專利名稱：Telkp和lkp融合免疫毒素、原核表達載體及制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表達載體及制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤生物治療近年來迅猛發(fā)展，因其高效低毒、目標明確而成為繼手術(shù)、放、化療以來的又一重要治療策略。生物毒素是腫瘤生物治療重要內(nèi)容之一，但因生物毒素對靶細胞的作用不具特異性，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。近年，有研究者嘗試將特異性抗體與生物毒素分子偶聯(lián)開發(fā)出第二代免疫毒素，但由于偶聯(lián)分子的分子量增大，其應(yīng)用效果也不理想。因此，開發(fā)具細胞靶向性小分子毒素是未來免疫毒素研究的主要方向。絲瓜毒素(Luffin-β )，是從絲瓜籽中分離到的I型核糖體失活蛋 白(ribosomeinactivating protein，RIP)，絲瓜 RIP 有多種類型，主要為Luffin-a, Luffin-β , Luffin-Ss, Luffin-cylin, Luffin-Pl,其中 Luffin-β 含 278 個氨基酸，分子質(zhì)量30. 583KD，等電點9. 5，能特異水解真核細胞核糖體28SrRNA4324位的腺嘌呤，使真核細胞核糖體60s大亞基失活，顯著抑制其蛋白合成，屬目前單鏈RIP中活性最高者之一，是近年備受關(guān)注的新型強效免疫毒素彈頭小分子(Poma，A.，G.Marcozzij et al. (1999). ^Antiproliferative effect and apoptotic response in vitroof human melanoma cells to liposomes containing the ribosome-inactivatingproteinluffin. "Biochim Biophys Acta1472 (1-2):197-205. Pomaj A.，M. Miranda, etal. (1998)· "Differential response of human melanoma and Ehrlich ascites cells invitro to the ribosome-inactivating protein luffin. "Melanoma Res8(5):465-467。Maj Q. J. ,J.H.Li,et al. (2003). ^Crystal structure of beta-luffin，a ribosome-inactivatingprotein，at2. OA resolution. 〃Acta CrystalIogr D BiolCrystallogr59 (Pt8) : 1366-1370.)，具較強抗瘤活性。尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinaseplasminogen activator，uPA)是含 431個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為50 60kD的一糖蛋白。在正常組織、細胞uPA及其uPAR表達極低，而幾乎所有的腫瘤，兩者明顯高表達。uPA與腫瘤的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移等均密切相關(guān)(Markl B，Renk I, Oruzio DV, and et al. Tumour budding, uPA and PAI-Iare associatedwith aggressive behaviour in colon cancer[J]. J Surg Oncol. 2010, 102(3):235-41.FongY, Shen KH，Chiang TA，and et al. Acacetin inhibits TPA-induced MMP_2andu-PA expressions of human lung cancer cells throughinactivating JNK signalingpathway and reducing binding activities of NF-kappaBand AP-I[J]. J FoodScij 2010，75(1) :H30-8)o因此，uPA被視為重要的腫瘤標志物和極具吸引力的腫瘤治療靶標。將尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase plasminogen activator, uPA)裂解位點(也稱uPA識別位點，簡寫為uPAcs，氨基酸序列為SGRSA)和絲瓜毒素分子(Luffin-β)構(gòu)建融合基因表達載體，誘導(dǎo)并純化其表達的融合免疫毒素。該融合免疫毒素在體內(nèi)高表達uPA的腫瘤組織細胞局部，經(jīng)uPA酶切割裂解位點序列將釋放具殺瘤活性的小分子毒素Luffin-β ,以發(fā)揮其殺瘤作用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于Luffin-β的抗腫瘤生物學(xué)特性及uPA與腫瘤的密切關(guān)系，本發(fā)明的目的之一是提供一種融合免疫毒素TELKP，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述TELKP融合免疫毒素的氨基酸序列從N端至C端依次為Trx標簽、EK識別序列、Luffin-β肽段、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列(uPAcs)，由此命名為TELKP。TELKP融合免疫毒素為進一步制備下述LKP融合免疫毒素奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的之二是提供一種融合免疫毒素LKP，氨基酸序列如SEQ IDN0. 2所
/Jn ο所述融合免疫毒素的氨基酸序列從N端至C端依次為Luffi η- β肽段、KDEL駐留信號序列、uPAcs (SGRSA),由此所述融合免疫毒素命名為LKP。C末端修飾KDEL的融合免疫毒素可增強其細胞毒性，還能刺激有效的淋巴細胞增殖和特異性淋巴細胞效應(yīng)增強，融合免疫毒素在體內(nèi)高表達uPA的腫瘤組織細胞局部，經(jīng)uPA酶切割裂解位點序列將釋放具殺瘤活性的小分子毒素Luffin-β，以發(fā)揮其對瘤細胞的殺傷作用。本發(fā)明的目的之三是提供含所述LKP融合免疫毒素基因的重組表達載體pET_32a(+ )/Luffin-β-KDEL-uPAcs，所述重組表達載體包括pET-32a ( + )載體序列和LKP (即Luffin-β -KDEL-uPAcs)融合免疫毒素的基因序列。本發(fā)明的目的之四是提供所述重組表達載體pET-32a(+ )/Luffin-β _KDEL_uPAcs的構(gòu)建方法，包括如下步驟(I)采用RT-PCR法，以植物絲瓜籽(物種名為Luffa acutangula)總RNA為模板，以上游SEQ ID N03和下游SEQ ID N04為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物I，即為Luffin-β肽段的cDNA序列，并克隆入載體ρΤΑ2中得到陽性重組載體pTA2/Luffin-i3，SEQ ID N03 :5’ -ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N04 :5’ -GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’ ；(2)采用引物延伸法，以所述載體pTA2/Luffin-i3為模板，以上游SEQ IDN05和下游SEQ ID N06為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物II，即為包括Luffin-β肽段、KDEL駐留信號序列和uPA識別序列的cDNA序列，再用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切所述PCR產(chǎn)物11和pET-32a ( + )載體，分別回收含Luffin-β -KDEL-uPAcs的cDNA序列的片段和pET_32a(+ )骨架片段，純化后連接，得到陽性重組表達載體pET-32a ( + ) /Luffin-β -KDEL-uPAcs，SEQ ID N05 :5’ -CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N06 :5’ -CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3，。本發(fā)明的目的之五是提供TELKP融合免疫毒素的制備方法，包括如下步驟(I)將所述表達載體 pET-32a(+ VLuffin-β -KDEL-uPAcs 轉(zhuǎn)化表達菌 BL21 (DE3)；(2)挑取克隆轉(zhuǎn)種于含50μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入O. 4mmol/L IPTG，于30°C過夜誘導(dǎo)使表達TELKP融合免疫毒素；(3)于4°C,6000r/min離心15min收集菌體，棄上清液，加入10倍體積的pH7. 3的PBS溶液重懸菌體，再加入PMSF和DTT，超聲破碎菌體，破菌完全后于4°C，10000r/min離心15min,將上清以O(shè). 45 μ m微孔濾膜過濾,再上樣于金屬螯合Ni2+柱,最后以ElutionBuffer洗脫得到TELKP融合免疫毒素溶液。本發(fā)明的目的之六是提供LKP融合免疫毒素的制備方法，包括如下步驟(I)向所述TELKP融合免疫毒素溶液中加入EK酶過夜酶切；(2) EK酶酶切后的蛋白用陽離子交換柱Pharmacia HiTrap SP FastFlowcolumn (26/20)洗脫純化得LKP融合免疫毒素溶液。本發(fā)明中，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)將KDEL序列與uPA裂解位點序列引入Luffin-β 的 C 端，獲得 Luffin-β -KDEL-uPAcs (LKP)融合免疫毒素，KDEL 序列和 uPA裂解位點序列使Luffin- β蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變，使之成為受KDEL肽與uPA裂解位點封閉的暫無活性(或低活性)的融合免疫毒素分子，腫瘤細胞標志物uPA酶可裂解 Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素釋放具活性的Luffin-β以殺傷肺癌細胞。LKP融合免疫毒素的表達與純化為其后續(xù)抗瘤生物學(xué)活性研究和抗瘤藥物的制備奠定堅實基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明絲瓜籽Luffin-β基因PCR擴增的電泳圖；圖2為本發(fā)明重組載體pTA2/Luffin_P經(jīng)酶切驗證的電泳圖；圖3為本發(fā)明重組表達載體pET_32a (+) /Luffin- β -KDEL-uPAcs經(jīng)酶切驗證的電泳圖；圖4為本發(fā)明融合免疫毒素TELKP的誘導(dǎo)表達與純化后的電泳圖；圖5為本發(fā)明融合免疫毒素TELKP經(jīng)酶切EK酶酶切后的電泳圖；圖6為本發(fā)明LKP融合免疫毒素經(jīng)uPA體外裂解的殺瘤活性檢測結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明LKP融合免疫毒素對H460細胞生長的影響曲線圖；圖8為本發(fā)明LKP蛋白影響H460細胞caspase_3基因mRNA表達的電泳圖。圖9為本發(fā)明LKP蛋白影響H460細胞caspase-3基因編碼蛋白表達的電泳圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明不限于下述實施方式或?qū)嵤├膊贿`背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實施例I :I材料與方法I. I 材料RT-PCR試劑、克隆載體pTA2、限制性內(nèi)切酶、高保真聚合酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒抽提及CCK-8等試劑購自TOYOBO公司；蛋白純化Ni柱及填料等購自GE公司；表達載體pET-32a(+)、大腸桿菌DH5 α和BL21 (DE3)表達菌、EK酶等購自上海捷瑞生物工程有限公司；人肺癌細胞株NCI-H460購自武漢大學(xué)細胞庫；測序由上海生工公司完成。I. 2 方法I. 2. I重組載體pTA2/Luffin- β的構(gòu)建和鑒定
以植物絲瓜籽總RNA為模板，用上游引物SEQ ID N03 5’ -ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’ 和下游引物 SEQ ID N04 :5’ -GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’ PCR擴增Luffin-β基因的全長編碼序列，O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖I所示，其中M為DNA標準(DL2000)，I為PCR產(chǎn)物。電泳圖顯示目的條帶大小與預(yù)期大小的834bp一致，初步說明擴增到目的基因Luffin-β的全長編碼序列。將擴增的Luffin-β基因克隆入載體pTA2中，并通過BamH I與XhoI雙酶切后
O.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證如圖2所示，其中M為DNA標準(DL2000)，I為酶切后的產(chǎn)物。電泳圖顯示I中兩個條帶分別為PTA2骨架片段序列和Luffin-β基因序列，分別與預(yù)期大小的2916bp和900bp (含Luffin-β的全長編碼序列和少部分載體序列)一致。另外將酶切驗證正確的載體送去測序，測序結(jié)果顯示與GenBank發(fā)布的Luffin-β基因序列(GenBank登錄號X62372. I)完全一致，由此，成功構(gòu)建了重組載體pTA2/Luffin-3。I. 2. 2重組pET_32a (+) /Luffin- β -KDEL-uPAcs融合免疫毒素載體的構(gòu)建和鑒定 自行設(shè)計構(gòu)建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因引物，引物中引入NcoI酶切位點、XhoI酶切位點、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列(uPAcs)，使獲得的基因序列為NcoI+Luffin-β-KDEL-uPAcs+XhoI，具體如下SEQ ID N05 :5，_CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’；SEQ ID N06 :5’ -CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3’ ；SEQ ID N05序列從5’端開始的堿基依次為酶切位點保護堿基(CATG)、NcoI酶切位點(CCATGG)，防止移碼突變而人為加入的堿基(CT)、SEQ ID N03序列(ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT)；SEQ ID N06序列從5’端開始的堿基依次為酶切位點保護堿基(CCG)、XhoI酶切位點(CTCGAG)，終止密碼子(TTA)，編碼uPA識別位點序列(TGCTGATCGTCCGCT)，編碼KDEL序列(TAGCTCATCTTT)、SEQ ID N04 序列(GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC)。以重組載體pTA2/Luffin-0為模板，上游引物SEQ ID N05和下游引物SEQIDN06進行PCR擴增得到含NcoI, XhoI酶切位點的Luffin- β -KDEL-uPAcs片段。用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切該PCR產(chǎn)物和pET-32a (+)載體，分別回收酶切后的Luffin-β-KDEL-uPAcs片段和pET_32a(+)骨架片段，純化后連接，得重組pET_32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素載體，將所得的重組載體用NcoI和XhoI雙酶切驗證，酶切后的電泳圖如圖3所示，其中，M為DNA標準(DL2000)，1為NcoI與XhoI酶切 pET-32a (+) /Luffin- β -KDEL-uPAcs 后的產(chǎn)物，2 為 pET_32a (+)載體。電泳圖顯示 I中的兩個條帶分別為pET-32a骨架片段和Luffin- β -KDEL-uPAcs目的片段，分別與預(yù)期大小的5852bp和866bp —致，經(jīng)測序鑒定正確，因此，成功構(gòu)建了重組pET_32a (+) /Luffin-β-KDEL-uPAcs融合免疫毒素載體。I. 2. 3TELKP融合免疫毒素的誘導(dǎo)表達與純化將重組載體pET-32a(+)/Luffin-β -KDEL-uPAcs 轉(zhuǎn)化表達菌 BL21 (DE3)大腸桿菌，次日挑3個克隆，分別放于盛5ml LB培養(yǎng)基的螺紋管中，培養(yǎng)(37°C，220r/min振搖)至對數(shù)生長期，加入O. 4mmol/L IPTG,于30°C過夜誘導(dǎo)。各取Iml培養(yǎng)物，14000r/min離心Imin,棄上清，100 μ I蒸懼水重懸沉淀,加34 μ 14xloading buffer,混勻，沸水浴3 5min,SDS-PAGE檢測融合免疫毒素TELKP的表達情況。
表達菌經(jīng)大量誘導(dǎo)后，4°C，6000r/min離心誘導(dǎo)后的細菌15min，10倍體積的PBS(pH7. 3)重懸菌體，超聲破碎(300W，工作10s，間隙10s，15次，循環(huán)3輪)，破菌時加入PMSF和DTT，防蛋白降解。鏡檢破菌效果。破菌完全后于4°C，10000r/min離心15min，留取上清及沉淀，上清以O(shè). 45 μ m微孔濾膜過濾。金屬螯合Ni2+柱中裝入約IOml Ni2+填料，His binding buffer平衡。將已過濾的上清上樣Ni2+柱，收集穿透液，復(fù)平衡，分別用5%、10%和1009ffilutionBuffer (20mM磷酸鈉，O. 5M NaCl，8M尿素，O. 5M咪唑，ρΗ7· 4)洗脫，100%組分透析于Tris (9. O)緩沖液中得到TELKP融合免疫毒素溶液。SDS-PAGE電泳鑒定未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌中融合免疫毒素TELKP的表達情況以及鑒定經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌再經(jīng)破菌離心后的上清和沉底中的融合免疫毒素TELKP的表達情況，如圖4所示，其中M為蛋白Marker，I為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的，2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的，3為誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化菌經(jīng)破菌離心后的上清，4為誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)化菌經(jīng)破菌離心后的沉淀。電泳圖顯示在43KDa和55KDa之間有條帶，與預(yù)期大小的48. 8KDa的目的蛋白TELKP 一致。I. 2. 4LKP融合免疫毒素的制備和檢測向I. 2. 3中獲得的TELKP融合免疫毒素溶液中加入適量腸激酶(EK酶)，過夜，留取約Iml未酶切樣品作對照，SDS-PAGE電泳檢測酶切效果，如圖5所示，其中M為蛋白Marker，I為TELKP，2為EK酶切TELKP。電泳圖顯示2中EK酶切TELKP后得到31. 8kD的目的蛋白LKP, 16. 9KD大小的蛋白條帶為EK酶切去的Trx標簽蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致。酶切后的蛋白用陽離子交換柱Pharmacia HiTrap SP Fast Flowcolumn(26/20)洗脫純化，洗脫純化獲得的目的蛋白LKP再用SDS-PAGE電泳檢測后行高效液相色譜(high performance liquid chromatogram, HPLC)分析，色譜柱為discovery (250mmX 4. 6mm, 5 μ m),歸一法計算其純度達 98. 8%。I. 2. 5. LKP融合免疫毒素經(jīng)uPA體外裂解的殺瘤IC50計算將人肺癌細胞株NCI-H460細胞接種于96孔板(3000個細胞/150 μ I/孔)，5 %C02、37°C與飽和濕度培養(yǎng) 24h，加入不同濃度(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)純化的LKP蛋白與uPA酶，分別以僅加蛋白LKP、uPA酶及不處理的細胞做對照，作用24h后，加入CCK-8(cell counting kit-8)試劑,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h,酶標儀測定450nm波長處光密度值，并計算其IC50。LKP經(jīng)uPA體外裂解的殺瘤活性檢測結(jié)果如圖6所示，其中A為正常人肺癌NCI-H460細胞，B為50ng/ml的LKP蛋白在100ng/ml uPA酶存在條件下24h時致H460細胞不同程度的死亡，C為200ng/ml的LKP蛋白在400ng/ml uPA酶存在條件下24h時致H460細胞不同程度的死亡?？梢?00ng/ml的LKP蛋白經(jīng)400ng/ml的uPA酶體外裂解24h致大部分H460細胞貼壁能力降低，部分細胞死亡、崩裂，而50ng/ml的LKP蛋白經(jīng)100ng/ml的uPA酶體外裂解相同的時間后致少部分H460細胞貼壁能力降低，較少部分細胞死亡。因此，LKP蛋白經(jīng)uPA酶體外裂解可釋放具殺瘤活性的免疫毒素Luffin- β，且其殺瘤活性呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系，其IC50為40ng/ml。I. 2. 6LKP融合免疫毒素對非小細胞肺癌細胞生長的影響-增殖曲線繪制將H460細胞接種至4個96孔板(3000個細胞/150 μ I/孔)，5 % C02，37°C與飽和濕度培養(yǎng)24h后加入目的蛋白LKP與uPA酶，分別以單純目的蛋白LKP、單純uPA酶作用于H460細胞及單純H460細胞作對照，單純培養(yǎng)液為空白對照，分別于ld、2d、3d、4d取出一96孔板，每孔加換新培養(yǎng)基與CCK-8，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，振蕩30秒混勻，酶標儀測定450nm波長處光密度值，以光密度值為Y軸，時間為X軸繪制增值曲線如圖7所示，LKP蛋白經(jīng)uPA酶體外裂解釋放具殺瘤活性的Luffin-β對人肺癌H460細胞生長具顯著殺傷作用(與對照細胞和uPA酶處理的細胞比較，P〈0. 01)，LKP蛋白經(jīng)uPA酶裂解后腫瘤殺傷能力顯著增強(在處理后培養(yǎng)2 — 4天，與LKP蛋白單獨處理的細胞比較，P〈0. 05)。I. 2. 7融合免疫毒素LKP對H460細胞促凋亡基因caspase-3表達的影響分別根據(jù)人caspase-3與GAPDH基因序列，設(shè)計其特異性擴增引物。caspase-3上游5' -TCCTGAGATGGGTTTATGTA-3 '，下游5' -CACGTGTAAGATCATTTT-3 ' ;GAPDH 上游5' -CGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游5' -TTGGCCAGGGGTGCTAAGC-3'。采用 RT-PCR 法，以蛋白LKP (50ng/ml)與uPA酶(100ng/ml)作用的H460細胞的總RNA為模板檢測caspase-3基因的表達情況,分別以單純目的蛋白LKP (50ng/ml)、單純uPA酶(100ng/ml)作用的H460細胞及單純H460細胞的相同檢測作對照，同時檢測的GAPDH基因作內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)條件30°C 10min;42°C,30min, 99°C 5min, 5°C,5min, I 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)條件94°C Imin ；94°C 30s, 45°C, lmin, 72°C, 5min, 30 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取 PCR 反應(yīng)液(5 10 μ I)行電泳檢測如圖8所示，其中M為DNA標準(DL2000)，I為Η460細胞，2為uPA作用的H460細胞，3為LKP作用的H460細胞，4為LKP與uPA作用的H460細胞。電泳圖顯示，以蛋白LKP與uPA酶作用的H460細胞總RNA為模板能檢測到caspase-3基因的較強表達，以單純目的蛋白LKP作用的H460細胞總RNA為模板能檢測到caspase-3基因的較弱表達，單純uPA酶作用的H460細胞及單純H460細胞的總RNA為模板所檢測到的caspase-3基因的表達最弱。提不蛋白LKP可致H460細胞調(diào)亡。I. 2. 8融合免疫毒素LKP對H460細胞促凋亡蛋白caspase-3表達的影響采用Western blot技術(shù)，分別將I. 2. 7的各組細胞總蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，浸泡于含caspase-3兔多抗(I 500)封閉液中，4°C過夜孵育，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(I 300)，室溫孵育lh，25°C，與化學(xué)發(fā)光底物結(jié)合5 lOmin，保存圖片。β-actin (43KD)作內(nèi)參。Western blot結(jié)果如圖9所示，其中I為H460細胞，2為uPA作用的H460細胞，3為LKP作用的H460細胞，4為LKP與uPA作用的H460細胞。Western blot結(jié)果顯示，蛋白LKP與uPA酶作用的H460細胞檢測在約17kDa處出現(xiàn)較強caspase-3抗原染色帶，單純目的蛋白LKP作用的H460細胞在相同位置出現(xiàn)該條帶則較弱，單純uPA酶作用的H460細胞及單純H460細胞在相同位置出現(xiàn)該條帶則最弱，提示蛋白LKP可致H460細胞凋亡。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.TELKP融合免疫毒素，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的TELKP融合免疫毒素，其特征在于氨基酸序列從N端至C端依次為Trx標簽、EK識別序列、Luffin- β肽段、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列。
3.LKP融合免疫毒素，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的LKP融合免疫毒素，其特征在于氨基酸序列從N端至C端依次為Luffin- β肽段、KDEL駐留信號序列、uPA識別序列。
5.含權(quán)利要求4所述LKP融合免疫毒素的基因的重組表達載體pET-32a( + )/Luffin- β -KDEL-uPAcs，其特征在于，包括pET_32a ( + )載體序列和LKP融合免疫毒素的基因序列。
6.權(quán)利要求5所述表達載體pET-32a( + ) /Luffin-β -KDEL-uPAcs的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)采用RT-PCR法，以植物絲瓜籽總RNA為模板，以上游SEQID N03和下游SEQ IDN04為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物I，即為Luffin-β肽段的cDNA序列，并克隆入載體pTA2中得到陽性重組載體pTA2/Luffin-3，SEQ ID N03 :5’ -ATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N04 :5’ -GTGTTTTGTAGGAATACCATCGTCAA-3’ ； (2)采用引物延伸法，以所述載體pTA2/Luffin-i3為模板，以上游SEQIDN05和下游SEQ ID N06為引物對，擴增得到PCR產(chǎn)物II，即為包括Luffin-β肽段、KDEL駐留信號序列和uPA識別序列的cDNA序列，再用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切所述PCR產(chǎn)物II和pET-32a ( + )載體,分別回收含 Luffin-β -KDEL-uPAcs 的 cDNA 序列片段和 pET_32a ( + )骨架片段，純化后連接，得陽性載體 pET-32a ( + )/Luffin-β-KDEL-uPAcs，SEQ ID N05 :5’-CATGCCATGGCTATGAACAGATTCACATTTCTCTCT-3’，SEQ ID N06 :5’-CCGCTCGAGTTATGCTGATCGTCCGCTTAGCTCATCTTTGTGTTTTGTAGGAATACCATCGTC-3，。
7.權(quán)利要求I或2所述TELKP融合免疫毒素的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將所述表達載體pET-32a ( + )/Luffun-β-KDEL-uPAcs 轉(zhuǎn)化表達菌 BL21 (DE3)； (2)挑取克隆轉(zhuǎn)種于含50μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入O. 4mmol/L IPTG，于30°C過夜誘導(dǎo)使其表達TELKP融合免疫毒素； (3)于4°C,6000r/min離心15min收集菌體，棄上清液，加入10倍體積的ρΗ7·3的PBS溶液重懸菌體，再加入PMSF和DTT，超聲破碎菌體，破菌完全后于4°C，10000r/min離心15min,將上清以O(shè). 45 μ m微孔濾膜過濾,再上樣于金屬螯合Ni2+柱,最后以Elution Buffer洗脫得到TELKP融合免疫毒素溶液。
8.權(quán)利要求3或4所述LKP融合免疫毒素的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (O向所述TELKP融合免疫毒素溶液加入EK酶過夜酶切； (2)酶切后的蛋白用陽離子交換柱 Pharmacia HiTrap SP Fast Flow column (26/20)洗脫純化得LKP融合免疫毒素溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表達載體及其制備方法，采用RT-PCR克隆絲瓜毒素Luffin-β基因，經(jīng)引物延伸法構(gòu)建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亞克隆至原核表達載體pET-32a(+)中，該表達載體經(jīng)誘導(dǎo)獲48.8KDa含Trx標簽蛋白的融合免疫毒素TELKP，腸激酶EK酶切TELKP獲16.9KDa的融合免疫毒素LKP；LKP免疫毒素可被uPA酶裂解釋放具活性的小分子毒素Luffin-β殺傷肺癌細胞，為讓帶uPA裂解位點序列的低活性或無活性的Luffin-β在高表達uPA的腫瘤組織細胞局部其活性被釋放而發(fā)揮局部殺瘤作用奠定基礎(chǔ)，為腫瘤的治療提供新策略。
文檔編號C12N15/70GK102924605SQ201210444580
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者項穎, 李啟英, 王莉 申請人:重慶市腫瘤研究所