專利名稱：含有類黃酮醛類的驅(qū)避組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為害蟲(chóng)驅(qū)避劑的類黃酮醛類。本發(fā)明是通過(guò)作為驅(qū)蚊劑和用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)和薊馬的肉桂醛或α-己基肉桂醛的應(yīng)用來(lái)舉例說(shuō)明的。背景今天在很多國(guó)家，疾病例如瘧疾、媒體傳染的出血性發(fā)熱、蟑螂過(guò)敏癥、污穢蚤癥、腺鼠疫、蜱病毒癥、立克次體、螺旋菌、住血吸蟲(chóng)病、和沙蠅熱仍是在居民間引起嚴(yán)重疾病和許多死亡的原因。人們對(duì)于保護(hù)瀕危物種關(guān)注的不斷增長(zhǎng)，以及公共衛(wèi)生廣譜性農(nóng)藥有效性呈下降性趨勢(shì)，迫使科學(xué)家們?nèi)ふ铱商峁┍Ｗo(hù)以免受疾病媒介侵害的其它經(jīng)濟(jì)方式。但是，對(duì)于許多較不發(fā)達(dá)的國(guó)家而言，農(nóng)藥的費(fèi)用通常太高，且存在著媒介對(duì)這些化合物不斷增長(zhǎng)的抗性這一日益嚴(yán)重的問(wèn)題。
當(dāng)其它傳統(tǒng)的媒介控制法不可行時(shí)，使用驅(qū)避劑是一種相當(dāng)好的替代方法。對(duì)于哺乳動(dòng)物的媒介靶體而言，將驅(qū)避劑適當(dāng)?shù)厥┯糜谄つw或是衣服上是不昂貴，而且是降低噬血節(jié)肢動(dòng)物叮咬活性和防止媒介疾病傳播的實(shí)際方法。驅(qū)避劑對(duì)廣范圍的疾病媒介是有效的，而疫苗則須針對(duì)每一種疾病必須個(gè)別地開(kāi)發(fā)出來(lái)，并且只有一少部分的疫苗對(duì)于通過(guò)媒介傳染的疾病是有效的。通過(guò)媒介傳播的疾病也會(huì)影響植物體。例如，荷蘭榆樹(shù)病破壞了遍及美國(guó)的數(shù)百萬(wàn)計(jì)的榆樹(shù)。此病是由真菌所引起的，該真菌通過(guò)榆樹(shù)對(duì)之有吸引力的特殊昆蟲(chóng)種類在樹(shù)與樹(shù)之間傳播而造成病害感染。目前的預(yù)防法只所獲得了有限的成功。因此需要一種對(duì)此破壞性植物病害有效的預(yù)防法。
取消在媒介控制和疾病預(yù)防上使用驅(qū)避劑通常是著眼于安全和費(fèi)用方面的問(wèn)題。例如，廣泛使用的驅(qū)避劑之一是6-2-2驅(qū)避劑，它包含酞酸二甲酯、乙基己二醇和避蚊酮，比例為6∶2∶2。酞酸二甲酯和避蚊酮仍是限制使用，但在1991年美國(guó)環(huán)境保護(hù)局應(yīng)有關(guān)的生產(chǎn)者的要求，取消所有乙基己二醇的注冊(cè)。作此之舉是因?yàn)橛行碌馁Y料表明它有可能對(duì)胎兒發(fā)育有不利的影響。
另一例子，最有效的驅(qū)蚊劑之一是避蚊胺(N，N-二乙基-1，3-甲基苯甲酰胺)。局部使用時(shí)，此物質(zhì)使其它驅(qū)避劑均黯然失色，在其發(fā)現(xiàn)近四十年后，它仍是當(dāng)今使用的最主要的驅(qū)避劑。但近年來(lái)，氯菊酯-一種除蟲(chóng)菊的合成衍生物，大量地取代避蚊胺，用于衣服和其它紡織物品上。作為驅(qū)避劑，避蚊胺是高效的，但它也可能造成過(guò)敏和毒性影響，特別是當(dāng)以高濃度重復(fù)用于皮膚上時(shí)。含有90％至99％避蚊胺的驅(qū)避劑制劑被認(rèn)為是高濃度的，但含有50％或更少避蚊胺的驅(qū)避劑制劑被認(rèn)為是與100％濃度同樣有效。濃度33％的避蚊胺可有效地提供10到14小時(shí)的保護(hù)。然而，對(duì)于含有低濃度避蚊胺的產(chǎn)品，為了使可能的不良作用降至最低，建議在不再需要驅(qū)避劑時(shí)，趕緊用溫和的肥皂清洗皮膚并用水清洗。這些建議通常不適于第三世界國(guó)家和軍事用途。
現(xiàn)有一些局部施用于哺乳動(dòng)物以及驅(qū)避昆蟲(chóng)使之不侵入居所和其它地區(qū)的驅(qū)避組合物。但許多這類局部施用組合物的安全性已受到質(zhì)疑。此外，許多這類局部施用組合物的效果有限，特別是在受昆蟲(chóng)嚴(yán)重侵害的區(qū)域。哺乳動(dòng)物外部昆蟲(chóng)侵害的處理，例如虱或蟹，通常涉及局部施用高毒殺蟲(chóng)組合物于皮膚或頭皮。通常會(huì)產(chǎn)生刺激，且長(zhǎng)期使用而引起的有害于健康的作用也是已知的。因此需要一種對(duì)哺乳動(dòng)物安全有效的局部施用驅(qū)避組合物。防止昆蟲(chóng)進(jìn)入的驅(qū)避組合物同樣也是沒(méi)有效果的。因?yàn)槠涓叨拘裕S多的這類已知驅(qū)避組合物在密閉的空間使用也是不安全的，特別是小孩和寵物可能進(jìn)入而與之接觸時(shí)。因此需要一種無(wú)刺激、無(wú)毒性且有效的驅(qū)避組合物。
樹(shù)木和其他木本植物的昆蟲(chóng)侵害每年破壞數(shù)百萬(wàn)計(jì)的觀賞樹(shù)木和農(nóng)作物。目前的處理只是部分成功，并會(huì)使得農(nóng)產(chǎn)品作物無(wú)價(jià)值，因?yàn)樗鼈兇嬖跉埩舳拘浴Ｒ虼?，也需要一種驅(qū)避樹(shù)木及木本灌木的昆蟲(chóng)侵害的相對(duì)無(wú)殘留的、有效的方法。相關(guān)文獻(xiàn)美國(guó)專利USP5,093,326公開(kāi)了驅(qū)避組合物，其包括臭氧化的未飽合碳?xì)浠衔?，包括帖烯。美?guó)專利USP5,365,017公開(kāi)了具有增加的環(huán)阿屯醇水平之轉(zhuǎn)基因植物的制備。與驅(qū)避制劑有關(guān)的文獻(xiàn)包括Reifenrath等人(1989)，J.Am.Mosquito Control Association 545-61和Reifenrath (1995)Cosmetics & Toiletries Magazme 11085-93。
發(fā)明概述本發(fā)明提供含有類黃酮醛類的驅(qū)避組合物和使用這些組合物的方法。這些驅(qū)避組合物含有下述(1)中所示結(jié)構(gòu)式的化合物

其中R表示-CH2OH或-CHO；n是從0至3的整數(shù)；而每個(gè)R1獨(dú)立地表示OH或是含有從1至10個(gè)碳原子和從0至5個(gè)雜原子的有機(jī)取代基，其中在所述化合物的所有R1取代基中的碳原子和其它原子的總數(shù)不多于15；且R4表示氫或含有1至10個(gè)碳原子的有機(jī)取代基。這些化合物包括天然的化合物如肉桂醛。同樣感興趣的還有α取代的醛，如α-己基肉桂醛(HCA)。使用時(shí)，將化合物施用于表面上，如皮膚、衣服、樹(shù)皮、棲息地等等希望驅(qū)避昆蟲(chóng)和其它害蟲(chóng)之處。本發(fā)明可用來(lái)例如預(yù)防因與攜帶疾病的昆蟲(chóng)媒介或其它害蟲(chóng)媒介接觸而造成的疾病和感染。
具體實(shí)施方案描述本發(fā)明提供獲得和/或維持一區(qū)域基本上沒(méi)有昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)的方法和組合物。與驅(qū)避害蟲(chóng)及引起疾病的生物體的方法一起提供的還有哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)類和它們的棲息地，以及種子、苗木、植物或植物部分如果實(shí)，它們基本上無(wú)病原生物體例如真菌、昆蟲(chóng)和其它害蟲(chóng)以及病毒、細(xì)菌、螺旋體和其它引起疾病的生物體、和吸樹(shù)汁昆蟲(chóng)。將感興趣的表面與足夠驅(qū)除昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)的量之類黃酮醛類接觸。所施用的驅(qū)避劑的量將部分取決于表面的性質(zhì)，且在某種程度上取決于所用的制劑和特定的化合物，且因此必須用具體的昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)經(jīng)驗(yàn)地決定最好的結(jié)果。
本發(fā)明的組合物和方法有幾項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)是優(yōu)于現(xiàn)有組合物和方法的。主要的優(yōu)點(diǎn)在于本配方組合物成分一般是認(rèn)為安全的(GRAS)且是許可用于食品的，例如，可在本發(fā)明制劑中找到用途的芳香醛類，如α-己基肉桂醛、肉桂醛和香草醛是GRAS合成的調(diào)味劑(21CFR§172.515)。HCA在1950年以前已普遍使用，且今天仍廣泛用在化妝制劑上(肥皂、洗滌劑、霜?jiǎng)?、洗劑、香?(香味原料專題，F(xiàn)ood Cosmet.Toxicol.12suppl.，915，1974)。HCA在1965年得到FEMA的許可GRAS地位(香味提取物生產(chǎn)商聯(lián)合會(huì)、調(diào)味成后應(yīng)用水平的調(diào)查，No.2569，F(xiàn)d.Technol.，Champaign，19(part 2)155，1965)，且被US FDA許可用于食品(21 CFR121，1164)。歐洲委員會(huì)(1970)(歐洲委員會(huì)，天然和人工調(diào)味物質(zhì)，在社會(huì)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的部分協(xié)議，Strasbourg，List A(1)，Series 1，no，129，p.55，1970)在許可的合成調(diào)味物質(zhì)中包括1ppm水平的HCA。
在本發(fā)明制劑中可用作乳化劑的表面活性劑，如吐溫(聚山梨酸酯)也已經(jīng)用作食物添加劑，皂草苷也一樣(它也得到GRAS地位)。此外，制劑的殘留性可以想辦法解決。由于可以獲得短期殘留，因此這對(duì)于害蟲(chóng)綜合治理有著巨大利益的的公開(kāi)制劑組分使用許可的GRAS和食物。病原生物體得以長(zhǎng)期控制會(huì)產(chǎn)生與非轉(zhuǎn)基因植物相比更健康的植物和宿主植物更高的產(chǎn)量。尤其是芳香醛具有積極的器官和嗅覺(jué)性能，這些性能在一些情況下可以改善處理的產(chǎn)品的香味和/或臭味，且可以消除與許多害蟲(chóng)驅(qū)避劑有關(guān)的不愉快氣味。例如，α-己基肉桂醛(HCA)的氣味被描述為帶一些草本特點(diǎn)的花或茉莉樣的氣味(Technical DataSheet)。
對(duì)于植物而言，活性成分可以通過(guò)將負(fù)責(zé)合成各種醛類的一或多種基因引入植物細(xì)胞基因組，而由植物生產(chǎn)。因?yàn)樵S多式(1)的化合物，特別是式(3)和(4)的化合物是GRAS食物添加劑，因此使用轉(zhuǎn)基因植物而非局部施用驅(qū)避劑于植物體，會(huì)降低對(duì)攝食植物組織或部分的田野工作者或動(dòng)物、魚(yú)類或鳥(niǎo)類所可能有的任何不良副作用。除此之外，現(xiàn)今的農(nóng)藥不能轉(zhuǎn)移至例如根來(lái)處理根瘤蚜，本發(fā)明克服了這一缺點(diǎn)。同樣，通過(guò)驅(qū)除攜帶疾病或破壞靶體的害蟲(chóng)媒介來(lái)避免侵害，會(huì)明顯地降低將死于由害蟲(chóng)帶來(lái)的疾病或被害蟲(chóng)的活動(dòng)所傷害的靶體動(dòng)物或植物的數(shù)目，例如被雌性地中海實(shí)蠅產(chǎn)卵于果實(shí)中所造成的傷害。
當(dāng)用于包括人的動(dòng)物時(shí)，本發(fā)明制劑是無(wú)毒的且在使用濃度下對(duì)皮膚無(wú)刺激。例如，α-己基肉桂醛(HCA)的大鼠口服LD50為3.1g/kg，經(jīng)皮LD50大于3g/kg(Moreno，O.M Report to RIFM，March 24，1971)。在吸留的情況下，對(duì)未去毛或去毛的免子涂用24小時(shí)，發(fā)現(xiàn)HCA為純化合物時(shí)有中度的刺激(Moreno)。當(dāng)用其12％的凡士林膏試驗(yàn)時(shí)，對(duì)人受試驗(yàn)者的緊貼膏藥試驗(yàn)(closed-patch test)48小時(shí)后，HCA不產(chǎn)生刺激，且在25位人受試驗(yàn)者上進(jìn)行的最大限度試驗(yàn)中不產(chǎn)生敏感性(Kligman(1966)J.Invest.Dermatol.47393)。在100位人受試驗(yàn)者上進(jìn)行的重復(fù)損害膏藥試驗(yàn)(insult patch test)中，在鄰苯二甲酸二乙酯中的20％HCA不產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。在文獻(xiàn)中可以找到18種芳香化合物的Jimbo制成表的過(guò)敏性數(shù)據(jù)。雖然肉桂醛在人的最大限度試驗(yàn)中有陽(yáng)性反應(yīng)，但HCA在此試驗(yàn)中的反應(yīng)是陰性的。2％的HCA在100位濕疹和皮炎患者上的膏藥試驗(yàn)結(jié)果是陰性的(0/100)。4位對(duì)2％肉桂醛敏感的患者，未見(jiàn)對(duì)2％的HCA有交互反應(yīng)。對(duì)肉桂醛頻繁報(bào)道的皮膚過(guò)敏可能是由于蛋白上的氨基酸與醛功能基團(tuán)反應(yīng)而刺激的。在相對(duì)于醛基的α位上的大烷基基團(tuán)的取代(例如HCA的己基)，可以通過(guò)創(chuàng)造立體障礙以及減少醛碳原子的親電性來(lái)降低這種反應(yīng)。α-取代的肉桂醛的皮膚敏感性是不常見(jiàn)的。與肉桂醛相比，α-己基肉桂醛與胺的反應(yīng)非常緩慢或甚至不反應(yīng)。在用豚鼠作的最大限度試驗(yàn)研究中，Senma及其合作者報(bào)道有這么一種趨勢(shì)，即，在肉桂醛的α位上取代烷基基團(tuán)的烴的數(shù)目增加，則敏感性反應(yīng)的速率降低。
本制劑也提供對(duì)多種生物體如真菌和昆蟲(chóng)的有效控制。已有報(bào)道說(shuō)這些化合物對(duì)C.botulinum孢子萌發(fā)有抑制活性。BowlesMiller，G.Food Protection(1993)56788-794。這種多靶體效力減少了對(duì)意欲保護(hù)的植物或動(dòng)物施用藥劑的需求，且基本上消除使用殺蟲(chóng)劑的需要。在特殊的情況下，例如在昆蟲(chóng)破壞動(dòng)物或植物部分或組織且第二種真菌或細(xì)菌疾病產(chǎn)生之時(shí)，本發(fā)明的這一方面尤為優(yōu)越。
本發(fā)明制劑示于下述式(1)中。優(yōu)選的制劑示于下述式(2)中

其中R1表示-CHO，R2表示-OH或含有1至10個(gè)碳原子的有機(jī)取代基，而R3表示甲氧基或含有1至10個(gè)碳原子的有機(jī)取代基，R4表示氫或含有1至10個(gè)碳原子的有機(jī)取代基。特別感興趣的是類黃酮醛類，特別是芳香族醛類。使用于本發(fā)明的芳香族醛類的例子是肉桂醛(下述(3))

和松柏醛(下述(4))

其它感興趣的化合物包括式(1)化合物的類似物如在α位由烷基如己基或支鏈烷基如戊基取代的化合物。通常在α位的基團(tuán)是C-5至C-10。這些化合物包括α-己基肉桂醛和α-戊基肉桂醛。α-己基肉桂醛(HCA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于下述(5)中

化學(xué)文摘服務(wù)社(Chemical Abstracts Service(CAS))的HCA名稱是2-(苯基亞甲基)辛醛，CAS登記號(hào)是[101-86-0]。此化合物的化學(xué)名稱也稱作2-己基-3-苯基-2-丙醛。此化合物的分子式是C15H20O，分子量是216.3。HCA可以由Firmenich得到，其產(chǎn)品主要由(E)-順式異構(gòu)體(最高為93.8％)和(Z)-反式異構(gòu)體(最高為6％)組成。其中的少量組分是辛醛的自醛醇縮合(1-1.5％)(PersonalCommunication，June Burkhardt，F(xiàn)irmenich，Plainsboro，New Jersey)。
這些化合物能單獨(dú)使用或與其它活性或非活性物質(zhì)組合使用，并能以含有此活性化合物的現(xiàn)有的最適合于特殊目的之濃縮液、溶液、懸浮液、粉末等等形式來(lái)進(jìn)行噴霧、澆注、浸蘸、注射的方式施用。它們也可以以例如稀釋溶液的形式或溶在適合的溶劑中，作為灌溉工作的一部分或作為單獨(dú)的施用，直接施用至根際。
用作葉片噴霧時(shí)，雖然醛類可以單獨(dú)加工，但它也可以通過(guò)包括乳化劑如吐溫80而付諸實(shí)施?？梢允褂玫钠渌礈靹┌庪x子洗滌劑如在美國(guó)申請(qǐng)專利4,978,686中所描述的那些?？蓡为?dú)或與洗滌劑結(jié)合使用的其它化合物包括從多種來(lái)源來(lái)的皂草苷，特別是從Yucca schidigera或Yucca valida來(lái)的皂草苷。一般說(shuō)來(lái)，使用于此制劑的洗滌劑或其它試劑不減損類黃酮醛類的驅(qū)避特性，但確會(huì)增加此制劑實(shí)質(zhì)上的特性(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利USP4,477,361)且能改進(jìn)農(nóng)藥的特性，包括殺真菌劑特性(見(jiàn)下文)。附加的組分如多元酸鹽類如碳酸氫鈉、硫酸鈉、磷酸鈉或磷酸二氫鈉的水溶液制備液可以包括在此制劑中，以增加此制劑的抗真菌特性。使用時(shí)，將所得的乳液稀釋至適當(dāng)濃度。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，此制劑包括α-己基肉桂醛、肉桂醛和/或松柏醛，制劑中還包含作為乳化劑的吐溫80或皂草苷，且能包括碳酸氫鈉。用于驅(qū)除蠅、蚊、蚤、蜱、虱、蟑螂、兩點(diǎn)葉螨、銀葉粉虱(silverleafwhite flies)、蚜蟲(chóng)、葉蟬、薊馬和螞蟻的優(yōu)選制劑是10-5000ppm；用于蜱的為100-2500ppm。一般而言，在制劑中存在的醛類總量是2％或更少。此制劑在不使用抗氧化劑的情形下是有效的，雖然有些特殊的醛類含有與生俱來(lái)的抗氧化劑特性，例如，松柏醛。醇類如二元醇類，包括丙二醇，同樣不是增加制劑的效力所需的，而且事實(shí)上可能對(duì)植物有害。
此制劑的穩(wěn)定性可通過(guò)多種方法來(lái)評(píng)估，包括加速試驗(yàn)，在試驗(yàn)中感興趣的制劑在一定時(shí)間內(nèi)暴露于增高的溫度下。制劑樣品以一定的時(shí)間間隔取出，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)進(jìn)行化學(xué)分析，確定分解的速率和性質(zhì)。例如，HCA可以用氣液色譜(GLC)來(lái)分析，采用30米非極性聚二甲基硅烷毛細(xì)管柱(例如，HP-1，Hewlett-Packard，或SPB-1，Supelco)和火焰-離子檢測(cè)器(PersonalCommunication)。采用氦作為載氣(8ml/分鐘)，柱溫為大約240℃，(E)-順式異構(gòu)體(主要組分)的保留時(shí)間為大約6.0分鐘，(Z)-反式異構(gòu)體(少量組分)的保留時(shí)間為大約6.3分鐘。
包括式(3)和/或式(4)和/或式(5)化合物的組合物的最有效量以及有用的其它式(1)化合物的量，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于評(píng)價(jià)化合物驅(qū)避效力的方案來(lái)確定。此方案的實(shí)施例示于下文中。這些方案也可以用來(lái)最佳化用于特定病原的采用式(1)或式(5)所包括之任一化合物的各個(gè)制劑，以及在使制劑的抗病原效果達(dá)到最大的同時(shí)，最佳化特定施用的各個(gè)制劑，使植物毒性或皮膚敏感性以及其它對(duì)于動(dòng)物體的副作用降至最低。
在一些情況下，可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)其它組分(即，除式(1)或式(5)化合物外的化合物)加入意欲改變其一些特殊方面的制劑中，從而增加制劑的效果。例如，對(duì)某一植物而言，如果使用時(shí)植物毒性大，則會(huì)希望降低植物毒性作用(植物毒性等級(jí)為2或更少，優(yōu)選為1或更少，見(jiàn)下文)，或是希望增加制劑驅(qū)避作用，或是兩者均有。優(yōu)選的是，附加的組分在增加制劑驅(qū)避作用的同時(shí)，能使對(duì)植物體或動(dòng)物體的副作用降至最低。特別感興趣的是使用這樣一或多種組分，它或它們是增加驅(qū)避性的且與之同時(shí)能使與特定的制劑有關(guān)的任何副作用降至最低的增效劑。“增效劑”是指這樣一種組分，由于它的存在，使所期效果大于加合效果。在保存或增高制劑的所期效果的同時(shí)，可以對(duì)一或多種其它制劑成分的濃度作修改。特別感興趣的是，向制劑中添加多種組分，使一給定的制劑中的一或多種其它成分的濃度降低，而與之同時(shí)基本上保持該制劑的效力。此種組分與制劑中的其它組分組合可以在混合和/或此組合物應(yīng)用的任何適合階段里完成。
優(yōu)選的附加成分為皂草苷，因?yàn)樗鼈兛梢源姹砻婊钚詣┳鳛槿榛瘎?，且此外在所用的濃度下?duì)至少相同的植物具有生長(zhǎng)促進(jìn)劑的作用。皂草苷是一類化合物，各由皂草配基部分和糖的一部分所組成。皂草配基可能是類固醇或三萜，且糖部分可以是葡萄糖、半乳糖、戊糖或甲基戊糖。S.Budavari，ed.，The Merck Index，11th ed.，Merck & Co.，Inc.，Rahway，N.J.，1990，p.1328。用于本發(fā)明的皂草苷可以或用本領(lǐng)域已知的方法從多種來(lái)源的多種植物部位生產(chǎn)或分離出來(lái)，植物部分包括果實(shí)、葉片、種子和/或根，所述的來(lái)源包括許多已知的產(chǎn)生皂草苷的植物，范圍從絲蘭、皂樹(shù)、龍舌蘭、菸草、甘草、大豆、人參和蘆荀到蘆薈木。與本發(fā)明一同使用的皂草苷優(yōu)選是對(duì)人或高等動(dòng)物無(wú)毒的。用于本發(fā)明的皂草苷最優(yōu)選是無(wú)毒性的食物級(jí)品，其來(lái)源來(lái)自絲蘭植物。更優(yōu)選的皂草苷是來(lái)自Yucca schidigera或Y.valida以及它們的等同物。皂草苷一般是通過(guò)一種冷壓萃取方法制得的且使用所得的液體萃取物。也可使用絲蘭的纖維；典型地是將其日曬，研磨并且篩選大小。通常皂草苷的有效量是在0.01至0.1％的范圍內(nèi)，且最優(yōu)選是約0.01％v/v的10°白利皂草苷萃取物水溶液。
已知有許多結(jié)構(gòu)上相關(guān)的皂草苷，最多變的結(jié)構(gòu)特征為糖基化型式。皂草苷也可能含有附加的修飾，例如薩灑皂草苷，它是帶有附著的類固醇的皂草苷，且皂草苷的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任一種酶的、化學(xué)的和/或機(jī)械方法修飾。來(lái)源于Yucca schidiger的皂草苷含有類固醇皂草苷，該類固醇皂草苷帶有的主要皂草配基是薩灑皂草配基和惕告配基(tigogenin)。薩灑皂草苷水解時(shí)產(chǎn)生薩灑皂草配基(薩灑皂草配基5-β，20-βF，22-δF，25-βF；也被稱作螺甾烷-3-β-01以及洋菝葜配基)、葡萄糖和半乳糖。薩灑皂草配基的分子式為C27H44O3。Nobel，Park S.，Agaves，Oxford Univ，Press，NewYork，1994。已知有多種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的皂草苷，最多變的結(jié)構(gòu)特征是糖基化型式。S.Budavari ed.The Merck Index 11th ed.，MERck & Co.，Inc.，Rahway，N.J.1990，p.1328。皂草苷也可能含有附加的修飾，例如薩灑皂草苷，它是帶有附著的類固醇的皂草苷，且皂草苷的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任一種酶的、化學(xué)的和/或機(jī)械方法修飾。通常，皂草苷的有效量是約0.01至3％且優(yōu)選是約0.25％v/v的10°白利皂草苷萃取物水溶液。10°白利是糖化學(xué)領(lǐng)域中的術(shù)語(yǔ)。白利度等于糖在溶液中的重量百分比。Hawley，ed.，簡(jiǎn)明化學(xué)詞典，10th ed.，Van NostrandReinhold，New York，1981，P.149。
在制劑是用來(lái)制備種植易受特定病原感染的宿主植物的土地或其它生長(zhǎng)底物的應(yīng)用中，特別是在生長(zhǎng)底物已經(jīng)受到侵染時(shí)，可以將本發(fā)明制劑直接加到根際或底物或可以將其結(jié)合到一固體支持物或是將其包囊于緩釋材料中，以驅(qū)除有害昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)。當(dāng)采用固體支持物時(shí)，應(yīng)避免使用可導(dǎo)致活性醛類氧化的材料。可以使用的釋放體系的例子包括淀粉-葡聚糖等等。其它的適宜材料的例子參見(jiàn)Yuan等人的基礎(chǔ)和應(yīng)用毒物學(xué)(1993)2083-87。
除前述式(1)、(2)、(3)、(4)和(5)的具體化合物外，任何這些化合物的前體，只要該前體在生物體系的作用下，產(chǎn)生與上述結(jié)構(gòu)式相同的化合物，則被認(rèn)為等同于本發(fā)明化合物。因此前體化合物應(yīng)用于植物體部分或組織將會(huì)等同于本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用。前體化合物之生物轉(zhuǎn)換成類黃酮醛類已描述于例如美國(guó)專利USP5,149,715及其所引用的參考文獻(xiàn)中。也可參見(jiàn)Casey和Dobb Enzyme Microb.Technol.(1992)14739-747。
本發(fā)明方法是通過(guò)將足夠量的驅(qū)避劑引入至感興趣之表面以驅(qū)除昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)而實(shí)施的。此外，當(dāng)感興趣的表面是皮膚、皮毛、發(fā)、衣物等等時(shí)，施用可以通過(guò)用制劑與感興趣的表面接觸來(lái)進(jìn)行，制劑是為感興趣的表面而付諸實(shí)施的，從而使驅(qū)避量的制劑留在處理過(guò)的表面上，且以足以驅(qū)避敏感的昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)的速率釋放。含有驅(qū)避劑的制劑通常是通過(guò)局部應(yīng)用而引入表面的。例如，以濕或干的制劑將制劑噴霧在表面和/或當(dāng)感興趣的表面適合時(shí)噴霧至下表面。適合施用的制劑是噴霧劑、粘著劑(stick)、和驅(qū)避油劑或膏劑。在一些情況下，可以用驅(qū)避制劑浸漬感興趣的表面。另外，可將制劑以濕或干的形式施用至根際，在那兒它可以在根系的附近蒸發(fā)，并與聚生于根系的病原生物相作用。在一些情況下，可以將空氣導(dǎo)入根系，以增加蒸發(fā)過(guò)程。為防止昆蟲(chóng)侵入一地區(qū)，可以將本發(fā)明組合物施用于此地區(qū)內(nèi)的表面和/或周?chē)?，可以將組合物施用于門(mén)、窗和建筑物的其它入口和/或這些入口周?chē)谋砻妗?br> 當(dāng)感興趣的表面是植物或植物部分時(shí)，驅(qū)避劑的存在可以是局部施用的結(jié)果，例如組合物可以經(jīng)空中施用于作物，或是作為基因修飾宿主植物的成果，驅(qū)避劑可以由宿主植物合成。
本發(fā)明之芳香族和脂族的醛類能通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種合成的方法制備出來(lái)。例如，參見(jiàn)J.March ed.，Appendix高級(jí)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理和結(jié)構(gòu)，2nd Ed.，McGraw-Hill，New York，1977。肉桂醛能被合成地制備出來(lái)，例如通過(guò)肉桂醇的氧化作用(Traynelis et al.，美國(guó)化學(xué)聯(lián)合會(huì)雜志(1964)86298)或通過(guò)苯乙烯和甲酰甲基苯胺的縮合作用(英國(guó)專利GB 504,125)。此醇類也可從自然來(lái)源分離。例如，肉桂醛分離自腐木真菌，密絨韌革菌(Stereumsubpileatum)。Birkinshaw et al.，Biochem.J.(1957)66188。α-己基肉桂醛(HCA)可以由稻獲得，或按USPN 5,055,621中所描述的方法合成。
在植物中產(chǎn)生本發(fā)明制劑所需組分的優(yōu)選方法是經(jīng)重組DNA的方式，特別是通過(guò)在感興趣的植物組織中，經(jīng)本領(lǐng)域已知的技術(shù)所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物來(lái)改變至少一種式(1)、(2)、(3)、(4)和/或(5)的感興趣化合物的水平。這些方法涉及用在植物細(xì)胞中有功能的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)和轉(zhuǎn)譯與轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來(lái)轉(zhuǎn)化感興趣的植物細(xì)胞，所述的表達(dá)盒是作為5′至3′方向轉(zhuǎn)錄的可操作連接組分包含于植物細(xì)胞中，而轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)域在可讀框5′內(nèi)結(jié)合至編碼和能夠調(diào)制生產(chǎn)的DNA序列上和/或是為生產(chǎn)感興趣化合物所需。由于感興趣化合物生物合成中所涉及的酶濃度改變的結(jié)果，因此生產(chǎn)此化合物所需的酶的表達(dá)提供了化合物產(chǎn)量的增加。特別感興趣的是在植物組織例如葉子、根、果實(shí)和種子內(nèi)選擇性控制肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA的生產(chǎn)。植物、植物部分、植物細(xì)胞、特定植物組織中的和/或與植物生長(zhǎng)的特定階段相關(guān)的感興趣的化合物水平的控制，需要一或多個(gè)基因或編碼基因或多種酶或酶途徑或簇(cluster)，通過(guò)調(diào)制它們的表達(dá)，可經(jīng)產(chǎn)生本發(fā)明制劑之一個(gè)或多個(gè)化合物。
此酶或此類酶可以在生物合成途徑或降解途徑中，并且能分別向上調(diào)或下調(diào)，即，調(diào)節(jié)固有或內(nèi)源植物基因的表達(dá)。固有植物基因是對(duì)宿主植物基因組而言是天生的基因。內(nèi)源植物基因是存在于所感興趣的宿主植物基因組中的基因，它可能是固有植物基因或是由于植物感染的結(jié)果而存在的基因(例如病毒基因)，或自然地?fù)饺胫参锘蚪M的基因。宿主植物也能通過(guò)重組方法來(lái)修飾或通過(guò)傳統(tǒng)植物育種方法來(lái)引入一個(gè)或多個(gè)對(duì)宿主植物而言是外源的編碼酶的基因，而所述的酶控制感興趣的化合物水平和/或是在式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)的一或多個(gè)化合物的合成途徑上的酶?！盎虮磉_(dá)的調(diào)控”是指在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和/或轉(zhuǎn)譯后水平上控制感興趣基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。感興趣化合物的水平是通過(guò)調(diào)控一或多個(gè)內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的表達(dá)來(lái)控制的，而這些基因編碼一或多個(gè)合成感興趣之化合物所需的酶。
調(diào)控在植物體中的基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。對(duì)植物體進(jìn)行生長(zhǎng)條件的改變或外用化合物可以影響基因的表達(dá)。在分子水平上，基因的表達(dá)基本上依賴于調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和終止控制區(qū)。通過(guò)利用調(diào)節(jié)這些控制區(qū)的植物信號(hào)或直接對(duì)這些控制區(qū)進(jìn)行重組操作，可以對(duì)(例如)控制肉桂醛水平所需的酶之編碼基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。在對(duì)植物體外源提供的轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用中，該轉(zhuǎn)基因?qū)刂茀^(qū)，而該控制區(qū)是選擇和設(shè)計(jì)來(lái)獲得所需的組織和/或基因表達(dá)的水平和時(shí)間的。適宜的話，控制區(qū)對(duì)感興趣的基因而言可能為同源的(天生的)或非同源的(非天生的)?！巴吹摹彼囊馑际强刂茀^(qū)源自或基本上相似于通常與感興趣的基因有關(guān)聯(lián)的控制區(qū)?！胺峭吹摹彼囊馑际强刂茀^(qū)源自不同的核苷酸來(lái)源或序列或是基本上不同于通常與感興趣的基因有關(guān)聯(lián)之控制區(qū)。例如，如果與控制區(qū)相比，此編碼酶的序列在來(lái)源上是非同源的，為了使此基因在感興趣的植物細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，則必須可操作地提供在這些植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始調(diào)節(jié)區(qū)或啟動(dòng)子，使之與編碼序列連接。在植物體內(nèi)有功能之轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始信號(hào)包括那些存在宿主植物體或其它植物種類基因，并在宿主植物體內(nèi)直接組成性或選擇性的表達(dá)。
特別感興趣的是這類基因控制區(qū)，其選擇性地調(diào)節(jié)在植物體、植物部分、植物細(xì)胞、特別的植物組織之結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)和/或是與植物生長(zhǎng)的特定階段有關(guān)。優(yōu)選的是那些本領(lǐng)域已知的控制區(qū)，特別是轉(zhuǎn)錄控制區(qū)或啟動(dòng)子，其可以用來(lái)調(diào)制編碼酶之基因的表達(dá)，而所述的酶是在植物、植物部分、植物細(xì)胞、特定的植物組織中控制式(1)、(2)、(3)、(4)化合物水平所需的和/或是與植物生長(zhǎng)的特定階段有關(guān)。例如，在果實(shí)中顯示不同表達(dá)類型的啟動(dòng)子描述于美國(guó)專利USPN4,943,674和美國(guó)專利USPN 5,175,095中；在種子中的情形描述于美國(guó)專利USPN 5,315,001中；以及在快速發(fā)育組織及嫩芽中的情形描述于美國(guó)專利USPN 5,177,011中。
在感興趣的組織內(nèi)選擇性控制肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA在植物中的生物合成，也將植物細(xì)胞用包含結(jié)構(gòu)基因之編碼DNA的表達(dá)盒來(lái)轉(zhuǎn)化，其中結(jié)構(gòu)基因是合成肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA所需的、并能夠在感興趣的組織中增加這些醛類水平的一個(gè)或多個(gè)酶的結(jié)構(gòu)基因。特別感興趣的是那些能夠由通常見(jiàn)于植物細(xì)胞中的底物，代謝出感興趣的肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA生物合成所需的前體化合物的一個(gè)或多個(gè)酶的編碼基因。更優(yōu)選的是至少一種式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)化合物的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
可以制備表達(dá)感興趣基因的DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體提供將表達(dá)盒整合入宿主植物的基因組內(nèi)。整合可以本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化體系例如土壤桿菌(Argobacterium)，電穿孔法或通過(guò)高速微粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法來(lái)完成。根據(jù)此應(yīng)用，皂草苷或感興趣的其它化合物之一可以在感興趣的組織和/或特別的細(xì)胞器內(nèi)優(yōu)先地表達(dá)。組織特異性是通過(guò)使用具有所需表達(dá)條件之轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來(lái)完成的。將酶轉(zhuǎn)移至特定的胞器可通過(guò)使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移肽來(lái)完成。業(yè)已描述的DNA構(gòu)建體的組織和胞器的特異表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。
為了確認(rèn)感興趣基因的調(diào)節(jié)和表達(dá)，有許多的技術(shù)可確定存在于植物細(xì)胞內(nèi)的所需DNA序列是否已整合入基因組中并且被轉(zhuǎn)錄出來(lái)。這些技術(shù)如Northern印跡法可以用來(lái)檢測(cè)編碼所需酶的信使RNA。表達(dá)可以進(jìn)一步通過(guò)分析酶活性或?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物免疫分析來(lái)檢測(cè)。更優(yōu)選的是，存在于宿主植物體中的感興趣化合物水平是用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)測(cè)量。例如，所需的表型是，正如用感興趣的基因表達(dá)所確定的，在感興趣的植物組織內(nèi)皂草苷的含量增加，和/或與對(duì)照植物相比，在植物宿主細(xì)胞中的HCA水平增加。
為了將本制劑的一或多個(gè)化合物引入到靶體生物體內(nèi)，將靶體生物體暴露于此驅(qū)避制劑的至少一種成分，從而產(chǎn)生一種對(duì)控制感興趣化合物水平的酶之編碼基因進(jìn)行表達(dá)的宿主植物。驅(qū)避制劑的至少一種成分可以通過(guò)植物宿主表達(dá)，并且任選驅(qū)避制劑的其它成分外源地應(yīng)用于植物宿主，這樣來(lái)組合地誘導(dǎo)出所需的驅(qū)避效果。
可以制備出一種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物具有增加的累積類黃酮醛類例如肉桂醛和松柏醛能力以提供抗植物害蟲(chóng)的自我保護(hù)作用或被用來(lái)當(dāng)作萃取類黃酮醛類天然的來(lái)源并隨后用作驅(qū)避劑。
類黃酮醛類的累積能通過(guò)下調(diào)特定植物基因的表達(dá)來(lái)獲得，其中的基因是引起所需的醛類進(jìn)一步代謝或從所需的醛類中轉(zhuǎn)移走代謝中間產(chǎn)物的酶的編碼基因。在肉桂醛的情況下，例如，累積涉及向下調(diào)節(jié)肉桂酸4-羥化酶(CA4H)和肉桂醇脫氫酶(CAD)。CA4H平常是從肉桂醛轉(zhuǎn)移走一些肉桂酸，產(chǎn)生對(duì)-香豆酸，對(duì)-香豆酸本身是代謝中間體。單獨(dú)降低CA4H活性不足以造成肉桂醛的累積，因?yàn)镃AD可以快速地將肉桂醛轉(zhuǎn)化成肉桂醇，然后肉桂醇逐漸并入木質(zhì)素或以糖苷累積。同時(shí)降低CA4H和CAD兩者的活性會(huì)造成由肉桂酸至肉桂醛代謝轉(zhuǎn)變的增加且降低肉桂醛至肉桂醇的轉(zhuǎn)化。一些肉桂醛逐漸并入木質(zhì)素，但肉桂醛(或是游離的或是作為糖苷)也累積至超過(guò)正常水平，特別是在肉桂酸的生物合成增加時(shí)。這種情形發(fā)生在苯丙氨酸氨裂解酶(PAL；在一般的苯丙酸類代謝的第一和限速步驟，Hahlbrock andScheel(1989)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40347-369)活性高時(shí)，一種自然發(fā)生在植物體中的情形，它是對(duì)包括被真菌侵害和與受傷及昆蟲(chóng)吃咬的機(jī)械傷害的廣泛刺激反應(yīng)。
抑制在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的CAD活性已被提議作為在植物體內(nèi)降低木質(zhì)素的合成且由此改善飼料作物的消化力的方法(WO93/05159)。雖然這些實(shí)驗(yàn)表明木質(zhì)素的生物合成已有質(zhì)量上的改變，但無(wú)需作數(shù)量上的改變，但是并未清楚或使人認(rèn)識(shí)到這樣一種希求，即，累積肉桂醛可作為增加對(duì)昆蟲(chóng)和其它害蟲(chóng)驅(qū)避性的方法。
業(yè)已克隆出一些植物CA4H和CAD基因，并且其序列能自基因庫(kù)(GeneBank)中得到。這些包括在不同植物種類間為保守的核苷酸序列的基因部分，可以直接用在植物表達(dá)載體上(反義或有義方向)，用以抑制相應(yīng)的內(nèi)源基因的表達(dá)(例如，Pear，等人The Plant CellAntisense Res.and Develop(1993)3181-190，Napoli，等人ThePlant Cell(1990)2279-289)。更優(yōu)選的是，這些保守的基因序列可用于從意欲修飾的植物種類的cDNA文庫(kù)分離出CA4H和CAD cDNA克隆。所得到的cDNA克隆或其中部分，之后被引入植物表達(dá)載體(反義或有義方向)且用于轉(zhuǎn)化感興趣的植物。根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體優(yōu)選包括一個(gè)至少50個(gè)堿基的序列，該序列與內(nèi)源CD4H或CAD基因同源。
重組DNA分子可以通過(guò)將載體可操作地連接于有用的DNA片段以形成可用來(lái)作植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。能夠由基因的克隆部分引導(dǎo)RNA表達(dá)的載體在本文中被稱為“表達(dá)載體”。此表達(dá)載體含有包括啟動(dòng)子的控制元件?？捎糜谠诟叩戎参镏斜磉_(dá)基因的典型載體是在本領(lǐng)域所熟知的，且包括根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefeciens)Ti質(zhì)粒所衍生的載體，這些衍生載體由Rogers等人在Methods in Enzymology(1987)153253-277中作了描述。用于提供引入基因強(qiáng)的組成性表達(dá)的普通啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子(可得自Pharmacia，Piscataway，NJ)?？梢允褂媒M成性啟動(dòng)子(如CaMV35S)或可誘導(dǎo)或發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子(如來(lái)自PAL基因或CA4H或CAD基因的啟動(dòng)子)。使用組成性啟動(dòng)子將容易影響植物體所有部分的功能，而使用可誘導(dǎo)性或發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，則具有反義或有義RNA只會(huì)在它所需的組織和條件下表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明中，使用發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是優(yōu)選的，因?yàn)橐阎交犷惿锖铣傻南抡{(diào)作用能夠在含有異源PAL基因的轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)育中產(chǎn)生不良的副作用(Elkind，Y.等人1990)Proc.Nat.Acad.Sci.(1990)879057-9061。
有許多不同的轉(zhuǎn)化方法可用于作為廣泛的植物種類的例行轉(zhuǎn)化作用。一種對(duì)于將DNA轉(zhuǎn)移至雙子葉植物特別有效的方法涉及使用土壤桿菌。在此方法中，將感興趣的基因插入T-DNA區(qū)域邊緣之間，該T-DNA區(qū)已用可選擇的標(biāo)記基因剪切成小的重組質(zhì)粒(例如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II或磷酯酰蘇氨酰(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)。然后將此重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化或是三親代交配引入土壤桿菌宿主內(nèi)。此攜帶感興趣基因的土壤桿菌株通過(guò)將適宜的植物組織(例如葉盤(pán))與此細(xì)胞從共同培養(yǎng)來(lái)轉(zhuǎn)化植物組織。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在組織培養(yǎng)中以適宜的篩選試劑篩選出來(lái)，并且植物體隨后再生(參見(jiàn)Horsch.R.B.等人Science(1985)2271229-1231)。其它已用在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，特別其它更難對(duì)付的作物之轉(zhuǎn)化作用的方法包括biolistics和電穿孔法(詳細(xì)方案參見(jiàn)Sanford等人(1993)Methods in Enzymology 217483-509；和Potter(1993)Methods in Enzymology 217461-478)。
一旦生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因植物，就可用CA4H和CAD的傳統(tǒng)酶分析來(lái)確定在不同轉(zhuǎn)化體中所達(dá)到的抑制酶活性的水平?？赡苤挥幸恍〔糠炙a(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體具有足夠低的酶殘留活性去引起類黃酮醛類的累積，且在植物生長(zhǎng)過(guò)程中不產(chǎn)生一些不良的副作用。為此，用抑制的CA4H和CAD生產(chǎn)所需轉(zhuǎn)化體的優(yōu)選方法是分別將這兩種基因引入不同的轉(zhuǎn)化體，之后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的有性雜交將它們結(jié)合。這使得大量基因抑制水平的組合能同時(shí)被評(píng)估。
在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生類黃酮醛類的另一種辦法是使用一類植物基因，這些植物基因賦與微生物宿主合成特定的類黃酮醛類能力。所得的微生物能用于在發(fā)酵體系中生產(chǎn)類黃酮醛類或是在活的或非活的微生物制備物中作為類黃酮醛類的天然運(yùn)輸體系。酵母菌，特別是啤酒糖酵母是此目之優(yōu)選生物體，因?yàn)樗呀?jīng)作了高水平表達(dá)PAL的基因工程改造(Faulkener等人，(1994)Gene 14313020，)，且植物的肉桂酸4-羥化酶業(yè)已顯示在酵母菌內(nèi)是有功能的(Urban等人，(1994)Eur.J.Biochem 222843-850)。
PAL的表達(dá)引入了由苯丙氨酸產(chǎn)生肉桂酸的能力。需要兩個(gè)另外的酶步驟從苯丙氨酸產(chǎn)生肉桂醛。在植物體，這些步驟由酶肉桂酸酯CoA連結(jié)酶(CL)和肉桂酰CoA還原酶(CCoAR)所催化，但4-香豆酸CoA連接酶(4CL)也能用肉桂酸當(dāng)作底物(Knobloch和Hahlbrock(1977)Arch.Biochem.Biophys.184237-248)，4CL可以用來(lái)取代CL。多于20個(gè)克隆的PAL基因和多于6個(gè)4CL基因已經(jīng)作了足夠詳細(xì)地描述(GeneBank)，足以利于它們?cè)趯?shí)施本發(fā)明時(shí)的使用。CCoAR的基因通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)基因克隆技術(shù)來(lái)分離cDNA克隆而得到，所述的cDNA用作由N-末端的氨基酸序列、或肽片斷、或純化蛋白所衍生的探針序列。CCoAR已從如下物質(zhì)中純化出來(lái)并且作了部分特征描述大豆培養(yǎng)物(Wengenmater等人(1976)Eur.J.Biochem，65529-536；Luderitz和Grisebach(1981)Eur.J.Biochem，119115-124)，云杉形成層汁(Luderitz和Grisebach supra)，楊樹(shù)木質(zhì)部(Sarni等人(1984)Eur.J.Biochem，139259-265)和桉樹(shù)(Eucalyptusgunnii)分化中的木質(zhì)部(Goffner等人(1994)Plant Physiol.106625-632)。純化優(yōu)選方法是Goffner等人(同上)的方法，因?yàn)樵摲椒傻玫皆赟DS-聚丙烯酰胺凝膠上的單個(gè)蛋白質(zhì)帶，該帶可作蛋白質(zhì)序列分析。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)如電穿孔(Becker和Guarante(1991)Methods in Enzymol，194182-187)，將克隆出的基因引入標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化微生物宿主，優(yōu)選酵母。用標(biāo)準(zhǔn)的酶分析確定基因工程改造過(guò)的基因的功能性表達(dá)，并用類黃酮醛類的分析來(lái)選擇有最大生產(chǎn)量的菌種。因?yàn)轭慄S酮醛類有抗微生物的特性，因此它優(yōu)選使用這樣的表達(dá)載體，即只會(huì)在生長(zhǎng)循環(huán)的后期造成引入的基因表達(dá)或是對(duì)化學(xué)引誘物有響應(yīng)的表達(dá)載體。也有可能希望在一固定的全細(xì)胞反應(yīng)器(例如Evans等人(1987)Biotechnology and Bioengineering 301067-1072)中生長(zhǎng)經(jīng)基因工程改造過(guò)的微生物宿主，以此避免醛類在培養(yǎng)基內(nèi)累積。
靶體昆蟲(chóng)和其它害蟲(chóng)是指那些為疾病生物體媒介的昆蟲(chóng)和害蟲(chóng)，疾病生物體如聚生于植物一部分的表面上的真菌，而植物則為真菌的誘發(fā)者。誘發(fā)者是指植物分泌真菌所需的營(yíng)養(yǎng)物。真菌以其聚生的植物體部分的例子如下。果實(shí)上的黑斑病菌，花、根和葉片上的鐮孢屬(Fusariumsp.)，和根和葉片上的鐮孢屬(Fusarium spp.)和曲霉屬(Aspergillus)。鐮孢屬引起一年生蔬菜和花卉、多年生草本觀賞植物、栽培作物和含羞草之維管枯萎。不同的植物受真菌的特定類型或種侵害。輪枝孢屬(棉黃輪枝孢和大麗輪枝孢)引起維管枯萎和聚生于根、花和葉片上。除此之外，下列也構(gòu)成靶體生物體；多孢銹菌屬(Phragmidium spp)；玫瑰雙殼菌(Diplocaopan rosae)；單絲殼菌(Sphaerotheca tannosa)，Oibiapsis sicula；疫霉菌(Phytophthorataraesitica)；蔓延疫霉(Phytophthora infestans)；柄銹屬(Pucciniaspp)；鏈格孢屬(Alternaria sp)；Susaium spp；灰色葡萄孢(Botrytiscinera)；核盤(pán)菌(Sclerotinia homoeocarca)；Tricophytonmentagrophpytes；荷蘭榆樹(shù)病菌(Ceratocystis ulmi)和橡樹(shù)枯萎病菌(C.fagacearum)。Ceratocystis引起維管枯萎，主要是樹(shù)的。也包括藍(lán)藻(Cyanobacteria)?？捎帽景l(fā)明制劑驅(qū)避的這些疾病的媒介包括甲蟲(chóng)和胡蜂。靶體生物體包括昆蟲(chóng)，特別是直翅目；纓翅目，它包括水生象甲(water weevil)和薊馬；及同翅目，它包括蚜蟲(chóng)如根蚜和葉蚜、葉蟬、粉虱、綿蚧、薊馬、蟬、毛蟲(chóng)如黎豆夜蛾毛蟲(chóng)、蘋(píng)蠹蛾、卷葉螟和蚧。其它的靶體生物體包括蛛形綱(特別是葉螨)、蠅類(家蠅)、蟑螂、腹足綱、蛾類和臭蟲(chóng)(溫帶臭蟲(chóng)(Cimex lectularis))及其相近的種類(雞臭蟲(chóng)(Haematosiphon indorus Duges))和歐洲鴿臭蟲(chóng)(Cimexcolumbarius Jerjus)和燕臭蟲(chóng)(Oeciains vicarius Hrovath)。
同樣特別感興趣的是通過(guò)驅(qū)避根瘤蚜來(lái)避免在葡萄上受根瘤蚜的侵害。為了此應(yīng)用，需要將此制劑釋放至根瘤蚜通常棲息的植物根系。當(dāng)以固體形式或微膠囊形式使用時(shí)，典型使用的劑量是1％至35％(w/w基準(zhǔn))的量級(jí)，意欲決定的最大負(fù)載為所選擇的殼物質(zhì)之函數(shù)。用分析化學(xué)技術(shù)決定和最佳化釋放速率。為了定性，可以使用GC技術(shù)來(lái)決定釋出之醛類的量。包囊(丸化)的產(chǎn)品樣品與所選擇的土壤混合并在不同時(shí)期采樣以測(cè)量釋放情況。另外，也可以分析從此制劑釋放出的揮發(fā)性氣體。為了測(cè)定葉面和滴灌溉應(yīng)用的活性，也可將制劑經(jīng)一定時(shí)間的穩(wěn)定性用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的GC方法來(lái)評(píng)估。也可制備此制劑的甲醇或乙醇萃取液用于HPLC分析。然而，優(yōu)選的驅(qū)避根瘤蚜和其它根部生長(zhǎng)的害蟲(chóng)的方法是提供例如葉面施用的系統(tǒng)反應(yīng)，將葉面施用的制劑轉(zhuǎn)移至根系。對(duì)于具體的植物需要經(jīng)驗(yàn)性地確定這類施用的時(shí)間，因?yàn)橛扇~面至根的水流是轉(zhuǎn)移所需的。通常，這種流動(dòng)在如下情況下最快在較涼的時(shí)間例如在傍晚時(shí)分，在夜間或在一清早的時(shí)間，和在果實(shí)生長(zhǎng)前或后或植物發(fā)育時(shí)。
本發(fā)明制劑，特別是那些含有HCA的制劑，也可用于處理葡萄，以驅(qū)避薊馬、線蟲(chóng)和卷葉螟；玫瑰，以驅(qū)避薊馬和棉鈴蟲(chóng)；牛，以驅(qū)避軟蜱；人，以驅(qū)避蚊蟲(chóng)；蘋(píng)果，以驅(qū)避蘋(píng)蠹蛾；動(dòng)物，以驅(qū)避蚤；蟑螂棲生地，以驅(qū)避或消除蟑螂滋生；和玉米，以驅(qū)避根蚜(root aphid)。
除了處理宿主植物，也可用本發(fā)明制劑來(lái)處理種子以驅(qū)避侵害種子和/或當(dāng)作疾病生物體媒介的昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)?？梢杂梅壑苿﹣?lái)噴粉(可以吸附本制劑的無(wú)機(jī)材料，參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)4,978,686)或在植物底物如蛭石中混合。在無(wú)菌的環(huán)境下由處理過(guò)的種子生長(zhǎng)成的幼苗是不受真菌和昆蟲(chóng)的影響。另外，幼苗也可以用此制劑處理。在一些情況下，當(dāng)柔弱嫩芽較可能顯示植物毒性的癥狀時(shí)，需要調(diào)整處理的制劑，從而減少任何與處理有關(guān)的植物毒性。處理制劑也可以用于控制開(kāi)花植物的傳粉時(shí)間。例如，為防止或延遲傳粉，將制劑以足以驅(qū)避蜜蜂和其它傳粉昆蟲(chóng)的量施用。通過(guò)調(diào)節(jié)制劑的殘留性，人們可以控制抑制傳粉的時(shí)間長(zhǎng)度。另一方面，對(duì)于植物而言，不管異花授粉是否是授精之所需，如果傳粉昆蟲(chóng)被制劑所驅(qū)避，應(yīng)當(dāng)避免在此期間施用此制劑，為了決定具體昆蟲(chóng)對(duì)所要求的組合物之驅(qū)避性的敏感性，采用體內(nèi)或體外試驗(yàn)，在試驗(yàn)中比較靶體害蟲(chóng)朝向行為，例如接近存在或不存在試驗(yàn)制劑的“誘餌”食物。經(jīng)一段時(shí)間的制劑效果可以通過(guò)將觀察時(shí)間延長(zhǎng)直到只有少數(shù)試驗(yàn)昆蟲(chóng)(約少于50％)從誘餌的附近驅(qū)避走。對(duì)于病原媒介昆蟲(chóng)，90％或更大的驅(qū)避率通常是適宜的。對(duì)于普通的令人討厭的害蟲(chóng)，降低到80％程度是適合的(例如在花園或食物區(qū))。此制劑還需要評(píng)估其用在植物上的植物毒性和表皮敏感性，特別是用在人類的皮膚和/或衣服時(shí)；接觸性皮炎和嗅覺(jué)敏感性采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的皮膚敏感性試驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)。同樣，植物毒性檢測(cè)可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)進(jìn)行。植物毒性可以毒性嚴(yán)重性增加的順序分級(jí)如下0-植物沒(méi)有任何癥狀；1-下胚軸非常輕微的變棕(沒(méi)有其它癥狀)；2-植物有一些枯萎，下面的葉片垂死，維管系統(tǒng)有一些變棕；3-整株植物枯萎，葉片垂死，下胚軸有外在和內(nèi)在的癥狀；4-根壞死，植物垂死。優(yōu)選的是，所用的制劑具有2級(jí)或更低的植物毒性等級(jí)，更優(yōu)選1級(jí)或更低。
意欲作特殊應(yīng)用的制劑組分可以如下確定首先，評(píng)估一濃度范圍，該范圍從給定的組分無(wú)活性至提供最大活性(劑量響應(yīng)曲線)，然后將此組分分別和與給定制劑的感興趣的其它組分組合進(jìn)行評(píng)估。然后針對(duì)帶或不帶感興趣的任何附加組分的系列稀釋液的各個(gè)配方和組分，確定具體制劑對(duì)于給定的昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)和宿主的驅(qū)避性和/或植物毒性和/或表皮影響。最佳采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)用體外或體內(nèi)試驗(yàn)計(jì)算。確定提供如下效果的制劑90％的驅(qū)避率，和/或?qū)χ参锏闹参锒拘缘燃?jí)為2或更低，優(yōu)選為1或更低，對(duì)動(dòng)物和家禽基本上沒(méi)有接觸性皮炎。
以下例子是以說(shuō)明而非以限制的方式給出。
實(shí)施例在下文中給出的實(shí)施例方案使用下列產(chǎn)品(1)肉桂醛，來(lái)自Spectrum Chemical Co.，New Jerscy，USA；(2)松柏醛，來(lái)自ADNI Chemical Co.，VF；(3)碳酸氫鈉和吐溫80，來(lái)自SpectrumChemical Co.，New Jerscy，USA。
實(shí)施例1蠅類(家蠅)此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛和α-己基肉桂醛對(duì)蠅類(家蠅)的驅(qū)避活性。二十只2-3日齡的雌蠅被放于62×62×34cm的籠子內(nèi)，籠子帶有325目的頂部篩網(wǎng)以允許空氣的流通(Carolina BiologicalSupplies)。誘餌由甜牛奶(Carnation)(90％)加上葡萄糖(10％)和染料(溴酚藍(lán)0.01％)及1毫升的制劑所做成，并放于3.5cm培養(yǎng)皿中，并置于松木籠內(nèi)(Carolina Biological Supplies)，木籠有一從頂端鉆下的一直徑為1cm洞，以方便接近含有誘餌的籠子。裝有5毫升水的直徑3.5cm的培養(yǎng)皿放于籠中供給水分。24小時(shí)后，將蠅移出，并壓碎在濾紙上，檢查染料的存在，染料指示取食的活力。多于10％的蠅進(jìn)入取食，則認(rèn)為制劑缺少驅(qū)避活性。
實(shí)施例2蟑螂(德國(guó)小蠊)此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛對(duì)蟑螂(德國(guó)小蠊)的驅(qū)避活性。五十只蛹和體長(zhǎng)1.5至3.5cm的成蟲(chóng)被放于62×62×34cm的籠子內(nèi)，籠子帶有325目的頂部篩網(wǎng)以允許空氣的流通。籠子的內(nèi)表面墻從地板5cm至10cm處用礦物油和石油膠(2∶3)的混合物處理以避免蟑螂逃走。蟑螂用狗食(Purina)、牛奶粉和水飼喂48小時(shí)，使之適應(yīng)環(huán)境。兩張Whatman濾紙“C”(4×4cm)對(duì)折兩次，用釘書(shū)釘釘好，并用1毫升的每一種制劑浸濕。濾紙隨后于空氣中干燥。濾紙放進(jìn)兩個(gè)4cm×4cm×4cm的立方體內(nèi)，各在地面(底)層帶一單獨(dú)0.75cm的門(mén)以便進(jìn)入。兩個(gè)藏匿盒放于14cm遠(yuǎn)的籠子地板底端。20小時(shí)后，將藏匿盒移走，并將且藏匿的蟑螂移走并計(jì)數(shù)。大于10％的蟑螂進(jìn)入藏匿盒內(nèi)則認(rèn)為制劑缺少驅(qū)避活性。
實(shí)施例3蚜蟲(chóng)(甜菜蚜)此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛制劑對(duì)黑豆蚜蟲(chóng)的驅(qū)避活性。在溫室內(nèi)，讓甜菜(Beta vulgaris)在7.5mm直徑盆的培養(yǎng)土中生長(zhǎng)。當(dāng)植物達(dá)到三葉期時(shí)，隨機(jī)選擇八株植物。在分別的試驗(yàn)中，將四株植物作如下處理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐溫80)；NaHCO3；吐溫80；和空白配方。處理是葉面施用，用手動(dòng)噴霧器(Gilmour)噴施5毫升的物質(zhì)成細(xì)霧狀。另四株植物則不處理，一株只用水噴霧。處理過(guò)和末處理的植物分別擺放成兩行，A或B，處理或未處理，于60×60×30cm箱籠中，籠子帶325目的篩網(wǎng)以允許空氣的流通。在4、8和24小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄處理和未處理的(A和B行)植物上的蚜蟲(chóng)數(shù)量。
實(shí)施例4銀葉粉虱(紅葉螨)此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛對(duì)銀葉粉虱的驅(qū)避性。在溫室內(nèi)，讓棉花在7.5mm直徑盆的培養(yǎng)土中生長(zhǎng)。當(dāng)植物達(dá)到三葉期時(shí)，隨機(jī)選擇八株植物。在分別的試驗(yàn)中，將四株植物作如下處理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐溫80)；NaHCO3；吐溫80；和空白配方。處理將是葉面施用，用手動(dòng)噴霧器(Gilmour)噴施5毫升的物質(zhì)成細(xì)霧狀。另四株植物則不處理，一株只用水噴霧。處理過(guò)和末處理的植物分別擺放成兩行，A或B，處理或未處理，于60×60×30cm箱籠中，籠子帶325目的篩網(wǎng)以允許空氣的流通。在4、8和24小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄處理和未處理的(A和B行)植物上存在的銀葉粉虱數(shù)量。在48小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄每一行植物上的卵數(shù)。
實(shí)施例5葉蟬類(大葉蟬科)此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛對(duì)葉蟬的驅(qū)避性。在溫室內(nèi)，讓棉花在7.5mm直徑盆的培養(yǎng)土中生長(zhǎng)。當(dāng)植物達(dá)到三葉期時(shí)，隨機(jī)選擇八株植物。在分別的試驗(yàn)中，將四株植物作如下處理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐溫80)；NaHCO3；吐溫80；和空白配方。處理是葉面施用，用手動(dòng)噴霧器(Gilmour)噴施5毫升的物質(zhì)成細(xì)霧狀。另四株植物則不處理，一株只用水噴霧。處理過(guò)和末處理的植物分別擺放成兩行，A或B，處理或未處理，于60×60×30cm箱籠中，籠子帶325目的篩網(wǎng)以允許空氣的流通。在4、8和24小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄處理和未處理的(A和B行)植物上存在的葉蟬數(shù)量。在48小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄每一行植物上的卵數(shù)。
實(shí)施例6薊馬(纓翅目)此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛對(duì)薊馬的驅(qū)避性。在溫室內(nèi)，讓棉花在7.5mm直徑盆的培養(yǎng)土中生長(zhǎng)。當(dāng)植物達(dá)到三葉期時(shí)，隨機(jī)選擇八株植物。在分別的試驗(yàn)中，將四株植物作如下處理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐溫80)；NaHCO3；吐溫80；和空白配方。處理是葉面施用，用手動(dòng)噴霧器(Gilmour)噴施5毫升的物質(zhì)成細(xì)霧狀。另四株植物則不處理，一株只用水噴霧。處理過(guò)和末處理的植物分別擺放成兩行，A或B，處理或未處理，于60×60×30cm箱籠中，籠子帶325目的篩網(wǎng)以允許空氣的流通。在4、8和24小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄處理和未處理的(A和B行)植物上存在的薊馬數(shù)量。在48小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄每一行植物(葉隙處)上的卵數(shù)。
實(shí)施例7兩點(diǎn)葉螨(紅葉螨)
此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛對(duì)葉蟬的驅(qū)避性。在溫室內(nèi)，讓棉花在7.5mm直徑盆的培養(yǎng)土中生長(zhǎng)。當(dāng)植物達(dá)到三葉期時(shí)，隨機(jī)選擇八株植物。在分別的試驗(yàn)中，將四株植物作如下處理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐溫80)；NaHCO3；吐溫80；和空白配方。處理是葉面施用，用手動(dòng)噴霧器(Gilmour)噴施5毫升的物質(zhì)成細(xì)霧狀。另四株植物則不處理，一株只用水噴霧。處理過(guò)和末處理的植物分別擺放成兩行，A或B，處理或未處理，于60×60×30cm箱籠中，籠子帶325目的篩網(wǎng)以允許空氣的流通。在4、8和24小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄處理和未處理的(A和B行)植物上存在的兩點(diǎn)葉螨數(shù)量。在48小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄每一行植物(葉隙處)上的卵數(shù)。
實(shí)施例8蚊子(埃及伊蚊)體外驅(qū)避性試驗(yàn)方法此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛對(duì)蚊子的驅(qū)避性。將二十只大致四日齡的未吸血雌蚊引入試驗(yàn)箱內(nèi)。四毫升的試驗(yàn)制劑吸取放于16cm Whatman2號(hào)圓型濾紙上并于空氣中干燥。試驗(yàn)用的試紙放置于通風(fēng)入口箱中。使CO2經(jīng)由水從氣味測(cè)量箱風(fēng)道的通風(fēng)入口末端處由在出入口冒泡而入；并使用最低轉(zhuǎn)速的風(fēng)扇裝置。捕集箱打開(kāi)5分鐘，之后關(guān)閉并計(jì)算及記錄蚊子的數(shù)目。23％的避蚊胺被使用來(lái)當(dāng)作陽(yáng)性對(duì)照組。驅(qū)避性試驗(yàn)方法，田野試驗(yàn)此實(shí)驗(yàn)的目的是生物分析肉桂醛作為蚊子驅(qū)避劑的活性。自篩網(wǎng)材料的1mm尼龍蚊子籠門(mén)栓剪下兩個(gè)直徑18cm和兩個(gè)直徑16cm的環(huán)。處理環(huán)(16cm)浸于1毫升制劑內(nèi)肉桂醛(2％)于2％吐溫80和6％NaHCO3中，之后使之于空氣中干燥2小時(shí)。十只來(lái)自KearneyAgricultural Center的蚊子控制研究實(shí)驗(yàn)室的未喂食雌蚊(埃及伊蚊)(5至7日齡)被引入兩個(gè)Kearney(Fischer)一品脫蚊子紙盒內(nèi)(對(duì)照和處理紙盒)。每一紙盒均用未處理的18cm環(huán)形篩網(wǎng)蓋住并用鑲邊封住此品脫紙盒，蓋子部分已除去。將處理的16cm環(huán)放于成年男性志愿者的一只腳上(事先以香皂和水清洗過(guò))，將未處理的16cm環(huán)放于其另一只腳上。一品脫蚊子紙盒齊平放置，使有篩網(wǎng)的一邊與腳的紗布接觸5分鐘。蚊子并沒(méi)有直接與化合物接觸。5分鐘后，計(jì)數(shù)10只中的吸血/飽食蚊子數(shù)目，結(jié)果顯示于表1，如下?？偣苍u(píng)估三十只昆蟲(chóng)，只有兩只末被肉桂醛制劑所驅(qū)除，而對(duì)照(未處理)組中為19只。
表1蚊子驅(qū)避性ProGuard方案 Kearney蚊蟲(chóng)研究實(shí)驗(yàn)室(10只蚊子中吸血/飽食的蚊子數(shù))試驗(yàn)1試驗(yàn)2試驗(yàn)3總數(shù)肉桂醛制劑10/10 2/10 0/10 2/30對(duì)照(末處理) 5/10 7/10 7/10 19/301肉桂醛(2％)、2％吐溫80和6％NaHCO3的水溶液與上面描述相似的方案用于測(cè)試α-己基肉桂醛。
實(shí)施例9鱗翅目產(chǎn)卵驅(qū)避性此實(shí)驗(yàn)的目的是決定肉桂醛對(duì)甜菜夜蛾成蟲(chóng)的驅(qū)除力。建一套裝置，該裝置進(jìn)口迫使氣流流過(guò)飛行籠中處理或未處理的盆栽植物。五株蕃茄植株在三葉期用5毫升不同濃度的化學(xué)配方和組分處理；之后放于此籠中。另五株蕃茄則以5毫升的水噴霧作對(duì)照，之后也放于籠中。在籠中釋放40只待產(chǎn)卵的甜菜夜蛾(Spodoptera exigna)成蟲(chóng)。打開(kāi)此裝置上的排氣扇，并且將低速直線氣流流經(jīng)作為化學(xué)制劑氣體蒸發(fā)器的籠子。24小時(shí)后，在處理植物、未處理植物以及籠子壁上評(píng)估產(chǎn)卵蛋情形。
實(shí)施例10根瘤蚜-驅(qū)避性的蒸氣試驗(yàn)此試驗(yàn)的目的是評(píng)估肉桂醛對(duì)根瘤蚜的蒸氣驅(qū)避性。將帶有能活的根瘤蚜卵(n-30)的葡萄根狀莖的根塊放置于50×9mm的盤(pán)中，其內(nèi)表面是經(jīng)過(guò)400毫升已知產(chǎn)物濃縮物處理?；瘜W(xué)物質(zhì)不直接放在根上，所以根部的吸收或代謝將不是影響因子。將此盤(pán)關(guān)上并用膠帶封住。經(jīng)過(guò)7天后，將這些盤(pán)打開(kāi)，確定昆蟲(chóng)是否能孵化并于根部立足和發(fā)育，或是否有新孵化的根瘤蚜逃離根部和死亡。
實(shí)施例11在轉(zhuǎn)基因植物體過(guò)量表達(dá)類黃酮醛類制備20微克的聚腺苷酸化RNA，并合成cDNA。將這部分克隆入λ-ZAP II載體內(nèi)(一商業(yè)上可得到的克隆載體)。用寡核苷酸探針至少篩選500,000個(gè)重組體，所述的寡核苷酸探針是由如下兩種序列設(shè)計(jì)的得自GeneBank的克隆CA4H和CAD基因的保守序列；及由想要的宿主植物純化得到的蛋白質(zhì)肽序列。選出強(qiáng)的雜交株，并用來(lái)研究此cDNA文庫(kù)。對(duì)所得的克隆分析其序列，以確保將適當(dāng)?shù)幕蛐蛄幸苑戳x或有義的方向引入植物表達(dá)盒內(nèi)。按照已公開(kāi)的方法，將此反義和有義的構(gòu)建體通過(guò)直接轉(zhuǎn)化引入根癌土壤桿菌LBA4404內(nèi)。煙草(品種Samsun)葉盤(pán)用已非常完善的公開(kāi)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Horsch等人(1985)Science 2271229-1231)。含有CA4H或CAD構(gòu)建體的植物用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確認(rèn)，并選出用于進(jìn)一步的分析。
采用已已非常完善的公開(kāi)分析方法，用來(lái)自轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化之對(duì)照植物的植物材料確定CA4H和CAD酶活性。選出CA4H和CAD的活性減少至低于對(duì)照植物所見(jiàn)的活性的20％的植物，用于進(jìn)一步的分析。具有低的CA4H活性的植物與具有低的CAD活性的植物雜交，并通過(guò)PCR篩選遺傳兩種基因構(gòu)建體的子代。采用標(biāo)準(zhǔn)的分開(kāi)方法，分析帶有抑制的CA4H和抑制的CAD活性之植物的類黃酮醛類的產(chǎn)量。之后，采用任一適宜的實(shí)施例，測(cè)試產(chǎn)生類黃酮醛類的植物對(duì)昆蟲(chóng)或其它害蟲(chóng)的驅(qū)避效力，例如用實(shí)施例3的方法，測(cè)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因棉花驅(qū)避蚜蟲(chóng)的能力。
實(shí)施例12在微生物體系中生產(chǎn)類黃酮醛類用萃取自六周齡的煙草莖之RNA產(chǎn)生一cDNA文庫(kù)。制備20微克的聚腺苷酸化RNA，并合成cDNA。將這部分克隆入λ-ZAP II載體內(nèi)(一商業(yè)上可得到的克隆載體)。用寡核苷酸探針至少篩選500,000個(gè)重組體，所述的寡核苷酸探針是由如下序列設(shè)計(jì)的采用Goffner等人的方案Plant Physiol.(1994)106625，由六周齡的煙草莖組織純化出的CCoAr蛋白質(zhì)肽序列。選出強(qiáng)的雜交株，并用來(lái)研究此cDNA文庫(kù)。將得到的克隆分析其序列，確保對(duì)全長(zhǎng)的cDNA插入體的鑒定，和將適當(dāng)?shù)腃CoAR基因序列引入酵母表達(dá)載體pNTL8110(Faulkner等人(1994)Gene 14313-20)內(nèi)。類酵母紅冬孢(Rhodpsporidiumtoruloides)苯丙氨酸氨裂解酶的編碼序列(PAL；GeneBank RHDPAL區(qū))和歐芹4-香豆酸CoAl連接酶的編碼序列(4CL；GeneBankPC4CL1AA區(qū))均相似地引入等同的酵母菌表達(dá)載體。通過(guò)已已非常完善的公開(kāi)方法(Becker，和Guarente(1991)Methods inEnzymology 194182-187；Simon，(1993)Method in Enzymol.217478-483)，用電穿孔法采用此PAL、4CL和CCoAR構(gòu)建體轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母菌。轉(zhuǎn)化體用缺乏亮氨酸的最小限度培養(yǎng)基來(lái)篩選。帶有所有三種基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化菌株用PCR確認(rèn)，并選出用于進(jìn)一步的分析。
采用已已非常完善的公開(kāi)測(cè)定法，用來(lái)自轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化對(duì)照菌株的萃取物確定PAL、4CL和CCoAR的酶活性。選出PAL、4CL和CCoAR的活性明顯高于在對(duì)照菌株中所檢測(cè)到背景活性的菌株，用于進(jìn)一步的分析。用標(biāo)準(zhǔn)的公開(kāi)方法，分析選出的菌株，選出生產(chǎn)顯著量的肉桂醛的那些菌株，用于最佳化發(fā)酵條件。之后，用所描述的任一種方法，測(cè)試所得植物在驅(qū)避昆蟲(chóng)上的效力。
實(shí)施例13HCA作為昆蟲(chóng)驅(qū)避劑的活性此實(shí)驗(yàn)的目的是確定α-己基肉桂醛是否是一種有效的昆蟲(chóng)驅(qū)避劑。在FDA進(jìn)行兔子的陰性皮膚刺激試驗(yàn)之后，在2至4位男性受試者的皮膚上進(jìn)行評(píng)價(jià)。將1ml HCA擦涂在一只前臂上。帶上手套保護(hù)未處理的手，而與之同時(shí)，將處理的手臂以大約30分鐘的時(shí)間間隔暴露于裝有大量(2,000-4,000只)未吸食的蚊子的籠子三分鐘，直到有兩處叮咬(在一個(gè)試驗(yàn)期中有兩處叮咬或在二個(gè)連續(xù)的試驗(yàn)期中各有一處叮咬)。施用的時(shí)間間隔和有兩處叮咬時(shí)被稱作“保護(hù)時(shí)間”。對(duì)埃及伊蚊，HCA被定為3級(jí)(121-180分鐘持續(xù)時(shí)間)。對(duì)四斑按蚊(Anopheles quadrimaculatus Say)，HCA被定為2級(jí)(31-60分鐘)。
也在處理的衣服上作了HCA對(duì)埃及伊蚊效果的評(píng)價(jià)。在這些試驗(yàn)中，采用了女性的絲光棉長(zhǎng)統(tǒng)襪。踝上的測(cè)定部分用HCA浸泡，其量相當(dāng)于每2英尺3.3g。將此長(zhǎng)統(tǒng)襪展開(kāi)在架上，然后成排掛于室內(nèi)。第一個(gè)試驗(yàn)在處理后24小時(shí)進(jìn)行。將長(zhǎng)統(tǒng)襪穿在手臂上，處理部分在前臂的中間。未處理的手用手套保護(hù)，并將穿長(zhǎng)統(tǒng)襪和手臂暴露于試驗(yàn)籠一分鐘。如果得到5處叮咬，處理則被認(rèn)為是無(wú)效的。如果少于5處叮咬，則將暴露每日連續(xù)進(jìn)行，直到第14天，之后以每周或每?jī)芍艿拈g隔進(jìn)行。HCA在此試驗(yàn)中被定為4級(jí)(有效期大于10天)，與避蚊胺的值相同。
這些試驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的肉桂醛和α-己基肉桂醛制劑對(duì)蚊子是有效的驅(qū)避劑。
在本說(shuō)明書(shū)中提到的所有文獻(xiàn)和申請(qǐng)專利指示與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域中技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有的文獻(xiàn)和申請(qǐng)專利均并入本文作為參考，這種并入等同于指明各單獨(dú)的文件或申請(qǐng)專利具體和個(gè)別地并入作為參考。
本發(fā)明現(xiàn)已完全敘述完，對(duì)于本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員而言，在不偏離本發(fā)明所附之權(quán)利要求書(shū)申請(qǐng)專利范圍的精神和范圍下能做許多改變和修正。
權(quán)利要求書(shū)按照條約第19條的修改1.一種驅(qū)避害蟲(chóng)的組合物，所述的驅(qū)避組合物包含為足以提供驅(qū)避害蟲(chóng)香味之濃度的至少一種類黃酮醛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的類黃酮醛是肉桂醛、α-己基肉桂醛和/或松柏醛。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一的組合物，其中所述的組合物還包含皂草苷。
5.一種從哺乳動(dòng)物身體附近驅(qū)避害蟲(chóng)如昆蟲(chóng)的方法，所述的方法包含以不引起皮膚刺激的量局部施用根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的組合物形式選自由噴霧劑、粘著劑、驅(qū)避油劑和膏劑。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物選自人、牛和羊。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人且所述的害蟲(chóng)是蚤或蚊子。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是牛且所述的害蟲(chóng)是軟蜱。
10.一種從植物附近驅(qū)避害蟲(chóng)的方法，所說(shuō)的方法包含施用根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一的組合物，其中所述的植物選自葡萄、玫瑰、蘋(píng)果和玉米。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是葡萄且所述的害蟲(chóng)是薊馬、線蟲(chóng)、根瘤蚜和卷葉螟。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是玫瑰且所述的害蟲(chóng)是薊馬或瓜蚜。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是蘋(píng)果樹(shù)且所述的害蟲(chóng)是蘋(píng)蠹蛾。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是玉米且所述的害蟲(chóng)是根蚜。
15.一種防止昆蟲(chóng)侵入一區(qū)域的方法，所述的方法是根據(jù)權(quán)利要求1-2、4和18-20之一的組合物施用于所述的侵入附近。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的昆蟲(chóng)是蟑螂。
17.一種防止樹(shù)受害蟲(chóng)侵害的方法，所述的方法包括將所述的樹(shù)干與根據(jù)權(quán)利要求1-2、4和18-21之任一的組合物接觸。
18.一種驅(qū)避害蟲(chóng)的組合物，所述的組合物包含皂草苷和為足以提供驅(qū)避害蟲(chóng)香味之濃度的至少一種類黃酮醛。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中所述的類黃酮醛選自肉桂醛、α-己基肉桂醛和松柏醛。
20.一種驅(qū)避害蟲(chóng)的組合物，所述的驅(qū)避組合物包含足以提供驅(qū)避害蟲(chóng)香味之濃度的α-己基肉桂醛和松柏醛的至少一種。
21.一種防止樹(shù)木被害蟲(chóng)侵害的方法，所述的方法包含將所述的樹(shù)干與一組組合物接觸，該組合物包含為足以提供避害蟲(chóng)之濃度的至少一種黃酮醛。
權(quán)利要求
1.一種驅(qū)避害蟲(chóng)的組合物，所述的驅(qū)避組合物包含為足以提供驅(qū)避害蟲(chóng)香味之濃度的至少一種類黃酮醛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述的類黃酮醛是肉桂醛、α-己基肉桂醛和/或松柏醛。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述的濃度對(duì)總的組合物而言是10-5000ppm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一的組合物，其中所述的組合物還包含皂草苷。
5.一種從哺乳動(dòng)物身體附近驅(qū)避害蟲(chóng)如昆蟲(chóng)的方法，所述的方法包含以不引起皮膚刺激的量局部施用根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的組合物形式選自由噴霧劑、粘著劑、驅(qū)避油劑和膏劑。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物選自人、牛和羊。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人且所述的害蟲(chóng)是蚤或蚊子。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是牛且所述的害蟲(chóng)是軟蜱。
10.一種從植物附近驅(qū)避害蟲(chóng)的方法，所說(shuō)的方法包含施用根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一的組合物，其中所述的植物選自葡萄、玫瑰、蘋(píng)果和玉米。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是玫瑰且所述的害蟲(chóng)是薊馬、線蟲(chóng)、根瘤蚜和卷葉螟。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是玫瑰且所述的害蟲(chóng)是瓜蚜。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是蘋(píng)果樹(shù)且所述的害蟲(chóng)是蘋(píng)蠹蛾。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的植物是玉米且所述的害蟲(chóng)是根蚜。
15.一種防止昆蟲(chóng)侵入一區(qū)域的方法，所述的方法是將根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的組合物施用于所述的侵入附近。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)的昆蟲(chóng)是蟑螂。
17.一種防止林木被害蟲(chóng)侵害的方法，所說(shuō)方法包括將所述樹(shù)的樹(shù)干與根據(jù)權(quán)利要求1-4任一的組合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供含有肉桂醛、α－已基肉桂醛和/松柏醛的驅(qū)避組合物及其作為害蟲(chóng)驅(qū)避劑應(yīng)用的方法,害蟲(chóng)包括蠅、蟑螂、蚜蟲(chóng)、銀葉粉虱、蚊、蜱、蚤、葉蟬、薊馬、二點(diǎn)葉螨、蝸牛、蛞蝓、叮咬蠓、蠼螋和蛾。
文檔編號(hào)A01N35/02GK1179699SQ95195443
公開(kāi)日1998年4月22日 申請(qǐng)日期1995年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月29日
發(fā)明者洛夫·W·愛(ài)默生, 小布來(lái)德福特·G·克蘭德?tīng)?申請(qǐng)人:普羅嘉德公司