專利名稱：甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗及其凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型和乙型肝炎聯(lián)合疫苗以及其冷凍干燥制劑，特別是涉及含有活的適當(dāng)減毒的甲型肝炎疫苗病毒和由重組CHO細(xì)胞和/或重組酵母表達(dá)并經(jīng)純化的乙型肝炎表面抗原的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，以及其冷凍干燥制劑。本發(fā)明還涉及制備所說的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的方法，以及所說的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的保護(hù)劑。
背景技術(shù)：
甲型肝炎是一種由自然界廣泛存在的甲型肝炎病毒(HAV)引起的全球性急性傳染病。由于甲型肝炎流行的普遍性而且傳播迅速，所以甲肝的流行已成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。特別是在包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家，由于人口眾多，社會經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生條件相對落后，所以甲型肝炎的大規(guī)模暴發(fā)及局部流行常有發(fā)生，即使在經(jīng)濟(jì)高度發(fā)達(dá)的美國，每年也約有數(shù)萬例肝炎病人與甲型肝炎病毒感染有關(guān)。
乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒引起的傳染性疾病。乙型肝炎在發(fā)展中國家有很高的發(fā)病率和致死率，而且一般預(yù)后較差。迄今為止，尚沒有一種治療乙型肝炎的有效方法。在中國，乙肝病毒攜帶者大約占人口總數(shù)的8-10％，并且其中慢性肝炎患者多達(dá)1000萬人以上。
由于甲型肝炎和乙型肝炎的嚴(yán)重危害性和高流行性，這兩種類型肝炎在世界許多國家的發(fā)病率始終占所有病毒性肝炎發(fā)病率的首位，為70％-80％左右。面對甲-乙型肝炎這種嚴(yán)重流行狀況，中國已率先成功開發(fā)了基于活的減毒甲型肝炎疫苗。特別是，為了解決乙型肝炎疫苗生產(chǎn)原材料的來源和可能的其他致病因子感染問題，近年來又在開發(fā)血源性乙型肝炎疫苗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了基于乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的基因工程乙型肝炎疫苗。
自1991年由聯(lián)合國兒童基金會和世界衛(wèi)生組織等國際組織發(fā)起并推行“兒童疫苗計(jì)劃”(CVI)以來，世界上許多從事疫苗研究與開發(fā)的實(shí)驗(yàn)室和公司都在致力于新疫苗的研制。這些新疫苗應(yīng)該是多聯(lián)多價(jià)的、耐熱穩(wěn)定的，并且是可以以口服或氣霧形式接種的。從臨床應(yīng)用角度看，通過使用聯(lián)合疫苗，經(jīng)一次免疫接種即可有效地預(yù)防兩種或多種疾病，以降低疫苗生產(chǎn)成本、提高疫苗接種效率、減少多次注射所帶來的不良反應(yīng)，是疫苗研究的主要發(fā)展方向。
近年來，研究人員在開發(fā)多聯(lián)多價(jià)疫苗方面已進(jìn)行了許多有益的嘗試。僅就肝炎疫苗而言，例如歐洲專利0339 667號公開了一種含有滅活的甲型肝炎病毒抗原及乙型肝炎病毒表面抗原和佐劑，可同時(shí)預(yù)防甲型肝炎和乙型肝炎的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗。另外，美國專利6,451,320號提供了一種適用于青少年接種的聯(lián)合疫苗組合物。該聯(lián)合疫苗組合物包括乙型肝炎病毒表面抗原和單純皰疹病毒抗原，以及選自甲型肝炎病毒抗原(HAV)、EB病毒(EBV)抗原等的一種或多種病毒抗原，并且其中HAV是失活的源自于HM-175病毒株。然而，現(xiàn)有的這些聯(lián)合疫苗中所使用的甲型肝炎病毒抗原均為滅活的HAV病毒。
迄今尚未見使用活的減毒甲型肝炎疫苗病毒生產(chǎn)甲-乙型肝炎聯(lián)合(佐劑)疫苗及其凍干制劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗組合物，包括活的減毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種冷凍干燥形式的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗組合物，包括活的減毒甲型肝炎疫苗病毒、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和保護(hù)劑。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種冷凍干燥形式的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗組合物的制備方法。
本發(fā)明的其他目的，見于本文對本發(fā)明的描述中。
本發(fā)明涉及甲型和乙型肝炎聯(lián)合疫苗，特別是涉及含有活的甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白以及保護(hù)劑的冷凍干燥形式的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗組合物。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及生產(chǎn)所說的聯(lián)合疫苗組合物的制備方法。
根據(jù)本發(fā)明，一種甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，含有活的減毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白。
用于本發(fā)明的活的減毒甲型肝炎疫苗病毒，可以是已知的活的減毒甲型肝炎疫苗病毒。例如，可以使用從自然感染的甲型肝炎病人的糞便中分離得到的并經(jīng)過系列減毒傳代終末稀釋、“克隆”純化或其他人工誘變方法而獲得的減毒適宜的甲型肝炎疫苗株作為種子病毒，采用對甲型肝炎疫苗病毒敏感的細(xì)胞基質(zhì)，例如已建立的人胚肺二倍體細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)，按照中國專利92114998.0號中詳細(xì)描述的方法，制備用于本發(fā)明的活的減毒甲型肝炎疫苗病毒原液。
優(yōu)選采用甲型肝炎減毒活疫苗L-A-1疫苗株所制備的疫苗原液。
用于本發(fā)明的乙型肝炎表面抗原蛋白，可以是已知的純化乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。例如，可以利用構(gòu)建和選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)，如在原核、真核或酵母宿主中表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。例如，可以從供血者的HBsAg陽性和乙型肝炎e抗原陰性血清中分離HBsAg基因，并將其克隆到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體如pBR322或其衍生物中，然后用所得到的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和/或酵母，并在適于表達(dá)HBsAg蛋白的條件下培養(yǎng)重組CHO細(xì)胞和/或酵母菌，然后從重組細(xì)胞培養(yǎng)液和/或酵母菌中收獲并純化得到所需的HBsAg蛋白。
乙肝表面抗原的制備可以依據(jù)2000年版《中國生物制品規(guī)程》中《重組(CHO細(xì)胞)乙型肝炎疫苗制造及檢定規(guī)程》制備。
或者，也可以使用密度梯度離心法或各種離子交換層析法，由HBsAg陽性病毒攜帶者的血清中，分離和純化血源性乙型肝炎表面抗原蛋白。
根據(jù)本發(fā)明聯(lián)合疫苗組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的活的減毒甲型肝炎疫苗病毒，是由自然感染的甲型肝炎病人糞便中分離得到的野毒型甲型肝炎病毒，經(jīng)終末稀釋“克隆”純化并在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中傳代減毒而得到的甲型肝炎L-A-1病毒株。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案，特征在于聯(lián)合疫苗中所含的活的減毒甲型肝炎疫苗病毒的病毒滴度不小于6.5LogCCID50/ml。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由重組CHO細(xì)胞和/或重組酵母表達(dá)并經(jīng)純化后而獲得。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案，特征在于聯(lián)合疫苗中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的蛋白含量不小于10μg/ml。
減毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白在聯(lián)合疫苗中的優(yōu)選比例范圍為6.5-7.0LogCCID50/ml比12-14μg/ml。
為了便于本發(fā)明聯(lián)合疫苗制品的運(yùn)輸、儲存和使用，減少這些過程中所謂“冷鏈”壓力，保證疫苗接種效果，本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)摸索，成功地研制了一種凍干保護(hù)劑或穩(wěn)定劑。這種凍干保護(hù)劑或穩(wěn)定劑能夠完全保證液態(tài)聯(lián)合疫苗制品，在冷凍干燥過程中，以及凍干后的運(yùn)輸、儲存和使用過程中，聯(lián)合疫苗不會失活。
因此，根據(jù)本發(fā)明，一種冷凍干燥形式的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，含有活的減毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白以及保護(hù)劑。
用于本發(fā)明聯(lián)合疫苗的保護(hù)劑，包含海藻糖、谷氨酸、抗壞血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐。
右旋糖酐可以是高，中，低分子的右旋糖酐，如右旋糖酐70，40，20；優(yōu)選低分子右旋糖酐，如右旋糖酐20。
冷凍干燥前，它們在聯(lián)合疫苗組合物中的含量(W/V)分別是海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗壞血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％，右旋糖酐1-6％。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中保護(hù)劑基本上是由海藻糖、谷氨酸、抗壞血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐組成的。
本發(fā)明的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗以及其冷凍干燥制品中，還可以含有一種或多種用于提高其免疫原性但不引起任何副作用的佐劑。這些佐劑一般都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其中包括但不只限于氫氧化鋁或磷酸鋁凝膠、3D-MPL(一種Th1細(xì)胞反應(yīng)刺激劑)等(參見PharmaceuticalBiotechnology，Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvantapproch，Powell and Newman，Plenurn Press)。
本發(fā)明優(yōu)選的免疫佐劑是氫氧化鋁溶液。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中還可含有適當(dāng)量的免疫佐劑，例如，0.8-1.2mg/ml的氫氧化鋁溶液。
根據(jù)本發(fā)明疫苗組合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中該佐劑是由凍干甲乙型肝炎聯(lián)合疫苗稀釋液中所含有的0.8-1.2mg/ml的氫氧化鋁溶液提供的。
根據(jù)本發(fā)明，一種冷凍干燥的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的生產(chǎn)方法，該方法包括(1)分別提供并按適當(dāng)?shù)谋壤旌系暮袦p毒的甲型肝炎疫苗病毒原液和由重組CHO細(xì)胞和/或重組酵母表達(dá)，并經(jīng)純化的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的蛋白原液，得到甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒表面抗原的混合懸液；(2)在步驟(1)中得到的混合懸液中加入適當(dāng)量的保護(hù)劑并混勻之，得到所需的甲型肝炎和乙型肝炎聯(lián)合疫苗組合物懸液；(3)冷凍干燥步驟(2)中得到的含有保護(hù)劑的聯(lián)合疫苗懸液。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中保護(hù)劑的成分及它們在聯(lián)合疫苗組合物懸液中的濃度(W/V)是海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗壞血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％和右旋糖酐1-6％。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的方法進(jìn)一步包括，凍干聯(lián)合疫苗在使用前，用氫氧化鋁溶液稀釋步驟(3)得到的凍干聯(lián)合疫苗組合物，使其中活的減毒甲型肝炎疫苗病毒的病毒滴度不低于6.5LogCCID50/ml，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的蛋白含量不低于10μg/ml，氫氧化鋁的濃度含量為0.8-1.2mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中佐劑是由凍干甲乙型肝炎聯(lián)合疫苗稀釋液中所含有的氫氧化鋁溶液提供的。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗組合物可有效地用于預(yù)防甲型肝炎和乙型肝炎。多種動物及猴體實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果表明，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗組合物不僅具有與其單價(jià)疫苗同樣良好的安全性，而且具有比其單價(jià)疫苗更佳的免疫原性。另一方面，由于本發(fā)明的聯(lián)合疫苗組合物中含有可有效的保護(hù)甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表明抗原蛋白的生物活性的凍干保護(hù)劑，所以可將其制成冷凍干燥的聯(lián)合疫苗制劑，并因此而免除了疫苗生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存和使用過程中的“冷鏈”壓力，從而可更有效的保證疫苗的接種效果。特別是，由于本發(fā)明的聯(lián)合疫苗組合物中使用了已充分證明具有良好安全性及免疫原性的活的甲型肝炎疫苗病毒，所以大大降低了聯(lián)合疫苗組合物的生產(chǎn)成本和市場價(jià)格，從而有利于其在包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家的推廣和普遍使用。
為了制備本發(fā)明聯(lián)合疫苗凍干保護(hù)劑，例如，可以首先按所示濃度將下列成份溶解于37℃蒸餾水(1000ml)中谷氨酸鈉100.0g/L、抗壞血酸20.0g/L、尿素80.0g/L、山梨醇80.0g/L和肌醇80.0g/L，并用0.1NHCL調(diào)整PH值至7.0。經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后得到保護(hù)劑組分A。然后稱取海藻糖500.0g溶解于溫度為37℃左右注射用水補(bǔ)至1000ml，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后得到保護(hù)劑組分B。最后再將低分子右旋糖苷300.0g溶解于溫度約為37℃的注射用水補(bǔ)至1000ml，經(jīng)116℃高壓蒸汽滅菌40分鐘后得到保護(hù)劑組分C。使用時(shí)可以在上述甲肝疫苗原液和乙肝疫苗原液的混合懸液中加入適當(dāng)體積的保護(hù)劑組分A、B和C，使保護(hù)劑的各成份達(dá)到如上限定的濃度范圍(參見實(shí)施例2)。
然而，本發(fā)明凍干聯(lián)合疫苗組合物中，佐劑并不是在疫苗制備過程中加入的，而是作為凍干制品的溶解劑和稀釋劑，于凍干聯(lián)合疫苗臨使用前加入的。對所加入的氫氧化鋁佐劑的含量一般有所限制，其作為凍干制品的溶解劑和稀釋劑加入后，能使聯(lián)合疫苗中甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白的免疫原性有所增強(qiáng)。一般說來，佐劑氫氧化鋁在凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗中的含量范圍約為0.8-1.2mg/ml。
可以通過簡單的機(jī)械混合方法，制備本發(fā)明的甲型和乙型肝炎聯(lián)合疫苗組合物。例如首先按照適當(dāng)?shù)捏w積比例(如大約20∶1(V/V))，將預(yù)制備的病毒滴度為大于7.0Log CCID50/ml的甲型肝炎疫苗原液與預(yù)制備的蛋白質(zhì)濃度為大于100μg/ml的乙型肝炎病毒表面抗原原液混合，然后再加入適當(dāng)量預(yù)制備的凍干保護(hù)劑并輕輕混合均勻。
然后，使用作為疫苗稀釋液的199綜合培養(yǎng)液稀釋至聯(lián)合疫苗中各組份所需含量或濃度，即得到懸液形式的聯(lián)合疫苗組合物。
最后，可以使用常規(guī)凍干裝置冷凍干燥分裝好的上述混合懸液，其中所使用的冷凍干燥條件是于-30℃至-55℃低溫條件預(yù)冷凍3-7時(shí)，然后于-30℃至35℃條件下真空干燥8至16小時(shí)。凍干過程中，疫苗凍干混合物的共融溫度低于-38℃。
與凍干前相比，凍干后甲型肝炎疫苗病毒滴度雖稍有下降，但下降幅度不大干約0.5LogCCID50/ml。如此得到的凍干疫苗制品可以在室溫條件較長時(shí)間地保存至6個月，而幾乎不影響其甲肝疫苗病毒的病毒滴度和乙肝病毒表面抗原的相對效力(使用重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗作為參比疫苗)。
在臨床應(yīng)用之前，可以使用含量為0.8-1.2mg/ml的氫氧化鋁溶液，溶解并稀釋如上得到的凍干聯(lián)合疫苗，將本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制成懸液形式的制劑。氫氧化鋁水溶液不僅可以作為凍干聯(lián)合疫苗的溶解劑和稀釋劑使用，而且還可為其提供具有免疫增強(qiáng)作用的佐劑。
大量的實(shí)驗(yàn)研究和包括恒河猴、紅面猴在內(nèi)的多種動物接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗作為一種新的藥物組合物，可有效地用于預(yù)防甲型肝炎和乙型肝炎，既不會因兩種病毒抗原的混合造成彼此干擾，亦不導(dǎo)致任何免疫反應(yīng)抑制作用或其他的不良反應(yīng)。安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種本發(fā)明聯(lián)合疫苗的所有靈長類動物(恒河猴或紅面猴)于接種后0-12周均未出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高.對動物的肝臟活體組織的病理學(xué)檢查顯示，所有被檢動物均未見有肝組織的異常病理學(xué)改變(參見實(shí)施例3)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明，與單獨(dú)使用甲型肝炎減毒活疫苗和/或乙型肝炎疫苗相比，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗似乎提供了比其單價(jià)疫苗更好的免疫原性。另外，由于本發(fā)明的聯(lián)合疫苗組合物中含有有效的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑成份，所以在疫苗的凍干過程中或凍干后的長時(shí)間儲存、運(yùn)輸過程中，甲肝疫苗病毒滴度和乙肝疫苗相對效力均沒有明顯下降。
對預(yù)制備的聯(lián)合疫苗兩種疫苗中組份檢定結(jié)果表明，其中甲型肝炎疫苗病毒滴度為不低于6.5LogCCID50/ml，而HBsAg抗原蛋白含量為不低于10μg/ml。
聯(lián)合疫苗免疫原性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，恒河猴或紅面猴接種聯(lián)合疫苗4周時(shí)，動物血清中抗HAV抗體的陽轉(zhuǎn)率即達(dá)到80-100％。同時(shí)觀察到，動物血清中抗HBsAg抗體的陽轉(zhuǎn)率約為20％；8周時(shí)的抗HBsAg抗體的陽轉(zhuǎn)率為40-80％；而接種12周后的抗HBsAg抗體的陽轉(zhuǎn)率可達(dá)到80-100％，另外，進(jìn)一步的比較實(shí)驗(yàn)顯示，與接種單價(jià)疫苗相比，接種本發(fā)明的凍干甲-乙肝炎聯(lián)合疫苗的靈長類動物(恒河猴或紅臉猴)，具有與其接種單價(jià)疫苗同樣良好的安全性和似乎更佳的免疫原性(參見實(shí)施例4-①)。
細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給BALB/C純系小鼠接種本發(fā)明的聯(lián)合疫苗組合物后，通過淋巴因子表面標(biāo)記檢測、自然殺傷(NK)細(xì)胞活性檢測、淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞活性檢測、巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測疫及一些細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-2、IL-18)檢測的結(jié)果表明動物產(chǎn)生了顯著的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，另外，進(jìn)一步比較試驗(yàn)顯示，與接種單價(jià)甲肝疫苗和乙肝疫苗比較，本發(fā)明的甲—乙型肝炎聯(lián)合疫苗可產(chǎn)生更佳的細(xì)胞免疫介導(dǎo)反應(yīng)(參見實(shí)施例4-②)。
進(jìn)一步的聯(lián)合疫苗儲存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的凍干聯(lián)合疫苗于2-8℃和室溫(25℃)下可分別儲存18和5個月以上，甲型肝炎疫苗病毒滴度和乙型肝炎疫苗相對效力穩(wěn)定(參見實(shí)施例5)。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例1甲型肝炎疫苗病毒原液制備首先使用加有10-15％小牛血清的基本培養(yǎng)基(MEM)(pH7.2-7.6)擴(kuò)增培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞。細(xì)胞形成致密的單層后棄去生長培養(yǎng)液，并以新鮮Earle氏液反復(fù)沖洗細(xì)胞后，接種按中國專利92114998.0號實(shí)施例1中所述方法制備的種子病毒液。34℃-36℃吸附3-4小時(shí)后，向培養(yǎng)物中補(bǔ)加細(xì)胞生長維持液(加有維生素C的乳白蛋白水解液)后于34℃-36℃下培養(yǎng)約4周，每周換液一次。培養(yǎng)后棄去維持液和殘留的小牛血清，直接加入含低濃度鹽(例如1-10mM NaCl)并且不含酚紅的199綜合培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)(34℃-36℃)2至4天。然后收集細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)凍融和超聲破碎細(xì)胞后離心收集上清即得到甲型肝炎疫苗病毒原液。
實(shí)施例2凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的制備將2.0L甲肝疫苗病毒的原液(L-A-1.毒株，病毒滴度為8.0LogCCID50/ml)與72ml由重組CHO細(xì)胞和/或重組酵母表達(dá)并經(jīng)純化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白原液(蛋白含量為1334μg/ml)混合，然后加入如下制備的保護(hù)劑原液保護(hù)劑組分A550ml、保護(hù)劑組分B700ml和保護(hù)劑組分C450ml。
然后，再向如此得到的混合懸液中加入適當(dāng)量作為病毒疫苗基質(zhì)液的199綜合培養(yǎng)液，使液態(tài)聯(lián)合疫苗的總體積達(dá)到8000ml，使其中甲型肝炎疫苗病毒滴度不小于6.5Log CCID50/ml，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量不小于10μg/ml。如此稀釋的結(jié)果也導(dǎo)致疫苗懸液中所加保護(hù)劑各組份的濃度(W/V)分別達(dá)到海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗壞血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％和右旋糖酐1-6％。
為了制備凍干保護(hù)劑原液，可以首先按所示濃度將下列成份溶解于蒸餾水(1000ml)中谷氨酸鈉100.0g/L、抗壞血酸20.0 g/L、尿素80.0g/L、山梨醇80.0g/L和肌醇80.0g/L，并用0.1N HCL調(diào)整PH值至7.0。經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后得到保護(hù)劑組份A。然后稱取海藻糖500.0g溶解于溫度為37℃左右注射用水補(bǔ)至1000ml，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后得到保護(hù)劑組份B。最后再將300.0g右旋糖酐20溶解于溫度約為37℃注射用水補(bǔ)至1000ml，經(jīng)116℃高壓蒸汽滅菌40分鐘后得到保護(hù)劑組份C。
按照每安瓶(或西林瓶)1ml的體積分裝上述聯(lián)合疫苗懸液，然后將安瓶置于密閉的真空冷凍干燥器(FS150-SS20C型，Hull Co.，USA)內(nèi)，按下述條件冷凍干燥首先將疫苗懸液于大約-40℃下預(yù)凍4小時(shí)，然后逐漸升溫至32℃真空干燥約15小時(shí)，從而得到所需的冷凍干燥的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗。
按照世界衛(wèi)生組織(WHO)及國家藥品監(jiān)督管理局(SDA)有關(guān)聯(lián)合疫苗及凍干制劑制檢規(guī)程及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，對本發(fā)明所提供的聯(lián)合疫苗進(jìn)行全面檢定，其結(jié)果各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均達(dá)到或超過世界衛(wèi)生組織(WHO)及國家藥品監(jiān)督管理局(SDA)所規(guī)定的制檢規(guī)程要求。其中甲型肝炎疫苗病毒滴度為不低于6.5LogCCID50/ml，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白質(zhì)含量為不低于10μg/ml。
實(shí)施例3凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的安全性實(shí)驗(yàn)選擇抗-HAV抗體、抗-HBV抗體均陰性、ALT指標(biāo)正常的健康紅面猴或恒河猴35只(平均體重1.5-4.5Kg)，隨機(jī)分為7組，每組5只動物。于實(shí)驗(yàn)開始之日，5個實(shí)驗(yàn)組的每只動物通過靜脈途徑注射不同批次的本發(fā)明凍干聯(lián)合疫苗各1ml(甲肝病毒滴度為6.5-7.0LogCCID50/ml，乙型肝炎病毒表明抗原蛋白含量為10-12μg/ml，其相對效力為2.45-3.06)，兩對照組的動物則分別接受同樣劑量的減毒甲肝活病毒疫苗(凍干制劑)和重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗。
于疫苗接種后第0、4、8和12周采集被免疫動物的靜脈血，分離血清并分別以常規(guī)生化檢測法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測動物的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)或(ALT)水平，以及抗HAV和抗HBsAg抗體水平以及乙肝疫苗相對效力(被檢疫苗的ED50與參比疫苗的ED50之比)。其中使用抗HAV檢測試劑盒并以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測抗HAV抗體；使用抗HSsAg試劑并以放射免疫法(RIA)檢測抗HBsAg抗體。在采血的同時(shí)，通過肝穿刺采集被試動物的活體肝組織并進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查。結(jié)果如下列表1所示。
表1 甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗接種猴體安全性試驗(yàn)疫苗 甲肝病毒滴度 乙肝 血清SGPT異常(周)肝組織病理異常(周)批號 LogCCID50/ml 相對效力 0 2 4 8 12 0 4 8 12980401 6.50 2.79 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/5 0/5 0/5 0/5980402 6.67 2.58 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/5 0/5 0/5 0/5980403 6.67 2.88 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/5 0/5 0/5 0/5980501 6.67 3.06 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/5 0/5 0/5 0/5980502 7.00 2.45 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/5 0/5 0/5 0/5HA980501 6.670/5 0/5 0/5 0/5 0/50/5 0/5 0/5 0/5HB980401 2.55 0/5 0/5 0/5 0/5 0/50/5 0/5 0/5 0/5HA凍干的甲肝減毒活病毒疫苗；HB重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗從表1所示結(jié)果可以看出，凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗及對照組疫苗接種猴體后，動物均未發(fā)生血清肝酶的異常升高。肝活體組織病理學(xué)檢查也表明，所有試驗(yàn)動物均未見肝組織的異常病理學(xué)改變。表明凍干甲乙型肝炎聯(lián)合疫苗具有與其單價(jià)疫苗同樣良好的安全性。
實(shí)施例4凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗免疫原性實(shí)驗(yàn)①疫苗誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)選擇HAV抗體、HBV抗體均陰性、ALT指標(biāo)正常的健康恒河猴35只(平均體重1.5-4.5Kg)，隨機(jī)分為柒組，每組5只動物。于實(shí)驗(yàn)開始之日，5個實(shí)驗(yàn)組的每只動物通過靜脈途徑接受本發(fā)明的不同批次的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗各1ml(甲肝病毒滴度為6.5-7.0LogCCID50/ml，乙型肝炎病毒表明抗原蛋白含量為10-12μg/ml，其相對效力為2.45-3.06)，其余2個對照組的動物則分別接受同樣劑量的減毒甲肝活病毒疫苗(凍干制劑)或重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗。
于疫苗接種后第0、4、8和12周采集被免疫動物的靜脈血，分離血清并使用常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法檢測動物的血清抗HAV和抗HBsAg抗體水平，以及HAV-IgM抗體滴度(作為疫苗接種后的原發(fā)性感染指征)。結(jié)果如下列表2、3、4和5所示。
表2 凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗接種猴體免疫原性試驗(yàn)(一)疫苗甲肝病毒滴度 乙肝 試驗(yàn) Anti-HAV陽性(W) HAV-IgM陽性(W)批號LogCCID50/ml 相對效力 動物數(shù) 0 2 48 0 2 4 8980401 6.50 2.79 50/5 3/5 5/5 5/5 0/5 4/5 3/5 0/5980402 6.67 2.58 50/5 5/5 5/5 5/5 0/5 5/5 3/5 0/5980403 6.67 2.88 50/5 4/5 4/5 5/5 0/5 5/5 2/5 0/5980501 6.67 3.06 50/5 2/5 5/5 5/5 0/5 4/5 3/5 1/5980502 7.00 2.45 50/5 3/5 4/5 5/5 0/5 3/5 2/5 1/5HA9805016.6750/5 3/5 5/5 5/5 0/5 4/5 2/5 0/5HA凍干的甲肝減毒活病毒疫苗表3 凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗接種猴體免疫原性試驗(yàn)(二)疫苗 甲肝病毒滴度 乙肝 試驗(yàn) 抗-HBS陽性(W)批號 LogCCID50/ml 相對效力 動物數(shù)0 4 8 12 16980401 6.50 2.79 5 0/50/5 2/5 5/55/5980402 6.67 2.58 5 0/51/5 3/5 4/54/5980403 6.67 2.88 5 0/51/5 4/5 5/55/5980501 6.67 3.06 5 0/51/5 3/5 5/55/5980502 7.00 2.45 5 0/51/5 3/5 4/54/5HB980401 2.555 0/51/5 3/5 4/54/5HB重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗表4 凍干甲乙型肝炎聯(lián)合疫苗接種猴體后甲肝抗體水平檢測-HAV滴度 乙肝 抗體水平(mIU/m1)樣品號 LogCCID50/ml 相對效力動物號(4W) (8W) (12W) (16W)321 1409 11008 69136 12769322 3896422 80589 46978980401 6.502.79323 1215 4984 70055 74418324 1586 6962 15958 10224325 1451 6336 14725 44275(X±SD) 1089.13±1.79 6891.30±1.34 39128.26±2.36 28913.57±2.40436 1389 1447 71535 12438437 4721489 69572 41287980402 6.672.58438 1441 1375 80109 49078439 1511 1491 15123 57325440 1312 1583 12263 10115(X±SD) 1133.71±1.64 1475.45±1.05 37477.78±2.53 27098.93±2.26326 1309 1479 15416 11098327 1538 1592 13817 12495HA980501 6.67328 4151319 15958 49907329 1375 1563 6751 58732330 1319 1601 7059 43285(X±SD) 1086.67±1.72 1506.96±1.08 11012.73±1.54 28123.6±2.23HA980501為單價(jià)凍干甲肝減毒活疫苗表5 凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗接種猴體后抗-HBs水平檢測HAV滴度 乙肝 乙肝抗-HBS滴度(mIU/ml)(周)樣品號 LogCCID50/ml相對效力動物號 8 12163210 652.45286.68322341.73 3586.68 4931.91980401 6.50 2.79 32367.63 785.543346.65324158.45 2038.51 1307.633250 1156.66 2037.75(X±SD) 1340.23±2.02 1660.09±3.01436163.56 3143.86 2193.864370 845.651198.73980402 6.67 2.58 438186.70 2104.45 3586.6843961.85 584.36797.454400 0 0(X±SD) 1344.05±2.19 1656.08±1.9433198.75 3296.71 1758.7033265.56 585.751965.30HB9804012.55 333152.41 2345.84 3346.153340 714.58652.683350 0 0(X±SD) 1340.44±2.36 1657.55±1.98HB90401為重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗由表2、3、4和5所示的結(jié)果可以看出，靈長類動物(恒河猴或紅面猴)接種不同批次的本發(fā)明甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗后，第4周時(shí)動物血清抗甲肝病毒抗體陽轉(zhuǎn)率為80％-100％，并且于8周后均達(dá)到100％。接種聯(lián)合疫苗4周后動物血清抗-HBs抗體的陽轉(zhuǎn)率為20％；8周時(shí)為40-80％，并且于12周時(shí)達(dá)到80-100％。聯(lián)合疫苗的抗體水平與其單價(jià)甲肝疫苗和乙肝疫苗相比，差異無顯著意義(P＞0.05)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗與其單價(jià)甲肝、乙肝疫苗均具有同樣良好的免疫原性。另外，動物在接種聯(lián)合疫苗后，作為甲肝原發(fā)性感染指征的血清抗甲肝病毒IgM抗體也均于接種后的2-4周時(shí)轉(zhuǎn)為陽性，并且于第8周后逐漸消失(表2)。
②疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)A試驗(yàn)動物選擇選自6-8周齡雌性BALB/C純系小鼠40只(長春生研所動物中心提供)，隨機(jī)分為四組，每組10只設(shè)空白對照組、甲肝疫苗組、乙肝疫苗組、甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗組。各實(shí)驗(yàn)組動物分別腹腔內(nèi)注射0.5ml相應(yīng)疫苗，空白對照組動物則以相同途徑注射等體積的氫氧化鋁(濃度為1.0mg/ml)的稀釋液。
B淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記檢測接種后10天處死動物，無菌摘取各組動物的脾臟并分別制備單細(xì)胞懸液。然后將所得到的細(xì)胞懸液按每管1ml的體積分裝于試管內(nèi)。各管分別加入結(jié)合了異硫氰酸熒光素(FITC)的抗CD3、抗CD4和抗CD8單克隆抗體(各0.1ml)。然后使用流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)進(jìn)行流式細(xì)胞光度檢測。結(jié)果如下列表6所示，其中數(shù)值以各組動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
表6 被免疫動物T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記的檢測組別 CD 3+(％)CD4+(％)CD8+(％) CD4+/CD8+(％)①對照組 35.44±6.47 16.19±3.62 8.90±0.031.81±0.04②甲肝疫苗組 47.46±5.60 25.86±2.85 9.24±0.752.80±0.01③乙肝疫苗組 47.23±4.25 26.91±0.41 9.56±0.212.81±0.03④聯(lián)合疫苗組 50.66±7.77 32.74±6.85 9.72±0.433.41±0.15由表6所示的結(jié)果可以看出，各試驗(yàn)組動物的CD3+總體上均較對照組有明顯增加(P＜0.05)。各試驗(yàn)組動物的CD4+也較對照組有明顯升高，而且聯(lián)合疫苗組動物的CD4+高于單價(jià)疫苗組(P＜0.05)。而且從中還可以看出，聯(lián)合疫苗組動物CD4+/CD8+值顯著高于單價(jià)疫苗組及空白對照組(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，動物接種本發(fā)明的聯(lián)合疫苗后，體內(nèi)免疫細(xì)胞被活化的程度明顯高于接種單價(jià)甲肝或乙肝疫苗的動物。
C天然殺傷(NK)細(xì)胞活性檢測接種后10天處死動物，無菌摘取各組動物的脾臟并分別制備單細(xì)胞懸液。然后將所得到的細(xì)胞懸液按每管1ml的體積分裝于試管內(nèi)。各管分別加入結(jié)合了PE(磷脂酰乙醇胺)的抗小鼠NK1.1單克隆抗體(各0.1ml)。然后使用流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)進(jìn)行流式細(xì)胞光度檢測。結(jié)果如下列表7中所示，其中數(shù)值以各組動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
D淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞活性檢測向上述被免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中加入終濃度為15μl/ml的白介素2(IL-2)，于37℃和5％CO2條件下保溫72小時(shí)后即得到所需的淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中以H3-TdR標(biāo)記的K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，并按照100∶1的效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比例混合兩種細(xì)胞。將混合的細(xì)胞懸液于37℃和5％CO2下保溫8小時(shí)。然后，充分洗滌并離心收集細(xì)胞，使用γ計(jì)數(shù)器測定各組動物細(xì)胞的放射活性(cpm值)。結(jié)果如下列表7中所示，其中所有數(shù)值均以各組動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
E腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定實(shí)驗(yàn)前，對所有被免疫小鼠腹腔內(nèi)注射2％糖原水溶液。24小時(shí)后腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液各1ml。30分鐘后處死動物，收集腹腔巨噬細(xì)胞并涂片。然后，將所得細(xì)胞涂片于37℃下孵育30分鐘。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)充分洗細(xì)胞并風(fēng)干后，對細(xì)胞進(jìn)行姬姆薩染色，然后于光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)已吞噬雞紅細(xì)胞的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)，計(jì)算吞噬百分率。結(jié)果如下列表7中所示，其中所有數(shù)值均以各組動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
表7 被免疫動物的NK活性、LAK活性和Mφ吞噬細(xì)胞活性組別NK活性(％) LAK活性(％) Mφ吞噬細(xì)胞活性①對照組4.46±0.51 33.5±5.6028.58±3.06②甲肝疫苗組11.80±0.71 64.10±6.38 50.62±2.67③乙肝疫苗組8.79±1.21 63.98±4.71 48.20±1.38④聯(lián)合疫苗組12.20±1.69 66.60±7.42 56.64±19.13由表7所示的結(jié)果可以看出，動物接種甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗和其單價(jià)甲型肝炎及乙型肝炎疫苗免疫后其NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞和Mφ吞噬細(xì)胞活性均有明顯的改善，與對照組相比差異非常顯著(p＜0.05)。其中相對于接種單價(jià)疫苗的動物，接種甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗動物的腹腔巨噬細(xì)胞活性有顯著提高(P＜0.05)。這些結(jié)果表明動物接種本發(fā)明的聯(lián)合疫苗后，巨噬細(xì)胞的吞噬作用及其引起的抗原呈遞明顯高于接種單純甲肝和乙肝疫苗的動物。
F細(xì)胞因子的定量檢測。
使用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))方法定量檢測編碼細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2及IL-18的DNA。同時(shí)從被免疫小鼠的脾細(xì)胞中提取RNA，然后用MMLV-RT(小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子引物以競爭性PCR方法擴(kuò)增細(xì)胞因子特異性cDNA。最后用瓊脂糖凝膠電泳法定量分析所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)中分別使用β-acting作為對照樣品。結(jié)果如下列表8-10所示。
表8 疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ的定量比較

表8所示的結(jié)果表明，甲肝疫苗組與甲-乙肝聯(lián)和疫苗組刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ的能力相近(P＞0.05)，但顯著高于對照組和乙肝疫苗組(P＜0.05)。
表9 疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-2的定量比較

表9所示的結(jié)果表明，甲-乙型肝炎聯(lián)和疫苗組刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-2的能力明顯優(yōu)于甲肝疫苗組、乙肝疫苗組和對照組(P＜0.05)。由于IL-2主要作用是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和分化，因此可以認(rèn)為本發(fā)明的甲-乙型肝炎聯(lián)和疫苗在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和分化能力方面明顯優(yōu)于甲肝及乙肝單價(jià)疫苗(P＜0.05)。
表10 疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-18的定量比較

表10所示的結(jié)果表明，甲-乙型肝炎聯(lián)和疫苗組刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-18的能力明顯優(yōu)于甲肝疫苗組、乙肝疫苗組和對照組(P＜0.05)。由于IL-18的主要作用在于活化的巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生并顯著地增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，因此可以認(rèn)為本發(fā)明的甲-乙型肝炎聯(lián)和疫苗在增強(qiáng)NK細(xì)胞活性方面明顯優(yōu)于單價(jià)的甲肝或乙肝疫苗(P＜0.05)。
實(shí)施例5凍干的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將聯(lián)合疫苗于不同溫度下保存不同時(shí)間，然后取樣進(jìn)行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力、殘余水分含量等項(xiàng)檢測，以評價(jià)本發(fā)明的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的熱穩(wěn)定性。
將本發(fā)明的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗于2-8℃的溫度下避光保存，其間分別于9、12、15、21、24個月時(shí)取樣進(jìn)行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力、殘余水分含量檢測。其中使用重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗作為參比疫苗。結(jié)果如下列表11和12所示。
表11 甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗2-8℃保存不同時(shí)間后的病毒滴度和乙肝相對效力測定疫苗 甲肝病毒滴度(LogCCID50/ml)(月) 乙肝相對效力(月)批號0 9 12 15 18 21 24 0 9 12 15 18 24980401 6.50 6.50 6.67 6.50 6.67 6.50 6.00 2.79 2.73 2.81 2.64 2.57 2.54980402 6.67 6.50 6.67 6.50 6.50 6.67 6.33 2.58 2.49 2.51 2.41 2.34 2.32980403 6.67 6.67 6.50 6.50 6.67 6.67 6.50 2.88 2.86 2.81 2.77 2.79 2.78980501 6.67 6.67 6.67 6.67 6.50 6.50 6.33 3.06 3.08 2.98 2.87 2.81 2.82980502 7.00 7.00 7.00 7.00 6.67 6.67 6.50 2.45 2.47 2.36 2.41 2.31 2.39表12 甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗2-8℃保存不同時(shí)間的殘余水份含量測定殘余水份含量(％)(月)疫苗批號0 9 12 15 18 21 24980401 2.232.302.292.372.412.442.90980402 2.152.252.272.312.392.402.43980403 2.302.302.292.332.322.892.39980501 2.282.312.302.342.312.792.95980502 2.262.282.282.312.292.42將本發(fā)明的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗于室溫下避光保存6個月，分別于0、2、3、4、5和6月取樣進(jìn)行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力和殘余水分含量檢測。其中使用重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗作為參比疫苗。結(jié)果如下列表13和15中所示。
表13 甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗室溫保存的甲肝病毒滴度和乙肝相對效力測定疫苗 甲肝病毒滴度(LogCCID50/ml)(月) 乙肝相對效力(月)批號 0 2 3 4 5 6 0 2 3 4 5 69804016.506.676.506.506.506.332.792.682.712.692.612.599804026.676.506.676.506.506.002.582.602.542.502.412.389804036.676.676.676.506.506.002.882.842.712.752.872.709805016.676.676.676.506.506.333.063.083.102.982.892.789805027.007.007.007.006.676.502.452.472.392.332.212.19將本發(fā)明的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗置于37℃保存，于第0、1、2、3、4和5周取樣進(jìn)行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力及殘余水分含量檢測。其中使用重組CHO細(xì)胞表達(dá)的乙肝疫苗作為參比疫苗。結(jié)果如下列表14和15中所示。
表14 甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗37℃保存的甲肝病毒滴度和乙肝相對效力測定疫苗 甲肝病毒滴度(LogCCID50/ml)(周) 乙肝效力(ED50)(周)批號 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 59804016.50 6.50 6.33 6.50 6.00 6.00 2.79 2.76 2.71 2.60 2.68 2.599804026.67 6.50 6.50 6.67 6.00 6.00 2.58 2.51 2.53 2.47 2.41 2.349804036.67 6.67 6.50 6.50 6.33 5.67 2.88 2.84 2.77 2.69 2.58 2.509805016.67 6.67 6.33 6.67 6.33 6.00 3.06 3.02 3.06 2.98 2.95 2.899805027.00 7.00 6.50 6.67 6.50 6.00 2.45 2.48 2.41 2.39 2.30 2.21表15 甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗于室溫和37℃保存不同時(shí)間后的殘余水份含量測定疫苗 初測 室溫殘余水份(％)(月) 37℃殘余水份(％)(周)批號 水份(％) 24 5 6 1 2 3 4980401 2.23 2.25 2.302.342.892.242.262.302.37980402 2.15 2.19 2.412.503.102.202.272.292.36980403 2.30 2.29 2.342.412.782.302.312.352.39980501 2.28 2.30 2.312.392.402.332.332.402.41980502 2.26 2.27 2.292.382.392.292.302.382.40
由以上表6-15所示的數(shù)據(jù)可以看出，與甲肝或乙肝單價(jià)疫苗相比，本發(fā)明的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗在室溫、2℃-8℃、37℃條件下保存不同時(shí)間后，其甲肝疫苗病毒滴度和乙肝疫苗相對效力均沒有明顯下降，甚至其乙肝疫苗效力高于乙肝單價(jià)疫苗。另外。本發(fā)明的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗在不同的溫度下儲存不同時(shí)間后，其殘余水分含量雖有所升高，但并不影響本發(fā)明的凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的總體質(zhì)量要求。
權(quán)利要求
1.一種甲型和乙型肝炎聯(lián)合疫苗，包括活的減毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。
2.一種凍干甲型和乙型肝炎聯(lián)合疫苗，包括活的減毒甲型肝炎疫苗病毒，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白和保護(hù)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，其中還含有適量免疫佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，其中所說的活的減毒甲型肝炎疫苗病毒是甲型肝炎減毒活疫苗L-A-1疫苗株或其它減毒活疫苗株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，其中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)蛋白系由重組CHO細(xì)胞和/或重組酵母表達(dá)并經(jīng)純化后獲得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，特征在于所說的活的減毒甲型肝炎疫苗病毒滴度不低于6.5LogCCID50/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，特征在于所說的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白的含量不低于10μg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，其中保護(hù)劑包含海藻糖、谷氨酸、抗壞血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，其中保護(hù)劑的成分及它們在聯(lián)合疫苗組合物懸液中的濃度(W/V)是海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗壞血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％和右旋糖酐1-6％。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗，其中佐劑是由作為凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗之稀釋液的含有0.8-1.2mg/ml氫氧化鋁溶液提供的。
11.一種制備凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的方法，該方法包括(1)分別提供并按適當(dāng)?shù)谋壤旌蠝p毒的甲型肝炎疫苗病毒原液和由重組CHO細(xì)胞或重組酵母表達(dá)并經(jīng)純化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白原液，得到甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎病毒表面抗原的混合液。(2)在步驟(1)中得到的混合液中加入適量的保護(hù)劑并混勻之，得到所需的甲型肝炎和乙型肝炎聯(lián)合疫苗組合物懸液。(3)冷凍干燥步驟(2)中得到的含有保護(hù)劑的聯(lián)合疫苗懸液，得到凍干甲-乙型肝炎聯(lián)合疫苗。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中步驟(3)所說的冷凍干燥步驟包括首先將所說的聯(lián)合疫苗組合物于大約-30至-55℃低溫條件下，預(yù)冷凍3-7小時(shí)，然后逐漸升溫至35℃，真空干燥8至16小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及甲型和乙型肝炎聯(lián)合疫苗以及其冷凍干燥制劑，特別是涉及含有活的適當(dāng)減毒的甲型肝炎疫苗病毒和由重組CHO細(xì)胞和/或重組酵母表達(dá)并經(jīng)純化的乙型肝炎表面抗原的甲－乙型肝炎聯(lián)合疫苗，以及其冷凍干燥制劑。在冷凍干燥制劑中，采用的保護(hù)劑含有海藻糖、谷氨酸、抗壞血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐。本發(fā)明的甲型和乙型肝炎聯(lián)合疫苗，可同時(shí)預(yù)防甲型肝炎和乙型肝炎。
文檔編號A61K39/29GK1513555SQ03149950
公開日2004年7月21日 申請日期2003年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月31日
發(fā)明者王鵬富, 劉景曄, 官桂范, 謝寶生, 羅璇, 劉令九, 陳萬革 申請人:長春生物制品研究所