專利名稱：蜂膠黃酮提取物的制備方法、藥物制劑及醫(yī)藥新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于蜂膠黃酮的提取純化的新方法、藥物制劑及其新用途的發(fā)明，其中包括蜂膠黃酮治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等作用，屬于中藥或天然藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蜂膠是蜜蜂從膠原植物生枝腋芽處采集的樹脂類物質(zhì)與蜜蜂內(nèi)分泌物的復(fù)雜化合物。蜂膠的化學(xué)成分非常復(fù)雜，通過色譜和質(zhì)譜分析，目前已經(jīng)分離確認(rèn)的黃酮就有二十多種。常規(guī)的蜂膠產(chǎn)品是以蜂膠脫臘后添加其它輔料壓制成片，每片含黃酮以無水蘆丁計(jì)算不得少于3毫克(相當(dāng)于原蜂膠100毫克)，即其產(chǎn)品為蜂膠中黃酮的粗提物。蜂膠作為一種天然藥物，其顯著的療效和神奇的多種功能已引起醫(yī)藥界的高度重視。
關(guān)于蜂膠黃酮治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等方法的報(bào)道在本發(fā)明完成之前沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供了一種適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蜂膠黃酮提取物的工藝。
本發(fā)明的目的之二是提供了以蜂膠黃酮提取物為藥物原料研制滴丸、片劑、膠囊劑、顆粒劑等。
本發(fā)明的目的之三是提供了以活性蜂膠黃酮和酚酸組分為主要藥物用于預(yù)防和治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等疾病。
本發(fā)明所說的蜂膠黃酮提取物是一種總黃酮和總酚酸的混合物，具有治療冠心病、心絞痛、高脂血癥的總黃酮和總酚酸組分，也是首次分離得到，提取物的總黃酮為總量的30-50％和總酚酸20-40％部分活性強(qiáng)、純度高(50％以上)，總黃酮含量以蘆丁計(jì)不少于30.0％，總酚酸含量以原兒茶酸計(jì)不少于20.0％，白楊素含量不得低于3.45％。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下取蜂膠藥材，冷凍(-10℃-4℃)1～5小時(shí)，粉碎成粗粉，按5-25ml/g的蜂膠比例加50-95％乙醇浸提1～4次，每次6～24小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮成稠膏，在40℃-80℃，0.05Mpa條件下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉。每克干粉加50-200ml氯仿-乙醇(10∶1-3∶1)溶解，以等體積0.5-5％氫氧化鈉溶液提取1～3次，堿提液加鹽酸調(diào)pH至4-8，產(chǎn)生沉淀，靜置，抽濾，水洗至中性，在40℃-80℃，0.05Mpa條件下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，即得本發(fā)明提取物。
本發(fā)明的方法制備的蜂膠黃酮提取物為黃棕色至棕色粉末；有特異香氣，味澀，其中總黃酮含量為總量的30-50％，總酚酸含量為總量的20-40％。
建立以蜂膠對(duì)照藥材及白楊素為對(duì)照品的薄層色譜鑒別方法。對(duì)本品干燥失重、熾灼殘?jiān)?、微生物限度進(jìn)行了檢查。蜂膠總黃酮、總酚酸含量采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，白楊素含量采用高效液相色譜法測(cè)定。規(guī)定本品干燥失重不得高于9.0％，熾灼殘?jiān)坏酶哂?.0％，總黃酮含量以蘆丁計(jì)不少于30.0％，總酚酸含量以原兒茶酸計(jì)不少于20.0％，白楊素含量不得低于3.45％。微生物限度符合規(guī)定。
本發(fā)明的化合物和組合物可用于制備治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等疾病的藥物。
按藥劑學(xué)方法，可以將本發(fā)明的蜂膠黃酮制備成多種臨床藥物劑型作為冠心病、心絞痛、高脂血癥等疾病的治療藥物，口服制劑選自于滴丸、片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、口服液體制劑中的任何一種。
本發(fā)明的藥物中的輔料是指常規(guī)的賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑、粘合劑等。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體。
上文的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括稀釋劑、賦形劑，填充劑，粘合劑，濕潤(rùn)劑，崩解劑，吸收促進(jìn)劑，表面活性劑，吸附載體。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選重量比為0.1％～99.5％活性成分，優(yōu)選含有10-90％，更優(yōu)選20-80％，最好為70％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明的施藥量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、疾病類型和嚴(yán)重程度等變化，日劑量為0.01～10mg/kg。
本發(fā)明的蜂膠黃酮藥物制劑具有治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等疾病，是通過以下的藥效實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
蜂膠總黃酮滴丸抗心肌缺血作用摘要 蜂膠總黃酮滴丸經(jīng)十二指腸給藥能明顯改善結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)造成的急性心肌梗塞；明顯縮小經(jīng)N-ST染色所顯示的心肌梗塞區(qū)(MIS)；對(duì)犬血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力的升高具有明顯的抑制作用，對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CPK)活力的升高雖有降低的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。蜂膠總黃酮滴丸還能明顯降低高膽固醇血癥小鼠Tch含量。
目的 通過系統(tǒng)的藥效學(xué)研究，觀察蜂膠總黃酮滴丸對(duì)心血管系統(tǒng)的藥理效應(yīng)，為臨床治療冠心病和心絞痛等心、血管疾病提供理論依據(jù)。
動(dòng)物 昆明種小鼠，體重18-22g，雌雄兼用，購自吉林省藥品檢驗(yàn)所，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為10-1008；健康成年雜種犬，體重12-16kg，雌雄兼用，由白求恩醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
藥物 蜂膠總黃酮滴丸由本院劑型研究室提供，批號(hào)991028，規(guī)格36mg/丸(9mg蜂膠總黃酮/丸)，用時(shí)以適量水配成所需濃度。復(fù)方丹參滴丸，由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)990116，規(guī)格25mg/粒，因其功能主治與本品相近，且其劑型為滴丸，與本品劑型相同，故被用作陽性對(duì)照藥。脂必妥由成都地奧九泓制藥廠出品，批號(hào)9809054。
儀器 RM-6000型多道生理記錄儀，日本光電公司出品；LIANG-100微機(jī)顯示自動(dòng)記錄血液血漿粘度計(jì)；CORMNG-178血?dú)夥治鰞x。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)“t”檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以X±SD表示。
試驗(yàn)結(jié)果一、蜂膠總黃酮滴丸對(duì)結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈前降支造成急性心肌梗塞的影響雜種犬25只，隨機(jī)分為5組，每組5只，以戊巴比妥30mg/kg iv麻醉。背位固定，頸部皮膚切開，氣管插管，連接WM-2型人工呼吸機(jī)，分離冠狀動(dòng)脈左前降支下1/3處，穿線以備結(jié)扎，造成心肌梗塞，施十二指腸術(shù)以備給藥。
術(shù)畢，穩(wěn)定15分鐘。然后自股靜脈取血，測(cè)AST，CPK和LDH值，做為給藥前值，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈15分鐘后，經(jīng)十二指腸給藥，對(duì)照組給予等容量生理鹽水，陽性藥物對(duì)照組給予復(fù)方丹參滴丸200mg/kg，蜂膠總黃酮滴丸80、40、20mg/kg(相當(dāng)于蜂膠總黃酮20、10和5mg/kg)三個(gè)劑量組，記錄300分后，第二次取血測(cè)心肌三酶。最后，取下心臟，稱全心重，沿冠狀溝剪去大血管根部和心房，稱左心室重，將左心室均勻地橫斷切成5片，置于硝基四氮唑蘭(N-BT)染液中，在37℃恒溫水浴箱中染色15分鐘。用落點(diǎn)求積法(36點(diǎn)/cm2)測(cè)量每片心肌雙側(cè)梗塞區(qū)(N-BT非染色區(qū))與非梗塞區(qū)(N-BT染色區(qū))，每片心肌稱重，計(jì)算每片心肌面積，心室總面積和梗塞區(qū)的總面積，計(jì)算梗塞區(qū)與心室及心臟重量百分比。
1、對(duì)MIS的影響陽性藥組，中劑量組，大劑量組均可明顯減少梗塞/全心及梗塞/左心面積(P＜0.05)。見表1。
表1 蜂膠總黃酮滴丸對(duì)心肌梗塞犬心肌梗塞面積的影響(n＝5)劑量組別 梗塞/全心(％)梗塞/左心(％)mg/kg鹽水組-13.23±1.555 20.40±1.734陽性組200 9.88±0.576**15.84±1.237**蜂膠總黃酮滴丸20 13.04±0.983 18.56±1.401蜂膠總黃酮滴丸40 10.84±1.405*17.16±1.744*蜂膠總黃酮滴 80 8.79±0.628***13.94±0.833***注與生理鹽水對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0012、對(duì)心肌三酶(AST、CPK、LDH)的影響陽性藥組對(duì)血清AST含量變化百分率的降低明顯(P＜0.05)；小劑量組對(duì)血清AST含量的變化百分率降低明顯(P＜0.05)；小劑量組對(duì)血清AST含量的實(shí)測(cè)值與對(duì)照組比較則降至89.40±38.901(P＜0.01)。中劑量組對(duì)血清AST含量實(shí)測(cè)值與對(duì)照組比較則降至104.78±22.05(P＜0.01)。大劑量組對(duì)血清AST含量實(shí)測(cè)值與對(duì)照組比較則降至74.80±21.856(P＜0.001)。陽性藥組，小劑量組、中劑量組、大劑量組亦可對(duì)血清CK、LDH、的含量雖有降低趨勢(shì)，但與生理鹽水對(duì)照組比較，無顯著性差異。見表2、3、4。
表2 蜂膠總黃酮滴丸對(duì)心肌梗塞犬血清中AST(U/L)的影響組別 劑量(mg/kg)給藥前給藥后(360min)鹽水組- 36.00±12.530170.60±33.126％ 420.92±209.85陽性組200 47.60±12.700100.60±28.112％ 131.91±102.58#蜂膠總黃酮滴丸20 36.00±7.314 89.40±38.901**％ 149.58±109.89#蜂膠總黃酮滴丸40 28.80±12.736104.78±22.050**％ 357.90±341.31蜂膠總黃酮滴丸80 27.60±7.570 74.80±21.856***％ 193.44±110.88表3 蜂膠總黃酮滴丸對(duì)心肌梗塞犬血清中CK(U/L)的影響組別 劑量(mg/kg)給藥前給藥后(360min)鹽水組- 67.60±25.540507.20±226.61％ 694.37±398.10陽性組200 99.40±40.303549.40±175.19％ 498.05±240.06蜂膠總黃酮滴丸20 66.20±15.595312.40±95.482％ 389.85±178.32蜂膠總黃酮滴丸40 48.80±11.541336.40±118.38％ 580.48±143.87蜂膠總黃酮滴丸80 78.20±10.450313.20±150.12％ 309.06±206.92表4 蜂膠總黃酮滴丸對(duì)心肌梗塞犬血清中LDH(U/L)的影響組別 劑量(mg/kg)給藥前給藥后(360min)鹽水組- 80.40±31.501157.60±45.643％ 168.20±70.247陽性組200 105.0±26.991168.20±70.247％ 73.12±96.522蜂膠總黃酮滴丸20 81.20±22.532168.00±71.376％ 112.75±104.20蜂膠總黃酮滴丸40 81.20±27.842187.20±39.354％ 154.79±95.664蜂膠總黃酮滴丸80 81.00±29.445117.40±13.576％ 59.33±56.369注與鹽水組比較，**P＜0.01，***＜0.001。變化百分率與鹽水組比較，#P＜0.05二、蜂膠總黃酮滴丸對(duì)高膽固醇血癥小鼠血清總膽固醇的影響取昆明種小鼠70只，雄性，體重20±2g，按體重分為7組，并按表5所示劑量連續(xù)給藥7日，于第6天禁食，16h后除空白對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射75％新鮮蛋黃乳0.5ml/20g，16h后各組小鼠眶靜脈取血，分離血清做總膽固醇Tch測(cè)定。結(jié)果表明蜂膠總黃酮滴丸能拮抗蛋黃乳液所致小鼠血清Tch含量的升高，且有顯著性差異，見表5。
表5.蜂膠總黃酮滴丸對(duì)高膽固醇血癥小鼠血清總膽固醇的影響組 別 劑量mg/kg Tch mmol/L空白對(duì)照組—— 2.48±0.40***模型對(duì)照組—— 14.37±3.77蜂膠總黃酮滴丸3209.34±2.27**16011.29±2.11*80 11.84±3.99與模型對(duì)照組比較 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001討論本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)造成急性心肌梗塞模型。用定量組織學(xué)測(cè)定心肌梗塞范圍及心肌梗塞后血清酶的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠總黃酮滴丸經(jīng)十二指腸給藥，能縮小心肌梗塞范圍(MIS)，降低谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，提示蜂膠總黃酮滴丸有抗心肌缺血作用。蜂膠總黃酮滴丸還能顯著降低高膽固醇血癥小鼠Tch的含量；綜上所述，蜂膠總黃酮滴丸具有明顯的抗心肌缺血作用。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1取蜂膠藥材，冷凍(-10℃-4℃)5小時(shí)，粉碎成粗粉，按每克蜂膠20ml的比例加95％的乙醇浸提兩次，每次24小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮成稠膏，80℃，0.05Mpa條件下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉。每克干粉加100ml氯仿-乙醇(10∶1-3∶1)溶解，以等體積5％氫氧化鈉溶液提取二次，堿提液加鹽酸調(diào)pH至4-8，產(chǎn)生沉淀，靜置24小時(shí)，抽濾，水洗至中性，60℃，0.05Mpa條件下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，即得本發(fā)明蜂膠黃酮提取物。
實(shí)施例2取蜂膠藥材，冷凍(-10℃-4℃)5小時(shí)，粉碎成粗粉，按每克蜂膠10ml的比例65％乙醇浸提兩次，每次10小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮成稠膏，55℃，0.05Mpa條件下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉。每克干粉加200ml氯仿-乙醇(10∶1-3∶1)溶解，以等體積1.5％氫氧化鈉溶液提取二次，堿提液加鹽酸調(diào)pH至4-8，產(chǎn)生沉淀，靜置24小時(shí)，抽濾，水洗至中性，減壓干燥(40℃-80℃，0.05MPa)，粉碎成細(xì)粉，即得蜂膠黃酮提取物。
實(shí)施例3滴丸的制備取蜂膠黃酮提取物83g與3倍量聚乙二醇6000經(jīng)混勻、熔化、滴制、冷卻、吸干而制成滴丸。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000版滴丸項(xiàng)目有關(guān)要求。
實(shí)施例4片劑的制備取蜂膠黃酮提取物1000g，藥用淀粉500g，混合均勻，用適量乙醇制粒，經(jīng)整粒機(jī)整粒，壓片，每片0.25g，口服，每次1-2片，每日兩次。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000版片劑項(xiàng)目有關(guān)要求。
實(shí)施例5膠囊劑的制備蜂膠黃酮提取物500g，藥用淀粉500g，混合均勻，裝入0#膠囊，每粒0.30g，每次口服1-2粒，每日兩次。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000版膠囊項(xiàng)目有關(guān)要求。
實(shí)施例6顆粒劑的制備蜂膠黃酮提取物100g，淀粉1000g，糖粉400g，混合均勻，用適量乙醇制粒，干燥、整粒、分裝即得。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000版顆粒劑項(xiàng)目有關(guān)要求?？诜?，一次5g，一日兩次。
權(quán)利要求
1.一種蜂膠黃酮提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟取蜂膠藥材，-10℃-4℃冷凍1～5小時(shí)，粉碎成粗粉，按蜂膠每克加5-25ml的比例50-95％醇浸提1～4次，每次6～24小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮成稠膏，40℃-80℃，0.05Mpa條件下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉；每克干粉加50-200ml氯仿-乙醇混合液溶解，氯仿-乙醇混合比例為10∶1-3∶1，以等體積0.5-5％氫氧化鈉溶液提取1～2次，堿提液加鹽酸調(diào)pH至4-8，產(chǎn)生沉淀，靜置，抽濾，水洗至中性，40℃-80℃條件下減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，即得本發(fā)明產(chǎn)品。
2.以活性蜂膠黃酮提取物為主要成分用于預(yù)防和治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等疾病的藥物及藥物組合物。
3.蜂膠黃酮提取物用于預(yù)防和治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于含有治療有效劑量的蜂膠總黃酮和總酚酸以及一種或多種藥學(xué)上可允許的賦形劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的藥物，其特征在于1％-99％的蜂膠黃酮和酚酸和99％-1％的賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物制劑，其特征在于所說的藥物是口服制劑的劑型。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物制劑，其特征在于所說的口服制劑選自于滴丸、片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、口服液體制劑當(dāng)中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蜂膠黃酮提取物的制備方法、藥物制劑及醫(yī)藥新用途。將蜂膠冷凍粉碎成粗粉，按比例加乙醇浸提，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮成稠膏，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉；用氯仿－乙醇混合液溶解，并以等體積的氫氧化鈉溶液提取，堿提液加鹽酸調(diào)pH至4－8，產(chǎn)生沉淀，抽濾，水洗至中性，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，即得本發(fā)明產(chǎn)品。制備蜂膠黃酮新工藝的特點(diǎn)是得到的蜂膠黃酮提取物總黃酮的含量以盧丁計(jì)不少于30％、總酚酸含量以原兒茶酸計(jì)不少于20％，白楊素含量不得低于3.45％。重金屬含量低(低于5ppm)，農(nóng)藥殘留量低(低于10ppb)，其藥物制劑可用于預(yù)防和治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等疾病。
文檔編號(hào)A61K9/48GK1544429SQ20031011008
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者隋殿軍, 楊明, 焦連慶 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院, 吉林省中醫(yī)中藥研究院