專利名稱：2,3-o去硫酸肝素在制備預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是生物制品在制備預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，腫瘤細胞惡性化的重要步驟是由原發(fā)部位向新的組織中的轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是一個高度受控、多因子參與的動態(tài)級聯(lián)反應過程。在此過程中，進入血液中循環(huán)的腫瘤細胞與血小板的相互作用形成“微栓塞”是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)?！拔⑺ㄈ钡男纬刹粌H為腫瘤細胞提供了一個保護罩，而且有利于腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞的粘附。許多研究已經(jīng)證明，血小板與腫瘤細胞“微栓塞”的形成要求血小板的P-選擇素與腫瘤細胞的P-選擇素配體的相互作用。肝素是P-選擇素的一種配體，可以干擾P-選擇素與其天然配體的結(jié)合，從而阻斷了血小板與腫瘤細胞的粘附。所以肝素抗腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要機制就是阻斷了由P-選擇素介導的血小板與腫瘤細胞的粘附。肝素是一種帶有高度負電荷的多硫酸化的糖胺聚糖，主要由糖醛酸-(1→4)-D-葡萄糖胺的重復二糖亞單位組成。但二糖亞單位上的N-硫酸化、O-硫酸化和N-乙?；榷喾N方式的取代使肝素產(chǎn)生了巨大而復雜的結(jié)構(gòu)。作為臨床廣泛應用的抗凝血藥物肝素已被證明可以在多方面有效地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，但是肝素的抗凝血活性帶來的潛在出血危險極大地限制了其在預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移方面的應用。解決上述問題的有效途徑一般是通過化學法或酶法制備低抗凝血活性的低分子量肝素。但由于這類肝素衍生物的分子量低，結(jié)構(gòu)相對簡單，失去了某些影響腫瘤轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另一個有效途徑是通過化學修飾手段制備非抗凝血活性的肝素。本研究通過多種選擇性化學修飾方法制備了8種非抗凝血肝素衍生物，選取了4種人腫瘤細胞系，系統(tǒng)地研究了這些人腫瘤細胞系與P-選擇素、轉(zhuǎn)染P-選擇素的CHO細胞和表達P-選擇素的血小板在靜止和層流狀態(tài)下的相互作用及各種非抗凝血肝素衍生物對這種相互作用的抑制。獲得了具有良好抑制腫瘤細胞粘附活性的非抗凝血肝素衍生物(2，3-O去硫酸肝素)，實現(xiàn)了本項發(fā)明預期的研究目標。到目前為止，將2，3-O去硫酸化的非抗凝血肝素衍生物用于抑制P-選擇素介導的腫瘤細胞與血小板粘附的研究在國內(nèi)外尚未見文獻和專利報道。
目前，在臨床上還沒有特別有效的藥物用于預防和治療腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。2，3-O去硫酸肝素的應用克服了肝素在臨床應用中帶來的潛在出血危險。同時，2，3-O去硫酸肝素制備工藝簡單、成本低，具有更好的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本項發(fā)明是將經(jīng)化學修飾獲得的非抗凝血肝素衍生物用于體外抗腫瘤細胞粘附的研究，獲得具有良好抑制腫瘤細胞粘附活性的非抗凝血肝素衍生物，目的是獲得進一步應用于臨床的預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的新的藥物。
本發(fā)明涉及2，3-O去硫酸肝素的制備、抗凝血活性分析及體外抗腫瘤細胞粘附等相關(guān)內(nèi)容。2，3-O去硫酸肝素的獲得是采用NaOH選擇性去硫酸根法，得到的肝素衍生物經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠層析檢驗具有肝素主體結(jié)構(gòu)的完整性。離子色譜分析顯示其硫酸根含量明顯降低(肝素樣品為26.76％，2，3-O去硫酸肝素為18.19％)。經(jīng)激活部分促凝血酶原激酶時間法(aPTT)測得2，3-O去硫酸肝素的抗凝血活性是肝素的1/250。2，3-0去硫酸肝素可以明顯地抑制4種人的腫瘤細胞(人結(jié)腸癌細胞COLO320、LS174T和CW-2，人惡性黑素瘤細胞A375)與P-選擇素在靜止狀態(tài)下的結(jié)合(以對COLO320的作用為例，在5mg/mL時的抑制率分別為90.4％、92.2％、84.8％和92.5％，而未修飾肝素為95.8％)、與轉(zhuǎn)P-選擇素基因的CHO細胞在層流下的結(jié)合(以對COLO320的作用為例，在5mg/mL濃度、層壁剪切力為0.3dyn/cm2時抑制率分別為77.4％、64％、64％和66％，未修飾肝素為79％)及與固定的血小板在層流下的結(jié)合(以對COLO320的作用為例，在5mg/mL濃度、層壁剪切力為0.3dyn/cm2時抑制率分別為92.3％、71.9％、56.3％和94.8％，未修飾肝素為96.8％)。
本發(fā)明解決了臨床上使用未修飾肝素帶來的潛在的出血危險，為臨床應用肝素預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供了新途徑。因為2，3-O去硫酸肝素具有制備工藝簡單、成本低等優(yōu)點，具有可觀的應用前景。
具體實施例方式
2，3-O去硫酸肝素的制備400mg肝素(Sigma-Aldrich Inc.，150U/mg，MW約為20,000)溶于100mL水中。加入NaOH使其終濃度達到0.5mol/L，pH為13.0。溶液被凍干。少量水溶解后，蒸餾水透析72h，HCl調(diào)pH值至7.0，溶液再次被凍干。
2，3-O去硫酸肝素的抗凝血分析采用aPTT(激活部分促凝血酶原激酶時間)測定法。各種肝素衍生物用檸檬酸化的人新鮮血漿配制成不同濃度，然后使用Lyophilizedsilica aPTT試劑盒，經(jīng)日本產(chǎn)ACL200凝聚儀測定。
體外抗腫瘤細胞粘附 用體外模擬毛細血管的層流實驗測定腫瘤細胞與固定的血小板(或CHO-P)的粘附作用。所有用于層流實驗的單細胞懸液密度均為1×106cells/mL。將覆蓋有血小板的玻片(或長滿CHO-P的35mm培養(yǎng)皿)裝配于平行板流動小室，然后放置在倒置顯微鏡的載物臺上。倒置顯微鏡連接有彩色視頻攝像裝置，可以將視頻圖像傳送到錄像機，并可用相連的計算機顯示器同步觀察。
首先用注射泵(Cole-Parmer Instrument Co.)注入PBS(0.1％BSA)沖洗平行板流動小室約2min，然后注入腫瘤細胞單細胞懸液。以適合的流速維持層壁剪切壓0.3dyn/cm2，模擬體外微循環(huán)和后毛細血管靜脈的流體機械環(huán)境。整個系統(tǒng)保持在22℃。當腫瘤細胞進入視野3min后，隨機選定10-20個區(qū)域(0.1266mm2)，記錄粘附于血小板(或CHO-P)的腫瘤細胞，最后通過觀看錄像帶人工計數(shù)。
2，3-0去硫酸肝素與未修飾肝素的抗凝血活性比較本實驗采用激活部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)測定法。2，3-O去硫酸肝素和未修飾肝素分別用檸檬酸化的健康人外周血的血漿配制成不同濃度，經(jīng)ACL200凝聚儀測定不同濃度的抗凝血時間(凝血時間以秒為單位，超過120秒不被統(tǒng)計)。結(jié)果表明，與未修飾肝素相比，2，3-O去硫酸肝素的抗凝血活性明顯降低，只相當于未修飾肝素的1/250(表1)。
表1.2/3-O去硫酸肝素和肝素的抗凝血活性aPTT(s) 2μg/ 4μg/ 6μg/ 8μg/0.1mg/mL 1.0mg/mL 5.0mg/mLmL mL mL mLControl 30.330.330.330.330.3 30.3 30.3Heparin 72.9＞120 - - ---2/3ODS-Heparin32.934.837.239.463.4 ＞120-
2，3-O去硫酸肝素對腫瘤細胞與CHO-P在層流狀態(tài)下結(jié)合的抑制用體外模擬毛細血管的層流實驗測定腫瘤細胞與固定的CHO-P的粘附作用。將長滿CHO-P的35mm培養(yǎng)皿裝配于平行板流動小室，然后放置在倒置顯微鏡的載物臺上(在與腫瘤細胞作用前，表達P-selectin的CHO-P細胞先與5.0mg/mL的2，3-O去硫酸肝素或未修飾肝素作用30分鐘)。用注射泵注入腫瘤細胞單細胞懸液(1×106cells/mL)，以適合的流速維持層壁剪切壓0.3dyn/cm2，整個系統(tǒng)保持在22℃，當腫瘤細胞進入視野3min后記錄粘附于CHO-P表面的腫瘤細胞，最后通過觀看錄像帶人工計數(shù)。結(jié)果顯示，2，3-O去硫酸肝素可以明顯地抑制腫瘤細胞與CHO-P在層流狀態(tài)下的結(jié)合。與陽性對照相比，其抑制效果分別達到64％(COLO320細胞)、57.5％(CW-2細胞)和72.7％(A375細胞)。2，3-O去硫酸肝素抑制腫瘤細胞(人結(jié)腸癌細胞COLO320和CW-2，人惡性黑素瘤細胞A375)與CHO-P在層流狀態(tài)下的結(jié)合。腫瘤細胞在0.3dyn/cm2壁層剪切壓條件下與靜止的CHO細胞的粘附設(shè)為(-)，與CHO-P細胞的粘附設(shè)為(+)。2，3-O去硫酸肝素和未修飾肝素的作用濃度為5.0mg/mL。數(shù)據(jù)來自3-6組獨立實驗的結(jié)果，每次實驗選擇10-20個視野進行統(tǒng)計，以平均值表示(±SD)，*p＜0.05，**p＜0.012，3-O去硫酸肝素對腫瘤細胞與血小板在層流狀態(tài)下結(jié)合的抑制用含5％自體血漿的PBS稀釋富含血小板的血漿沉淀物，以1×106cells/mL的密度將血小板鋪于直徑35mm的圓形蓋片上，室溫作用1h，0.1％BSA封閉10min，然后將覆蓋血小板蓋片裝配于平行板流動小室，放置在倒置顯微鏡的載物臺上(在與腫瘤細胞作用前，血小板先與5.0mg/mL的2，3-O去硫酸肝素或未修飾肝素作用30min)。用注射泵注入腫瘤細胞單細胞懸液(1×106cells/mL)，以適合的流速維持層壁剪切壓0.3dyn/cm2，整個系統(tǒng)保持在22℃，當腫瘤細胞進入視野3min后記錄粘附于CHO-P表面的腫瘤細胞，最后通過觀看錄像帶人工計數(shù)。結(jié)果顯示，2，3-O去硫酸肝素可以明顯地抑制腫瘤細胞與血小板在層流狀態(tài)下的結(jié)合。與陽性對照相比，其抑制效果分別達到92.3％(COLO320細胞)、56.3％(CW-2細胞)和94.8％(A375細胞)。即使在1.0mg/mL的較低濃度下，抑制率也可以分別達到88.8％(COLO320細胞)、47.3％(CW-2細胞)和89.4％(A375細胞)。2，3-O去硫酸肝素抑制腫瘤細胞(人結(jié)腸癌細胞COLO320和CW-2，人惡性黑素瘤細胞A375)與血小板在層流狀態(tài)下的結(jié)合。腫瘤細胞在0.3dyn/cm2壁層剪切壓條件下與未活化的血小板之間的粘附設(shè)為(-)，與活化的血小板之間的粘附設(shè)為(+)。2，3-O去硫酸肝素和未修飾肝素的作用濃度分別為5.0mg/mL、1.0mg/mL和0.1mg/mL。數(shù)據(jù)來自3-6組獨立實驗的結(jié)果，每次實驗選者10-20個視野進行統(tǒng)計，以平均值表示(±SD)，*p＜0.05，**p＜0.01。
權(quán)利要求
1.2，3-0去硫酸肝素在制備預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應用。
全文摘要
2，3－O去硫酸肝素在預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移中的應用。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是生物制品在預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移中的應用。本發(fā)明是將經(jīng)化學修飾獲得的非抗凝血的2，3－O去硫酸肝素用于抗腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，主要基于2，3－O去硫酸肝素抑制P－選擇素介導的腫瘤細胞與血小板的粘附的實驗結(jié)果。2，3－O去硫酸肝素具有肝素的完整結(jié)構(gòu)，抗腫瘤細胞粘附的活性與肝素相當，但只有極低的抗凝血活性。2，3－O去硫酸肝素用于預防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移，解決了臨床上使用肝素帶來的潛在的出血危險，同時2，3－O去硫酸肝素具有制備工藝簡單、成本低等優(yōu)點。
文檔編號A61K31/726GK1522708SQ0312713
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月5日
發(fā)明者曾憲錄, 魏民 申請人:東北師范大學