專利名稱：一種從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硫酸皮膚素的制備方法，尤其涉及一種從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮 膚素的方法。
背景技術(shù)：
硫酸皮膚素(dermatan sulfate,簡稱DS)，是一種天然的糖胺聚糖，由重復(fù)的二糖 單位組成，其二糖為乙酰氨基硫酸半乳糖和艾杜糖醛酸，主要為N-乙酰半乳糖胺4-硫酸和 L-艾杜糖醛構(gòu)成的雙糖鏈結(jié)構(gòu)。DS廣泛分布于動物組織中，具有抗血栓、抗水腫、促進(jìn)皮膚 更新、阻止皮膚的過度角質(zhì)化和棘皮癥、滋潤皮膚、保持水分的作用，近年來受到國內(nèi)外專 家的日益重視。長期以來，動物皮層是制備硫酸皮膚素的主要原料，也是商品硫酸皮膚素的主要 來源。早在 60 年代，Clifonelli J A 和 Roden L 等人(BiochemicalPrep 12，5-12，1968) 就曾利用豬皮為原料制備硫酸皮膚素，采用木瓜蛋白酶降解后利用不同濃度的氯化十六烷 基吡啶進(jìn)行結(jié)合與解析硫酸皮膚素粗品，將粗品溶于水，以氫氧化鈉和班式試劑沉淀，將沉 淀溶于乙酸中，用氫氧化鈉中和后透析，透析液通過強(qiáng)酸型陽離子樹脂脫銅，脫銅液以乙酸 調(diào)至pH4-5，最后以2倍乙醇沉淀出硫酸皮膚素。1996年，Voler(J Chromatogram B 685，27-34，1996)以牛肺為原料，以丙酮、三氯 甲烷、甲醇等處理，木瓜蛋白酶和膠原蛋白酶酶解，離子交換樹脂吸附、洗滌、洗脫，三氯乙 酸除蛋白，多次沉淀、離心，干燥得到精致的粘多糖，混合粘多糖溶液中又通過添加不同體 積的有機(jī)溶劑，如甲醇，乙醇和丙酮等，根據(jù)不同粘多糖的溶解性不同而將它們分離。2007年張虹等人(專利申請?zhí)?00710069959. 0)以鮫鰊魚皮為原料，通過胰酶 與木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶提取，向提取液中添加氫氧化鈉斷裂糖肽鍵，除糖肽鍵過程以 NaPH4保護(hù)糖苷鍵，以savage法除去蛋白質(zhì)，用乙醇沉淀出硫酸皮膚素。從動物組織中提取硫酸皮膚素以犧牲動物為代價，所得的硫酸皮膚素量比較少， 不能滿足市場的需求。另外，從動物組織中提取硫酸皮膚素的步驟比較繁瑣，不適用于工業(yè) 大規(guī)模生產(chǎn)。與此相反，在生產(chǎn)肝素的過程中產(chǎn)生的大量含有硫酸皮膚素的副產(chǎn)物，本發(fā)明提 供了一種從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，充分利用了肝素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn) 物，該方法工藝簡單、收率高、所得硫酸皮膚素純度可高達(dá)93%以上，適用于工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法。在生產(chǎn)肝素的過程中產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，其中主要組成是硫酸皮膚素、肝素、硫酸類 肝素。本發(fā)明中建立了一種新的分離純化工藝，將硫酸皮膚素分離出來并得到高純度的產(chǎn) 品。本發(fā)明包括下述順序步驟
(1)將肝素副產(chǎn)物溶解為2-10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的溶液，向其中加入醋酸鉀至 20-80%濃度，攪拌溶解，以醋酸調(diào)節(jié)pH至5-7，在2-8°C沉淀1_7天。離心收集上清得到清 除肝素后的硫酸多糖溶液。(2)向步驟所得⑴的硫酸多糖溶液中加入0.5-1.6倍體積的斑氏試劑和 0. 05-0. 2倍體積的飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀10-60分鐘，離心分離清液和沉淀。(3)向步驟(2)所得的沉淀中加入0. 5-1. 6倍體積的斑氏試劑，充分?jǐn)嚢枋谷芙猓?然后加入0. 05-0. 2倍體積的飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀10-60分鐘，離心取沉淀。(4)將步驟(3)得到的沉淀用純化水溶解，調(diào)節(jié)pH為中性，上一根陰離子交換性質(zhì) 的層析柱，以0. 1-0. 6M氯化鈉溶液洗去銅離子。然后以1-2. 5M氯化鈉溶液線形濃度梯度 洗脫，收集硫酸化糖胺聚糖濃度峰的幾管，合并溶液，65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，過濾，向 濾液中加1/4體積水，以乙醇沉淀，3000rpm離心30min，收集沉淀、烘干，得到高純度的硫酸 皮膚素。步驟⑴所述的肝素副產(chǎn)物溶液濃度優(yōu)選為5% _9%，進(jìn)一步優(yōu)選為8% ；步驟 (2)、(3)所述的沉淀?xiàng)l件選選為0. 6-1. 2倍體積的斑氏試劑和0. 08-0. 15倍體積的飽和氫 氧化鈉，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8倍體積的斑氏試劑和0. 1倍體積的飽和氫氧化鈉；步驟(4)所述 陰離子交換性質(zhì)的層析柱優(yōu)選為Q-S印haroseFF、DEAE-Sepharose FF ；步驟(4)所述從層 析柱洗去銅離子的氯化鈉溶液濃度優(yōu)選為0. 2-0. 4M，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 3M。本發(fā)明所述制備方法具有工藝簡單、成本低、容易放大、純化工藝收率高等特點(diǎn)， 產(chǎn)品純度高，制得的硫酸皮膚素用瓊脂糖電泳檢測未發(fā)現(xiàn)其它硫酸化氨基多糖條帶。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明所述內(nèi)容作進(jìn)一步闡述。實(shí)施例一將肝素副產(chǎn)物溶解為20%溶液，向其中加入醋酸鉀至20%濃度，攪拌溶解，以醋 酸調(diào)節(jié)PH至5，在2°C沉淀1天，離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向前述硫酸多糖溶液中加入0. 5倍體積斑氏試劑和0. 05倍體積飽和氫氧化鈉，攪 拌后室溫沉淀10分鐘，離心分離清液和沉淀。向沉淀中加入0. 5倍體積斑氏試劑，充分?jǐn)?拌使溶解，然后加入0. 05倍體積飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀10分鐘，離心取沉淀。將得到的沉淀用400ml純化水稀釋，調(diào)節(jié)pH為中性，上一根DEAE-S印harose FF 層析柱，以0. IM氯化鈉洗滌300ml，以1-2. 5M氯化鈉線形梯度洗脫400ml，收集硫酸化糖胺 聚糖濃度峰的幾管，合并溶液，65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，過濾，向?yàn)V液中加1/4體積水， 以2V新乙醇沉淀，3000rpm離心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮膚素經(jīng)過HPLC測定純 度為93. 9%，旋光性分析為-55、抗凝測定< 8USP/mg。實(shí)施例二將肝素副產(chǎn)物溶解為10%溶液，向其中加入醋酸鉀至80%濃度，攪拌溶解，以醋 酸調(diào)節(jié)PH至7，在2°C沉淀7天，離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向前述硫酸多糖溶液中加入1. 6倍斑氏試劑和0. 2倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫 沉淀60分鐘，離心分離清液和沉淀。向沉淀中加入1. 6倍斑氏試劑，充分?jǐn)嚢枋谷芙?，然?加入0. 2倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀60分鐘，離心取沉淀。
將得到的沉淀用400ml純化水稀釋，調(diào)節(jié)pH為中性，上一根DEAE-S印harose FF 層析柱，以0. 6M氯化鈉洗滌300ml，以1-2. 5M氯化鈉線形梯度洗脫400ml，收集硫酸化糖胺 聚糖濃度峰的幾管，合并溶液，65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，過濾，向?yàn)V液中加1/4體積水， 以2V新乙醇沉淀，3000rpm離心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮膚素經(jīng)過HPLC測定純 度為95. 2%，旋光性分析為-55、抗凝測定< 8USP/mg。實(shí)施例三將肝素副產(chǎn)物溶解為8%溶液，向其中加入醋酸鉀至60%濃度，攪拌溶解，以醋酸 調(diào)節(jié)PH至6. 5，在5°C沉淀5天，離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向前述硫酸多糖溶液中加入0. 8倍斑氏試劑和0. 1倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫 沉淀40分鐘，離心分離清液和沉淀。向沉淀中加入0. 8倍斑氏試劑，充分?jǐn)嚢枋谷芙?，然?加入0. 1倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀40分鐘，離心取沉淀。將得到的沉淀用400ml純化水稀釋，調(diào)節(jié)pH為中性，上一根DEAE-S印harose FF 柱，以0. 3M氯化鈉洗滌300ml，以1-2. 5M氯化鈉線形梯度洗脫400ml，收集硫酸化糖胺聚糖 濃度峰的幾管，合并溶液，65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，過濾，向?yàn)V液中加1/4體積水，以2V 新乙醇沉淀，3000rpm離心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮膚素經(jīng)過HPLC測定純度為 95. 5%，旋光性分析為-55、抗凝測定< 8USP/mg。實(shí)施例四將肝素副產(chǎn)物溶解為5%溶液，向其中加入醋酸鉀至50%濃度，攪拌溶解，以醋酸 調(diào)節(jié)PH至6，在4°C沉淀4天，離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向前述硫酸多糖溶液中加入0. 6倍斑氏試劑和0. 15倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫 沉淀20分鐘，離心分離清液和沉淀。向沉淀中加入0. 6倍斑氏試劑，充分?jǐn)嚢枋谷芙?，然?加入0. 15倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀40分鐘，離心取沉淀。將得到的沉淀用400ml純化水稀釋，調(diào)節(jié)pH為中性，上一根Q-S印haroseFF柱，以 0. 4M氯化鈉洗滌300ml，以1-2. 5M氯化鈉線形梯度洗脫400ml，收集硫酸化糖胺聚糖濃度峰 的幾管，合并溶液，65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，過濾，向?yàn)V液中加1/4體積水，以2V新乙醇 沉淀，3000rpm離心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮膚素經(jīng)過HPLC測定純度為94. 3%， 旋光性分析為-55、抗凝測定< 8USP/mg。實(shí)施例五將肝素副產(chǎn)物溶解為9%溶液，向其中加入醋酸鉀至30%濃度，攪拌溶解，以醋酸 調(diào)節(jié)PH至5. 5，在7°C沉淀4天，離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向前述硫酸多糖溶液中加入1.倍斑氏試劑和0. 08倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫 沉淀20分鐘，離心分離清液和沉淀。向沉淀中加入1. 1倍斑氏試劑，充分?jǐn)嚢枋谷芙?，然?加入0. 08倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀40分鐘，離心取沉淀。將得到的沉淀用400ml純化水稀釋，調(diào)節(jié)pH為中性，上一根Q-S印haroseFF柱，以 0. 2M氯化鈉洗滌300ml，以1-2. 5M氯化鈉線形梯度洗脫400ml，收集硫酸化糖胺聚糖濃度峰 的幾管，合并溶液，65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，過濾，向?yàn)V液中加1/4體積水，以2V新乙醇 沉淀，3000rpm離心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮膚素經(jīng)過HPLC測定純度為95. 6%， 旋光性分析為-55、抗凝測定< 8USP/mg。實(shí)施例六
將肝素副產(chǎn)物溶解為3%溶液，向其中加入醋酸鉀至30%濃度，攪拌溶解，以醋酸 調(diào)節(jié)PH至6，在7°C沉淀3天，離心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。向前述硫酸多糖溶液中加入1. 3倍斑氏試劑和0. 12倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫 沉淀50分鐘，離心分離清液和沉淀。向沉淀中加入1. 3倍斑氏試劑，充分?jǐn)嚢枋谷芙?，然?加入0. 12倍飽和氫氧化鈉，攪拌后室溫沉淀20分鐘，離心取沉淀。將得到的沉淀用400ml純化水稀釋，調(diào)節(jié)pH為中性，上一根Q-S印haroseFF柱，以 0. 5M氯化鈉洗滌300ml，以1-2. 5M氯化鈉線形梯度洗脫400ml，收集硫酸化糖胺聚糖濃度峰 的幾管，合并溶液，65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，過濾，向?yàn)V液中加1/4體積水，以2V新乙醇 沉淀，3000rpm離心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮膚素經(jīng)過HPLC測定純度為93. 5%， 旋光性分析為-55、抗凝測定< 8USP/mg。
權(quán)利要求
一種從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟a、肝素副產(chǎn)物溶解為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2-10％的溶液，加入醋酸鉀使溶液濃度為20-80％，以醋酸調(diào)節(jié)pH值為5-7，2-8℃沉淀1-7天，離心取清液；b、加入0.5-1.6倍體積的斑氏試劑、0.05-0.2倍體積的飽和氫氧化鈉，攪拌，室溫沉淀10-60分鐘，離心取沉淀；c、沉淀溶解，重復(fù)上一步驟；d、沉淀用純化水溶解，調(diào)節(jié)pH值為中性；f、上一根陰離子交換層析柱，以濃度為0.1-0.6M的氯化鈉洗去銅離子；g、以氯化鈉濃度為1-2.5M線性梯度洗脫，收集洗脫液，蒸發(fā)濃縮，過濾，向?yàn)V液中加1/4體積水，以乙醇沉淀，離心收集沉淀，烘干。
2.如權(quán)利要求1所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟a中 所述肝素副產(chǎn)物溶解濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% -9%的溶液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟a 中所述肝素副產(chǎn)物溶解濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟b中 所述斑氏試劑的量為0. 6-1. 2倍的體積，所述飽和氫氧化鈉的量為0. 08-0. 15倍的體積。
5.如權(quán)利要求1或4所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟b 中所述斑氏試劑的量為0. 8倍的體積，所述飽和氫氧化鈉的量為0. 1倍的體積。
6.如權(quán)利要求1所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟f中 所述陰離子交換層析柱為Q-S印harose FF、DEAE-S印haroseFF陰離子交換層析柱。
7.如權(quán)利要求1所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟f中 所述氯化鈉濃度為0. 2-0. 4M。
8.如權(quán)利要求1或6所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟f 中所述氯化鈉濃度為0. 3M。
9.如權(quán)利要求1所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟g中 所述離心為3000rpm離心30min。
10.如權(quán)利要求1所述的從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，其特征在于步驟g中 所述蒸發(fā)濃縮為65°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從肝素副產(chǎn)物純化硫酸皮膚素的方法，本發(fā)明以肝素副產(chǎn)物為原料，溶解后加入醋酸鉀，以醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值產(chǎn)生沉淀，清液為硫酸多糖溶液，向硫酸多糖溶液加入斑氏試劑、飽和氫氧化鈉溶液，離心收集沉淀，重沉淀，再將沉淀溶解，以陰離子交換性質(zhì)的層析柱、氯化鈉溶液洗去銅離子，再以氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集洗脫液，將洗脫液蒸發(fā)濃縮以乙醇沉淀得到高純度的硫酸皮膚素。本發(fā)明的純化工藝簡單、純化收率高、成本低、容易放大，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C08B37/00GK101885782SQ20091003936
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者李坦, 李鋰, 馬小來 申請人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司