專利名稱：5,7,4'-取代黃酮在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及5，7，4’-取代黃酮的應(yīng)用，具體地說，涉及5，7，4’-取代黃酮在制藥領(lǐng)域中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
5，7，4’-取代黃酮是由中藥凌宵花、茺蔚子、女貞子、荊芥、麻黃中提取或由提取物經(jīng)化學(xué)修飾而獲得，其結(jié)構(gòu)通式如下 式中R1＝H，CH3，CH3CO或-C6H11O5(glucosyl，葡糖基)；R2＝H或-C6H11O5(rhammosyl，鼠李糖基)。
5，7，4’-取代黃酮目前已知醫(yī)藥用途是在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用，而將其應(yīng)用于制備治療或預(yù)防肝硬化的藥品中未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供5，7，4’-取代黃酮的新的用途，即涉及5，7，4’-取代黃酮作為制備治療或預(yù)防肝硬化的藥品中的應(yīng)用。
本發(fā)明所用的5，7，4’-取代黃酮均采用現(xiàn)有技術(shù)由中藥凌宵花、茺蔚子、女貞子、荊芥、麻黃中提取或由提取物經(jīng)化學(xué)修飾而獲得，具體的提取和化學(xué)修飾方法參見<中草藥>1981；12(8)372，Biochem Syst Ecol 1993；21(4)531，Anal Chem 1965211190，沈陽藥學(xué)院學(xué)報(bào)1984；(1)44，中藥通報(bào)1985；10(8)36，其中R1＝CH3CO，R2＝H的取代物由5，7，4’-三羥基黃酮與乙酰氯反應(yīng)，再經(jīng)硅膠柱sephadex LH-20分離制備。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)及方便說明，下面以5，7，4’-三羥基黃酮(俗稱芹黃素，apigenin，縮寫AP)為例，通過其的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明5，7，4’-三羥基黃酮在制藥領(lǐng)域中的新用途。其它取代黃酮化合物均采用相同的藥理試驗(yàn)方法且有相同的結(jié)論，限于篇幅，在此不一一例舉。因此，下面所舉例子并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
1、芹黃素對(duì)SD大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的保護(hù)作用。
以Sprague-Dawley(SD)大鼠(雌雄各半，體重164±30g)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共設(shè)陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽性對(duì)照組(苦參堿)、芹黃素(AP)10mg/kg及50mg/kg組。均灌胃(ig)給藥。
試驗(yàn)方法SD大鼠隨機(jī)分組，皮下注射50％四氯化碳(tetrachloride，CCL4)-橄欖油0.1ml/kg，每周2次，制備大鼠肝纖維化模型，模型對(duì)照組僅注射橄欖油。陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和藥物組同時(shí)每日ig生理鹽水，苦參堿50mg/kg以及芹黃素10mg/kg和50mg/kg。于實(shí)驗(yàn)第3，6，12周處死動(dòng)物，取血制備血清測定丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)和透明質(zhì)酸(hyaluronate，HA)；取肝臟組織進(jìn)行病理檢查以及測定肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HyP)。
試驗(yàn)結(jié)果(1)對(duì)血清中ALT、HA和HyP的影響在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，3周時(shí)血清中ALT和HA明顯升高，HyP未明顯變化；6周和12周時(shí)ALT、HA和HyP均明顯升高。在此基礎(chǔ)上，觀察AP對(duì)ALT、HA和HyP的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芹黃素10和50mg/kg以及陽性對(duì)照組苦參堿50mg/kg均能顯著降低升高的ALT、HA和HyP。(表1)。
表1芹黃素對(duì)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、透明質(zhì)酸和肝臟羥脯氨酸的影響正常組 溶劑對(duì)照組芹黃素 芹黃素 苦參堿(模型組) 10mg/kg 50mg/kg 50mg/kg第3周ALT(U/L)157±16 555±178**425±64Δ350±28Δ406±89HA(ng/ml) 183±17 466±37** 362±76Δ295±102Δ334±31ΔΔHyP(μg/mg) 1.18±0.20 1.35±0.111.36±0.12 1.23±0.12 1.37±0.34第6周ALT(U/L)194±58 506±57** 336±28ΔΔ304±69ΔΔ374±70ΔΔHA(ng/ml) 181±48 451±80** 228±78ΔΔ191±67ΔΔ307±59ΔΔHyP(μg/mg) 1.23±0.72 4.85 ±2.92±0.32Δ2.28±0.64Δ3.15±1.031.76*第12周ALT(U/L)182±60 881±50** 644±35ΔΔ605±23ΔΔ685±58ΔΔHA(ng/ml) 169±33 448±78** 211±75ΔΔ184±82ΔΔ313±26ΔΔHyP(μg/mg) 1.33±0.51 6.28±2.27** 2.89±0.43Δ2.52±0.55Δ3.35±0.96Δ與正常組比較，**P＜0.01，與溶劑對(duì)照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01(2)對(duì)肝臟病理變化的影響組織病理檢查結(jié)果顯示，在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，3周時(shí)可見肝細(xì)胞大量變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤；6周和12周時(shí)肝細(xì)胞變性、壞死且伴有成纖維細(xì)胞大量浸潤，膠原纖維增生。芹黃素10和50mg/kg以及陽性對(duì)照組苦參堿均能顯著減輕大鼠肝細(xì)胞變性、壞死和結(jié)締組織形成(表2)。
表2 芹黃素對(duì)肝臟病理變化的影響變性壞死 炎性細(xì)胞浸潤纖維組織增生3周 6周12周3周 6周12周3周6周12周正常組 -- - - -～+ -～+- - -溶劑對(duì)照組 ++～++ ++～++ ++ +++ - + ++～+++ +++AP 10mg/kg --～+ ++ -～++ + - -～+ +AP 50mg/kg --～+ + -～+-～+ + - -～+ -～+苦 參 堿 --～+ ++ -～++ + - -～+ +50mg/kg2、芹黃素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和膠原合成的作用。
試驗(yàn)方法HSC-T6細(xì)胞增殖試驗(yàn) 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入1×104個(gè)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6，在37℃ CO2孵箱中孵育24h，然后加入100μl含有不同藥物濃度和10％新生牛血清(NCS)的DMEM培養(yǎng)液或無藥培養(yǎng)液(含最大藥物濃度時(shí)的溶劑量)，繼續(xù)培養(yǎng)48h后結(jié)晶紫染色法測定吸收度值D(595)。試驗(yàn)血小板衍生生長因子(PDGF)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，則將細(xì)胞培養(yǎng)上清液棄去，加入含0.4％NCS的培養(yǎng)液孵育48h，然后加入藥物與PDGF，再孵育24h，最后測定吸D(595)。
HSC-T6膠原合成的測定 采用3H-脯氨酸同位素法。將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105個(gè)/ml，在96孔板上每孔加100μl，培養(yǎng)24h使之形成單層，以消除細(xì)胞生長對(duì)膠原合成的影響。然后加入含50μg.ml-1的維生素C的藥物與10％NCS或轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)再培養(yǎng)48h，同時(shí)加入每孔[3H]-脯氨酸18.5kBq。細(xì)胞用胰酶消化后，收集于玻璃纖維濾紙上，用液閃儀測定細(xì)胞3H-脯氨酸摻入值(cpm)。
試驗(yàn)結(jié)果(1)芹黃素對(duì)血清促HSC-T6細(xì)胞增殖和膠原合成的影響芹黃素(6.25～50μmol.L-1)能顯著濃度依賴地抑制10％的小牛血清刺激的HSC-T6細(xì)胞增殖以及膠原合成的作用，苦參堿2mmol.L-1也有同樣的抑制作用(表3)。
表3芹黃素對(duì)血清刺激的HSC-T6細(xì)胞增殖和膠原合成的影響組別細(xì)胞增殖/膠原合成/[n＝6，D(595)] (n＝6，A/cpm)溶劑對(duì)照組 1.00±0.053089±258苦參堿2mmol.L-10.58±0.07**2172±241**芹黃素(μmol.L-1)6.25 0.98±0.113051±24712.5 0.84±0.02**2668±314*25.0 0.72±0.05**2288±425**50.0 0.46±0.08**2114±310**與溶劑對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01(2)芹黃素對(duì)PDGF促HSC-T6細(xì)胞增殖和TGFβ1促膠原合成的影響PDGF 10ng.ml-1能顯著促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞增殖，增殖率為42.86％，TGFβ12ng.ml-1能增加細(xì)胞膠原合成，增加百分率為86.1％(P＜0.01)。芹黃素(6.25～50μmol.L-1)能濃度依賴地抑制PDGF和TGFβ1的作用，苦參堿2mmol.L-1也有同樣的抑制作用(表4)。
表4 芹黃素對(duì)血小板源生長因子促HSC-T6細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化生長因子β1促膠原合成的影響組別 細(xì)胞增殖/ 膠原合成/[n＝6，D(595)](n＝6，A/cpm)DMEMa0.63±0.03 3688±255對(duì)照組b0.90±0.07++6717±699++苦參堿2mmol.L-10.64±0.07**3256±112**芹黃素(μmol.L-1)6.25 0.82±0.06*6538±48412.5 0.73±0.04**5328±159**25.0 0.64±0.02**3964±502**50.0 0.58±0.05**2909±347**a含0.5％ NCS，b含藥物溶劑和PDGF(10ng.ml-1)或TGFβ1(2ng.ml-1)；與DMEM組相比，++P＜0.01，與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明發(fā)掘了已知化合物5，7，4’-取代黃酮的新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明的5，7，4’-取代黃酮安全無毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。
(3)提取本發(fā)明的5，7，4’-取代黃酮的原料來源豐富，提取技術(shù)成熟，并可做成口服劑型或注射劑型等，使用方便。
權(quán)利要求
1.5，7，4’-取代黃酮，其結(jié)構(gòu)式如下 式中R1＝H，CH3，CH3CO或-C6H11O5(glucosyl)；R2＝H或-C6H11O5(rhammosyl)在制備治療或預(yù)防肝硬化的藥品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及5，7，4’－取代黃酮的新用途，所述的5，7，4’－取代黃酮是由中藥凌宵花、茺蔚子、女貞子、荊芥、麻黃中提取或由提取物經(jīng)化學(xué)修飾而獲得，能明顯抑制肝星狀細(xì)胞增殖以及膠原合成，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化和肝硬化具有防治作用，等效劑量明顯低于苦參堿。本發(fā)明拓寬了5，7，4’－取代黃酮的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K31/352GK1526389SQ0311563
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2003年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月3日
發(fā)明者張俊平, 肖振宇, 謝天培 申請(qǐng)人:張俊平, 肖振宇, 謝天培