專利名稱：復(fù)方腎保護氨基酸組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬涉及一種新型復(fù)方氨基酸組合物，尤其涉及腎保護支鏈氨基酸組合物，及該組合物在治療腎功能障礙的制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
近年來關(guān)于應(yīng)用藥物預(yù)防和治療急性腎功能障礙時的細(xì)胞損傷和促進細(xì)胞修復(fù)與再生的報道日益增多。常見有腺嘌呤核苷酸類藥物、氧自由基清除劑、鈣離子阻滯劑、鈣鎂鋅等兩價陽離子、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、前列腺素。
氨基酸對腎功能保護作用的機理尚未闡明。若甘氨酸、丙氨酸用量過高(125umol/kg·min)，GFR下降32％，說明甘氨酸、丙氨酸用量過高有潛在腎毒性。低至中劑量的氨基酸可引起腎血管擴張及GFR的增加。Weinberg JM等發(fā)現(xiàn)存在甘氨酸和L-丙氨酸增加腎近端小管細(xì)胞耐受缺氧損傷，保護作用不依賴細(xì)胞內(nèi)的ATP的水平，和氨基酸的代謝無關(guān)。認(rèn)為高度的特異受體和配體的作用在維持細(xì)胞的完整性起關(guān)鍵作用。Paller Ms等發(fā)現(xiàn)甘氨酸和丙氨酸對培養(yǎng)腎近端小管細(xì)胞的缺氧再供氧有保護作用。Silva p等2mM的甘氨酸加入離體灌注大鼠腎模型中，甘氨酸能保護髓攀粗升支的缺氧損傷，丙氨酸也有同樣作用，與NO和降低細(xì)胞活動無關(guān)。Baines AD等發(fā)現(xiàn)在離體灌注腎模型中檢查氨基酸的保護作用發(fā)現(xiàn)甘氨酸和丙氨酸等中性氨基酸的保護不需代謝，和它們穩(wěn)定膜蛋白的三級結(jié)構(gòu)有關(guān)。
現(xiàn)臨床使用的復(fù)方腎病用氨基酸，主要通過給予必需氨基酸以糾正慢性腎時必需氨基酸血濃度下降，同時作為急性和慢性腎功能衰竭時營養(yǎng)支持。有高含量的賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等非支鏈氨基酸，對急性腎功能障礙無保護作用。如劑量過大具有潛在地腎毒性。
本發(fā)明的目的是通過下述方案實現(xiàn)的一種新型復(fù)方腎保護氨基酸組合物，其組合物及各組分的重量比為

本發(fā)明優(yōu)選的各組分的重量比為

本發(fā)明最優(yōu)選的各組分的重量比為

本發(fā)明的另一個目的是該組合物應(yīng)用于制備預(yù)防和/或治療由屬于順鉑類和缺血導(dǎo)致的急性腎功能障礙的藥物，包括注射劑，粉劑，片劑，膠囊等多種劑型。
本發(fā)明由于采用上述方案，因而具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明的組合物對順鉑類所致急性腎功能衰竭具有保護作用。
實驗研究表明本發(fā)明的氨基酸組合物能增加順鉑所致急性腎功能衰竭時腎小球濾過率；保護腎小管細(xì)胞中線粒體的氧化磷酸化，改善線粒體呼吸障礙；保護腎小管細(xì)胞中溶酶體和線粒體等多種細(xì)胞器損傷，改善Na，K的排泄異常。
2.本發(fā)明的組合物對腎缺血再灌注損傷具有保護作用。
實驗研究表明本發(fā)明的氨基酸組合物能增加缺血性腎功能障礙時的腎小球濾過率，尿流率；減緩血肌酐和尿素氮升高；減輕腎小管細(xì)胞損傷程度；減少腎小管細(xì)胞的凋亡；促進腎小管細(xì)胞熱休克蛋白HSP70和Bcl-2蛋白表達；減低腎臟內(nèi)皮素水平。
3.本發(fā)明的組合物可以避免單種甘氨酸或丙氨酸用于預(yù)防和/或治療急性腎功能障礙時甘氨酸、丙氨酸用量過高存在潛在腎毒性。
4.本發(fā)明的組合物的氨基酸可以為腎臟損傷修復(fù)與再生提供所需的各種氨基酸，同時也為腎衰病人提供營養(yǎng)支持和能量代謝保證。
5.本發(fā)明使用的各種支鏈氨基酸是人體組成天然氨基酸，來源豐富，價格實惠。
6.本發(fā)明的氨基酸組合模式合理。
實施例1本發(fā)明的組合物配制稱取甘氨酸5.5克，L-丙氨酸7.5克，L-蘇氨酸0克，L-絲氨酸7.5克，L-纈氨酸5克，L-亮氨酸5克，L-異亮氨酸2克，L-脯氨酸5克，用500ml 0.45％NaCl溶解，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)溶液PH值6.5。
實施例2氨基酸合劑對順鉑所致大鼠急性腎功能衰竭的保護作用實驗?zāi)Ｐ瓦x用體重250-350g雄性SD大鼠，分4組，對照組(n＝16)靜滴0.9％氯化鈉2ml，以后2ml/h速度維持；順鉑組(n＝12)靜滴0.9％氯化鈉2ml以后接受10mg/kg順鉑(10mg/ml)，氯化鈉溶液繼續(xù)2ml/h靜滴；順鉑+氨基酸組(n＝10)靜脈滴注8種L-氨基酸合劑2ml后，給予10mg/kg順鉑，繼以氨基酸2ml/h；氨基酸組(n＝16)靜脈滴注8種L-氨基酸合劑2ml后，以2ml/h維持。以戊巴比妥鈉60mg/kg腹腔注射麻醉，體溫維持在37C.一側(cè)股靜脈插入雙通道靜脈輸液器，用于注射液體。切開腹中線進入腹腔，于腎血管平面下插動脈導(dǎo)管進入腹主動脈，與描記器相連，記錄平均動脈壓，實驗中維持在100-120mmHg。經(jīng)膀胱壁插入硅膠導(dǎo)管，每30分鐘收集尿一次用于測尿流率，尿肌酐及鈉鉀濃度。體內(nèi)實驗完成時從門靜脈抽血2ml測定血肌酐濃度；分離結(jié)扎腸系膜上動脈及腎血管平面上下的主動脈，經(jīng)動脈導(dǎo)管用4度灌注液沖洗一側(cè)腎臟后取下。對側(cè)腎臟作形態(tài)學(xué)研究。腎小管線粒體呼吸功能的測定先分離腎小管線粒體，以極譜法在25度測定呼吸功能，極譜儀反應(yīng)池容積為0.45ml，通過Clark氧電極與描記器相連。測定時反應(yīng)池中加入0.45ml含5mmol/l蘋果酸及5mmol/l谷氨酸的線粒體混懸液，加0.5mmol/lADP后測定的氧耗率稱為狀態(tài)3呼吸，ADP耗盡時的氧耗率稱為狀態(tài)4呼吸。線粒體懸液中加入2nmol/l對三氟甲氧基腙羰基氰化物(FCCP)以測定FCCP解偶聯(lián)呼吸。
結(jié)果如下1.增加腎臟的腎小球濾過率，氨基酸合劑靜脈滴注3小時，與對照組(1.87±0.08)ml/min相比，GFR增加85％(3.45±0.21)ml/min，p＜0.01。
2.改善尿鈉鉀排泄異常。順鉑作用30min，腎小管細(xì)胞功能受損，尿鈉濃度增加56％，尿鉀濃度增加2.6倍，氨基酸合劑注射后尿鈉濃度迅速恢復(fù)正常，甚至低于對照組62％-71％，p＜0.01；尿鉀濃度恢復(fù)至對照組水平。
3.氨基酸改善腎小管細(xì)胞線粒體呼吸功能。順鉑作用后3小時，鼠腎小管細(xì)胞線粒體電子傳遞及ADP磷酸化和ATP功能均受抑制，狀態(tài)4呼吸增加1倍。狀態(tài)3呼吸、呼吸控制率(RCR)及FCCP解偶聯(lián)呼吸分別減少46％、74％及47％。同時應(yīng)用氨基酸合劑使?fàn)顟B(tài)4呼吸恢復(fù)至正常水平；受抑狀態(tài)3呼吸、RCR及FCCP解偶聯(lián)呼吸明顯改善，受抑百分比分別降為對照組的16％(p＜0.05)，22％(p＜0.01)，21％(p＜0.01)。氨基酸對鼠腎小管正常線粒體呼吸功能無影響。
實驗結(jié)果可知，本發(fā)明的組合物能增加順鉑所致急性腎功能衰竭時腎小球濾過率；保護腎小管細(xì)胞中線粒體的氧化磷酸化，改善線粒體呼吸障礙；保護腎小管細(xì)胞中線粒體損傷，改善Na，K的排泄異常。對順鉑類所致急性腎功能衰竭具有保護作用。
實施例3氨基酸合劑對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用。
1.本發(fā)明的組合物配制稱取甘氨酸7.5克，L-丙氨酸5.5克，L-蘇氨酸2.0克，L-絲氨酸7.5克，L-纈氨酸5克，L-亮氨酸2克，L-異亮氨酸0克，L-脯氨酸6.5克，用500ml 0.45％NaCl溶解，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)溶液PH值6.5。
2.實驗方案健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體重(230±18)g。隨機分A組假手術(shù)組，B組對照組，C組治療組。每組8只。2％戊巴比妥鈉60mg/kg腹腔注射麻醉。左股靜脈插管，接微泵持續(xù)輸注生理鹽水(A、B組)或氨基酸合劑(C組) 液體輸注速度1ml·100g-1·h-1。膀胱造瘺，接以預(yù)先稱重1.5ml微量離心管，收集尿標(biāo)本，計算尿流率。輸注液體60min后，行腹部正中切口，無損傷動脈夾阻斷雙腎蒂45min。假手術(shù)組不上夾。于再灌注30、60、90、120、150、180min留取尿標(biāo)本。3h時斷尾取血0.5ml。
再灌注24h時，取門靜脈血3ml，切取雙腎。血標(biāo)本離心后-20℃凍存。測定血清肌酐、尿素氮、鈉濃度；尿肌酐、鉀、鈉濃度。計算出180min內(nèi)生肌酐清除率，排鈉量、排鉀量、尿流率。腎臟標(biāo)本10％中性甲醛固定，HE(蘇木素—伊紅)常規(guī)染色，常規(guī)光鏡檢查。按Paller標(biāo)準(zhǔn)評分。免疫組化檢測HSP70和BCL-2蛋白的表達。新鮮腎標(biāo)本制作單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測溴化丙啶染色和Anenexin法的腎小管細(xì)胞凋亡情況。稱取100mg腎皮質(zhì)用放射免疫法測定內(nèi)皮素(ET-1)含量。
結(jié)果如下1.尿流率的變化在再灌注30min時尿量3組無顯著性差異。對照組在再灌注60min開始尿量明顯增加，60、90、120、150、180min與假手術(shù)組比較有顯著性差異。氨基酸合劑治療組在60min開始尿量明顯增加，高于其他組；90、120、150、180min時與對照組比較有顯著性差異。見表1。
表1 大鼠急性缺血后尿量UV(ul/min)的變化組別 AB C30min6.1±1.5 5.5±4.6 6.1±2.960min6.1±1.1#19.6±11.832.6±14.390min5.6±1.7*24.3±7.7 63.6±15.2*120min 6.2±1.9*26.1±7.6 82.1±36.2#150min 6.1±2.0*28.0±9.6 91.7±35.2*180min 5.7±1.2*32.5±13.0111.0±59.1#與對照組比較，#p＜0.05，*p＜0.012.再灌注3、24h血肌酐、尿素氮濃度變化至3h時血肌酐3組無顯著性差異。3h血尿素氮對照組高于假手術(shù)組，有顯著性差異；氨基酸合劑治療組高于對照組，差異有顯著性。24h時血肌酐、尿素氮對照組高于假手術(shù)組，差異有顯著性；氨基酸合劑治療組血肌酐、尿素氮低于對照組，有顯著性差異。見表2。
表2 大鼠急性缺血后血肌酐尿素氮和尿肌酐排出和內(nèi)生肌酐清除率的變化組別 A B C3h Cr(umol/L) 116.7±27.8136.0±9.6119.8±23.73h B UN(mmol/L)7.4±0.9* 12.1±3.6 17.9±2.8#24h Cr(umol/L) 68.8±5.5* 112.7±19.5 85.0±7.7*24h BUN(mmol/L)7.1±1.1* 20.7±6.6 11.4±3.9#90min肌酐排出(nmol/min)46.8±6.2* 20.4±6.0 64.1±10.9*180min肌酐排出(nmol/min) 45.3±5.6* 31.4±4.0 57.9±12.4#180min肌酐清除率(ul/min) 469.0±55.4* 227.5 ±27.0 471.0±121.5*與對照組比較，#p＜0.05，*p＜0.013.尿肌酐排出、180min內(nèi)生肌酐清除率變化90、180min時尿肌酐排出量對照組低于假手術(shù)組，有顯著性差異；氨基酸合劑治療組尿肌酐排出量高于對照組，有顯著性差異。180min時內(nèi)生肌酐清除率對照組低于假手術(shù)組，有顯著性差異；氨基酸合劑治療組內(nèi)生肌酐清除率高于對照組，有顯著性差異。見表2。
4.尿鈉、尿鉀排出變化90、180min尿鉀濃度3組無顯著性差異。90、180min時尿鉀排出量對照組明顯高于假手術(shù)組，有顯著性差異。氨基酸合劑治療組尿鉀排出量高于對照組，有顯著性差異。90分鐘時尿鈉濃度，90、180分鐘尿鈉排出量對照組高于假手術(shù)組，有顯著性差異。氨基酸合劑治療組90分鐘時尿鈉濃度，90、180分鐘尿鈉排出量高于對照組，有顯著性差異。180分鐘時尿鈉濃度3組無顯著性差異。見表3。
表3 大鼠急性缺血后尿鉀與鈉濃度和尿與鉀鈉排出量的變化組別 A B C90min鉀濃度(mmol/L)57.8±113.655.1±21.1 52.2±14.090min鉀排出量(nmol)310.8±555.0* 1259.0±253.8 3137.6±251.2*180min鉀濃度(mmol/L46.9±76.8 57.3±15.8 42.6±30.4180min鉀排出量(nmol) 284.5±469.6* 1554.7±421.9 3162.5±1191.9#90min鈉濃度(mmol/L 45.3±23.6*92.2±29.0 117.3±25.3#90min鈉排出量(nmol 285.4±86.9* 2152.6±598.6 7683.9±3258.9*180min鈉濃度(mmol/L) 64.4±55.2 72.1±53.4 86.3±23.4180min鈉排出量(nmol) 383.1±337.9# 2111.5±1547.6 9307.3±5240.9*與對照組比較，#p＜0.05，*p＜0.015.減少腎組織內(nèi)皮素的升高，B組缺血45min，再灌注15min、3h時腎組織內(nèi)皮素(ET-1)分別是7.3±2.5，10.1±2.8，13.0±2.7(pg/mg)，氨基酸合劑組再灌注15min、3h時腎組織內(nèi)皮素(ET-1)分別是7.2±0.8，9.6±1.0(pg/mg)，差異有顯著性p＜0.05。通過減低腎臟內(nèi)皮素水平，改善腎臟的缺血再灌注時的微循環(huán)障礙。
6.腎小管細(xì)胞凋亡的變化，在再灌注15min，凋亡和壞死的細(xì)胞白分率在A組5.4±1.1，B組9.0±2.2，C組16.5±3.2，氨基酸合劑有明顯減少腎小管細(xì)胞的凋亡(p＜0.05)；7.腎組織學(xué)檢查正常大鼠腎臟HE切片未發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變。光鏡下對照組近曲小管上皮細(xì)胞空泡變性和壞死，腎小管腔擴張，內(nèi)可見管型和壞死脫落的細(xì)胞損傷累及近曲小管所有細(xì)胞；可見明顯管周血管的擴張淤血間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤。氨基酸合劑治療組近曲小管上皮細(xì)胞部分腫脹、顆粒變性和小空泡變性罕見細(xì)胞壞死和管型。Paller評分氨基酸治療組低于對照組(108.7±5.7vs168.8±14.8)p＜0.01。
8.腎組織HSP70和Bcl-2蛋白的表達的變化。
用免疫組化技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，氨基酸治療組抗損傷內(nèi)在保護蛋白HSP70表達較對照組明顯升高，同時發(fā)現(xiàn)氨基酸治療組的抗凋亡蛋白Bcl-2也較對照組增加。本氨基酸合劑的保護機制之一可能是通過促進上述蛋白表達起保護作、尿素氮和尿肌酐排出和內(nèi)生肌酐清除率的變化。
綜上實驗結(jié)果可知，氨基酸組合物能增加缺血性腎功能障礙時的腎小球濾過率，尿流率；減緩血肌酐和尿素氮升高；減輕腎小管細(xì)胞損傷程度；減少腎小管細(xì)胞的凋亡；促進腎小管細(xì)胞熱休克蛋白HSP70和Bcl-2蛋白表達；減低腎臟內(nèi)皮素水平。本發(fā)明的組合物對腎缺血再灌注損傷具有保護作用。本發(fā)明組合物具有良好的開發(fā)和臨床應(yīng)用前景。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種變更和改進。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻1.劉平。急性腎功能衰竭。見王海燕主編。腎臟病學(xué)(第二版)。北京人民衛(wèi)生出版社，1996，1341-1378.
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權(quán)利要求
1.一種新型復(fù)方腎保護氨基酸組合物及其應(yīng)用，其特征是組合物及各組分的重量比為
2.如權(quán)利要求1所述的新型復(fù)合腎保護氨基酸組合物的應(yīng)用，其特征是該組合物可應(yīng)用于制備預(yù)防和/或治療由屬于順鉑類和缺血導(dǎo)致的急性腎功能障礙的藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的新型復(fù)合腎保護氨基酸組合物，其特征是組合物優(yōu)選各組分的重量比為
4.如權(quán)利要求1和3所述的組合物，其特征是組合物最優(yōu)選各組分的重量比為
5.如權(quán)利要求2所述的組合物的應(yīng)用，其特征是該組合物制備的藥物包括注射劑，粉劑，片劑，膠囊等多種劑型。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型復(fù)方腎保護氨基酸組合物及其應(yīng)用，該組合物包含甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、吉氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸等支鏈氨基酸。本發(fā)明提供的組合物適用于制備預(yù)防和/或治療由順鉑類和缺血導(dǎo)致的急性腎功能障礙的藥物，包括注射劑，粉劑，片劑，膠囊等多種劑型。本發(fā)明對接受順鉑類腫瘤化療藥物治療的病人以及各種原因引起急性腎臟缺血再灌注損傷的病人，具有良好預(yù)防和/或治療急性腎功能障礙的，可用于預(yù)防和/或治療由順鉑類和缺血引起的腎功能障礙等疾病。
文檔編號A61P13/12GK1439364SQ0311604
公開日2003年9月3日 申請日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日
發(fā)明者謝立平 申請人:浙江大學(xué)