專(zhuān)利名稱(chēng)：P-選擇素糖蛋白配體1的調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明乃是有關(guān)于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物與方法。
背景技術(shù)：
如何調(diào)節(jié)不需要的免疫應(yīng)答對(duì)治療如自身免疫性疾病、器官移植排斥、過(guò)敏疾病以及一些癌而言，至今仍是最關(guān)鍵性的課題之一。過(guò)度攻擊性的T細(xì)胞的活性可用抑制免疫或誘導(dǎo)免疫耐受的方法來(lái)加以控制。耐受是免疫系統(tǒng)對(duì)某一抗原不應(yīng)答的一種狀態(tài)，而免疫抑制是降低對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，因此通常需要持續(xù)性的給藥。在器官移植中，T細(xì)胞在對(duì)同種抗原的免疫應(yīng)答中扮演了不可或缺的角色?，F(xiàn)行免疫抑制的治療法通常包括采用皮質(zhì)類(lèi)固醇、環(huán)胞菌素A(cyclosporin)或雷帕霉素(rapamycin)，其可阻斷對(duì)T細(xì)胞而言是關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子的白介素-2(IL-2)的轉(zhuǎn)錄，或抑制白介素-2依賴(lài)型的細(xì)胞增生。但是有一些單克隆抗體，或?yàn)門(mén)細(xì)胞消減試劑(T cell-depletingagent)(如抗CD3、CD4、CD8的抗體)，或?yàn)榧?xì)胞因子信號(hào)傳遞的抑制物或T細(xì)胞共同刺激路徑的抑制物(如抗CD25、B7-1、B7-2、CD152、CTLA4的抗體)，這些單克隆抗體顯示對(duì)減少排斥作用的發(fā)生有效，而副作用及毒性不高。這些抗體藥物中有部分顯示對(duì)于治療自身免疫性疾病與延長(zhǎng)移植體存活具有某種程度的成效。
目前已經(jīng)廣泛公認(rèn)細(xì)胞凋亡對(duì)維持免疫系統(tǒng)正常功能極為重要，也是移除不必要細(xì)胞的主要機(jī)制(Kabelitz et al.Immunol.Today 14338-340(1993)；Raff，Nature 356397-399(1992))。不論是源自細(xì)胞內(nèi)部或外部的種種信號(hào)皆會(huì)影響細(xì)胞的生與死?？筎細(xì)胞表面分子的抗體如抗Fas(或稱(chēng)CD95，分子量43kD)、TNFR2(分子量75kD)、CD2(分子量45kD)及CTLA-4(分子量33kD)的抗體均會(huì)誘發(fā)T細(xì)胞凋亡(Osborne，Curr.Opin.Immunol.8245-248(1996)；Lin et al.J.Immunol.158598-603(1997)；Zhang et al.Nature377348-350(1995)；Lai et al.Eur.J.Immunol.253243-3248(1995)；Mollereau et al.J.Immunol.1563184-3190(1996)；Gribben et al.Proc.Natl.Acad，Sci.USA 92811-815(1995))。企圖利用Fas與TNFR2分子來(lái)控制不需要的T細(xì)胞時(shí)，會(huì)因?yàn)檫@兩種分子并不只在免疫細(xì)胞上表達(dá)，而在其他如肝臟等重要臟器的細(xì)胞表面也有表達(dá)而在應(yīng)用上受到妨礙，這種分子表達(dá)模式可能限制了這兩種抗體在治療上的運(yùn)用(Ogasawara et al.Nature 364806-809(1993)；Pfeffer et al.Cell73457-467(1993)；Engelmann et al.J.Biological Chemical26414497-14504(1990))。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)即T細(xì)胞表面抗原P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)可用來(lái)消減T細(xì)胞或誘發(fā)T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡。T細(xì)胞消減對(duì)治療過(guò)量或不需要的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或是與過(guò)量或不需要的T細(xì)胞增殖相關(guān)的病癥特別有用，例如T細(xì)胞的消減可降低或是除去不需要的T細(xì)胞活性或增殖，而該T細(xì)胞的活性或增殖與自身免疫疾病、器官移植排斥、過(guò)敏性疾病和/或T細(xì)胞癌(T cell-derived cancers)等相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明包含使用PSGL-1功能的調(diào)節(jié)劑以避免或減少經(jīng)由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，以及篩選PSGL-1功能的調(diào)節(jié)劑的方法。
一方面，本發(fā)明的特征為一種在個(gè)體中預(yù)防或降低由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括下列步驟選擇一個(gè)體，其被診斷出患有以過(guò)強(qiáng)或不需要的由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疾病，或有患該疾病的危險(xiǎn)，以及對(duì)該個(gè)體給藥能與T細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合的化合物，其中所述化合物與T細(xì)胞表面的PSGL-1的結(jié)合可誘發(fā)造成T細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，因而預(yù)防或降低該個(gè)體中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
用于本方法的化合物可以涵蓋與PSGL-1能特異性結(jié)合的抗體，或是抗體的抗原結(jié)合片段。于一例示中，此化合物為與PSGL-1能特異性結(jié)合的單克隆抗體。于一實(shí)施方案中，該方法包括給藥能與單克隆抗體結(jié)合的試劑(agent)及誘發(fā)T細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原交聯(lián)的步驟。于一實(shí)施方案中，該方法包括誘發(fā)T細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)，其中所述交聯(lián)會(huì)誘發(fā)信號(hào)傳遞過(guò)程而造成T細(xì)胞的死亡。
在一例示中，本方法包括選擇一被診斷出有自身免疫性疾病的個(gè)體；另一例示中，該方法包括選擇已接受或計(jì)劃接受同種異體或異種器官移植的個(gè)體；于另一例示中，本方法包括選擇一個(gè)診斷出有過(guò)敏病癥的個(gè)體；于另一例示中，本方法包括選擇一個(gè)診斷出有T細(xì)胞癌的個(gè)體的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞為活化的T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述T細(xì)胞是CD4+的T細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，所述T細(xì)胞是CD8+的T細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括檢測(cè)采集自給藥化合物之前的個(gè)體樣品(第一生物樣品)的T細(xì)胞數(shù)目，并將該數(shù)目與采集自給藥化合物后的個(gè)體樣品(第二生物樣品)的T細(xì)胞的數(shù)目相比較。
在另一實(shí)施方案中，本方法包括檢測(cè)采集自給藥化合物之前的個(gè)體樣品(第一生物樣品)的T細(xì)胞的生物活性，并將該生物活性與采集自給藥化合物后的個(gè)體樣品(第二生物樣品)的T細(xì)胞的生物活性相比較。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在個(gè)體給藥后造成外周血液中至少消減20％的CD3+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在個(gè)體給藥后造成外周血液中至少30％、40％、50％或更多的CD3+細(xì)胞的消減。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在接觸抗體或其抗原結(jié)合片段后，抗體或其抗原結(jié)合片段誘導(dǎo)了外周血液中至少20％的CD3+細(xì)胞死亡；在一些實(shí)施方案中，在個(gè)體給藥后會(huì)誘發(fā)外周血液中至少30％、40％、50％或更多的CD3+細(xì)胞的死亡。細(xì)胞死亡現(xiàn)象可于任何時(shí)候檢測(cè)，如在接觸抗體或其抗原結(jié)合片段后的一、二、三、四、五、六、七或更多天。
另一方面，本發(fā)明的特征為一種誘發(fā)T細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞死亡的方法。本方法包括以下步驟提供細(xì)胞表面表達(dá)PSGL-1的T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞，以及將能與T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合的化合物與T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞接觸，其中該化合物與T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞表面的PSGL-1的結(jié)合會(huì)誘發(fā)信號(hào)傳遞造成T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞的死亡。
在本方法中使用的化合物可包括對(duì)PSGL-1具特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施例中，所述化合物是對(duì)PSGL-1具特異性結(jié)合的單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使此單克隆抗體與結(jié)合該單克隆抗體的試劑接觸的步驟，誘導(dǎo)T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞表面的多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括誘導(dǎo)T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞表面的多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)的步驟，其中所述交聯(lián)誘導(dǎo)導(dǎo)致T細(xì)胞或NK細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞為活化的T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述T細(xì)胞是CD4+的T細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，所述T細(xì)胞是CD8+的T細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括評(píng)估在接觸化合物后T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞的存活力(Viability)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括評(píng)估在接觸化合物后T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞的生物活性。
另一方面，本發(fā)明的特征為篩選PSGL-1功能的調(diào)節(jié)劑的方法。本方法包括以下步驟提供在細(xì)胞表面表達(dá)PSGL-1的細(xì)胞；使細(xì)胞與測(cè)試物質(zhì)接觸；在細(xì)胞接觸測(cè)試物質(zhì)后檢測(cè)該細(xì)胞的存活力，從而確定該測(cè)試物質(zhì)是否可做為PSGL-1功能的調(diào)節(jié)劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括檢測(cè)由測(cè)試物質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而確定該測(cè)試物質(zhì)是否可做為PSGL-1功能的調(diào)節(jié)劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)試物質(zhì)是與PSGL-1特異結(jié)合的抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施例中，所述測(cè)試物質(zhì)是與PSGL-1特異結(jié)合的單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括使單克隆抗體與能與該單克隆抗體結(jié)合的試劑接觸，并誘導(dǎo)細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括誘導(dǎo)細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)的步驟，其中所述交聯(lián)可誘導(dǎo)造成細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞為活化的T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，所述T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括制備大量測(cè)試物質(zhì)及將測(cè)試物質(zhì)與可藥用載體進(jìn)行配制的步驟。
另一方面，本發(fā)明的特征是一種試劑盒，其包含結(jié)合于T細(xì)胞表面PSGL-1的化合物，其中該化合物與T細(xì)胞表面PSGL-1結(jié)合后會(huì)誘發(fā)造成T細(xì)胞死亡的信號(hào)傳遞過(guò)程；以及使用該化合物治療自身免疫、器官移植排斥、過(guò)敏病癥，或T細(xì)胞癌的使用說(shuō)明書(shū)。在另一實(shí)施方案中，該試劑盒包括治療本文所描述的各種疾病或病癥的使用說(shuō)明。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為其容許在不并發(fā)不希望有或損傷性免疫應(yīng)答的情況下消減T細(xì)胞數(shù)目或誘導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。譬如，向個(gè)體給藥抗PSGL-1的抗體不會(huì)造成炎性細(xì)胞因子如IL-2或TNF-α水平的不期望的升高。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是以細(xì)胞表面蛋白質(zhì)PSGL-1為標(biāo)靶，因其主要表達(dá)在白細(xì)胞，尤其是T細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞上，因此，本文所述的化合物不誘發(fā)其他細(xì)胞如肝細(xì)胞等的明顯水平的凋亡。在無(wú)明顯誘導(dǎo)威脅生命的全身性細(xì)胞因子應(yīng)答及在不傷害其他臟器系統(tǒng)的情況下，以T細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞(參與器官移植排斥的重要的CD3-細(xì)胞類(lèi)型)為標(biāo)靶的選擇性消減，是期望免疫抑制劑所具有的特征。
除非有其他的定義，在此使用的所有技術(shù)及科學(xué)名詞的意義，與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員所理解的定義相同。雖然相似或等同于在此所述的材料與方法的那些材料和方法也可用在本發(fā)明的實(shí)施和測(cè)試中，適合的材料與方法將述如下。所有的出版品、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利及其他在此提及的參考文獻(xiàn)完全納入?yún)⒖贾?。萬(wàn)一有專(zhuān)門(mén)用語(yǔ)上的抵觸，則以本說(shuō)明書(shū)為依歸。再者，所敘述的材料與方法僅為說(shuō)明例證，而并非用以限定本發(fā)明。
本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將明白表示于后述說(shuō)明細(xì)節(jié)與權(quán)利要求中。


圖1顯示當(dāng)活化的T細(xì)胞與TAB4(一種抗PSGL-1的單克隆抗體)反應(yīng)后所引起細(xì)胞凋亡信號(hào)的敏感性的時(shí)程實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖2顯示細(xì)胞表面生物素化結(jié)果和由TAB4抗體識(shí)別的抗原的免疫沉淀結(jié)果。
圖3顯示PSGL-1抗原在脾臟CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞及NK細(xì)胞上的表達(dá)情況。
圖4顯示PSGL-1抗原在CD4+、CD8+、CD4+8+及CD4-8-胸腺細(xì)胞上的表達(dá)情況。
圖5顯示在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中IL-2的產(chǎn)生量；該培養(yǎng)將分離自TAB4(或倉(cāng)鼠免疫球蛋白)處理過(guò)的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞用做應(yīng)答細(xì)胞，并以H2不相容的C3H脾細(xì)胞做為刺激細(xì)胞。
圖6顯示W(wǎng)estern印跡分析證明(A)經(jīng)TAB4抗體免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)可以用商購(gòu)的抗PSGL-1抗體加以識(shí)別(B)以抗PSGL-1抗體與T細(xì)胞裂解產(chǎn)物作前置處理可以去除被TAB4識(shí)別的蛋白質(zhì)。
圖7顯示C57BL/6小鼠接受了從Balb/c小鼠來(lái)的皮膚移植物，并經(jīng)抗PSGL-1抗體3(黑方塊)或?qū)φ战M抗體(空心方形)處理后，其體內(nèi)移植物存活百分比。
圖8顯示在活化的人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)抗人PSGL-1抗體處理后T細(xì)胞凋亡百分比的時(shí)程圖。
圖9顯示自體免疫的非肥胖型糖尿病(NOD)雄性小鼠經(jīng)抗PSGL-1的抗體(實(shí)心方形)或?qū)φ战M抗體(空心方塊)處理后糖尿病的發(fā)生率。
發(fā)明詳述本發(fā)明是一種藉由調(diào)節(jié)T細(xì)胞表面的PSGL-1分子的功能來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的方法。PSGL-1與在此所述的組合物結(jié)合后可造成T細(xì)胞數(shù)目消減或誘發(fā)T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡。這些組合物因此可作為控制免疫相關(guān)疾病，如自身免疫性疾病、器官移植排斥、過(guò)敏性疾病和/或T細(xì)胞癌的治療劑。該組合物對(duì)任何生物樣本(其中，T細(xì)胞的存在和活性是不希望的)中T細(xì)胞的消減也是有用的。
PSGL-1蛋白質(zhì)PSGL-1為一細(xì)胞表面粘附分子，其表達(dá)于嗜中性白細(xì)胞、T及B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞以及有CD34的原始的人造血前體細(xì)胞上。通過(guò)與選擇素(Selectins)結(jié)合的能力，PSGL-1會(huì)誘導(dǎo)白細(xì)胞滾動(dòng)到內(nèi)皮組織上及白細(xì)胞滲入炎癥組織中。PSGL-1介導(dǎo)的T細(xì)胞與E選擇素和P選擇素的結(jié)合，或遷移是受到不同調(diào)節(jié)的。例如，在T細(xì)胞由初始T細(xì)胞向記憶性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，T細(xì)胞上才被誘導(dǎo)出CLA(皮膚淋巴細(xì)胞抗原)表位。只有活化的1型T輔助細(xì)胞而非2型T輔助細(xì)胞才表達(dá)功能性的PSGL-1，并且有能力移行到皮膚炎癥區(qū)域。
PSGL-1為一唾液酸化粘蛋白(Sialomucin)，必須加以特別的唾液酸化、海藻糖基化、硫酸化才能與P-選擇素結(jié)合。PSGL-1分子因在其N(xiāo)末端存在不同程度的糖基化和硫酸化位點(diǎn)而有多個(gè)同工型(isoform)。靜止的外周血T細(xì)胞和B細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系及在體外活化的外周血T細(xì)胞，有相近水平的PSGL-1表達(dá)量。然而，只有活化的T細(xì)胞才會(huì)表達(dá)出功能性型態(tài)的PSGL-1，并與P-選擇素產(chǎn)生高親和性的結(jié)合。這種活化依存性的結(jié)合活性看來(lái)是不同的翻譯后修飾作用所造成的結(jié)果，在活化的T細(xì)胞中α(1，3)海藻糖基化轉(zhuǎn)移酶活性水平升高也提示了這一推斷。PSGL-1同工型對(duì)L-選擇素和E-選擇素也顯示不同的親和性，例如，CLA陽(yáng)性同工型的人類(lèi)T細(xì)胞既可以在E-選擇素上又能在P-選擇素上粘附和滾動(dòng)，僅表達(dá)PSGL-1而無(wú)CLA表位的T細(xì)胞就只能與P-選擇素結(jié)合。再者，PSGL-1與P-選擇素的結(jié)合取決于其N(xiāo)末端十個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，該末端十個(gè)氨基酸的肽包括三個(gè)用于硫酸化的酪氨酸殘基，及一個(gè)用于糖基化的蘇氨酸殘基。
PSGL-1蛋白質(zhì)可以藉由DNA重組方法和/或經(jīng)由生物材料中分離出天然PSGL-1來(lái)制備。重組的PSGL-1蛋白質(zhì)可在原核或真核細(xì)胞中，體內(nèi)或體外制備，編碼PSGL-1的核酸可用于該蛋白的重組制備(參考，例如GenBank Accession NM 003006中編碼PSGL-1多肽的核酸實(shí)例)；抗PSGL-1的抗體也可用來(lái)做PSGL-1抗原的純化(Herron at al.(2000)Science Jun 2；288(5471)1653-56；WO 00/25808)和/或用于本文所述的方法。對(duì)PSGL-1的進(jìn)一步研究描述在如下文獻(xiàn)中，但不限于這些文獻(xiàn)Sako et al.(1993)Cell751179，Vechino et al.(1995)J.Biol.Chem.27021966和Veldman et al.(1995)J.Biol.Chem.27016470。
對(duì)PSGL-1的重組制備而言，同時(shí)表達(dá)PSGL-1及負(fù)責(zé)其糖基化修飾的α(1，3)海藻糖基化轉(zhuǎn)移酶Fuc-TVII，對(duì)PSGL-1的功能表現(xiàn)都可能是需要的，另外/或者，在制備重組PSGL-1時(shí)，同時(shí)用編碼JPACE的核酸進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，以除去前肽和/或編碼酪氨酸磺基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
抗PSGL-1的抗體可用來(lái)分離及純化來(lái)自生物材料中的PSGL-1抗原，任何表達(dá)PSGL-1蛋白的細(xì)胞如來(lái)源于個(gè)體的T細(xì)胞或T細(xì)胞系，均可作為純化該蛋白質(zhì)的供應(yīng)源。一經(jīng)純化，PSGL-1蛋白可以用在本文所述的各種方法中。例如，純化的PSGL-1蛋白可用于T細(xì)胞上PSGL-1功能的調(diào)節(jié)劑的篩選，或做為免疫原以制備抗PSGL-1蛋白的抗體。
另外，也可以利用選擇素-Fc融合蛋白(如p-選擇素-Fc融合蛋白)進(jìn)行PSGL-1抗原的純化。
抗PSGL-1抗體PSGL-1多肽(或其免疫原性片段或類(lèi)似物)在本發(fā)明的方法中可以用來(lái)產(chǎn)生抗體。如上所述，PSGL-1多肽或其肽片段的生產(chǎn)可以用重組技術(shù)或固相合成的方法來(lái)合成。重組的PSGL-1多肽或其肽片段可當(dāng)成免疫原來(lái)制備抗PSGL-1的抗體。另外，抗PSGL-1抗體，如TAB4單克隆抗體，則可用來(lái)純化PSGL-1多肽，例如，天然構(gòu)象的PSGL-1多肽，繼而再將該多肽用作免疫原來(lái)制備額外的抗PSGL-1抗體。
本發(fā)明的抗體可以是特異性結(jié)合PSGL-1多肽的單克隆抗體，多克隆抗體或基因工程抗體?！疤禺愋越Y(jié)合”特定抗原，如PSGL-1多肽的抗體基本不識(shí)別或結(jié)合樣本中的其它分子。因此，本發(fā)明的特征也表現(xiàn)在用如下方法來(lái)鑒定與本發(fā)明多肽結(jié)合的測(cè)試化合物(例如，抗體)，所述方法是將所述多肽與測(cè)試化合物接觸，然后確定所述多肽是否與測(cè)試化合物相結(jié)合(例如，通過(guò)直接檢測(cè)結(jié)合，直接檢測(cè)干擾測(cè)試化合物與所述多肽結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)化合物和/或用檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)活性的檢測(cè)法直接檢測(cè)結(jié)合來(lái)確定)。
一般而言，PSGL-1多肽可與載體蛋白如KHL進(jìn)行連結(jié)，并混合佐劑后注射到哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)。該動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可藉由肽抗原親和層析加以純化。
具體地，有多種動(dòng)物宿主可注射PSGL-1多肽或其抗原片段進(jìn)行免疫。所述動(dòng)物宿主通常包括兔、小鼠、豚鼠及大鼠。依宿主種類(lèi)不同會(huì)采用不同的佐劑以增加免疫應(yīng)答。所述佐劑包括弗氏佐劑(完全及不完全)、礦物膠(如氫氧化鋁)、表面活性劑(如溶血卵磷脂(lysolecithin))、多聚醇(pluronicpolyols)、聚陰離子、肽、油性乳劑、匙孔血藍(lán)蛋白及二硝基酚等?？赡軕?yīng)用在人類(lèi)的佐劑有BCG(卡介苗bacilli Calmette-Guerin)及小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。經(jīng)由上述免疫過(guò)程產(chǎn)生的多克隆抗體是抗體分子的異質(zhì)群(heterogeneous populations)，可以從免疫過(guò)的動(dòng)物血清中獲得。
因此，本發(fā)明中的抗體包括多克隆抗體，另外尚有單克隆抗體、人源化(humanized)抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、以及使用Fab表達(dá)文文庫(kù)產(chǎn)生的分子。
單克隆抗體是針對(duì)特定抗原的抗體的均質(zhì)群(homogeneouspopulations)，可采用上述PSGL-1多肽及標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)而制備(參照，例如Kohler et al.，Nature 256495(1975)；Kohler et al.，Eur J Immunol 6511(1976)；Kohler et al.，Eur.J Immunol 6292(1976)；Hammerling et al.，Monoclonal Antibodies and T cell Hybridomas，Elseveir，N.Y.(1981))。
具體地，單克隆抗體可以由如下技術(shù)來(lái)獲得用連續(xù)傳代的培養(yǎng)的細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)(如Kohler et al.，Nature 256495(1975)和美國(guó)專(zhuān)利4,376,110所述)，人類(lèi)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosber et al.，ImmunologyToday 472(1983)；Cole et al.，Proc Natl Acad Sci USA 802026(1983))以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96(1983))。所述抗體可以是任何種類(lèi)的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及它們的任何亞類(lèi)。本發(fā)明產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。在體內(nèi)制備高滴度單克隆抗體的能力使得雜交瘤技術(shù)成為生產(chǎn)單克隆抗體特別有用的方法。
一旦產(chǎn)生，可采用標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡或免疫沉淀分析法(例如，如Ausubel等(同上)所述的方法)來(lái)測(cè)試多克隆或單克隆抗體對(duì)PSGL-1特異性的識(shí)別。能特異性識(shí)別和結(jié)合PSGL-1的抗體可用于本發(fā)明。那些可結(jié)合T細(xì)胞(例如CD3+細(xì)胞)表面PSGL-1抗原并能誘導(dǎo)T細(xì)胞消減和/或凋亡的抗PSGL-1抗體尤其有用。
上述抗體可以例如用作治療方案的一部分(例如，所述治療方案用來(lái)降低或消除不期望的免疫應(yīng)答，諸如與自身免疫性疾病，移植排斥，過(guò)敏性疾病和T細(xì)胞癌等疾病有關(guān)的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。這些抗體也可以應(yīng)用于篩選具結(jié)合PSGL-1能力的候選化合物。
再者，制備“嵌合抗體”的技術(shù)已廣為使用(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851(1984)；Neuberger et al.，Nature 312604(1984)；Takadaet al.，Nature 314452(1984))，所述技術(shù)是將具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有適當(dāng)生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起。所述嵌合抗體的分子中，不同的部分來(lái)源于不同的動(dòng)物種類(lèi)，例如一些嵌合抗體具有來(lái)源于小鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
另外還有制備單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4946778及4704692)，可適用于制備抗PSGL-1多肽的抗體或其片段。單鏈抗體藉由氨基酸橋來(lái)結(jié)合重鏈與輕鏈的Fv區(qū)片段，形成單鏈多肽。
能夠識(shí)別并結(jié)合特異性表位的抗體片段可經(jīng)由已知的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。例如所述片段包括但不限于由木瓜蛋白酶分解抗體分子而產(chǎn)生的F(ab′)2片段，和還原F(ab′)2片段間的二硫鍵而生成的Fab片段?；蛘?，可以建構(gòu)Fab表達(dá)文文庫(kù)(Huse et al.，Science 2461275(1989))，以快速及容易地鑒定具有所需特異性的Fab片段。
目前已有本領(lǐng)域已知的方法將抗體加以人源化。例如，具有所需的特異性的單克隆抗體可通過(guò)商業(yè)途徑進(jìn)行人源化(Scotgene，Scotland；OxfordMolecular，Palo Alto，Calif)。而完全人類(lèi)化的抗體，如在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)的人類(lèi)抗體也是本發(fā)明的特點(diǎn)之一(Green et al.，Nature Genetics 713(1994)；和U.S.Pat.No.5,545,806和5,569,825)。
篩選具調(diào)節(jié)PSGL-1功能的化合物的方法本發(fā)明也包含鑒定能與PSGL-1(或PSGL-1的某區(qū)域)相互作用的化合物的方法，所述化合物包括但不限于與PSGL-1結(jié)合時(shí)能誘發(fā)T細(xì)胞消減和/或T細(xì)胞凋亡的化合物。所述化合物還包括調(diào)節(jié)PSGL-1與調(diào)節(jié)PSGL-1活性的跨膜蛋白，胞外蛋白或胞內(nèi)蛋白之間相互作用的化合物，以及調(diào)節(jié)PSGL-1活性的化合物。
依照本發(fā)明篩選的化合物包括但不限于肽，抗體及其片段，以及結(jié)合PSGL-1并調(diào)節(jié)PSGL-1介導(dǎo)的生物功能的其它有機(jī)化合物(如本文所述)。
這些化合物也包括但不限于肽，如可溶性肽，包括但不限于隨機(jī)肽文庫(kù)的成員(Lam et al.，Nature 35482 ；Houghten et al.，Nature35484 )，由D和/或L構(gòu)型氨基酸，磷肽(phosphopeptides)制成的組合的化學(xué)衍生的分子文庫(kù)成員(包括，但不限于，隨機(jī)或部分簡(jiǎn)并的，定向磷肽文庫(kù)(directed phosphopeptide libraries)的成員；Songyang et al.，Cell72767 )，抗體(包括，但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，人源化抗體，抗獨(dú)特型抗體，嵌合抗體或單鏈抗體，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab′)2和Fab表達(dá)文庫(kù)片段以及其表位結(jié)合片段)以及小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。
可依照本發(fā)明篩選的其它化合物包括，但不限于影響PSGL-1蛋白活性的小有機(jī)分子(如本文所述)。
可以藉助于電腦模擬和搜尋技術(shù)，提供化合物的鑒定或?qū)σ阎衔锏母纳?，所述化合物能調(diào)節(jié)PSGL-1的表達(dá)或活性。一旦確認(rèn)出這樣的化合物或組合物，其活性位點(diǎn)或區(qū)域即可分析得知。通常，這些活性位點(diǎn)可能是天然活性調(diào)節(jié)劑的結(jié)合位點(diǎn)。這些活性位點(diǎn)可以由本領(lǐng)域已知的技術(shù)加以確認(rèn)，包括從肽的氨基酸序列、核酸的核苷酸序列、或從相關(guān)化合物或組合物與其天然配體的復(fù)合物的研究得知。在后一種情況下，利用化學(xué)或X線晶體學(xué)方法，可通過(guò)尋找到調(diào)節(jié)劑(或配體)結(jié)合的位置來(lái)找到活性位點(diǎn)。
雖然可以如上所述對(duì)能改變結(jié)合的化合物進(jìn)行設(shè)計(jì)和制備，人們也可以篩選已知的化合物文庫(kù)，包括天然產(chǎn)物文庫(kù)，合成的化合物文庫(kù)以及生物活性材料(包括蛋白)文庫(kù)，從中篩選出能結(jié)合PSGL-1蛋白并能導(dǎo)致T細(xì)胞消減和/或誘發(fā)T細(xì)胞凋亡的化合物。
在體外，可設(shè)計(jì)一些系統(tǒng)來(lái)鑒定能與PSGL-1(或PSGL-1某區(qū)域)相互作用的化合物。所鑒定的化合物可以用來(lái)例如調(diào)節(jié)本文所述的T細(xì)胞活性，從而用于治療如自身免疫性疾病，移植排斥，過(guò)敏性疾病以及T細(xì)胞癌等疾病。
用來(lái)鑒定與PSGL-1結(jié)合的化合物的試驗(yàn)的要素包括，在一定條件下制備PSGL-1(或其某區(qū)域)的反應(yīng)混合物和測(cè)試化合物，然后在充足時(shí)間下使這兩種化合物相互作用并結(jié)合，從而形成可從反應(yīng)混合物中除去和/或檢測(cè)到的復(fù)合物。所采用的PSGL-1種類(lèi)可基于篩選目的不同而改變。在一些情況下，優(yōu)選對(duì)應(yīng)于PSGL-1區(qū)域的肽與賦予檢測(cè)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)(例如，標(biāo)記、分離產(chǎn)生的復(fù)合物等)的異源蛋白或多肽融合。
篩選分析可以多種方式進(jìn)行。例如一實(shí)現(xiàn)此分析的方法涉及將固定PSGL-1蛋白、多肽、肽、融合蛋白質(zhì)或測(cè)試物質(zhì)錨定到一固相上，并檢測(cè)在反應(yīng)終了時(shí)附著于固相的PSGL-1與測(cè)試物形成的復(fù)合體。在本方法的實(shí)施方案中，PSGL-1反應(yīng)物可被錨定于固體表面，而并未固定的測(cè)試化合物可能被直接或間接地標(biāo)記。
在實(shí)施時(shí)，微量滴定板可以便利地用作固相。錨定的化合物可用非共價(jià)或共價(jià)附著方式加以固定。非共價(jià)附著可能由簡(jiǎn)單地在固體表面覆蓋蛋白質(zhì)溶液并風(fēng)干來(lái)完成；或者，也可以先將蛋白特異性的抗體，優(yōu)選單克隆抗體加以固定，繼而利用所固定的抗體將所述蛋白錨定于固體表面。此覆蓋蛋白質(zhì)的固相可事先制備并儲(chǔ)存。
為了完成此分析，加入非固定成分至含有錨定成分的被覆蓋的表面。當(dāng)反應(yīng)完成后，藉由例如洗滌方式去除未反應(yīng)成分，以使所形成的任何復(fù)合物仍然固定于所述固相表面。檢測(cè)固定在固相表面的復(fù)合物可用許多方法來(lái)完成，其中可以將預(yù)先未固定的成分預(yù)先標(biāo)記，然后檢測(cè)固定于表面的標(biāo)記即代表復(fù)合物已形成。另外也可使用沒(méi)有預(yù)先標(biāo)記的未固定成分，然后再利用間接標(biāo)記來(lái)檢測(cè)固定于表面的復(fù)合物，如采用對(duì)預(yù)先未固定成分具特異性的標(biāo)記抗體等。
或者，反應(yīng)可在液相中進(jìn)行，再將反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的成分分離開(kāi)，并檢測(cè)產(chǎn)生的復(fù)合體，如使用固定的PSGL-1蛋白、多肽、肽、融合蛋白或檢測(cè)化合物特異性的抗體，來(lái)錨定在溶液中形成的任何復(fù)合物，然后用對(duì)上述可能復(fù)合物的其它成分特異的標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)錨定復(fù)合物的存在。
另外，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析方法也可以用來(lái)鑒定能與PSGL-1反應(yīng)的化合物。例如使用表達(dá)PSGL-1的細(xì)胞系，或經(jīng)由基因工程方法使其表達(dá)PSGL-1的細(xì)胞系。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析方法在鑒定化合物功能效用上特別有其價(jià)值，例如一旦鑒定出某化合物具有PSGL-1蛋白的結(jié)合能力后，該化合物便可在體外或體內(nèi)檢測(cè)是否具有誘發(fā)T細(xì)胞凋亡或?qū)е耇細(xì)胞消減的能力。
藥物組合物本發(fā)明的目的是改變個(gè)體中的免疫應(yīng)答，而包括例如，抗體、小分子、或其他可特異性結(jié)合PSGL-1多肽的化合物的藥物組合物也是本發(fā)明的一個(gè)特征。在一優(yōu)選實(shí)施例中，該化合物可用作PSGL-1的激動(dòng)劑(Agonist)。
使用于本發(fā)明的藥物組合物可以是傳統(tǒng)方法的配方，采用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑。因此該化合物及其生理上可接受的鹽類(lèi)和溶劑化物可根據(jù)多種不同的給藥路徑而進(jìn)行配制。
化合物可配制成胃腸道外注射給藥的制劑，例如快速大量(bolus)注射或連續(xù)輸液的制劑。注射用制劑可以用單位劑量方式來(lái)取用，例如保存在安瓶中或在多劑容器中，并加入防腐劑。該組合物可制備成懸浮液、溶液、或在油性或水性載體中的乳液的形式，并可包含如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑等配藥試劑。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用適當(dāng)?shù)妮d體如滅菌的無(wú)熱原的水來(lái)配制。
控制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及消減T細(xì)胞群的方法經(jīng)本文詳細(xì)篩檢分析后所獲得的那些化合物，可用來(lái)例如調(diào)節(jié)經(jīng)由PSGL-1多肽所介導(dǎo)的生物功能和/或治療與過(guò)強(qiáng)或不需要的細(xì)胞應(yīng)答，例如T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)的疾病。這些化合物包括但不限于肽、抗體及其片段、以及其他有機(jī)化合物，它們結(jié)合于T細(xì)胞表面的PSGL-1并誘發(fā)信號(hào)傳遞路徑造成T細(xì)胞的死亡。本發(fā)明方法任選包括加入誘導(dǎo)細(xì)胞表面PSGL-1交聯(lián)的交聯(lián)劑。本發(fā)明所述的化合物可用于任何期望消減或除去T細(xì)胞活性的情況，特別應(yīng)用于治療包括自身免疫性疾病、器官移植排斥、過(guò)敏性疾病及T細(xì)胞癌。
此處所述的抗PSGL-1的化合物可治療的疾病實(shí)例包括但不限于糖尿病、關(guān)節(jié)炎(包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎及牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)、多發(fā)性硬化癥、腦脊髓炎、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、自體免疫性甲狀腺炎、皮炎(包括特應(yīng)性皮炎、濕疹性皮炎)、牛皮癬、斯耶格倫氏綜合征(sjogen′s syndrome)、克羅恩氏病(crohn′s disease)、鵝口瘡性潰瘍、虹膜炎、結(jié)膜炎、角膜結(jié)膜炎、I型糖尿病、炎癥性腸管疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘、過(guò)敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡(cutaneous lupus erythematosus)、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥疹、麻風(fēng)回變反應(yīng)(leprosy reversal reaction)、紅斑性麻風(fēng)節(jié)結(jié)(erythema nodosum leprosum)、自體免疫性葡萄膜炎、過(guò)敏性腦脊髓炎、急性壞死出血性腦病、自發(fā)性進(jìn)行性雙側(cè)感覺(jué)神經(jīng)聽(tīng)覺(jué)喪失(idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss)、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞性貧血、自發(fā)性血小板減少癥、多發(fā)性軟骨炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener′s granulomatosis)、慢性活動(dòng)性肝炎、史提夫-強(qiáng)生氏綜合征(Stevens-Johnson syndrome)、自發(fā)性熱帶口瘡、扁平苔癬，奎夫氏病(Graves′disease)、類(lèi)肉瘤病、原發(fā)性膽管硬化、眼后房葡萄膜炎、間質(zhì)性肺臟纖維化、移植物抗宿主疾病、移植病例(包括使用異源或異種組織的移植)如骨髓移植、肝臟移植、或任何器官組織的移植、過(guò)敏性疾病如特應(yīng)性過(guò)敏(atopicallergy)、愛(ài)滋病及T細(xì)胞腫瘤如白血病和/或淋巴瘤。
本發(fā)明方法可用于不論是體外或體內(nèi)于細(xì)胞群里消減T細(xì)胞。例如來(lái)自于個(gè)體的生物樣本可藉由在體外與本發(fā)明所述的抗PSGL-1的化合物混合，并任選加入交聯(lián)試劑來(lái)消減T細(xì)胞。本方法可應(yīng)用于如在細(xì)胞群中提升非T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目，以及減少或除去細(xì)胞群中T細(xì)胞的活性。
以下為本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的范圍并不僅限于下述實(shí)施例中。
實(shí)施例實(shí)施例1抗T細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白(“TAIP”)單克隆抗體的制備生產(chǎn)TAIP特異性的單克隆抗體的方法是采用Kohler與Milstein的人們熟知的細(xì)胞融合方法(European Journal of Immunology(1976)6511-519)以制備分泌所需抗體的雜交瘤。將刀豆蛋白A(Con A)活化后的Balb/c小鼠脾臟T細(xì)胞注射給倉(cāng)鼠后，取得其抗體生成細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞系融合，形成分泌抗體的雜交瘤。兩種細(xì)胞群是用聚乙二醇融合的，并克隆出所產(chǎn)生的抗體生成細(xì)胞，再以標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)方法進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)這些方法生產(chǎn)的雜交瘤分泌單克隆抗體，命名為T(mén)AB4，此單克隆抗體可在體外誘發(fā)T細(xì)胞凋亡，及在體內(nèi)導(dǎo)致T細(xì)胞消減。而由TAB4識(shí)別的蛋白質(zhì)命名為T(mén)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白(T cell apoptosis inducing protein，TAIP)。
C57BL/6J(B6)和BALB/c小鼠購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)。敘利亞倉(cāng)鼠購(gòu)自國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。
TAB4雜交瘤的濃縮的培養(yǎng)上清液以20000×g離心10分鐘，所得上清以1∶1的比例用結(jié)合緩沖液(0.1M醋酸鈉，pH5.0)進(jìn)行稀釋。將蛋白質(zhì)G柱(柱床體積約1ml)以3-5ml結(jié)合緩沖液洗三次。將澄清的培養(yǎng)上清液上樣至蛋白質(zhì)G柱，且將流出的上清液再上樣至柱中。以6-10ml結(jié)合緩沖液洗柱，并用5ml洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸-鹽酸，pH2.8)從所述柱中洗脫出結(jié)合的抗體。每一級(jí)分包含1ml洗脫的抗體，通過(guò)使每個(gè)1ml的級(jí)分與50μl 1MTris-HCl，pH7.5混合，將洗脫的級(jí)分調(diào)整至中性pH值。匯集包含抗體的級(jí)分，并在2升PBS(pH7.4)中透析三次，每次透析三小時(shí)。之后的抗體樣品用Bradford所述的方法用Bio-Rad Protein Assay(BIO-RAD，Hercules，CA)檢測(cè)其蛋白濃度。
實(shí)施例2小鼠脾細(xì)胞懸浮液的制備及T細(xì)胞的活化與富集小鼠脾臟浸漬于8ml的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中，用滅菌蓋玻片小心磨碎，細(xì)胞液移入15ml的離心管(Coaster)，以200×g離心5分鐘，倒掉上清液，細(xì)胞沉淀層藉由輕拍管壁使之重新懸浮于剩余的緩沖溶液中。加入1ml紅細(xì)胞裂解緩沖液(0.6M NH4Cl，0.17M Tris堿，pH7.65)，置于室溫孵育2分鐘以裂解混入的紅細(xì)胞，再加入9ml HBSS快速終止反應(yīng)。以200×g離心5分鐘后倒掉上清液，所得的細(xì)胞沉淀層以HBSS洗兩次后懸浮于RPMI培養(yǎng)液中。用血球計(jì)數(shù)器(Cambridge Scientific Inc.)及臺(tái)盼藍(lán)排除法來(lái)檢測(cè)上述混合物中細(xì)胞的濃度及存活率。
將上述脾細(xì)胞用RPMI培養(yǎng)液調(diào)整至終濃度3×106/ml，并加入終濃度為2μg/ml的刀豆蛋白A來(lái)活化T細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液移至6孔培養(yǎng)板(每孔5ml)或10cm的培養(yǎng)皿中(每一培養(yǎng)皿10ml)，在37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)，然后收獲培養(yǎng)物。這樣活化的脾細(xì)胞(包括活化的T細(xì)胞)，重新懸浮于5ml的HBSS中，并小心覆蓋到離心管中5ml 55％的Percoll溶液層上，此時(shí)小心勿破壞已分開(kāi)的溶液層。在25℃以1900×g離心細(xì)胞13分鐘且不使用煞車(chē)減速。從兩層間的交界面收集富集的T細(xì)胞，并用HBSS洗二次后即可用于實(shí)驗(yàn)中。
實(shí)施例3活化T細(xì)胞的凋亡被活化的T細(xì)胞(見(jiàn)實(shí)施例2)以含有5ng/mlIL-2的PRMI培養(yǎng)液稀釋到終濃度5×105個(gè)細(xì)胞/ml，并依據(jù)表1的處理?xiàng)l件用對(duì)照Ig、TAB4或抗CD3抗體進(jìn)行處理。
表1

在培養(yǎng)18-24小時(shí)后，使用7-AAD細(xì)胞凋亡分析來(lái)檢測(cè)每一培養(yǎng)液中的細(xì)胞凋亡程度。處理過(guò)的細(xì)胞移至流式細(xì)胞儀(FACS)分析管(Falcon)，用冰冷的FACS溶液(PBS中含1％胎牛血清，0.05％疊氮鈉)洗兩次，在4℃，200×g離心得到細(xì)胞沉淀層。細(xì)胞重新懸浮于冰冷的FACS溶液至終濃度1-2×107個(gè)細(xì)胞/ml。此時(shí)使0.1ml細(xì)胞懸浮液與7-AAD混合，至7-AAD的終濃度為2μg/ml，然后于4℃避光培養(yǎng)20分鐘進(jìn)行染色。染色后的細(xì)胞以冰冷的FACS溶液洗二次，再懸浮于0.5ml的FACS溶液中，并以BD LSR流式細(xì)胞儀(Becton Dickison)進(jìn)行分析。
圖1顯示代表性的時(shí)程實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)研究活化的T細(xì)胞對(duì)TAB4(抗TAIP)介導(dǎo)的凋亡信號(hào)獲得敏感性的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)方法為小鼠脾細(xì)胞以Con-A活化并維持在含有IL-2的培養(yǎng)液中。收獲并懸浮活化的T細(xì)胞，然后用TAB4單克隆抗體或?qū)φ諅}(cāng)鼠Ig進(jìn)行攻擊，并以抗倉(cāng)鼠IgG抗體做為交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)。于第一天即觀察到TAIP交聯(lián)具有誘發(fā)低水平(6.5％)凋亡細(xì)胞死亡的能力，但是TAB4誘發(fā)細(xì)胞凋亡的程度在第2天增加至17％，第4天至52％的高峰，而在第6天下降至44％。而與僅用IL-2的培養(yǎng)物比較，對(duì)照倉(cāng)鼠IgG不誘發(fā)特異的凋亡T細(xì)胞的死亡?？笴D3抗體(做為陽(yáng)性對(duì)照)在活化48小時(shí)后，可以誘發(fā)38％的T細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例4在不同組織中TAIP抗原的表達(dá)細(xì)胞用冰冷的FACS溶液(PBS中含1％胎牛血清，0.05％疊氮鈉)洗兩次，裝入FACS分析管(Falcon)中于4℃200×g離心，細(xì)胞重新懸浮于冰冷的FACS溶液至細(xì)胞終濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/ml，并分成0.1ml的等份，裝入FACS分析管(Falcon)中以備每次分析之用。此時(shí)加入TAB4單克隆抗體或?qū)φ諅}(cāng)鼠Ig(終濃度2μg/ml)至細(xì)胞中，在蔽光及4℃條件下孵育30分鐘進(jìn)行表面染色。細(xì)胞以冰冷的FACS溶液洗一次后再進(jìn)行后續(xù)的染色(1)向脾細(xì)胞加入含有細(xì)胞色素(cychrome)偶聯(lián)的抗CD3抗體(2μg/ml)、FITC偶聯(lián)的抗倉(cāng)鼠Ig及PE偶聯(lián)的抗CD8/CD4/CD19/CD11b/泛(pan)-NK/I-A/I-E/Mac-3抗體(2μg/ml)的100μl冰冷的FACS溶液；(2)向胸腺細(xì)胞加入含有FITC偶聯(lián)的抗倉(cāng)鼠Ig、PE偶聯(lián)的抗CD8抗體及細(xì)胞色素偶聯(lián)的抗CD4抗體(2μg/ml)的100μl冰冷的FACS溶液。在蔽光及4℃條件下反應(yīng)30分鐘。染色后的細(xì)胞以冰冷的FACS溶液洗兩次，重新懸浮于1毫升的FACS溶液中，并以BD LSR流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)分析。
圖3和圖4顯示經(jīng)由FACS分析得知TAIP抗原在脾細(xì)胞與胸腺細(xì)胞不同亞群上的分布。如圖3所示，CD19+B細(xì)胞表面表達(dá)低水平但可檢測(cè)到的TAIP蛋白。然而在CD3+T細(xì)胞及部分自然殺傷細(xì)胞表面則可檢測(cè)到大量的TAIP蛋白。大部分的CD4+、CD8+及CD4+8+胸腺T細(xì)胞表達(dá)大量的ATIP蛋白，相反的只有少量的CD4-8-胸腺T細(xì)胞表達(dá)TAIP蛋白(圖4)。
收集來(lái)源于B6和BALB/c小鼠的組織，包括腦、胸腺、心臟、肺臟、肝臟、胃、腎臟、脾臟以及皮膚，于室溫過(guò)夜固定于10％甲醛，并包埋于石臘塊中。石臘塊以Leica RM2135切片機(jī)切成4μm厚的組織切片，延展于45℃水中并平鋪于有涂層的玻片上，玻片在37℃干燥以便使用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
含有組織石臘切片的玻片依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序加以脫臘及經(jīng)二甲苯-100％乙醇的系列干燥之，最后保存在100％乙醇中。組織切片依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序經(jīng)由100％乙醇-90％乙醇-85％乙醇-70％乙醇-PBS的系列進(jìn)行再水化(rehydrated)，最后置于PBS溶液中。接下來(lái)的反應(yīng)都在潮濕箱中進(jìn)行。將組織切片置于封閉(Blocking)緩沖液(含1％正常山羊血清)，于室溫孵育1小時(shí)(或4℃過(guò)夜)以封閉非特異性的結(jié)合。移去封閉緩沖液，切片加入TAB4或正常倉(cāng)鼠Ig(1∶200稀釋)繼續(xù)在室溫中孵育1小時(shí)(或4℃過(guò)夜)。切片以PBS洗二次，每次5分鐘以移去第一抗體(primary antibody)，再與1∶250稀釋的堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗倉(cāng)鼠Ig反應(yīng)，并在室溫下孵育1小時(shí)。切片再次以PBS洗二次，每次5分鐘，以移去酶偶聯(lián)的抗體，并以BCIP/NBT底物溶液于室溫避光呈色30分鐘。之后再次以PBS洗切片，以移去多余的酶底物，并以PBS-乙醇-二甲苯的系列進(jìn)行脫水，封固以用于顯微鏡下觀察。
結(jié)果顯示只在骨髓來(lái)源的組織中可檢測(cè)到TAIP蛋白的表達(dá)，在所檢測(cè)的其它組織上沒(méi)有檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例5細(xì)胞表面TAIP抗原的生物素化及免疫沉淀5×107個(gè)RL♂1或NIH-3T3細(xì)胞于含有0.5mg/ml Sulfo-NHS-生物素(Pierce)的1ml PBS中，置于冰上30分鐘進(jìn)行表面生物素化反應(yīng)。反應(yīng)后將細(xì)胞孵育于0.5ml Dulbecco的更改了的Eagle′s培養(yǎng)液(Life Technologies，Inc.)，置于冰上10分鐘以終止反應(yīng)，細(xì)胞以1ml的Dulbecco的更改了的Eagle′s培養(yǎng)液洗一次，再用1ml PBS洗兩次。
已標(biāo)記的細(xì)胞以5.0×107個(gè)細(xì)胞/ml的密度在含有完全蛋白酶抑制物混合劑(Roche)的冷的溶解緩沖液(1％Triton X-100，20mM Tris-HCl，pH8.0，160mM NaCl，1mM CaCl2)中溶解15分鐘，而不溶解的物質(zhì)以10,000×g離心10分鐘沉淀下來(lái)，這些步驟及所有后續(xù)步驟皆在4℃下進(jìn)行。為了進(jìn)行免疫沉淀，事先將溶解產(chǎn)物與50μl壓緊的蛋白質(zhì)G-Sepharose(AmershamPharmacia Biotech)孵育30分鐘以去除非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)，粒狀物被沉淀，將上清液分成多個(gè)等份(通常相當(dāng)于5.0×107個(gè)細(xì)胞)與事先加入了10μgTAB4單克隆抗體或來(lái)自正常倉(cāng)鼠血清的IgG的蛋白質(zhì)G-Sepharose 20μl共同孵育。在4℃孵育4小時(shí)后，樹(shù)脂以洗滌緩沖液(0.05％Triton X-100，50mMTris-HCl，pH8.5,400mM NaCl，1mM CaCl2，1mg/ml卵白蛋白)洗四次，再以相似的洗滌緩沖液(250mM NaCl代替400mM NaCl)洗兩次。特異性結(jié)合于TAB4的蛋白質(zhì)以50μl的1×SDS樣品緩沖液洗脫。洗脫的蛋白質(zhì)以8％SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Millipore)上。濾膜用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的卵白素(Avidin)(PharMingen)進(jìn)行反應(yīng)并以化學(xué)發(fā)光試劑(NEMTMLife Science Products)呈色來(lái)分析生物素化的蛋白。
如圖2所示，在RL♂1細(xì)胞(TAIP+T細(xì)胞)中由TAB4鑒定出來(lái)的生物素化的表面蛋白的分子量約120kDa，而在3T3細(xì)胞(TAIP-細(xì)胞)中則未鑒定出所述蛋白。而且包含有倉(cāng)鼠正常血清的蛋白質(zhì)G-Sepharose沒(méi)能回收到此120kDa的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果顯示這種120kDa的蛋白質(zhì)是TAB4單克隆抗體所識(shí)別的T細(xì)胞表面抗原。
實(shí)施例6體內(nèi)T細(xì)胞的消減為檢驗(yàn)體內(nèi)TAB4對(duì)T細(xì)胞或其他細(xì)胞群的作用，在小鼠腹膜內(nèi)注射300μg TAB4或?qū)φ諅}(cāng)鼠Ig，在第4天收取脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)算總細(xì)胞數(shù)并以FACS分析細(xì)胞表面標(biāo)志。
為了FACS分析，細(xì)胞于4℃以2％多聚甲醛固定20分鐘，洗二次，再懸浮于冰冷的FACS溶液至終濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/ml。每一次分析FACS分析管(Falcon)中加入100μl等份的細(xì)胞懸浮液。TAB4或?qū)φ諅}(cāng)鼠Ig加到細(xì)胞中混合至終濃度2μg/ml，并于4℃避光孵育30分鐘。細(xì)胞以冰冷的FACS溶液洗一次后，依下列條件進(jìn)行反應(yīng)(1)脾細(xì)胞加入100μl冰冷的FACS溶液，其中含有細(xì)胞色素偶聯(lián)的抗CD3抗體(2μg/ml)、FITC偶聯(lián)的抗倉(cāng)鼠Ig及PE偶聯(lián)的抗CD8/CD4/CD19/CD11b/泛NK/I-A/I-E/Mac-3抗體(2μg/ml)；和(2)胸腺細(xì)胞加入100μl冰冷的FACS溶液，其中含有FITC偶聯(lián)的抗倉(cāng)鼠Ig、PE偶聯(lián)的抗CD8抗體及細(xì)胞色素偶聯(lián)的抗CD4抗體(2μg/ml)。在4℃避光進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。最后，染色的細(xì)胞以冰冷的FACS溶液洗兩次，重新懸浮于1,000μl的FACS溶液中，之后以BD LSR流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)分析。
注射后4天，在TAB4處理的小鼠的外周血白細(xì)胞(PBL)中，CD3+T細(xì)胞百分比從對(duì)照組小鼠的36.7％降至4.1％(表2)。而TAB4處理僅造成脾細(xì)胞總數(shù)些微下降。然而在在TAB4處理的小鼠中，CD3+T細(xì)胞數(shù)目下降62％，自然殺傷細(xì)胞數(shù)目下降50％，CD19+B細(xì)胞總數(shù)目稍微增加。從TAB4處理的小鼠取得的胸腺細(xì)胞總數(shù)僅是對(duì)照小鼠中所觀察到的胸腺細(xì)胞水平的48％(減少了52％)。此外，除了CD4+T細(xì)胞，所有其他CD8+、CD4+CD8+及CD4-CD8-T細(xì)胞數(shù)目也都有減少，其中CD4+CD8+的T細(xì)胞亞群受到的影響最大(減少了64.7％)。
表2



(上述代表性數(shù)據(jù)來(lái)自三次實(shí)驗(yàn))實(shí)施例7抗TAIP抗體不誘導(dǎo)IL-2或TNF-α的分泌Balb/c小鼠(H-2d)腹膜內(nèi)注射300μg TAB4或?qū)φ諅}(cāng)鼠Ig。注射后7天分離脾細(xì)胞(做為應(yīng)答細(xì)胞)，與絲裂霉素C處理的C3H(H-2k)脾細(xì)胞(做為刺激細(xì)胞)共同培養(yǎng)，3天后收取培養(yǎng)上清液，并以ELISA試劑盒(PharMingen)測(cè)量IL-2含量。如圖5所示，與對(duì)照組小鼠相比較，來(lái)自TAB4處理小鼠的反應(yīng)細(xì)胞其IL-2分泌被抑制。但是分析血漿中IL-2與TNF-α水平時(shí)，在對(duì)照組與TAB4處理小鼠的血清中其含量并無(wú)明顯不同。既然IL-2的分泌對(duì)T細(xì)胞的活化是重要的，此結(jié)果顯示特異性抗TAIP抗體如TAB4，可以應(yīng)用于體內(nèi)調(diào)節(jié)T細(xì)胞并控制不需要的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，如與自身免疫性疾病或器官移植排斥有關(guān)的那些免疫應(yīng)答。
實(shí)施例8使用抗TAIP抗體預(yù)防移植排斥8至12周齡小鼠(取自杰克森實(shí)驗(yàn)室)以馬來(lái)酸乙酰丙嗪(Acepromazinemeleate)(Fermenta Animal Health Co.，Kansas City，MO)麻醉。皮膚移植前(皮膚移植手術(shù)前7天)，無(wú)胸腺切除的C57BL/6受體小鼠(H-2b)腹膜內(nèi)注射500μg TAB4或同型對(duì)照抗體。七天后，將完全異基因的不相容的Balb/cj小鼠(H-2d)的脅腹外側(cè)皮膚移植到經(jīng)抗體預(yù)先處理過(guò)的C57BL/6小鼠的脅腹外側(cè)。移植后七天，小鼠再次注射500μg TAB4或同型對(duì)照抗體。移值后每天監(jiān)測(cè)小鼠。當(dāng)有50％捐贈(zèng)皮膚壞死時(shí)視為排斥。移植物存活的百分比如圖7(n＝8)所示。數(shù)據(jù)顯示TAB4處理延長(zhǎng)了異基因皮膚移植物的存活率。
實(shí)施例9TAIP經(jīng)鑒定為PSGL-1P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)，又名CD162，是白細(xì)胞上表達(dá)的主要的P-選擇素配體，此白細(xì)胞包括T細(xì)胞(Sako et al.，1993，Cell 751179；Vachino et al.，1995，J.Biol.Chem.27021966；Veldman et al.，1995，J.Biol.Chem.27016470)。TAIP的生化特性如分子量與其二聚化的趨勢(shì)，提示TAIP與PSGL-1可能為相似物的可能性。為了研究此兩種抗原的關(guān)系，進(jìn)行了以下測(cè)試1)由TAB4沉淀的抗原是否也可被市面上可購(gòu)得的抗PSGL-1抗體所識(shí)別；和2)從細(xì)胞溶解物中抗PSGL-1抗體是否能消減TAB4。
RL♂1T細(xì)胞以1.0×108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度在含有完整蛋白酶抑制物混合劑的裂解緩沖液(1％Triton X-100，20mM Tris-HCl，pH8.0，160mMNaCl，1mM CaCl2)中裂解一小時(shí)，而未裂解的物質(zhì)則以10,000×g離心10分鐘沉淀，上述及后續(xù)步驟皆在4℃下進(jìn)行。相當(dāng)于5.0×107個(gè)細(xì)胞的裂解物與事先加入10μg抗PSGL-1單克隆抗體(clone 2PHl，PharMingen，SanDiego，CA)、抗TAIP單克隆抗體、TAB4或來(lái)自正常倉(cāng)鼠血清的IgG的20μl蛋白質(zhì)G-Sepharose孵育，于4℃孵育4小時(shí)后，粒狀物以洗滌緩沖液(0.05％Triton X-100，50mM Tris-HCL，pH8.5，400mM NaCl，1mM CaCl2，1mg/ml卵白蛋白)洗五次，再以相似的洗滌緩沖液(250mM代替400mM NaCl)洗兩次。結(jié)合的蛋白以40μl的1×SDS樣品緩沖液洗脫。洗脫的蛋白以6％SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，該膜以抗PSGL-1單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡，并用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG(重鏈+輕鏈)及化學(xué)發(fā)光劑(Renaissance，NEN)進(jìn)行顯示。
表面生物素化的RL♂1T細(xì)胞在1.0×108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度下在裂解緩沖液中裂解。細(xì)胞提取物與結(jié)合到40μl蛋白質(zhì)G-Sepharose上的20μg抗體在4℃下過(guò)夜孵育。用抗PSGL-1單克隆抗體(2PHl)或?qū)φ沾笫驣gG進(jìn)行消減，或用TAB4或正常倉(cāng)鼠對(duì)照血清進(jìn)行消減。消減后的裂解物分別以TAB4或抗PSGL-1單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀物于6％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并以熒光自顯影法檢測(cè)。如圖6所示，抗PSGL-1抗體可以從T細(xì)胞裂解物中消減TAIP蛋白。再者，用抗TAIP抗體(TAB4)免疫沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)，可經(jīng)由Western印跡分析得知能夠被抗PSGL-1抗體所識(shí)別。
實(shí)施例10抗PSGL-1抗體可誘發(fā)人類(lèi)T細(xì)胞凋亡為了確定PSGL-1在人類(lèi)T細(xì)胞凋亡中所扮演的角色，對(duì)活化的T細(xì)胞進(jìn)行時(shí)程實(shí)驗(yàn)，以找到該細(xì)胞對(duì)PSGL-1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)獲得敏感性的時(shí)間。以植物血凝素(PHA)絲裂原刺激人類(lèi)T細(xì)胞并使其在包含IL-2的培養(yǎng)液中進(jìn)一步擴(kuò)增。之后收取活化的T細(xì)胞，在IL-2與交聯(lián)抗體存在下用抗PSGL-1抗體進(jìn)行攻擊。
從健康成人獲得的人外周血加入肝素抗凝后，依不同細(xì)胞密度以Ficoll-Paque Plus(Pharmacia Biotech)富集外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。此細(xì)胞以1％PHA(Life Technologies，GibcoBRL)活化48小時(shí)，并將該細(xì)胞在整個(gè)分析期間培養(yǎng)在含有重組人IL-2(5ng/ml)的培養(yǎng)液中。為了評(píng)估抗人PSGL-1抗體誘導(dǎo)凋亡的能力，活化的細(xì)胞進(jìn)行如下處理(1)加入1μg/ml的抗PSGL-1抗體克隆KPL-1(BD PharMingen)及0.5μg/ml的交聯(lián)劑兔抗小鼠Ig(Jackson ImmunoResearch Laboratory)；(2)加入純化的同型對(duì)照小鼠Ig及交聯(lián)劑兔抗小鼠Ig；或(3)僅加入交聯(lián)劑兔抗小鼠Ig。處理六小時(shí)后，細(xì)胞以抗膜聯(lián)蛋白V抗體(BD PharMingen)和PI(Sigma)進(jìn)行染色，以FACS分析確定早期凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
如圖8所示，在應(yīng)用抗PSGL-1抗體加交聯(lián)劑時(shí)，由PSGL-1激發(fā)的信號(hào)，可導(dǎo)致PHA活化的人PBMC(主要為T(mén)細(xì)胞)的明顯水平的凋亡。經(jīng)抗PSGL-1抗體處理過(guò)的培養(yǎng)物中凋亡細(xì)胞的百分比，從第三天的8.5％增加至第八天的24％。而用同位吻合(isotopic-matched)的對(duì)照抗體或僅用交聯(lián)抗體的處理對(duì)上述細(xì)胞皆無(wú)任何作用。
實(shí)施例11使用抗PSGL-1激動(dòng)劑型抗體治療自身免疫性疾病非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠，是一種被充分認(rèn)可的自體免疫糖尿病動(dòng)物，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下。在大約20周齡時(shí)NOD小鼠會(huì)產(chǎn)生自發(fā)性糖尿病。在實(shí)驗(yàn)組中，每只小鼠在第14、15和17周齡分別接受300μg劑量的抗PSGL-1抗體(TAB4)腹膜內(nèi)注射。在第24和26周齡各追加一次相同劑量的注射。而對(duì)照組則給予相同劑量的倉(cāng)鼠Ig。在15周齡后以Medi-Test葡萄糖試紙(Macherery-Nagel，Germany)每周兩次監(jiān)測(cè)小鼠的尿糖。連續(xù)兩次測(cè)量非空腹尿中葡萄糖水平超過(guò)300mg/dl時(shí)視為糖尿病。
如圖9所示，與對(duì)照抗體處理相比，TAB4(抗PSGL-1抗體)處理產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用。因此抗PSGL-1抗體處理可抑制自身免疫T細(xì)胞的活性，并可延遲I型糖尿病的發(fā)生。
其他實(shí)施方案首先必須要了解上述的發(fā)明以及其細(xì)節(jié)敘述僅是以闡明本發(fā)明為目的，但非限制本發(fā)明的范疇。本發(fā)明的其他觀點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)及修改皆包含于下述的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或降低個(gè)體內(nèi)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括挑選已診斷患有以過(guò)強(qiáng)或不需要的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為特征的疾病的個(gè)體或有患該疾病危險(xiǎn)的個(gè)體；以及給藥該個(gè)體能結(jié)合T細(xì)胞表面P選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)的化合物，其中，所述化合物與T細(xì)胞表面PSGL-1的結(jié)合可誘導(dǎo)導(dǎo)致T細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而預(yù)防或降低個(gè)體的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物是特異性結(jié)合PSGL-1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物是特異性結(jié)合PSGL-1的單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3所述的方法，該方法還包括給藥能與所述單克隆抗體結(jié)合并可誘導(dǎo)所述T細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)的試劑。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括誘導(dǎo)所述T細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)，其中，所述交聯(lián)可誘發(fā)導(dǎo)致T細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
6.權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括挑選已診斷患有自身免疫性疾病的個(gè)體。
7.權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括挑選已接受或計(jì)劃接受同種異體或異種移植的個(gè)體。
8.權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括挑選已診斷患有過(guò)敏性疾病的個(gè)體。
9.權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括挑選已診斷患有T細(xì)胞癌的個(gè)體。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述T細(xì)胞為活化的T細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述T細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述T細(xì)胞為CD8+T細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中該方法包括檢測(cè)在給藥所述化合物前從所述個(gè)體中取得的第一生物樣品中的T細(xì)胞數(shù)目，并將該結(jié)果與給藥該化合物后從該個(gè)體獲得的第二生物樣品中的T細(xì)胞數(shù)目相比較。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中該方法包括檢測(cè)在給藥所述化合物前從所述個(gè)體中取得的第一生物樣品中的T細(xì)胞的生物活性，并將該結(jié)果與給藥該化合物后從該個(gè)體獲得的第二生物樣品中的T細(xì)胞的生物活性相比較。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述給藥可導(dǎo)致個(gè)體內(nèi)至少20％的外周血CD3+細(xì)胞的消減。
16.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段在該個(gè)體暴露于該抗體或其抗原結(jié)合片段后，可誘發(fā)至少20％的外周血CD3+細(xì)胞的死亡。
17.一種誘導(dǎo)T細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞死亡的方法，該方法包括提供在其細(xì)胞表面表達(dá)PSGL-1的T細(xì)胞或NK細(xì)胞；以及將該T細(xì)胞或NK細(xì)胞與能與T細(xì)胞或NK細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合的化合物接觸，其中該化合物與T細(xì)胞或NK細(xì)胞表面的PSGL-1的結(jié)合可誘導(dǎo)造成該T細(xì)胞或NK細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述化合物為特異性結(jié)合PSGL-1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述化合物為特異性結(jié)合PSGL-1的單克隆抗體。
20.權(quán)利要求19所述的方法，該方法還包括使所述單克隆抗體與這樣的試劑接觸，該試劑能與該單克隆抗體結(jié)合并可誘導(dǎo)T細(xì)胞或NK細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)。
21.權(quán)利要求17所述的方法，其中該方法包括誘導(dǎo)T細(xì)胞或NK細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)，其中，所述交聯(lián)可誘發(fā)導(dǎo)致T細(xì)胞或NK細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
22.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細(xì)胞為活化的T細(xì)胞。
23.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞。
24.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細(xì)胞為CD8+T細(xì)胞。
25.權(quán)利要求17所述的方法，其中該方法包含評(píng)估所述T細(xì)胞或NK細(xì)胞在接觸所述化合物后的存活力。
26.權(quán)利要求17所述的方法，其中該方法包含評(píng)估所述T細(xì)胞或NK細(xì)胞在接觸所述化合物后的生物活性。
27.一種篩選PSGL-1的功能的調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括提供表面表達(dá)PSGL-1的細(xì)胞；將該細(xì)胞與測(cè)試物質(zhì)接觸；以及測(cè)量該細(xì)胞與該測(cè)試物質(zhì)接觸后該細(xì)胞的存活力，由此判定該測(cè)試物質(zhì)是否為PSGL-1的功能的調(diào)節(jié)劑。
28.權(quán)利要求27所述的方法，該方法還包含檢測(cè)該測(cè)試物質(zhì)所誘發(fā)的細(xì)胞死亡，由此判定該測(cè)試物質(zhì)是否為PSGL-1的功能的調(diào)節(jié)劑。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述測(cè)試物質(zhì)為特異性結(jié)合PSGL-1的抗體或其抗原結(jié)合片段。
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述測(cè)試物質(zhì)為特異性結(jié)合PSGL-1的單克隆抗體。
31.權(quán)利要求30所述的方法，該方法還包括使所述單克隆抗體與這樣的試劑接觸，該試劑能與該單克隆抗體結(jié)合并可誘導(dǎo)細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)。
32.權(quán)利要求28所述的方法，其中該方法包括誘導(dǎo)細(xì)胞表面多個(gè)PSGL-1抗原的交聯(lián)，其中，所述交聯(lián)可誘發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
33.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述細(xì)胞為活化的T細(xì)胞。
34.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞。
35.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述細(xì)胞為CD8+T細(xì)胞。
36.權(quán)利要求28所述的方法，該方法還包括制備大量該測(cè)試物質(zhì)并將該測(cè)試物質(zhì)配制于藥學(xué)上可接受的載體中。
37.一種試劑盒，其包含可結(jié)合T細(xì)胞表面PSGL-1的化合物，其中該化合物與T細(xì)胞表面PSGL-1的結(jié)合可誘發(fā)導(dǎo)致T細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑；以及使用該化合物治療自身免疫、移植排斥、過(guò)敏性疾病或T細(xì)胞癌的說(shuō)明。
全文摘要
與T細(xì)胞或NK細(xì)胞表面的P－選擇素糖蛋白配體1(PSGL－1)結(jié)合的化合物，可用于誘發(fā)T細(xì)胞或NK細(xì)胞的消減和/或誘發(fā)T細(xì)胞或NK細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。本發(fā)明的化合物及方法可用來(lái)調(diào)節(jié)自身免疫性疾病、器官移植排斥以及過(guò)敏性疾病中的不需要的T細(xì)胞或NK細(xì)胞誘發(fā)的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1473052SQ02802984
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2002年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月3日
發(fā)明者林榮華, 吳忠勛, 徐碧嶺 申請(qǐng)人:臺(tái)醫(yī)生物科技股份有限公司