專利名稱：千金藤素在制備抗sars病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體地是千金藤素在制備抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自正式確定非典型肺炎的病原體為SARS冠狀病毒以來，對于非典型肺炎及其病原體的防治和研究取得了極大進(jìn)展，抗SARS冠狀病毒藥物和疫苗研制工作也在全力進(jìn)行。SARS病毒是一種新型的冠狀病毒，具有較強(qiáng)的傳染性和變異性。目前SARS還缺乏特效的治療，目前的治療包括抗病毒治療如利巴韋林，血清療法等，用激素降低免疫系統(tǒng)對肺的損傷，用抗生素治療潛在的細(xì)菌感染，辨證的中西醫(yī)結(jié)合治療；呼吸機(jī)的應(yīng)用以及應(yīng)激和ARDS的對癥支持治療等。抗SARS藥物研制目前尚處于初期階段。國內(nèi)外多家實驗室用各種方式在不同水平正進(jìn)行著抗SARS病毒藥物的篩選工作。國內(nèi)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制的ω干擾素作為一種輔助性治療SARS藥物已通過鑒定，中國科學(xué)院上海藥物研究所以非典病毒E蛋白、N蛋白和(3CL)蛋白水解酶作藥靶，初步篩選到可能有抗SARS病毒活性的藥物19種，但是尚未見到有明確抗SARS病毒藥物的體外細(xì)胞實驗結(jié)果報道。千金藤素為米黃色粉末，經(jīng)圖譜(紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜)分析結(jié)果證明符合分子式C37H38N2O6，分子量為606.686，用非水滴定法測定純度達(dá)95％以上。本品易溶于氯仿、甲醇、乙醇，不溶于水。臨床上主要用于防治腫瘤患者因放、化療及其它原因所致的白細(xì)胞減少癥，是從防己科千金藤屬(Stephanialour)植物中提取分離出來的生物堿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供千金藤素在制備抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明是以千金藤素為有效成分制備抗SARS病毒藥物，可采用常規(guī)的制備工藝，制備成不同的藥物劑型供患者使用，如制成口服液、膠囊、粉劑、針劑等。
藥物注射液的用法與用量通常成人，一次50mg，一日一次，(與250ml 5％葡萄糖液混勻后，也可不加葡萄糖。)緩緩靜脈滴注。
以千金藤素為有效成分制備的抗SARS病毒藥物作用如下1、藥物對細(xì)胞的保護(hù)作用以不同濃度藥物加到長滿單層用于體外培養(yǎng)SARS病毒的Vero-E6細(xì)胞株Vero-E6細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)2h后棄藥液，接種100TCID50的SARS-CoV病毒液，37℃吸附5％CO2培養(yǎng)48h，觀察藥物處理后的細(xì)胞對SARS-CoV感染的影響。同時做單用病毒感染時的病毒對照、正常細(xì)胞對照。結(jié)果顯示在Vero-E6細(xì)胞上的最大無毒濃度為10μg/mL。
表1是用MTS/PMS法測定藥物對Vero-E6細(xì)胞的毒性劑量試驗結(jié)果表1

根據(jù)CC50綜合法求得CC5021.38ug/mL，即千金藤素對Vero-E6細(xì)胞的半致死劑量為21.38ug/ml。
2、藥物的抗SARS病毒作用用細(xì)胞病變(CPE)法觀察得千金藤素在不同情況下的效果。表2是不同劑量的千金藤素作用48h后，SARS-CoV感染的Vero-E6細(xì)胞病變情況表2

注“+”為CPE等級，0～25％為+、25％～50％為++、50％～75％為+++、75％～100％為++++結(jié)果顯示(1)藥物對SARS-CoV增殖的影響接種100TCID50的SARS-CoV于長滿單層Vero-E6細(xì)胞的96孔板上，37℃吸附2h，換上含相應(yīng)濃度藥物的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察藥物對SARS-CoV增殖的影響。結(jié)果顯示千金藤素對SARS-CoV的半抑制劑量為8ug/ml。
(2)藥物對SARS-CoV的直接殺傷作用含不同濃度藥物的維持液與等量病毒液后，置37℃作用2h后，將孵育液加入長滿單層Vero-E6細(xì)胞的96孔板中，0.1ml/孔，37℃吸附1h，換上含相應(yīng)濃度藥物的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察藥物對SARS-CoV的直接殺傷作用。結(jié)果顯示不同濃度藥物與病毒等量混合2h后，在10μg/ml時對細(xì)胞感染SARS-CoV皆有全抑制作用。
(3)藥物對SARS-CoV感染細(xì)胞的綜合作用藥物和病毒等量混合后直接加到長滿單層Vero-E6細(xì)胞的96孔板上37℃吸附2h，棄混合液加維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察藥物對SARS-CoV感染細(xì)胞的綜合作用。結(jié)果顯示千金藤素對SARS-CoV感染細(xì)胞的綜合作用效果為8ug/ml有抑制作用，濃度為10ug/ml時，對SARS-CoV病毒有100％的抑制效果。
(4)藥物對病毒感染細(xì)胞的預(yù)防作用不同濃度藥物預(yù)先與細(xì)胞作用2h后，接種病毒，千金藤素在10μg/mL時可以66％抑制SARS病毒感染的Vero-E6細(xì)胞病變。
(5)藥物對病毒感染細(xì)胞的治療作用千金藤素在10μg/ml時對細(xì)胞感染SARS-CoV有全部抑制作用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點1、在安全劑量范圍內(nèi)，對SARS病毒的抑制率高。
2、有較強(qiáng)的預(yù)防SARS病毒感染的作用。
3、愈后快，可以減輕感染病人的綜合癥狀。
4、藥物毒性小，穩(wěn)定性好，耐藥性強(qiáng)。


圖1是Vero-E6正常細(xì)胞圖；圖2是Vero-E6細(xì)胞被SARS-CoV感染后病變圖；圖3是千金藤素藥物對被SARS-CoV感染的Vero-E6細(xì)胞的保護(hù)效果圖。
具體實施例方式
如圖1所示，正常Vero-E6細(xì)胞貼壁生長，具有貼壁細(xì)胞的一般特性，細(xì)胞之間空隙小。如圖2所示，Vero-E6細(xì)胞被SARS-CoV感染后，細(xì)胞從壁上脫落，細(xì)胞碎裂。如圖3所示，被SARS-CoV感染Vero-E6細(xì)胞加入千金藤素處理后，僅有部分細(xì)胞從壁上脫落，大部分細(xì)胞的形態(tài)與正常細(xì)胞相同。
實施例11、實驗材料受試藥物是千金藤素，實驗時用生理鹽水配成混懸液，供實驗用。
2、實驗動物 昆明種小鼠，體重(20±2)g；Wistar大鼠，體重(270±20)g；C57BL/6小鼠，體重(20±2)g。
3、經(jīng)口灌胃給藥的急、慢性毒性試驗①對小鼠急性毒性(LD50)及最大耐受量測定試驗取預(yù)先空腹12h的動物30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，各劑量組間間距為0.85。將千金藤素分別配成濃度為(2.0，1.7，1.4％)，然后給動物0.4ml·10g-1體重，1次ig，最大劑量為800mg·kg-1，觀察1周，所有動物一般情況良好，無任何毒性反應(yīng)及死亡。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行1天內(nèi)最大耐受量試驗；另取動物20只，雌雄各半，禁食(不禁水)12h，然后按上法給動物1天2.0％的濃度ig兩次，總量達(dá)1600mg·kg-1，，相當(dāng)于人用量1.0mg·kg-1的1000倍以上，僅有少數(shù)動物出現(xiàn)少動，停止飲水和進(jìn)食，持續(xù)2～3h后，即恢復(fù)正常，無動物死亡。表明，千金藤素對昆明種小鼠ig途徑給藥的最大耐受劑量為1600mg·kg-1。②對大鼠的長期毒性實驗取大鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組20只，雌雄各半。(a)對照組NS，20ml·kg-1，ig；(b)和(c)組為千金藤素組，劑量分別為40，80mg·kg-1，ig(相當(dāng)于人用量的40，80倍)，每日1次，連用60d，ig；給藥。在用藥期間每日觀察動物一般情況(活動、毛發(fā)、食量、大便等)，每10d稱1次體重；在用藥30d及60d時測定血象(白細(xì)胞總數(shù)及分類，血小板、紅細(xì)胞、血色素)，肝腎功能，試驗結(jié)束，處死各組部分動物，剖取主要臟器(心、肺、肝、脾、腎、腸、胃、睪丸、子宮)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。其結(jié)果為各組所有動物一般情況良好；大劑量組動物體重增長較慢，而對血象、肝腎功能及各主要臟器的病理組織學(xué)均無明顯影響，與對照組相比，無差異。
實施例2對人進(jìn)行的臨床試驗，試驗組用藥，千金藤素注射液的用法與用量一次50mg，一日一次，緩緩靜脈滴注。對照組注射生理鹽水，其病情狀況如表3所示，治愈時間如表4所示表3病情狀況

該表結(jié)果顯示試驗組(即使用RD-01治療組)的病人比對照組的病人在病情上有較大的減輕。
表4治愈時間

注()號內(nèi)的數(shù)字為死亡人數(shù)。該表結(jié)果顯示試驗組(即使用RD-01治療組)的病人在治療時間比對照組有較大的縮短。
權(quán)利要求
1.一種千金藤素在制備抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用，是以千金藤素為有效成分制備抗SARS病毒藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的千金藤素在制備抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用，制備的藥物劑型是口服液、膠囊、粉劑、或針劑。
全文摘要
一種千金藤素在制備抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用，是以千金藤素為有效成分制備抗SARS病毒藥物，在安全劑量范圍內(nèi)，對SARS病毒的抑制率高；強(qiáng)的預(yù)防SARS病毒感染的作用；愈后快，可以減輕感染病人的綜合癥狀；藥物毒性小，穩(wěn)定性好，耐藥性強(qiáng)。
文檔編號A61P31/00GK1452967SQ03126918
公開日2003年11月5日 申請日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者王一飛, 李久香, 王慶瑞, 楊崇文, 陸家海, 劉新建 申請人:廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司