專利名稱：乙型肝炎治療疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎治療疫苗。具體而言，本發(fā)明涉及一種乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體偶聯(lián)的治療疫苗。更具體而言，本發(fā)明涉及一種含有乙型肝炎表面抗原與破傷風類毒素經(jīng)化學偶聯(lián)而成的結(jié)合物，再經(jīng)適宜配制成為治療疫苗。本發(fā)明還涉及這種治療疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是嚴重影響人類健康的傳染性疾病之一，全世界約有3.5億人為慢性攜帶者(Lee，W.M.等人，N Engl J Med，3371733-45，1997)。我國是乙型肝炎高發(fā)流行區(qū)，約有1億人口攜帶乙肝表面抗原，慢性乙肝病人約2000～3000萬。慢性乙肝是引起肝硬化、肝癌的最主要原因(Wright，T.L.等人，Lancet，3421340-4，1993)。目前為止，尚無有效的治療藥物和治療手段，乙型肝炎成為重大的社會衛(wèi)生問題。
抗病毒治療是清除乙肝病毒，減少并發(fā)癥，防止肝纖維化的措施之一。目前抗病毒藥物療效明確的有干擾素和拉米夫啶，其他藥物如胸腺素、白介素-12、泛昔洛韋等也有一定的抗病毒作用。干擾素既能抑制病毒復制，又能調(diào)節(jié)宿主免疫功能。但干擾素的持續(xù)有效率僅為20％，且治療費用昂貴，難以推廣應(yīng)用，尤其對ALT正常的病人效果較差(Hoonfnagle，J.H.等人，N Engl J Med，336347-356，1997)。拉米夫啶口服吸收好，在肝細胞內(nèi)磷酸化為三磷酸拉米夫啶，通過抑制HBV-DNA逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA多聚酶的活性而起到抗病毒作用，但拉米夫啶停藥后復燃及長期用藥后耐藥株的出現(xiàn)是急待解決的問題(Dienstag，J.L.等人，N Engl J Med，3331657-1661，1995)。
乙型肝炎慢性化機制十分復雜，其中免疫耐受是形成慢性化的機制之一。乙型肝炎慢性化為HBV抗原和感染宿主相互作用的結(jié)果，特異性免疫治療是打破免疫耐受的方法之一。治療性乙肝疫苗可通過改變抗原提呈和加工途徑，激活耐受機體的免疫應(yīng)答，從而打破免疫耐受，改變慢性乙肝的臨床過程。研究表明乙肝疫苗或乙肝疫苗合用免疫調(diào)節(jié)劑可打破轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫耐受，具有較好的治療前景(Mancini.M.等人，J Med Virol，3967-74，1993)。
目前，葛蘭素史克公司和美國Cytel等公司均已有治療性疫苗進入臨床考核階段。近年來，國內(nèi)治療性乙肝疫苗發(fā)展迅速，乙肝表面抗原和乙肝免疫球蛋白復合物制劑，已經(jīng)I期臨床證明安全性好，正在進行II期臨床考核；多肽表位疫苗已批準進入I期臨床，此外作為免疫調(diào)節(jié)劑使用的60μg劑乙肝疫苗也進入審評階段。
乙肝抗原作為治療性乙肝疫苗的主要成分，在臨床應(yīng)用具有良好的前景具實用性，多年來已積累了豐富的臨床經(jīng)驗，證明安全性好，價格低廉，治療方案較易接受，但療效仍無定論，可能與選擇疫苗的種類、劑量、佐劑成分以及治療對象的選擇等因素有關(guān)。研究方向應(yīng)從疫苗劑量的增加、免疫調(diào)節(jié)劑的配合，給藥途徑，或與干擾素抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用，特別是新型疫苗佐劑等方面深入研究。
乙肝缺乏動物模型，藥效學評價困難。單用乙肝疫苗不易打破免疫耐受，必須輔助以能增加乙肝疫苗的細胞免疫反應(yīng)免疫增強劑，而如何選擇和使用免疫增強劑是治療性乙肝疫苗研究的難點。近期研究表明，早期誘導特異性的TH1類細胞反應(yīng)是治療乙肝的關(guān)鍵，因此研究的重點應(yīng)為尋找能增加特異性細胞免疫反應(yīng)的免疫增強劑或類似物(佐劑)。
免疫實踐證明，細菌莢膜多糖屬于T細胞非依賴性抗原，其免疫效果與接種對象的年齡明顯相關(guān)，嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，接種多糖疫苗后不能有效激活T輔助細胞和T記憶細胞，不能誘導產(chǎn)生免疫回憶反應(yīng)，因而，免疫保護時間短暫，再次免疫接種也不能產(chǎn)生加強免疫效應(yīng)。例如，腦膜炎球菌多糖抗原雖能誘導產(chǎn)生IgM和IgG抗體，但人類所產(chǎn)生的IgG主要是IgG2亞類，而人血清IgG2亞類抗體出現(xiàn)較遲，一般要到8～12歲才能上升至成人水平。這可能與分泌IgG2亞類抗體的B淋巴細胞發(fā)育遲緩有關(guān)。故此，嬰幼兒接種多糖疫苗后，產(chǎn)生只有短暫作用的IgM抗體為主。為提高多糖疫苗的免疫效果，主要辦法是將多糖抗原與蛋白載體結(jié)合，使多糖抗原由T細胞非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細胞依賴性抗原。研究表明，多糖與蛋白載體結(jié)合后，T細胞能識別載體，刺激B細胞對多糖產(chǎn)生應(yīng)答，并能誘導T細胞介導的免疫回憶反應(yīng)使更多的B細胞產(chǎn)生特異性抗體。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細菌多糖和一蛋白載體偶聯(lián)后的效果在Hib(b型流感嗜血桿菌)結(jié)合疫苗和C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗中得到了驗證。多糖和蛋白載體偶聯(lián)后，T細胞能識別載體，刺激B細胞對多糖產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并能誘導T細胞免疫記憶反應(yīng)。上述結(jié)合疫苗均能產(chǎn)生足夠.高水平的抗莢膜IgG抗體和有免疫記憶的B細胞。目前已有4種蛋白載體用于結(jié)合疫苗，破傷風類毒素、突變無毒白喉毒素(CRM197)、白喉類毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白。
破傷風梭菌在適宜培養(yǎng)基上生長繁殖的過程中所產(chǎn)生的破傷風毒素是一種由1,315個氨基酸所組成的、分子量為150,700的單純蛋白質(zhì)。破傷風毒素是一種外毒素，最初是在菌體內(nèi)形成單一多肽鏈，當從菌體釋放出后便形成具有輕鏈和重鏈的以雙硫鍵相連的多肽鏈。破傷風毒素經(jīng)甲醛脫毒處理后轉(zhuǎn)變成類毒素，依然保留良好的破傷風抗原的免疫原性，而其毒力降低并不引起相應(yīng)癥狀(Gapta，R.K.et al，J.of Biol.Stand.，1985，13355～359)。
鑒于上述原因，本發(fā)明采用蛋白載體和乙肝表面抗原經(jīng)化學共價偶聯(lián)。該蛋白載體作為免疫增強劑誘導機體產(chǎn)生對乙肝表面抗原的細胞免疫反應(yīng)，從而達到打破乙肝病人的免疫耐受，改變慢性乙肝的臨床過程的目的。
目前最常用的人用疫苗佐劑仍為氫氧化鋁和磷酸鋁。而APC佐劑、T細胞佐劑，可選擇性誘導T細胞免疫，有效控制和殺傷細胞內(nèi)病原體和腫瘤細胞，故為研究的重點。近年來，TH1極化佐劑的研究已成為研究熱點。一些佐劑配方包括微生物來源的FCA、MDP、MPL、細胞因子如IL-12、r-IFN、脂質(zhì)體等均可刺激小鼠產(chǎn)生TH1應(yīng)答，可望成為用于免疫治療的新型疫苗佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。
鑒于上述原因，本發(fā)明將乙肝表面抗原與破傷風類毒素為代表的蛋白載體經(jīng)化學偶聯(lián)行成的結(jié)合物，以綠膿桿菌制劑作為佐劑，再經(jīng)適宜配制成為乙型肝炎治療疫苗。該治療疫苗用于臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預防乙型肝炎病毒感染。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種新的疫苗，特別是，本發(fā)明提供了一種乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體化學共價偶聯(lián)而成的乙型肝炎治療疫苗。優(yōu)選的是，含有以破傷風類毒素為載體的并與乙型肝炎表面抗原經(jīng)化學偶聯(lián)形成的共價結(jié)合物為主要成份的乙型肝炎治療疫苗，用以臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預防乙型肝炎病毒感染。
本發(fā)明還提供了一種制備乙型肝炎治療疫苗的方法，該方法包括(A)將2.5～90微克乙型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白載體偶聯(lián)地一偶聯(lián)物；(B)將乙型肝炎表面抗原和蛋白載體的偶聯(lián)物經(jīng)配制而成一種乙型肝炎治療疫苗。
其中所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。優(yōu)選的是，所述的蛋白載體是破傷風類毒素。本發(fā)明的疫苗可以用鋁佐劑和/或緩沖生理鹽水配制。
在本發(fā)明，乙型肝炎表面抗原可以與作載體的破傷風類毒素經(jīng)化學偶聯(lián)形成共價結(jié)合物，再將此共價結(jié)合物配制成一種新的乙型肝炎治療疫苗的方法。
本發(fā)明所用乙型肝炎表面抗原為商品化的基因工程乙肝抗原，其來源包括酵母細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等表達系統(tǒng)。乙型肝炎表面抗原的制備方法見《中國生物制品制品規(guī)程》(化學工業(yè)出版社，2000年，175～183頁)。
本發(fā)明所用破傷風類毒素是指商品化破傷風類毒素，如精制破傷風類毒素。破傷風類毒素的制備方法見《中國生物制品制品規(guī)程》(化學工業(yè)出版社，2000年，213～218頁)本發(fā)明的一個實施方案中，作為載體的蛋白可以是破傷風類毒素、突變無毒白喉毒素(CRM197)、白喉類毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白中的任何一個。這里給出的破傷風類毒素僅僅是為了例示性說明本發(fā)明，如果滿足需要也可采用其它蛋白載體。
本發(fā)明采用溴化氰(CNBr)活化乙型肝炎表面抗原，以虎鉑酰亞胺(SPDP)為雙功能親核間隔基，是之形成乙型肝炎表面抗原虎鉑酰亞胺衍生物。進一步通過碳二亞胺(EDAC)介導的縮合作用與破傷風類毒素共價結(jié)合，獲得乙型肝炎表面抗原-破傷風類毒素偶聯(lián)結(jié)合物。再經(jīng)超濾濃縮，柱層析純化獲得的高分子偶聯(lián)結(jié)合物，經(jīng)除菌過濾、配制、稀釋分裝成為治療疫苗。
如上所述，在乙型肝炎表面抗原和破傷風類毒素形成偶聯(lián)物的過程中，可以由單個乙型肝炎表面抗原經(jīng)活化后可能有多個位點同時結(jié)合多個破傷風類毒素。同樣也可以由活化后的單個破傷風類毒素的多個位點同時結(jié)合多個乙型肝炎表面抗原。乙型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的結(jié)合并不限定于1∶1，也就是一個乙型肝炎表面抗原分子上可以偶聯(lián)上1個或者多個破傷風類毒素分子；同樣地，一個破傷風類毒素分子上可以偶聯(lián)上1個或者多個乙型肝炎表面抗原分子。在乙型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的偶聯(lián)中，優(yōu)選發(fā)生乙型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的一一對應(yīng)的結(jié)合。但是如上所述，乙型肝炎表面抗原和破傷風類毒素的各種結(jié)合只要并不影響本發(fā)明的治療疫苗所能達到的效果，那么所有這些偶聯(lián)中的細節(jié)變化均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所述的乙型肝炎表面抗原與破傷風類毒素的偶聯(lián)方法僅僅是用于說明，所以，可以采用各種等同的方法實現(xiàn)本發(fā)明所述的偶聯(lián)過程，因此任何用于蛋白分子偶聯(lián)的方法和工藝或者過程都有可能用于實施本發(fā)明。
在本發(fā)明的治療疫苗中，乙型肝炎表面抗原每劑免疫劑量為2.5～90微克之間，蛋白載體，例如破傷風類毒素，含量在5～60微克之間，至于用量的上限，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)治療疫苗臨床使用的常規(guī)實踐靈活掌握。
本發(fā)明的治療疫苗中可以進一步添加綠膿桿菌制劑作為佐劑，增強治療疫苗的免疫應(yīng)答水平。
在本發(fā)明的治療疫苗中可以進一步添加吸附佐劑，例如氫氧化鋁和/或磷酸鋁等鋁佐劑。使用時，可以對本發(fā)明的治療疫苗進行稀釋，合適的稀釋液的不限定的實例有緩沖生理鹽水稀釋液。
總之，目前還沒有一種新的利用乙型肝炎表面抗原與一種蛋白載體經(jīng)化學偶聯(lián)而成的治療疫苗。本發(fā)明通過將乙型肝炎表面抗原和蛋白載體進行化學偶聯(lián)，以綠膿桿菌制劑作為佐劑，得到新型的乙型肝炎治療疫苗。該治療疫苗可特異性的誘導細胞免疫和體液免疫，用于臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預防乙型肝炎病毒感染。
本發(fā)明的另一重點是，采用綠膿桿菌制劑為佐劑，優(yōu)選的是以綠膿桿菌MSHA菌毛株制劑。本發(fā)明首次將綠膿桿菌MSHA菌毛株制劑(PA)作為佐劑加入乙型肝炎治療疫苗中。用MSHA菌毛株制備的綠膿桿菌制劑已作為治療腫瘤的藥物上市，該制品能調(diào)整人體體液免疫和細胞免疫的不平衡狀態(tài)，增加巨噬細胞和NK細胞的活性，維持T細胞的數(shù)量與比例，調(diào)節(jié)白細胞介素-2、干擾素與抗體的協(xié)同作用(中國生物制品規(guī)程，化學工業(yè)出版社，2000年，265頁)。
本發(fā)明治療性乙肝疫苗具有較高的安全性，理由如下1.乙肝表面抗原乙肝表面抗原作為預防性疫苗的主要成分已在世界范圍內(nèi)經(jīng)數(shù)億人次、近20年的大量應(yīng)用，應(yīng)用效果充分證明了其安全性。
2.破傷風類毒素破傷風類毒素已作為常規(guī)疫苗在全世界范圍內(nèi)使用，其良好的安全和保護效果早已公知。
3.綠膿桿菌制劑作為佐劑應(yīng)用的安全性綠膿桿菌制劑是中國食品藥品監(jiān)督管理局批準的治療腫瘤的上市品種，其制造檢定規(guī)程已列入《中國生物制品制品規(guī)程》(2000年版)。綠膿桿菌制劑臨床應(yīng)用的安全性已被證實。
4.乙肝表面抗原與破傷風毒素偶聯(lián)后的安全性在整個偶聯(lián)過程中采用了透析、超濾、柱層析等綜合措施，有效地去除了化學試劑的殘余物和小分子量物質(zhì)，保證了制品的安全性。
5.乙肝治療疫苗的安全驗證經(jīng)異常毒性實驗證實乙肝治療疫苗在動物體內(nèi)有良好的安全性。


圖1乙肝抗原與TT偶聯(lián)后免疫小鼠體液免疫反應(yīng)，其中ED50單位為稀釋度，HbsAg+TT乙肝抗原與TT偶聯(lián)，HbsAg+AL-TT乙肝疫苗(含鋁佐劑)與TT混合，HbsAg+Al乙肝疫苗(含鋁佐劑)，HbsAg-TT乙肝抗原與TT混合。
圖2乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與與PA混合組誘導體液免疫反應(yīng)，其中，HBsAg+TT乙肝抗原與TT偶聯(lián)，HBsAg+TT+PA乙肝抗原與TT偶聯(lián)混合PA，HBsAg+Al乙肝疫苗(含鋁佐劑)。
圖3乙型肝炎治療疫苗誘導抗體的IGg2a/IGg1比值，其中G1乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組；G2乙肝疫苗組；G3乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組。
圖4治療性乙肝疫苗免疫小鼠脾細胞ELISPOT檢測γ-IFN結(jié)果。
圖5治療性乙肝疫苗免疫小鼠脾細胞ELISPOT檢測IL-2結(jié)果。
圖6治療性乙肝疫苗不同劑量HBsAg免疫小鼠脾細胞ELISPOT檢測γ-IFN結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例描述本發(fā)明以破傷風類毒素為蛋白載體與乙型肝炎表面抗原通過化學偶聯(lián)形成共價結(jié)合物，經(jīng)配制成治療疫苗，并經(jīng)動物試驗證明該治療疫苗具有可靠的安全性和顯著的免疫原性。
實施例1乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和精制破傷風類毒素(TT)共價偶聯(lián)物的制備取濃度為1～2mg/ml的HBsAg，加0.5～1.0mg/ml溴化氰(CNBr)活化，在23±3℃下作用0.5～1小時，維持PH8.2～10。加N-琥鉑酰亞胺-3-(2-硫代吡啶)丙酸(SPDP)2.5～4mg/ml活化物，維持PH8.2～10.0，作用10～30分鐘。于2～8℃攪拌10～20小時，透析去除小分子物質(zhì)。加濃度為2～4mg/ml的等體積TT混合均勻，加入碳二亞胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5～15℃作用0.5～1小時，調(diào)PH5～7。偶聯(lián)原液經(jīng)300KD透析膜在0.2M NaCl溶液透析12～15小時。收集透析后結(jié)合物，經(jīng)Sephacryl S 400柱層析，用0.15～0.2M NaCl洗脫，收集V0峰附近高分子量結(jié)合物。除菌過濾后無菌保存于2～8℃。
圖1、乙型肝炎表面抗原與破傷風類毒素經(jīng)化學偶聯(lián)而成的共價結(jié)合物柱層析圖。圖中的上層峰乙型肝炎表面抗原鋒，與破傷風類毒素結(jié)合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物為主；下層峰破傷風類毒素峰，與乙型肝炎表面抗原結(jié)合后，分子量隨之增大，以V0附近高分子量化合物為主。
實施例2 乙型肝炎治療疫苗配制和稀釋分裝(無佐劑)根據(jù)乙型肝炎表面抗原和破傷風類毒素偶聯(lián)物中乙型肝炎表面抗原含量測定結(jié)果，用緩沖生理鹽水無菌稀釋分裝，使每劑治療疫苗為；≥0.5ml分裝量、含有乙型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破傷風類毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克。
實施例3乙型肝炎治療疫苗配制和稀釋分裝(含佐劑)根據(jù)乙型肝炎表面抗原和破傷風類毒素偶聯(lián)物中乙型肝炎表面抗原含量測定結(jié)果，用氫氧化鋁稀釋液無菌稀釋分裝，使每劑治療疫苗為；≥0.5ml分裝量、含有乙型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破傷風類毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克、氫氧化鋁0.35～0.70毫克。
實施例4乙型肝炎治療疫苗安全性研究對乙型肝炎治療疫苗的安全性進行考核，分別采用小鼠、豚鼠異常毒性試驗法，考核其安全性。
選用豚鼠、腹腔接種5ml乙型肝炎治療疫苗，分別于免前、免后7天稱體重，并每日觀察接種反應(yīng)。
選用SPF級Balb/C小鼠，腹腔接種0.5ml乙型肝炎治療疫苗，分別于免前、免后7天稱體重，并每日觀察接種反應(yīng)。
實驗結(jié)果列于表1、表2。
表1.乙型肝炎治療疫苗豚鼠安全性試驗


表2.乙型肝炎治療疫苗小鼠安全性試驗

異常毒性試驗表明乙型肝炎治療疫苗具有可靠的安全性。
實施例5乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT誘導動物體液免疫的研究—ED50測定將乙肝表面抗原與破傷風類毒素偶聯(lián)物，乙肝表面抗原與破傷風類毒素(TT)混合物，乙肝疫苗與破傷風類毒素混合物和乙肝疫苗分別稀釋4、16、64、256倍后，腹腔注射BALB/c小鼠，原倍抗原為含10μg HbsAg，每組10只小鼠。免疫后4周時，采集血清，應(yīng)用RIA試劑檢測乙肝表面抗體。應(yīng)用Reed-Munch法計算ED50。由圖1可見乙肝疫苗-TT偶聯(lián)組抗體效力最高(6.68)，顯著高于乙肝疫苗與TT混合組(2.59)，乙肝疫苗與TT混合組(0)和乙肝疫苗組(4)(P＜0.01)。其次為乙肝疫苗與TT混合組和乙肝疫苗組，而乙肝表面抗原與TT混合組免疫小鼠后檢測不到抗體反應(yīng)。
實施例6乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與綠膿桿菌制劑(PA)混合誘導體液免疫的研究將乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合后，稀釋4、16、64、256倍后腹腔注射BALB/c小鼠。每組10只，對照組為表面抗原混合PA組，氫氧化鋁佐劑疫苗組。免疫、采集血清、檢測乙肝表面抗體和ED50統(tǒng)計方法同前。
由圖2可見乙肝疫苗-TT偶聯(lián)組和乙肝疫苗-TT偶聯(lián)混合PA組抗體效力顯著高于乙肝疫苗組(19.0；28.9；5.0，P＜0.01)；而乙肝疫苗-TT偶聯(lián)混合PA組誘導抗體反應(yīng)又明顯高于乙肝疫苗-TT偶聯(lián)組，提示混合PA可進一步增高乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT的抗體反應(yīng)。
實施例7乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組誘導體液免疫抗體亞型的研究將乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組及乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組，稀釋4、16、64、256倍后腹腔注射BALB/c小鼠。每組10只，對照組為氫氧化鋁佐劑疫苗組。免疫、采集血清等方法同前，應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法分別檢測抗-HBs IgG、IGg2a和IGg1。結(jié)果見圖3。
由圖3可見乙肝治療性疫苗組免疫小鼠誘導IGg2a/IGg1比例(1.1412)顯著高于乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組(0.421)和乙肝疫苗組(0.235)(P＜0.01)，表明乙肝治療性疫苗可誘導高水平IGg2a，即可誘導較強的TH1細胞反應(yīng)。
實施例8乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)破傷風類毒素(TT)與PA混合組誘導特異性細胞因子的研究將乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合后，背部皮下免疫小鼠，其中HBsAg的含量均為3μg/只，分別按實驗組和對照組每組10只小鼠，共5組。分別于第5日、10日、15日放血處死。按常規(guī)制備脾懸液并經(jīng)淋巴細胞分離液分離出單個核細胞(MNC)，用完全培養(yǎng)基(含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)調(diào)整細胞濃度至2×106ml-1，，于24孔培養(yǎng)板上每孔加入1000μl該懸液，200μl HBsAg多肽，HBsAg的終濃度為50μg·ml-1，培養(yǎng)板置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)5天，收集上清。分別用ELISPOT試劑盒檢測細胞因子γ-IFN和IL-2。
由圖4，5、6可見，在小鼠免后5、10和20天時，誘導CTL效應(yīng)細胞因子γ-IFN或IL-2產(chǎn)生的能力均以乙肝治療性疫苗與PA混合組最高，其次為乙肝治療性疫苗組，均顯著高于疫苗對照組。
應(yīng)用含1、3和6μg HBsAg的乙肝治療性疫苗與PA混合組、乙肝治療性疫苗組、疫苗對照組分別免疫小鼠，在免后10天時處死，應(yīng)用ELISPOT試劑盒檢測γ-IFN。結(jié)果表明隨免疫HBsAg含量增加，乙肝治療性疫苗組和乙肝治療性疫苗與PA混合組誘導γ-IFN細胞數(shù)明顯升高，3和6μg HBsAg的乙肝治療性疫苗組及與PA混合組顯著高于1μg組(P＜0.05)；而6μg乙肝治療性疫苗組及與PA混合組與3μg組間無顯著差異(P＞0.05)。
實施例9HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠打破免疫耐受的研究分別應(yīng)用乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組、乙肝治療性疫苗組、乙肝疫苗對照組，免疫HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠，其中HbsAg含量均為3ug，免疫3次后1周時處死，檢測HBsAg、抗-HBs。
表3治療性乙肝疫苗免疫轉(zhuǎn)基因小鼠后打破免疫耐受的研究

參見表3，結(jié)果表明，乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT組和乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組均能顯著增強打破轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫耐受，而對照乙肝疫苗組10只小鼠免疫3次后，仍有9只HBsAg陽性，提示乙肝治療性疫苗的治療前景。
綜上從誘導體液免疫，抗體亞型；特異性CTL效應(yīng)細胞因子測定、轉(zhuǎn)基因小鼠打破免疫耐受的研究等方面證明了乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT(HBsAg+TT)的治療作用；同時研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎表面抗原偶聯(lián)TT與PA混合組(HBsAg+TT+PA)組免疫效果更優(yōu)。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎治療疫苗，由乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體化學共價偶聯(lián)而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的乙型肝炎表面抗原為基因工程乙型肝炎表面抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的基因工程乙型肝炎表面抗原來源包括酵母細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達系統(tǒng)制備的乙型肝炎表面抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述化學偶聯(lián)由單個乙型肝炎表面抗原經(jīng)活化后的多個位點同時結(jié)合多個破傷風類毒素實現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的化學偶聯(lián)由單個破傷風類毒素經(jīng)活化后的多個位點同時結(jié)合多個乙型肝炎表面抗原實現(xiàn)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的乙型肝炎表面抗原的含量在每毫升2.5～90微克之間，蛋白載體含量在5～60微克之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，可以用鋁佐劑和/或緩沖生理鹽水配制。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，以綠膿桿菌制劑為佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，所述的綠膿桿菌制劑為綠膿桿菌MSHA菌毛株制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乙型肝炎治療疫苗，其特征在于，其制劑包括脂質(zhì)體、毫微顆粒(納米級顆粒)以及它們的凍干粉形式的制劑。
12.一種制備乙型肝炎治療疫苗的方法，該方法包括(A)將2.5～90微克乙型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白載體偶聯(lián)地一偶聯(lián)物；(B)將乙型肝炎表面抗原和蛋白載體的偶聯(lián)物經(jīng)配制而成一種乙型肝炎治療疫苗。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的乙型肝炎治療疫苗的方法，其特征在于，所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株CRM197毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白群組的任何一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的乙型肝炎治療疫苗的方法，其特征在于，所述的蛋白載體是選自破傷風類毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎治療疫苗及其制備方法，包括將乙型肝炎表面抗原和一蛋白載體進行偶聯(lián)形成結(jié)合物，該結(jié)合物中的乙型肝炎表面抗原與蛋白載體發(fā)生化學共價偶聯(lián)。本發(fā)明可以采用綠膿桿菌制劑為佐劑。本發(fā)明中乙型肝炎面抗原和蛋白載體偶聯(lián)后形成的結(jié)合物可誘導機體產(chǎn)生針對乙型肝炎表面抗原較高且特異的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，由此結(jié)合物制備的新型偶聯(lián)治療疫苗可用于臨床上治療乙型肝炎患者和健康人預防乙型肝炎病毒感染。
文檔編號A61K47/42GK1618466SQ200310113770
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者薛平, 張國銘 申請人:薛平, 張國銘