng)物的生長并通過離心(10000g下10分鐘)和無菌過濾培養(yǎng)物上清去掉細胞碎片后收獲該噬菌體。
Zink等(1992 Appl.Environ.Microbiol.58，296-302)描述了從高滴度原種中純化進一步分子研究所必需的噬菌體。簡單地說，通過聚乙二醇8000沉淀，遞增CsCl密度梯度離心和透析來純化和濃縮該該噬菌體(參見，例如，Sambrook等，Molecular Cloninga laboratory manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。通過電子顯微鏡檢(EM)檢查推定的噬菌體顆粒。
結(jié)果使用菌株ATCC3626和NCTC8533，對紫外誘導的無菌培養(yǎng)物上清觀察到的裂解活性是由于存在噬菌體，通過EM證實了這一點。該噬菌體屬于Siphoviridae類型，且命名為φ3626和φ8533。兩種噬菌體的最佳繁殖宿主分別測定為NCTC3110和菌株ATCC3628。
實施例2噬菌體裂解范圍的測定方法通過滴到菌苔上的技術(shù)(drop-on-the-lawn technique)檢測了兩種噬菌體裂解產(chǎn)氣莢膜梭菌的能力。將10μl噬菌體原種(107pfu/ml)放在用產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株接種的平板上。通過培養(yǎng)過夜后在細菌菌苔上形成的噬斑觀察該裂解活性。
結(jié)果噬菌體φ3626裂解51種產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中的11種菌株(21.6％)而噬菌體φ8533能夠裂解4種菌株(7.8％)。
實施例3產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體φ3626的基因組DNA的測序和分析方法使用提取噬菌體λDNA的標準方法(參見Sambrook等，出處同上)獲得φ3626的基因組DNA。噬菌體φ3626基因組文庫的構(gòu)建按Loessner等(2000 Mol.Microbiol 35，324-40)的詳細描述進行。用Tsp509I(New EnglandBiolabs)進行DNA的時間限制性消化和使用HindIII(MBI Fermentas)和TaqI(Roche)進行完全消化。從瓊脂糖凝膠中回收所需長度的片段(1-2kbp)并在載體pBluescript(Stratagene)中接合。將接合產(chǎn)物電穿孔進大腸桿菌DH5αMCR中。在含有Xgal-的瓊脂板上進行的藍白篩選可用于鑒定攜帶插入片段的轉(zhuǎn)化子。從小規(guī)模培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒(Qiaprep Miniprep Kit；Qiagen)并用PauI(MBI)消化。在瓊脂糖凝膠中以限制性模式鑒定了攜帶長度在1-2kbp之間變化的不同插入片段的58個克隆。這些克隆用于使用熒光標記(IRD-800 LI-COR)的與pBluescript多克隆位點兩側(cè)的序列互補的標準引物進行測序。在自動DNA測序儀(4200IR2；LI-COR)上使用熱穩(wěn)定性聚合酶(SequiTherm EXCEL II DNA Sequencing Kit-LC；Epicentre Technologies)進行測序。
使用軟件DNASIS版2.10(Hitachi)排列獲得的序列。排列產(chǎn)生的連續(xù)序列(contigs)用于設(shè)計特異性引物以封閉缺口。通過在φ3626 DNA上進行引物步查(walking)封閉剩下的缺口直到在粘性位點觀察到清楚的鏈終止。使用與粘性位點上游和下游序列互補的引物在溶原性宿主DNA上進行PCR來測定粘性位點的核心序列完成基因組序列。PCR產(chǎn)物和引物步查方法的DNA鏈通過使用染色終止子技術(shù)在ABI 373A自動DNA測序儀上進行測序。
DNASIS/PROSIS(Hitachi)和Husar分析軟件包，包括GCG軟件包(http//genius.embnet.dkfz-heidelberg.de；Biocomputing Service Group at theGerman Cancer Research Center，DKFZ)可用于分析核苷酸和氨基酸序列。Altschul等(1990J.Mol.Biol 215，403-10)教導的BLAST算法可用于對通過國家生物技術(shù)信息中心(the National Center for Biotechnology Information)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)或生物計算機服務公司(the BiocomputingService Group)獲得的數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索。
結(jié)果φ3626基因組長度為33507bp，具有9個核苷酸長的3′-突出的單鏈粘性末端。平均摩爾GC含量為28.4mol％。對φ3626基因組的生物信息分析揭示存在50個推定的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，覆蓋94.1％的序列。
φ3626基因組的蛋白質(zhì)編碼區(qū)可按ORFs的方向明顯地組織成3個主要功能性基因簇(見圖3)。第一個基因簇從坐標為1的粘性位點到坐標19804，在基因組圖譜中向右轉(zhuǎn)錄(圖3)，代表編碼結(jié)構(gòu)蛋白和裂解系統(tǒng)的基因。這些基因可概括為“晚期基因”。第二個基因簇位于bp19805-23645且編碼負責溶原性控制的產(chǎn)物，包括att-位點，整合酶，阻遏物和推定的cro-阻遏物。最后一個基因簇從核苷酸23680延伸到33507，包括以向右方向單向排列的ORFs(參見圖3)。其推定的產(chǎn)物負責噬菌體DNA的復制，重組，修飾且代表“早期”基因。
實施例3溶菌素基因的序列測定方法與其它噬菌體(φ105，Sfi21，φadh，φSLT，φPVL)比較揭示了φ3626基因組具有相似的組織結(jié)構(gòu)。一般來說，內(nèi)溶素位于溶原性控制區(qū)的上游，其ORFs通常以相反的方向排列(見圖3)。ORF19的產(chǎn)物與枯草芽孢桿菌噬菌體φ105可能的成孔素(holin)(Kobayashi，K等，未公開，登錄號AB016282)表現(xiàn)出相似性(105個氨基酸中的50％)。使用Sonnhammer等(1998 Proc.Int.Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.，6175-182)所述的生物信息分析工具TmHMM，確定了該推定的蛋白質(zhì)具有兩個跨膜螺旋區(qū)是非?？赡艿?。因此，暫時假定ORF19編碼φ3626的成孔素。
在有尾噬菌體中，內(nèi)溶素基因位于編碼成孔素基因的下游(參見Wang等(2000 Ann.Rev.Microbiol.54799825)。使用BLASTP2的同源性檢索揭示了ORF20推定的基因產(chǎn)物與未知功能的產(chǎn)氣莢膜梭菌假定的蛋白質(zhì)有強相似性(265-346氨基酸中的72-75％)(參見Garnier等，1988 Plasmid 19135-50；Lyristis等，1994 Mol.Microbiol 12761-77；Shimizu等，1994 J.Bacteriol.1761616-23)。在氨基末端內(nèi)，它與不同來源的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶表現(xiàn)出相似性(枯草芽孢桿菌自溶素，蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)噬菌體12862內(nèi)溶素，多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)的CwlV，在163-166個氨基酸上具有43-45％的相似性)(參見Ishikawa等，1999Mol.Gen.Genet 262738-48；Kunst等，1997 Nature 390；249-56；和Loessner等，1997 J.Bacteriol 1792845-51)。使用PFAM數(shù)據(jù)庫的Hidden MarkovModel(HMM)掃描(參見Durbin等，1998 Biological Sequence AnalysisProbabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids，Cambridge Uni.Press)也表明存在推定的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶結(jié)構(gòu)域。
結(jié)果ORF20鑒定為編碼內(nèi)溶素的基因ply3626且發(fā)現(xiàn)它正好位于編碼成孔素基因的下游。該酶在氨基末端內(nèi)具有酰胺酶結(jié)構(gòu)域的可能性也表明ORF20是內(nèi)溶素。內(nèi)溶素的羧基末端顯示出無已知功能，但是根據(jù)許多內(nèi)溶素表現(xiàn)出模塊結(jié)構(gòu)(modular organization)的發(fā)現(xiàn)(參見Garcia等，1990 Gene8681-8)，推定可能的細胞壁結(jié)合功能域位于ply3626的羧基末端。
實施例4ply3626在大腸桿菌中的表達根據(jù)生物信息學分析，設(shè)計引物用于使用PCR擴增ply3626。引物設(shè)計成與該基因末端互補且在該基因上游和下游具有限制性位點以允許介導克隆進表達載體pQE30(Qiagen)中。純化PCR產(chǎn)物，用合適的限制性核酸內(nèi)切酶消化并在制備的載體中連接。將連接產(chǎn)物通過電穿孔轉(zhuǎn)化進由Zdanovsky等(2000 App.Environ Microbiol 1663166-73)惠贈的以前用質(zhì)粒pACYC-IRL10轉(zhuǎn)化制備的大腸桿菌JM109中。pACYC-IRL10給大腸桿菌提供在大腸桿菌中很少使用而在梭菌中經(jīng)常使用的tRNAs的基因(ileX，argU和leuW)。
用編碼內(nèi)溶素的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在室溫(22℃)下生長，單獨通過載體系統(tǒng)的背景表達產(chǎn)生該內(nèi)溶素。通過使用IPTG誘導觀察，發(fā)現(xiàn)這樣可防止形成內(nèi)含體(inclusion body)。16小時后，離心(8000g，15分鐘)收獲細胞。沉淀重懸于PBS緩沖液中，通過使用French以40000kPa擠壓細胞制備該細胞的粗提物(RE)。將RE以35000g離心30分鐘并無菌過濾。通過在產(chǎn)氣莢膜梭菌NCTC3110細胞上進行裂解試驗顯示酶活性。
通過表達載體pQE30使用與內(nèi)溶素融合的HIS-標記也可純化該內(nèi)溶素。純化的內(nèi)溶素與粗提物中的內(nèi)溶素表現(xiàn)出相同的裂解活性。
實施例5用重組大腸桿菌產(chǎn)生的ply3626對產(chǎn)氣莢膜梭菌進行裂解試驗對于裂解活性的光度測定試驗，產(chǎn)氣莢膜梭菌NCTC3110用作ply3626的底物。該細菌生長過夜(500ml)，通過離心(8000g，15分鐘)收獲并重懸于PBS緩沖液(5ml)中。在-20℃貯存細胞備用。對于裂解試驗，將細胞在PBS緩沖液中稀釋成490mn下光密度為0.7-0.8。向180μl該底物中加入20μl生產(chǎn)內(nèi)溶素的重組大腸桿菌的粗提物并在一段時間內(nèi)測量光密度的改變。作為陰性對照，使用攜帶具有3’截短的ply3626基因的載體的大腸桿菌粗提物。與陰性對照相比，對于含有內(nèi)溶素ply3626的RE測量到由于底物細胞壁的破裂引起光密度明顯降低(見圖4)。
實施例6底物特異性方法為了測定從產(chǎn)氣莢膜梭菌獲得的溶菌素的底物特異性，用ply3626對各種細菌進行裂解試驗。篩選了49個不同的細菌種的109個菌株對ply3626的敏感性。該細菌在標準條件下生長，離心收獲并將沉淀重懸于PBS中。這些原種在-20℃下貯存?zhèn)溆?。稀釋該細胞以獲得0.5-0.9(在490nm下)的光密度且通過加入20μl含有ply3626的重組大腸桿菌粗提物將180μl稀釋的細胞懸液用作裂解試驗的底物。
與陰性對照相比光密度的S型降低解釋為對Ply3626敏感。如果檢測不倒降低，可認為不敏感。
試驗的各種細菌的列表在下面表1和2中提供(其中WS是指Weihenstephan微生物培養(yǎng)保藏中心；ATCC是指美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，USA；且NCTC是指國家典型培養(yǎng)物保藏中心，PHLS，倫敦)表1



表2


結(jié)果如圖5所示，所有48種產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株都對根據(jù)本發(fā)明的溶菌素敏感。只有一種其它梭菌種類表現(xiàn)出敏感性，它是譎詐梭菌(C.fallax)菌株DSM2631。譎詐梭菌的敏感性可能是由于該梭菌種的細胞壁結(jié)構(gòu)與產(chǎn)氣莢膜梭菌同樣具有A3γ型肽聚糖，它通過LL-DAP與甘氨酸交聯(lián)形成雜合橋鍵(interbridge)(參見Schleifer等1972 Bacteriol Rev.36407-77)。
在試驗的所有其它細菌中(不論是諸如肉毒梭菌，破傷風梭菌，諾氏梭菌，酪丁酸梭菌等其它梭菌種類，還是諸如芽孢桿菌屬，彎曲桿菌屬，明串珠菌屬，乳桿菌屬，乳球菌屬，片球菌屬，腸桿菌屬，大腸桿菌，利斯特氏菌屬，雙歧桿菌屬，腸球菌屬，鏈球菌屬，葡萄球菌屬等非梭菌細菌)-總共60個菌株-發(fā)現(xiàn)都對根據(jù)本發(fā)明的溶菌素不敏感。
結(jié)論因此，令人驚奇的是，從產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體分離和測序的溶菌素對產(chǎn)氣莢膜梭菌具有種特異性或者基本上具有種特異性。該種特異性的優(yōu)勢在于給受試者施用所述的溶菌素導致選擇性破壞產(chǎn)氣莢膜梭菌和/或譎詐梭菌(兩者都是病原性梭菌屬種類)而不傷害有益的和/或無害的細菌。
上面說明書中提及的所有出版物在本文中作為參考文獻引用。本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化在不偏離本發(fā)明范圍和精神的前提下對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管本發(fā)明結(jié)合特別優(yōu)選的實施方案進行了描述，應明白要求保護的本發(fā)明不應不適當?shù)鼐窒抻谠摼唧w實施方案。事實上，對生化和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的實施本發(fā)明的所述方式的各種修改方案打算包含在下面權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種溶菌素，所述溶菌素可從能定居于產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體獲得。
2.一種以基本上純化形式存在的溶菌素，它包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列或其變體，同源物或衍生物。
3.一種核酸，含有編碼包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的溶菌素的核苷酸序列或其變體，同源物或衍生物。
4.一種核酸，含有編碼溶菌素的核苷酸序列，該核苷酸序列包含SEQID No.1所示序列或其變體，同源物或衍生物。
5.含有權(quán)利要求1的核苷酸序列的核酸，其中所述的核苷酸序列可從能夠定居于產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體獲得。
6.基本上純的溶菌素，可通過權(quán)利要求3-5之一的核酸的表達獲得。
7.一種宿主，被權(quán)利要求3-5之一的編碼溶菌素的核酸轉(zhuǎn)化。
8.一種宿主，被權(quán)利要求3-5之一的核酸轉(zhuǎn)化。
9.權(quán)利要求7或8的宿主，所述宿主是微生物宿主。
10.權(quán)利要求7-9之一的宿主，所述宿主是食品級生物。
11.權(quán)利要求7-10之一的宿主，所述宿主是腸定居的生物。
12.權(quán)利要求7-11之一的宿主，所述宿主是來自下列屬的一種或多種微生物埃希氏菌屬，乳桿菌屬，芽孢桿菌屬，乳球菌屬，葡萄球菌屬，片球菌屬。
13.權(quán)利要求7-12之一的宿主，所述宿主是來自一個或多個下列種的細菌大腸桿菌，嗜酸乳桿菌，肉葡萄球菌或相關(guān)種類。
14.一種溶菌素，通過培養(yǎng)權(quán)利要求7-13之一的宿主來衍生。
15.權(quán)利要求14的溶菌素，所述溶菌素以基本上純的形式存在。
16.一種組合物，它含有權(quán)利要求1-2，6或14-15之一的溶菌素。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中該組合物是藥用組合物并且還含有可藥用的稀釋劑，賦形劑或載體。
18.權(quán)利要求1-2，6或14-15之一的溶菌素，用作藥物。
19.權(quán)利要求1-2，6或14-15之一的溶菌素的用途，用于制備治療與病原性梭菌屬種類相關(guān)的病癥，疾病或癥狀的藥物。
20.權(quán)利要求3-5或12-13之一的溶菌素的用途，用于制備治療與產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的病癥，疾病或癥狀的藥物。
21.權(quán)利要求19或20的用途，其中該病癥，疾病或癥狀是下列一種或多種體重下降，壞死性腸炎，壞疽。
22.一種藥物，它含有權(quán)利要求1-2，6或14-15之一的溶菌素。
23.一種治療需要治療的受試者的病癥，疾病或癥狀的方法，該方法包括給所述的受試者施用有效量的權(quán)利要求1-2，6或14-15之一所述的溶菌素或權(quán)利要求16-17之一的組合物。
24.一種藥物包，它包含一個或多個區(qū)室，其中至少一個區(qū)室包含一種或多種在權(quán)利要求1-2，6或14-15之一中限定的溶菌素或權(quán)利要求16-17之一的組合物。
25.一種制備權(quán)利要求17的藥用組合物的方法，所述的方法包括將一種或多種在權(quán)利要求1-2，6或14-15之一中限定的溶菌素與可藥用的稀釋劑，賦形劑或載體混合。
26.一種消滅梭菌屬病原菌的方法，該方法包括用權(quán)利要求1-2，6或14-15之一中限定的溶菌素或權(quán)利要求16-17之一的組合物裂解梭菌屬病原性細菌。
27.權(quán)利要求26的方法，所述梭菌屬細菌屬于產(chǎn)氣莢膜梭菌種。
28.權(quán)利要求26-27之一的方法，所述梭菌屬細菌在受試者腸道中。
29.一種表達載體，含有權(quán)利要求3-5之一的核苷酸序列和與其相連的用于在合適的宿主中表達該編碼序列的調(diào)控區(qū)。
30.一種檢測樣品中梭菌屬細菌的方法，使用以權(quán)利要求1-2，6或14-15之一的溶菌素或其模擬物為基礎(chǔ)的診斷標記。
31.權(quán)利要求30的方法，所述梭菌屬細菌屬于產(chǎn)氣莢膜梭菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含編碼溶菌素的核苷酸序列的核酸，該核苷酸序列包含SEQ ID No.1所示的序列或其變體，同源物或衍生物。本發(fā)明還涉及可從能夠定居產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體獲得的新型溶菌素，及其作為治療與諸如病原性梭菌屬細菌相關(guān)的疾病的藥物的用途。
文檔編號A61K38/46GK1813062SQ03805822
公開日2006年8月2日 申請日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月4日
發(fā)明者馬庫斯·齊默, 馬丁·洛斯納, 安德魯·J·摩根 申請人:普羅福斯股份公司