專利名稱：一種用于放化療減毒增效的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于放化療減毒增效的藥物及其制備方法，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是我國(guó)常見(jiàn)病和多發(fā)病。目前所有的抗腫瘤藥物幾乎都屬于細(xì)胞毒的范疇，抗癌藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織也損傷嚴(yán)重，這種無(wú)法回避的毒副作用，限制了抗癌藥物的應(yīng)用和療效的發(fā)揮。日前市場(chǎng)上常見(jiàn)用于放化療減毒增效的藥有核糖核酸、中成藥有貞芪扶正顆粒、云芝多糖膠囊、精黃芝口服液(陜衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993第001612號(hào)))等。這類中成藥有的制劑工藝簡(jiǎn)單，有效成分不明確，有的作用靶點(diǎn)分散，從而影響療效等。有資料表明，用于腫瘤的放療、化療中的升白效果明顯、毒性小、且能增加血小板的藥物很少，維血寧顆粒是同類藥物中唯一的國(guó)家中藥保護(hù)品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是，如何依據(jù)中醫(yī)藥理論，研制在放化療時(shí)使用具有減毒增效作用的藥物組合物，同時(shí)通過(guò)優(yōu)化制劑工藝、富集有效部位群，制備成療效穩(wěn)定、質(zhì)量可控的中藥制劑。
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。
一種有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物組合物，其特征在于它基本上由下列重量份的原料藥制成黃芪、枸杞、靈芝為1-40份∶1-15份∶1-15份。其中原料藥的較好的用量為黃芪、枸杞、靈芝重量比為1-30份∶1-12份∶1-12份。其中原料藥更為理想的用量為黃芪、枸杞、靈芝重量比為30份∶12份∶12份。其中黃芪甘溫，大補(bǔ)元?dú)猓瑸榫?。枸杞子甘平，滋補(bǔ)肝腎，靈芝甘平，補(bǔ)虛益肺，二藥共為臣。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎之功。
上述藥物組合物的制備方法，包括下列步驟a)取原料藥黃芪、枸杞與靈芝，備用；b)將所述重量配比的黃芪，用70～90％乙醇提取1～4次，每次1～2.5小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上大孔樹(shù)脂柱，用55～84％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙；c)將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?0～14倍量水，冷浸或煎煮提取2～4次，每次1～2小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至相對(duì)密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量達(dá)70-85％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至相對(duì)密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量達(dá)70-80％，濾取沉淀物，干燥得總多糖；d)將黃芪總皂甙與總多糖混合，得本發(fā)明藥物的活性組分。該活性組分可與藥學(xué)制劑上常規(guī)輔料混合，也可不加常規(guī)輔料，制成常規(guī)藥物制劑。
本發(fā)明藥物組合物較好的制備方法是b)將所述重量配比的黃芪，用75～85％乙醇提取2～3次，每次1.5～2.0小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上AB-8和/或D101型號(hào)大孔樹(shù)脂柱，用60～80％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙；c)將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?1～13倍量水，煎煮3次，每次1.5小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量達(dá)75-80％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量達(dá)75-80％，濾取沉淀物，干燥得總多糖；d)將黃芪總皂甙與總多糖混合，加入藥用輔料，常規(guī)制成口服制劑。
所述制備方法的較理想的技術(shù)特征在于b)將所述重量配比的黃芪，用80～82％乙醇提取3次，每次1.5小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上AB-8或D101型號(hào)大孔樹(shù)脂柱，用65～70％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙；c)將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜ⅲ尤?2倍量水煎煮，煎煮液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)75％，濾取沉淀物，干燥得總多糖；d)將黃芪總皂甙、總多糖與藥學(xué)上常規(guī)輔料混合，制成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑或口服液。
上述制備方法中，其特征在于c)取水煎煮液，濃縮，醇沉，過(guò)濾得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，過(guò)濾，用膜按常規(guī)操作進(jìn)行超濾，先用30萬(wàn)截留分子量膜超濾去除大分子雜質(zhì)，然后再用1000截留分子量膜超濾去除水分及部分小分子雜質(zhì)，濃縮至相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)75％，濾取沉淀，得總多糖。
常用口服制劑輔料可選用，崩解劑如羥丙基淀粉、羥丙纖維素、羧甲基淀粉鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；填充劑如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纖維素、糊精、淀粉、磷酸鈣、磷酸氫鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、環(huán)糊精、微粉纖維素等；潤(rùn)濕劑和粘合劑如乙醇、預(yù)膠化淀粉、聚維酮、羧甲基纖維素鈉、羥丙甲纖維素；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、微粉硅膠、氫化植物油、聚乙二醇4000和6000；潤(rùn)濕劑如十二烷基硫酸鈉、吐溫80。
本發(fā)明藥物組合物，在制備提高免疫藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明藥物組合物，在制備用于放化療減毒增效的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明藥物組合物，在制備與放化療合用的提高免疫、減毒增效藥物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明藥物組合物的原料藥組方形成后，對(duì)有效部位的篩選是制備療效準(zhǔn)確、組分明確、質(zhì)量可控的中藥現(xiàn)代制劑的基礎(chǔ)。
本發(fā)明藥物組合物中的枸杞多糖和黃芪多糖都能于體外增強(qiáng)LAK活性。小鼠腹腔注射枸杞多糖5g/L(7d)可以顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能，并能部分對(duì)抗環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠NK細(xì)胞的抑制作用。靈芝的多糖類、三萜類、氨基酸多肽類、腺苷等化學(xué)成分，對(duì)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌和代謝系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等具有調(diào)節(jié)作用，靈芝中的一種Gac-D三萜酸具有類似于紫杉醇的作用，可使癌細(xì)胞周期移行阻斷在G2+M期，阻斷癌細(xì)胞的瘋長(zhǎng)。深入的研究還顯示靈芝多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。而靈芝多糖類通過(guò)與三萜結(jié)合，可以具備免疫識(shí)別與細(xì)胞毒雙重作用，能選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞，保證正常細(xì)胞不受損害，可以全面、主動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。與放化療聯(lián)用，本發(fā)明藥物組合物即靈芝多糖、枸杞多糖和黃芪多糖與黃芪皂甙合用，具有顯著協(xié)同減毒增效作用，具體表現(xiàn)在對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180有顯著減毒增效作用，對(duì)60Co照射抑制小鼠肉瘤S180有明顯的減毒增效作用，對(duì)正常小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺化療有明顯的減毒作用，對(duì)60Co放療所引起的毒副作用有明顯的減毒功效作用，對(duì)荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫功能均有明顯增強(qiáng)作用，從而真正實(shí)現(xiàn)了“零毒化療”。
一、有效部位篩選實(shí)驗(yàn)以藥效學(xué)試驗(yàn)考察不同提取條件的差異及不同提取部位的藥理活性。以正常小鼠化療試驗(yàn)進(jìn)行黃芪的不同提取部位的藥理活性篩選，同時(shí)考察不同提取方法對(duì)枸杞多糖藥效學(xué)的影響。結(jié)果表明黃芪中的皂甙為活性部位，而由黃芪提取出的氨基酸無(wú)明顯藥理活性；不同的提取溫度對(duì)枸杞多糖的藥理活性無(wú)明顯影響。
動(dòng)物昆明種小白鼠，♀♂各半，普通級(jí)，購(gòu)于南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，合格證號(hào)SCXK(蘇)2001-0014。飼養(yǎng)環(huán)境為普通級(jí)，合格證號(hào)SYXK(蘇)2001-0008。
黃芪多糖(藥液)含生藥1g/ml，批號(hào)20010609。黃芪皂甙(藥液)含生藥1g/ml，批號(hào)20010426。黃芪氨基酸(藥液)含生藥1g/ml，批號(hào)20010429，江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究室提供，用時(shí)加適量蒸餾水配成適宜濃度的混懸液。
枸杞多糖I(藥液)為冷提所得，含生藥材1g/ml，批號(hào)20010425；枸杞多糖II(藥液)為熱提所得，含生藥材1g/ml，批號(hào)20010411，江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究室提供，用時(shí)加適量蒸餾水配成適宜濃度的混懸液。
注射用環(huán)磷酰胺0.2g/支，魯衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第403501號(hào)，批號(hào)01010310，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，用時(shí)加適量無(wú)菌生理鹽水配成所需濃度的藥液。
黃芪不同提取部位的藥理活性比較昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18～22克，隨機(jī)分為5組即正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺化療組、黃芪多糖組、皂甙組和氨基酸組。黃芪多糖、皂甙和氨基酸組均灌胃給予相當(dāng)于生藥材11.0g/kg的相應(yīng)樣品，正常對(duì)照及環(huán)磷酰胺化療組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥10天。除正常對(duì)照組外，其余小鼠均于給藥第8天開(kāi)始，于灌胃給予水或藥液的同時(shí)，每日腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy)40mg/kg，連續(xù)3天。于末次注射Cy后24小時(shí)，各組動(dòng)物眼眶后靜脈叢采血30μl，注入稀釋液中，用法國(guó)產(chǎn)全自動(dòng)動(dòng)物血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血象。
結(jié)果表明正常小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺化療后，外周血液中白細(xì)胞數(shù)量顯著下降，與環(huán)磷酰胺組比較，給予黃芪多糖及黃芪皂甙治療的動(dòng)物白細(xì)胞數(shù)量均有明顯恢復(fù)(P＜0.05)，而給予黃芪氨基酸治療的小鼠白細(xì)胞數(shù)量與環(huán)磷酰胺化療組比較無(wú)顯著性差異，這表明黃芪多糖及黃芪皂甙對(duì)化療藥引起的白細(xì)胞數(shù)量降低有顯著的改善作用，而黃芪氨基酸則無(wú)明顯的升白作用。
不同提取方法所得的枸杞多糖對(duì)正常小鼠Cy化療后外周血象的影響實(shí)驗(yàn)表明，與環(huán)磷酰胺化療組比較，給予枸杞多糖I和枸杞多糖II的小鼠白細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P＜0.05)，且兩組動(dòng)物的血紅蛋白數(shù)均比化療組有所增高(P＜0.01～0.001)，而這兩組之間的外周血象則無(wú)明顯差異，表明主要由枸杞多糖I和II組成的枸杞總多糖對(duì)化療引起的白細(xì)胞數(shù)量減少均有顯著的改善作用，證明枸杞多糖不同的提取溫度對(duì)其藥理活性無(wú)明顯影響。
黃芪總皂甙和黃芪、枸杞與靈芝總多糖混合后，在放化療情況下，對(duì)提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠的免疫功能、減毒增效具有顯著作用。
二、本發(fā)明藥物組合物的制備方法研究黃芪藥材用乙醇回流提取可采用不同濃度乙醇冷浸或回流和/或索氏提??；沉淀時(shí)可靜置，靜置方法可用冷藏靜置和/或常溫靜置；分離方法可采用離心分離，主要是去除雜質(zhì)，和冷藏靜置分離，主要是去除上浮油脂。樹(shù)脂柱純化分離時(shí)，事先可按常規(guī)將大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理。本發(fā)明制備方法中回收乙醇可采用常壓回收和/或減壓回收。干燥分離的沉淀時(shí)，可采用烘箱干燥、真空干燥、冷凍干燥和/或噴霧干燥。黃芪等水提取可用冷浸和/或煎煮。本發(fā)明制備方法中，凡涉及濃縮工藝時(shí)，可采用減壓濃縮、常壓濃縮和/或薄膜蒸發(fā)濃縮。
本發(fā)明方法中凡涉及沉淀或析出物與液體分離時(shí)，可采用離心分離、膜分離和/或常壓或減壓過(guò)濾。粉碎可采用單獨(dú)粉碎和/或混合粉碎。制?？刹捎脻穹ㄖ屏：?或干法制粒。
對(duì)影響黃芪醇回流提取的主要因素乙醇濃度按四因素三水平L(3)進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，影響黃芪總皂苷的主要因素為提取次數(shù)；影響黃芪甲苷的主要因素為乙醇的百分濃度，其次為提取次數(shù)，溶媒量和提取時(shí)間影響較小。綜合三者，總提取物多者，即帶進(jìn)雜質(zhì)亦較多，給下一步的純化增加困難，根據(jù)綜合分析的結(jié)果選擇了發(fā)明藥物組合物的制備方法。由于第一次醇回流時(shí)藥材是干品，本身要吸收約2倍量的醇，因此第一次加醇量均在基礎(chǔ)醇量上多加2倍。
提取液減壓回收乙醇，離心或靜置除去上浮油脂，AB-8樹(shù)脂和/或D101和/或D605和/或D140和/或NKAII大孔樹(shù)脂純化，乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，干燥，得黃芪總皂苷。結(jié)果見(jiàn)表1。
本發(fā)明黃芪總皂苷提取物用AB-8和/或D101和/或D605和/或D140和/或NKAII大孔樹(shù)脂分離純化方法比傳統(tǒng)的水醇法比較，本發(fā)明制得的樣品中黃芪總皂苷含量較高，且總皂苷含量占總固體比例高，表明AB-8大孔樹(shù)脂含量較大，表明用大孔樹(shù)脂純化法除去雜質(zhì)的同時(shí)保留了有效成分的比例高。與傳統(tǒng)工藝即水醇法比較，結(jié)果總皂苷的含量提高5倍，總皂苷占總固體物的比例由原來(lái)的2.3％提高至50％以上。結(jié)果見(jiàn)表2。
在總皂苷解吸過(guò)程中，用85～55％乙醇洗脫總皂甙含量較高，用75～60％乙醇洗脫更好，用65％乙醇洗脫最好，其總提取物中總皂苷含量為56.6％，高于其它濃度。結(jié)果見(jiàn)表2。
對(duì)影響黃芪、枸杞、靈芝三藥多糖提取的因素加水量、藥材浸泡時(shí)間、提取次數(shù)按四因素三水平L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)。按常規(guī)，將中藥的水煎煮條件設(shè)計(jì)為中間水平，分別再取高低兩個(gè)水平。試驗(yàn)表明，影響多糖提取的主要因素均為煎煮時(shí)間，且均以煎煮三次，每次1.5小時(shí)為佳。結(jié)果見(jiàn)表3。
表1 水醇法與大孔樹(shù)脂純化法樣品含量比較純化方法總皂苷含量總提取物總提取中mg/g mg/g總皂苷含量(％)AB-873.3 10.569.8水醇法 14.7 63.02.3表2總皂苷乙醇解吸濃度比較乙醇濃度％總皂苷含量總提取物總提取中Mg/g mg/g 總皂苷含量(％)351.5029 6.18 24.3453.3896 7.09 47.8554.2278 8.90 47.5656.1688 10.09 56.6755.7850 11.18 51.7855.2486 10.09 52.0953.5428 9.27 38.1
表3 水提取正交試驗(yàn)總提取 多糖含量序列 A B CD 總多糖％物％ mg/g生藥1 1 1 11 25.373.04 13.97042 1 2 22 33.369.24 50.57493 1 3 33 36.6411.34 64.05124 2 1 23 34.5210.05 58.60995 2 2 31 27.003.99 23.29836 2 3 12 33.989.43 50.06697 3 1 32 32.0010.28 57.53688 3 2 13 35.338.75 49.71309 3 3 21 27.737.22 39.7752總K195.37 91.89 94.6880.10提K295.50 95.69 95.6199.34取K395.06 98.35 95.64106.49物R×3 0.44 6.46 0.96 26.39總K123.62 23.37 21.2214.25多K223.47 21.98 26.5128.95糖K326.25 27.99 25.6130.14R×3 2.78 6.01 4.39 15.89多K1128.5965 130.1171 113.753 77.0439糖K2131.9751 125.5862 148.960 158.1786含K3147.0250 153.8933 144.883 172.3741量R×3 18.4285 28.3071 31.1360 95.3302三、發(fā)明組合物主要藥效學(xué)研究資料1、對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180的減毒增效作用本發(fā)明藥物組合物按10.0、5.0和2.5g生藥/kg灌胃給藥，對(duì)S180荷瘤小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺化療所引起的白細(xì)胞降低及骨髓有核細(xì)胞減少有明顯的升高作用，對(duì)化療所引起的脾臟及胸腺指數(shù)下降有顯著的改善作用，與環(huán)磷酰胺合用能顯著升高其抑瘤率，表明本品對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180有明顯的減毒增效作用。
本發(fā)明組合物(干粉)含生藥37.0g/g，制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。
維血寧顆粒8g/袋，蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1993)第165801號(hào)，批號(hào)020712，常州藥業(yè)股份有限公司健民制藥廠生產(chǎn)，用時(shí)加適量蒸餾水配成適宜濃度的混懸液。(下同)注射用環(huán)磷酰胺(簡(jiǎn)稱Cy，下同)0.2g/支，魯衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第403501號(hào)，批號(hào)02080421，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，用時(shí)加適量無(wú)菌生理鹽水配成所需濃度的藥液。(下同)
瘤株肉瘤S180實(shí)體型，移自江蘇省腫瘤研究所，由江蘇省中醫(yī)藥研究院藥理室傳代保種。(下同)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)方法參見(jiàn)中藥新藥藥理學(xué)研究指南.治療惡性腫瘤中藥的藥效學(xué)研究.衛(wèi)生部藥政局《中藥新藥研究指南》，1994104；葉應(yīng)嫵、王毓三等.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程.東南大學(xué)出版社.19914，64；萬(wàn)軍梅、張永忠、吳巍等.抑瘤扶正丸提高化療療效的實(shí)驗(yàn)研究.中成藥，2002，24(9)695～6972、對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180瘤重及抑瘤率的影響昆明種雄性小鼠60只，體重18-22克，分為6組即荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺化療組、維血寧顆粒組和本發(fā)明組合物高、中、低劑量組。給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，荷瘤對(duì)照組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥12天。并于給藥的第4天，取腹部接種S180瘤株8天的荷瘤小鼠，無(wú)菌操作下抽取腹腔瘤液，以滅菌生理鹽水稀釋成1∶4濃度的瘤細(xì)胞液(鏡檢含瘤細(xì)胞數(shù)5×107/ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接種0.2ml/鼠。除荷瘤對(duì)照組外，其余小鼠均于接種腫瘤后次日開(kāi)始，于灌胃給予水或藥液的同時(shí)，每日腹腔注射環(huán)磷酰胺15mg/kg，連續(xù)8天，于末次給藥后24小時(shí)，小鼠脫頸椎處死，剝離肉瘤，電子天平稱重。計(jì)算各組小鼠瘤重平均值及抑瘤率。結(jié)果見(jiàn)表1。 表4 本發(fā)明組合物對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠肉瘤S180瘤重和抑瘤率的影響(x±SD，n＝10)劑量 Cy 瘤重抑瘤率組別(g/kg)(mg/kg×d)(g，X±SD) (％)荷瘤對(duì)照組 / / 1.910±0.402Cy組/ 15×8 1.086±0.305***43.12陽(yáng)性藥組4.8 15×8 0.810±0.258***Δ57.59高劑量組10.0 15×8 0.708±0.377***Δ62.93中劑量組5.0 15×8 0.735±0.366***Δ61.52低劑量組2.5 15×8 0.904±0.413***52.67注1.與荷瘤對(duì)照組比較(t-檢驗(yàn))，***P＜0.001；2.與Cy組比較(t-檢驗(yàn))，ΔP＜0.05；表4可見(jiàn)，S180荷瘤小鼠在Cy化療同時(shí)灌胃給予本發(fā)明組合物，與荷瘤對(duì)照組比較，各給藥組瘤重均有顯著抑制作用(P＜0.001)，瘤重抑制率在52％至62％之間，且與單用Cy組比較，高、中劑量組瘤重明顯減輕(P＜0.05)，表明本品對(duì)Cy抑制小鼠肉瘤S180有明顯的增效作用。
3、對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后外周血象的影響昆明種雄性小鼠70只，體重18～22克，隨機(jī)分為7組即正常對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺化療組、陽(yáng)性藥組和給藥高、中、低劑量組。給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，正常及荷瘤對(duì)照組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥15天。并于給藥的第4天，除正常對(duì)照組外，其余小鼠右前肢腋部皮下接種S180瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除正常及荷瘤對(duì)照組外，其余小鼠均于接種腫瘤后次日(即給藥第5天)開(kāi)始，于灌胃給予水或藥液的同時(shí)，每日腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy)15mg/kg，連續(xù)8天。于末次注射Cy后第二、四、六天，各組動(dòng)物眼眶后靜脈叢采血30μl，注入稀釋液中，用法國(guó)產(chǎn)全自動(dòng)動(dòng)物血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血象。結(jié)果見(jiàn)表5～8。
表5 本發(fā)明組合物對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后外周血液中WBC的影響(x±SD，n＝10)Cy WBC(109/L)組別 劑量(g/kg)(mg/kg×d) 第一次 第二次 第三次正常對(duì)照組 / / 17.0±4.8 17.2±2.718.1±5.1荷瘤對(duì)照組 / / 16.9±5.5***16.0±4.5*18.1±4.7Cy組/ 15×8 7.3±3.1 12.2±2.618.3±5.1陽(yáng)性藥組4.8 15×8 11.9±3.5**15.9±4.3*19.8±5.5高劑量組10.0 15×8 12.2±3.9**17.1±3.4**19.7±6.8中劑量組5.0 15×8 11.3±4.5*15.7±3.9*18.4±3.9低劑量組2.5 15×8 13.2±4.3**15.1±3.4*20.8±4.5注與Cy化療組比(t檢驗(yàn))，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表6 本發(fā)明組合物對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后外周血液中RBC的影響(x±SD，n＝10)Cy RBC(1012/L)組別 劑量(g/kg)(mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常對(duì)照組 // 13.23±1.53 12.72±2.2212.13±1.15荷瘤對(duì)照組 // 11.96±1.47 11.29±1.0111.98±1.07Cy組 /15×8 10.92±1.19 11.55±1.1011.04±1.35陽(yáng)性藥組 4.8 15×8 11.50±1.46 10.76±1.2810.13±1.74高劑量組 10.0 15×8 12.52±1.76*12.43±1.2011.93±1.66中劑量組 5.0 15×8 11.99±1.47 11.76±2.3411.11±0.86低劑量組 2.5 15×8 11.07±1.39 11.55±2.0411.90±1.60注與Cy化療組比(t檢驗(yàn))，*P＜0.05。
表7 本發(fā)明組合物對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后外周血液中HGB的影響(x±SD，n＝10)Cy HGB(g/L)組別 劑量(g/kg)(mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常對(duì)照組 / / 205.7±19.1Δ201.9±37.0Δ187.1±18.0
荷瘤對(duì)照組/ / 182.3±28.0170.4±15.5185.7±14.9Cy組 / 15×8169.6±21.9167.5±19.2171.4±21.2陽(yáng)性藥組4.815×8179.6±26.8161.1±18.6152.5±22.6高劑量組10.0 15×8193.7±24.9*192.9±21.9*179.1±25.0中劑量組5.015×8187.4±25.2176.6±32.1167.8±11.5低劑量組2.515×8172.4±22.2173.6±25.8183.4±26.8注1.與Cy化療組比(t檢驗(yàn))，*P＜0.05。
2.與荷瘤組比(t檢驗(yàn))，ΔP＜0.05。
表8 本發(fā)明組合物對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后外周血液中PLT的影響(x±SD，n＝10)劑量 Cy PLT(109/L)組別(g/kg) (mg/kg×d)第一次 第二次 第三次正常對(duì)照組// 707.6±132.1 793.2±111.0 643.3±79.7荷瘤對(duì)照組// 627.6±104.8 752.3±202.4 697.4±109.2Cy組 /15×8 649.5±160.5 709.9±96.0720.0±112.0陽(yáng)性藥組 4.8 15×8 691.2±123.4 778.5±106.9 787.2±192.7高劑量組 10.0 15×8 660.0±89.9771.1±166.7 768.1±82.1中劑量組 5.0 15×8 693.4±167.7 734.6±118.6 766.7±103.4低劑量組 2.5 15×8 771.7±198.1 748.5±122.2 798.9±68.9由表5～8可見(jiàn)，荷瘤小鼠經(jīng)Cy化療后，外周血液中WBC數(shù)量顯著下降，并呈現(xiàn)出明顯的時(shí)效關(guān)系，在末次注射Cy后24小時(shí)為最低點(diǎn)，以后逐淅恢復(fù)。與Cy組比較，給予本發(fā)明組合物治療的各組動(dòng)物的WBC數(shù)量在不同時(shí)間段均有明顯恢復(fù)(P＜0.05～0.01)，且在化療組WBC數(shù)量在最低點(diǎn)時(shí)作用更加顯著，表明本品對(duì)化療藥引起的WBC數(shù)降低有顯著的改善作用。而化療組的RBC、HGB、PLT數(shù)則無(wú)明顯變化，但本品高劑量組RBC及HGB比化療組略有升高(P＜0.05)。
4、對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后骨髓有核細(xì)胞的影響昆明種雄性小鼠70只，體重18-22克，分為7組即正常組、荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺化療組、維血寧顆粒組和本發(fā)明組合物高、中、低劑量組。給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，正常及荷瘤對(duì)照組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥12天。并于給藥的第4天，除正常對(duì)照組外，其余小鼠右前肢腋部皮下接種S180瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除荷瘤對(duì)照組外，其余小鼠均于接種腫瘤后次日開(kāi)始，于灌胃給予水或藥液的同時(shí)，每日腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy)15mg/kg，連續(xù)8天，于末次給藥后24小時(shí)，小鼠脫頸椎處死，剝離左側(cè)股骨，以3％醋酸10ml沖出骨髓細(xì)胞，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，計(jì)算1根骨內(nèi)的骨髓有核細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果見(jiàn)表9。表9 本發(fā)明組合物對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后骨髓有核細(xì)胞數(shù)量的影響(x±SD，n＝10)
組別 劑量(g/kg)Cy(mg/kg×d)骨髓有核細(xì)胞數(shù)(109/L)正常對(duì)照組/ / 24.32±3.75荷瘤對(duì)照組//23.70±4.65***Cy組 / 15×812.50±2.86陽(yáng)性藥組 4.8 15×816.60±3.66*高劑量組 10.0 15×817.84±3.05***中劑量組 5.0 15×816.78±3.33**低劑量組 2.5 15×815.29±2.84*注與Cy化療組比(t-檢驗(yàn))，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
由表9可見(jiàn)，與Cy化療組比較，本發(fā)明組合物各組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P＜0.05～0.001)，表明本品對(duì)化療引起的骨髓有核細(xì)胞數(shù)量減少有顯著增高作用。
5、對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后免疫器官重量的影響昆明種雄性小鼠70只，體重18-22克，實(shí)驗(yàn)方法同2.3。于末次給藥后24小時(shí)，小鼠稱重后脫頸椎處死，取脾臟及胸腺稱重并計(jì)算臟器指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表10。
表10 本發(fā)明組合物對(duì)荷瘤小鼠Cy化療后免疫器官重量的影響(x±SD，n＝10)組別劑量(g/kg) Cy(mg/kg×d)脾臟指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)正常對(duì)照組/ / 5.01±1.162.70±0.76荷瘤對(duì)照組/ / 5.81±0.74***2.64±0.88**Cy組 /15×83.27±0.651.58±0.44陽(yáng)性藥組 4.8 15×84.51±1.70*2.11±0.64*高劑量組 10.0 15×84.72±1.34**2.33±0.54**中劑量組 5.0 15×84.13±1.02*1.93±0.52低劑量組 2.5 15×83.97±1.131.67±0.67注與Cy化療組比(t-檢驗(yàn))，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表10可見(jiàn)，與Cy化療組比較，本發(fā)明組合物高、中劑量組小鼠脾臟指數(shù)明顯增加(P＜0.05～0.01)，高劑量組胸腺指數(shù)顯著增高(P＜0.01)，表明本品對(duì)Cy化療引起的胸腺及脾臟指數(shù)降低有明顯的改善作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明組合物對(duì)環(huán)磷酰胺化療所引起的S180荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量減少有明顯的改善作用，同時(shí)能明顯升高骨髓有核細(xì)胞數(shù)量，并能增加荷瘤化療小鼠的脾及胸腺指數(shù)；本品與環(huán)磷酰胺合用，能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)化療藥Cy的抑瘤作用有明顯增強(qiáng)作用。以上結(jié)果表明本發(fā)明組合物與化療藥Cy合用，有明顯的減毒增效作用。
6、對(duì)60Co照射抑制小鼠肉瘤S180的減毒增效作用本發(fā)明藥物組合物按10.0、5.0和2.5g生藥/kg灌胃給藥，對(duì)S180荷瘤小鼠經(jīng)60Co放療所引起的白細(xì)胞降低及骨髓有核細(xì)胞減少有明顯的升高作用，對(duì)放療所引起的脾臟及胸腺指數(shù)下降有一定的改善作用，能顯著升高放療抑瘤率，表明本品對(duì)60Co放療抑制小鼠肉瘤S180有明顯的減毒增效作用。
本發(fā)明組合物(干粉)含生藥37.0g/g，批號(hào)20020629，江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究室提供。其余同上。
實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果對(duì)60Co放療抑制小鼠肉瘤S180瘤重及抑瘤率的影響昆明種雄性小鼠60只，體重18-22克，分為6組即荷瘤對(duì)照組、60Co放療組、維血寧顆粒組和本發(fā)明組合物高、中、低劑量組。給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，荷瘤對(duì)照組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥12天。并于給藥的第4天，取腹部接種S180瘤株8天的荷瘤小鼠，無(wú)菌操作下抽取腹腔瘤液，以滅菌生理鹽水稀釋成1∶4濃度的瘤細(xì)胞液(鏡檢含瘤細(xì)胞數(shù)5×107/ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接種0.2ml/鼠。除荷瘤對(duì)照組外，其余小鼠均于接種腫瘤三日后，一次給予350Rad60Co照射。于末次給藥后24小時(shí)，小鼠脫頸椎處死，剝離肉瘤，電子天平稱重。計(jì)算各組小鼠瘤重平均值及抑瘤率。結(jié)果見(jiàn)表11。 表11 本發(fā)明組合物對(duì)60Co放療抑制小鼠肉瘤S180瘤重和抑瘤率的影響(x±SD，n＝10)劑量60Co(Rad) 瘤重抑瘤率組別(g/kg) (g，X±SD) (％)荷瘤對(duì)照組 // 2.683±0.69560Co組 / 350 1.608±0.467***40.06陽(yáng)性藥組4.8 350 1.211±0.0.365***Δ54.85高劑量組10.0350 1.153±0.346***Δ57.02中劑量組5.0 350 1.179±0.319***Δ56.05低劑量組2.5 350 1.332±0.223***50.35注1.與荷瘤對(duì)照組比較(t-檢驗(yàn))，***P＜0.001；2.與60Co放療組比較(t-檢驗(yàn))，ΔP＜0.05；表11可見(jiàn)，S180荷瘤小鼠在60Co放療同時(shí)灌胃給予本發(fā)明組合物，與荷瘤對(duì)照組比較，各給藥組瘤重均有顯著抑制作用(P＜0.001)，瘤重抑制率在50％至57％之間，且與單用60Co放療組比較，高、中劑量組瘤重明顯減輕(P＜0.05)，表明本品對(duì)60Co放療抑制小鼠肉瘤S180有明顯的增效作用。
7、對(duì)荷瘤小鼠60Co放療后外周血象的影響昆明種雄性小鼠70只，體重18-22克，隨機(jī)分為7組即正常對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、60Co放療組、陽(yáng)性藥組和給藥高、中、低劑量組。給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，正常及荷瘤對(duì)照組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥15天。并于給藥的第4天，除正常對(duì)照組外，其余小鼠右前肢腋部皮下接種S180瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除正常及荷瘤對(duì)照組外，其余小鼠均于接種腫瘤3日后(即給藥第7天)一次給予350Rad60Co照射。于60Co照射后第三、六、九天，各組動(dòng)物眼眶后靜脈叢采血30μ1，注入稀釋液中，用法國(guó)產(chǎn)全自動(dòng)動(dòng)物血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血象。實(shí)驗(yàn)表明荷瘤小鼠經(jīng)60Co放療后，外周血液中WBC數(shù)量顯著下降，且持續(xù)維持較低水平，而RBC、HGB及PLT數(shù)量在照射后第六日明顯減少，至第九日，PLT仍維持較低水平。與60Co放療組比較，本發(fā)明組合物高、中劑量組動(dòng)物的WBC數(shù)量在第六日及第九日均有明顯恢復(fù)(P＜0.05～0.01)，高劑量組HGB及PLT數(shù)量也明顯升高(P＜0.05～0.01)，對(duì)RBC的降低有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果表明本品對(duì)化療藥引起的WBC數(shù)降低有顯著的改善作用，并在一定程度上升高HGB和PLT。
8、對(duì)荷瘤小鼠60Co放療后骨髓有核細(xì)胞的影響昆明種雄性小鼠70只，體重18-22克，分為7組即正常組、荷瘤對(duì)照組、60Co放療組、維血寧顆粒組和本發(fā)明組合物高、中、低劑量組。給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，正常及荷瘤對(duì)照組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥12天。并于給藥的第4天，除正常對(duì)照組外，其余小鼠右前肢腋部皮下接種S180瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠(方法同前2.1)。除荷瘤對(duì)照組外，其余小鼠均于接種腫瘤3日后一次給予350Rad60Co照射。于末次給藥后24小時(shí)，小鼠脫頸椎處死，剝離左側(cè)股骨，以3％醋酸10ml沖出骨髓細(xì)胞，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，計(jì)算1根骨內(nèi)的骨髓有核細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)表明與60Co放療組比較，本發(fā)明組合物對(duì)60Co放療所引起的S180荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量減少有明顯的改善作用，在一定程度上升高由于放療引起的HGB及PLT數(shù)量的下降，同時(shí)能明顯升高骨髓有核細(xì)胞數(shù)量；本品與60Co照射合用，能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)放療的抑瘤作用有明顯增強(qiáng)作用。以上結(jié)果表明本發(fā)明組合物與放療合用，有明顯的減毒增效作用。
9、對(duì)正常小鼠化療的減毒作用本發(fā)明藥物組合物按10.0、5.0和2.5g生藥/kg灌胃給藥，對(duì)正常小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺化療所引起的白細(xì)胞降低及骨髓有核細(xì)胞數(shù)減少有明顯的升高作用，對(duì)化療所引起的脾臟及胸腺指數(shù)下降有顯著的改善作用，表明本品對(duì)正常小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺化療有明顯的減毒作用。
10、對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響本發(fā)明藥物組合物按10.0、5.0和2.5g生藥/kg灌胃給藥，可使S180荷瘤小鼠對(duì)PHA刺激的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)增強(qiáng)，小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞百分比明顯升高，并且荷瘤機(jī)體血清溶血素水平顯著提高。以上結(jié)果表明本品對(duì)荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫功能均有明顯增強(qiáng)作用。
本發(fā)明組合物(干粉)含生藥37.0g/g，批號(hào)20020629，江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究室提供。
對(duì)PHA刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(體內(nèi)誘導(dǎo)法)，參見(jiàn)李儀奎等.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué).上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991164昆明種小鼠70只，雌雄各半，體重18-22克，分為7組即正常對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺模型組、維血寧顆粒組和本發(fā)明組合物高、中、低劑量組。除正常對(duì)照組外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接種1∶4稀釋的S180瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠。接種腫瘤次日開(kāi)始給藥，給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，正常組、荷瘤對(duì)照組及模型組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥8天。并于給藥的第1天起，每天肌肉注射PHA10mg/kg一次，連續(xù)三次；給藥第6天除正常及荷瘤對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg，第7天重復(fù)一次，末次給藥后1小時(shí)，小鼠眼眶后靜脈叢采血，推片，甲醇固定，姬氏染色，水洗，晾干，高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞中淋巴母細(xì)胞數(shù)，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果見(jiàn)表12。
表12、本發(fā)明組合物對(duì)荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及T淋巴細(xì)胞酯酶染色率的影響(x±SD，n＝10)組別 劑量 Cy淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率ANAE染色率(g/kg) (mg/kg×d)(％，X±SD) (％，X±SD)正常對(duì)照組// 43.6±5.6 59.3±7.1荷瘤對(duì)照組// 44.5±3.9***58.7±6.1***Cy組 / 40×2 15.0±4.832.2±5.8陽(yáng)性藥組 4.8 40×2 22.7±7.4*40.8±8.6*高劑量組 10.040×2 24.8±5.4***41.2±7.2**中劑量組 5.0 40×2 22.5±4.8**39.0±7.2*低劑量組 25 40×2 20.0±3.9*35.9±7.5注與Cy組比較(t-檢驗(yàn))，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；表12可見(jiàn)，本發(fā)明組合物各劑量組動(dòng)物對(duì)PHA刺激的轉(zhuǎn)化反應(yīng)增強(qiáng)，淋巴母細(xì)胞百分率與環(huán)磷酰胺組比較有顯著提高(P＜0.05～0.001)，表明本品能提高荷瘤機(jī)體T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答功能，即提高細(xì)胞免疫功能。
11、對(duì)荷瘤小鼠T-淋巴細(xì)胞酯酶染色率的影響昆明種小鼠70只，雌雄各半，體重18-22克，分為7組即正常對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺模型組、維血寧顆粒組和本發(fā)明組合物高、中、低劑量組。除正常對(duì)照組外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接種1∶4稀釋的S180瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠。接種腫瘤次日開(kāi)始給藥，給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，正常組、荷瘤對(duì)照組及模型組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥10天。第8天除正常及荷瘤對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg，第9天重復(fù)一次，末次給藥后1小時(shí)，小鼠眼眶后靜脈叢采血，推片，酯酶染色，晾干，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞，其中有棕紅色顆粒的為T(mén)細(xì)胞，無(wú)棕紅色顆粒的為B細(xì)胞。由表12結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明組合物高、中劑量組外周血中T淋巴細(xì)胞百分比明顯高于環(huán)磷酰胺組(P＜0.05～0.01)，說(shuō)明本品對(duì)環(huán)磷酰胺所致的荷瘤機(jī)體免疫抑制有明顯恢復(fù)作用，即對(duì)細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用。
12、對(duì)荷瘤小鼠溶血素抗體生成的影響(比色法)昆明種小鼠70只，雌雄各半，體重18-22克，分為7組即正常對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺模型組、維血寧顆粒組和本發(fā)明組合物高、中、低劑量組。除正常對(duì)照組外，其余小鼠均于右前肢腋部皮下接種1∶4稀釋的S180瘤細(xì)胞液0.2ml/鼠。接種腫瘤次日開(kāi)始給藥，給藥組分別灌胃給予本發(fā)明組合物混懸液10.0、5.0和2.5g生藥/kg，陽(yáng)性藥組灌胃給予維血寧顆粒4.8g/kg，正常組、荷瘤對(duì)照組及模型組灌胃給予同體積的蒸餾水，小鼠均灌胃給藥10天。于給藥后第3天各組動(dòng)物腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液0.2ml/只進(jìn)行免疫，再于給藥后第8天除正常及荷瘤對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg，第9天重復(fù)一次，末次給藥后1小時(shí)，小鼠眼眶后靜脈叢采血，離心，取10μl血清用生理鹽水稀釋100倍，與5％雞紅細(xì)胞懸液0.5ml及10％補(bǔ)體0.5ml混合，37℃恒溫水浴中保溫30min后，0℃冰水浴中終止反應(yīng)，離心，取上清液于分光光度計(jì)540nm處比色，測(cè)光密度值，另設(shè)不加血清的空白對(duì)照，取上清液作為比色時(shí)調(diào)零的基準(zhǔn)。以O(shè)D值作為判定血清溶血素水平的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明組合物能明顯增加荷瘤小鼠血清溶血素水平(P＜0.05～0.001)，使環(huán)磷酰胺所致的血清溶血素含量下降有明顯恢復(fù)，表明本品能提高荷瘤機(jī)體的體液免疫能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明組合物對(duì)S180荷瘤小鼠由環(huán)磷酰胺所引起的免疫抑制有明顯的恢復(fù)作用，能顯著升高T淋巴細(xì)胞酯酶染色率、增強(qiáng)PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，并能明顯提高血清溶血素水平，表明本品對(duì)于荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫均有顯著增強(qiáng)作用。
四、本發(fā)明組合物急性毒性試驗(yàn)本發(fā)明組合物給小鼠灌胃給藥未見(jiàn)明顯的急性毒性反應(yīng)，無(wú)法按常規(guī)方法測(cè)定半數(shù)致死量(LD50)。小鼠一次灌胃給藥的最大給藥量為740g生藥/kg，此劑量相當(dāng)于擬臨床人用量的822倍，未見(jiàn)明顯的毒性反應(yīng)。
五、本發(fā)明組合物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究表明，用相當(dāng)于生藥材50.0、25.0和12.5g/kg劑量的本發(fā)明組合物給SD大鼠連續(xù)灌胃90天，其中大劑量約為臨床人擬用劑量的55.6倍，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物有活動(dòng)減少、毛松亂、精神萎糜不振等現(xiàn)象，對(duì)大鼠的體重、臟器系數(shù)、血液生化檢查等均未見(jiàn)明顯的毒性反應(yīng)。血液生化學(xué)檢查顯示大劑量組3個(gè)月的的ALP及6個(gè)月的AST明顯升高，中、小劑量組未見(jiàn)有明顯毒性，表明本品長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的中劑量(25.0g生藥/kg)以下為安全劑量，大劑量組對(duì)肝功能有一定損害，提請(qǐng)臨床使用時(shí)注意對(duì)血液生化學(xué)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取黃芪3.0kg、枸杞1.2kg、靈芝1.2kg。
黃芪藥材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小時(shí)，合并回流液，過(guò)濾，回收乙醇，母液靜置12小時(shí)，離心，離心液上已處理過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂純化，70％乙醇洗脫，回收乙醇，干燥，得總皂苷30克。
黃芪藥渣，枸杞、靈芝等處方藥用12倍量水提取三次，每次1.5小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至相對(duì)密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量達(dá)80％，靜置，過(guò)濾，沉淀物揮去乙醇至干，加蒸餾水溶解，離心，離心液濃縮至相對(duì)密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量達(dá)75％，靜置，過(guò)濾，揮去乙醇至干，得總多糖150克。
合并總皂甙與總多糖，粉碎，裝入明膠硬膠囊。服法一天3次，一次2粒。
黃芪藥材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小時(shí)，合并回流液，過(guò)濾，回收乙醇，母液靜置12小時(shí)，離心，離心液上已處理過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂純化，70％乙醇洗脫，回收乙醇，干燥，得總皂苷30克。
黃芪藥渣，枸杞、靈芝等處方藥用12倍量水提取三次，每次1.5小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至相對(duì)密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量達(dá)80％，靜置，過(guò)濾，沉淀物揮去乙醇至干，加蒸餾水溶解，離心，離心液濃縮至相對(duì)密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量達(dá)75％，靜置，過(guò)濾，揮去乙醇至干，得總多糖150克。
合并總皂甙與總多糖，粉碎，加賦形劑，壓片。服法一天3次，一次3片。
實(shí)施例3取黃芪4.0kg、枸杞1.5kg、靈芝1.5kg。
將所述重量配比的黃芪，用90％乙醇提取4次，每次2.5小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上AB-8大孔樹(shù)脂柱，用80％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙40克；將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?0倍量水，煎煮4次，每次2小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至相對(duì)密度1.3，加入乙醇使含醇量達(dá)70％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至相對(duì)密度1.1，加入乙醇使含醇量達(dá)70％，濾取沉淀物，干燥得總多糖196克；合并總皂甙與總多糖，粉碎，加入乙醇作粘合劑，加入淀粉作填充劑，常規(guī)壓制成顆粒劑。服法一天3次，一次1袋。
實(shí)施例4取黃芪4.0kg、枸杞3.5kg、靈芝3.5kg。
將所述重量配比的黃芪，用70％乙醇提取2次，每次1小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上D101大孔樹(shù)脂柱，用60％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙40克；將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?4倍量水，煎煮2次，每次1小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)85％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至相對(duì)密度1.3，加入乙醇使含醇量達(dá)70％，濾取沉淀物，干燥得總多糖276克；將黃芪總皂甙與總多糖混合，粉碎，加入常規(guī)輔料，制成散劑。服法一天3次，一次1袋。
實(shí)施例5取黃芪4.0kg、枸杞2.0kg、靈芝2.0kg將所述重量配比的黃芪，用75％乙醇提取3次，每次1小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上D101大孔樹(shù)脂柱，用65％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙40克；將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?3倍量水煎煮，煎煮液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)75％，濾取沉淀物，干燥得總多糖210克；合并總皂甙與總多糖，粉碎，常規(guī)制粒，裝膠囊。
實(shí)施例6取黃芪4.0kg、枸杞1.0kg、靈芝1.0kg將所述重量配比的黃芪，用75％乙醇提取3次，每次1小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上D101大孔樹(shù)脂柱，用65％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙40克；將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?3倍量水煎煮，取水煎煮液，濃縮，醇沉，過(guò)濾得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，過(guò)濾，用膜按常規(guī)操作進(jìn)行超濾，先用30萬(wàn)截留分子量膜超濾去除大分子雜質(zhì)，然后再用1000截留分子量膜超濾去除水分及部分小分子雜質(zhì)，濃縮至相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)75％，濾取沉淀，得總多糖176克。合并總皂甙與總多糖，粉碎，裝膠囊。
實(shí)施例7取黃芪3.0kg、枸杞1.2kg、靈芝1.2kg。
黃芪藥材第一次用8倍量、第二次用6倍量80％乙醇回流提取二次，每次2小時(shí)，合并回流液，過(guò)濾，回收乙醇，母液靜置12小時(shí)，離心，離心液上已處理過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂純化，70％乙醇洗脫，回收乙醇，干燥，得總皂苷30克。
黃芪藥渣，枸杞、靈芝等處方藥用12倍量水提取三次，每次1.5小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至相對(duì)密度1.2(80℃)，乙醇沉淀含醇量達(dá)80％，靜置，過(guò)濾，沉淀物揮去乙醇至干，加蒸餾水溶解，離心，離心液濃縮至相對(duì)密度1.2(80℃)，再用乙醇沉淀，含醇量達(dá)75％，靜置，過(guò)濾，揮去乙醇至干，得總多糖150克。合并總皂甙與總多糖，加蒸餾水溶解，過(guò)濾，制成每1ml含1.8g生藥溶液，灌裝于10ml管制口服液瓶中，滅菌。
權(quán)利要求
1.一種有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物組合物，其特征在于它基本上由下列重量份的原料藥制成黃芪、枸杞、靈芝為1-40份∶1-15份∶1-15份。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中原料藥的用量為黃芪、枸杞、靈芝重量比為1-30份∶1-12份∶1-12份。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中原料藥的用量為黃芪、枸杞、靈芝重量比為30份∶12份∶12份。
4.權(quán)利要求1～3之一藥物組合物的制備方法，包括下列步驟a)取原料藥黃芪、枸杞與靈芝，備用；b)將所述重量配比的黃芪，用70～90％乙醇提取1～4次，每次1～2.5小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上大孔樹(shù)脂柱，用55～84％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙；c)將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?0～14倍量水，冷浸或煎煮提取2～4次，每次1～2小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至相對(duì)密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量達(dá)70-85％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至相對(duì)密度1.0-1.4，加入乙醇使含醇量達(dá)70-80％，濾取沉淀物，干燥得總多糖；d)將黃芪總皂甙與總多糖混合，得本發(fā)明藥物的活性組分。
5.權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于b)將所述重量配比的黃芪，用75～85％乙醇提取2～3次，每次1.5～2.0小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上AB-8和/或D101型號(hào)大孔樹(shù)脂柱，用60～80％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙；c)將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜ⅲ尤?1～13倍量水，煎煮3次，每次1.5小時(shí)，合并煎煮液，濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量達(dá)75-80％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.1-1.3，加入乙醇使含醇量達(dá)75-80％，濾取沉淀物，干燥得總多糖；d)將黃芪總皂甙與總多糖混合后，加入藥用輔料，常規(guī)制成口服制劑。
6.權(quán)利要求5的制備方法，其特征在于b)將所述重量配比的黃芪，用80～82％乙醇提取3次，每次1.5小時(shí)，合并乙醇提取液，回收乙醇，將去除沉淀后的液體上AB-8或D101型號(hào)大孔樹(shù)脂柱，用65～70％乙醇洗脫，得黃芪總皂甙；c)將所述重量配比的枸杞、靈芝與上述乙醇提取過(guò)黃芪殘?jiān)喜?，加?2倍量水煎煮，煎煮液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，過(guò)濾得沉淀物，干燥沉淀物，加水溶解后，將水液濃縮至80℃時(shí)相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)75％，濾取沉淀物，干燥得總多糖；d)將黃芪總皂甙、總多糖與藥學(xué)上常規(guī)輔料混合，制成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑或口服液。
7.權(quán)利要求6的制備方法，其特征在于c)取水煎煮液，濃縮，醇沉，過(guò)濾得沉淀物后，取沉淀物加水溶解，過(guò)濾，用膜按常規(guī)操作進(jìn)行超濾，先用30萬(wàn)截留分子量膜超濾去除大分子雜質(zhì)，然后再用1000截留分子量膜超濾去除水分及部分小分子雜質(zhì)，濃縮至相對(duì)密度1.2，加入乙醇使含醇量達(dá)75％，濾取沉淀，得總多糖。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，在制備提高免疫藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物的制備方法，在制備用于放化療減毒增效的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1的藥物組合物，在制備與放化療合用的提高免疫、減毒增效藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種與放化療用協(xié)同作用的提高免疫、減毒增效的藥物組合物，由黃芪、枸杞、靈芝按1－40份∶1－15份∶1－15份重量配比，通過(guò)優(yōu)化制劑工藝，富集有效部位群，制成療效顯著且穩(wěn)定、質(zhì)量可控的中藥口服制劑。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1480208SQ03132059
公開(kāi)日2004年3月10日 申請(qǐng)日期2003年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者段金廒, 賈曉斌, 彭蘊(yùn)茹 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院