專利名稱：用于分解煙堿的功能藥劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于分解煙堿的功能藥劑及其制備方法，更具體地，涉及一種除去由吸煙引起的煙堿傷害和抑制由吸煙引起的致癌物產(chǎn)生的功能藥劑。
背景技術：
煙堿是無色或淡黃色有毒液體，由吸煙吸收入身體內(nèi)。煙堿的毒性在于它影響神經(jīng)節(jié)的細胞膜。此外，已知煙堿可引起血壓的升高，骨骼肌纖維的痙攣，和由于興奮的口麻痹。
煙堿的瞬時傷害包括瞳孔收縮、眼睛視力渾濁、嘔吐、惡心、胃痛、腹瀉、控制排尿困難、喉灼傷、呼吸困難、唾液和呼吸器官的分泌物增加、青紫病和脈搏變緩。當吸煙延續(xù)時，煙堿在身體內(nèi)積累使得它可引起癌癥、高血壓、口疾病、由于過量酸消化不良的各種胃腸紊亂和各種循環(huán)疾病，如動脈硬化。同樣，煙堿是促進老化的重要因素，并且在嚴重情況下，它可引起痙攣、驚厥、呼吸麻痹、肌肉痙攣和不必要的高血壓(Damaj，M.I.，Welch，S.P.和Martin，B.R.(1996)J.Pharmacol.Exp.Thr.，277，454-461)。
由于煙堿衍生出亞硝胺，因而煙堿是非常強的致癌物。全世界每年有數(shù)億計的患者患上由吸煙引起的肺癌和肺疾病。在1956年，Magee和Barnes證明N’-亞硝基二甲胺(NDMA)對大鼠是非常強的肝癌誘導物(Magee，P.N.，和Barnes，J.M.(1956)Br.J.Cancer，10，114-122)，其后超過30種N-亞硝胺化合物被確認為具有致癌物活性(Druckrey，H.，Preussmann，R.，Ivankovic，S.，和Schmahl，D.(1967)Z.Krebsforsch.，69，103-201；Preussmann，R.，和Stewart，B.W.(1984)N-亞硝基致癌物，化學致癌作用(Chemical Carcinogenesis)，(Searle，C.E.主編)643-828頁，美國化學會(American Chemical Society)，華盛頓特區(qū)；Lijinsky，W.(1992)N-亞硝基化合物的化學和生物學(Chemistry and Biology of N-NitrosoCompounds)，劍橋大學出版社(Cambridgee University Press)，英國劍橋；Bogovski，，P.，和Bogovski，S.(1981)Int.J.Cancer，27，471-474))。
在1962年，Druckrey和Preussmann提出衍生自煙草生物堿的亞硝胺存在于煙草煙霧中(Druckrey，H.，和Pressmann，R.(1962)Die Natur.，49，488-499)。在1964年，Boyland等人證實NNN(N’-亞硝基降煙堿)使小鼠發(fā)生肺癌，NAB(N’-亞硝基新煙堿)使大鼠發(fā)生食道癌(Boyland，E.，Roe，F(xiàn).J.C.，和Gorrod，J.W.(1964)Nature，202，1126；Boyland，E.，Roe，F(xiàn).J.C.，和Gorrod，J.W.，和Mitchley，B.C.V.(1964)Br.J.Cancer，18，265-270)。
Smith等人在他的經(jīng)典研究(Smith，P.A.S.，和Loeppky，R.N.(1967)J.Am.Chem.Soc.，89，1148-1152)中，根據(jù)通過亞胺離子的叔胺亞硝化(Klus，H.，和Kuhn，H.(1975)Fachliche MittAustria Tabakwerke，16，307-317；Hecht，S.S.，Chen，C.B.，Dong，M.，Ornaf，R.M.，Hoffmann，D.，和Tso，T.C.(1977)Beitr Tabakforsch.，9，1-6) 證明各種亞硝胺是由煙堿產(chǎn)生。Hecht等人確認4-(甲基亞硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、4-(甲基亞硝氨基)-4-(3-吡啶基)-丁醛(NNA)、NNN和其它硝基化合物由煙堿產(chǎn)生，并從煙草中檢測出NNK(Hecht，S.S.，Chen，C.B.和Hoffmann，D.(1976)Tetrahedron Lett.，8，593-596；Hecht，S.S.，Chen，C.B.，Ornaf，R.M.，Jacobs，E.，Adams，J.D.，和Hoffmann，D.(1978)J.Org.Chem.，43，72-76；Hecht，S.S.，Chen.C.B.，Hirota，N.，Ornaf，R.M.，Tso，T.C.，和Hoffmann，D.(1978)J.Natl.Cancer Inst.，60，819-824)。
圖1顯示煙堿代謝產(chǎn)生的各種亞硝胺。
到目前為止，已經(jīng)從煙草產(chǎn)物中識別出7種煙草特異性亞硝胺，即NNN、NNK、NNAL、NAT、NAB、異-NNAN和異-NNAC，其中NNN、NNK和NAT比其它幾種以更大數(shù)量檢測到。特別是NNN、NNK、和NAT已經(jīng)確認為非常強的致癌物。
煙堿通過兩種過程代謝為可替寧，在代謝中涉及細胞色素P450(以下稱CYP)和細胞溶質醛氧化酶。煙堿由不同的CYP代謝成可替寧，其中CYP2A6具有重要的作用(Cashman，J.R.，Park，S.B.，Yang，Z.C.，Wrighton，S.A.，Jacob.P.III.，和Benowitz，N.L.(1992)Chem.Res.Toxicol.，5，639-646)。
圖2顯示由煙堿到可替寧的代謝。
70-80％的煙堿轉化為可替寧，其中10-15％的可替寧由尿排泄，剩余部分代謝為酮酸。85％的酮酸代謝為羥基酸并由尿排泄。不代謝為可替寧的4％煙堿由FMO(含黃素的單氧酶)轉化為煙堿-1-N-氧化物，大多數(shù)由尿排泄(Benowitz，N.L.，Jacob.P.III.，和Fong，I.(1994)J.Pharmacol.Exp.Ther.，268，296-301)。因此，80-90％的煙堿通過代謝由尿排泄(Kyerematen，G.A.，Morgan，M.L，Chattopadhyay，B.，deBethizy，J.D.，和Vessel，E.S.(1990)Clin.Pharmacol.Ther.，48，641-651；Caldwell，W.S.，Greene，J.M.，Byrd，G.D.，Chang，K-M，Uhrig，M.S.，deBethizy，J.D.，Crooks，P.A.，Bhatti，B.S.，和Riggs，R.M.(1992)Chem.Res.Toxicol.，5，280-285；Byrd，G.D.，Chang，K-M.，Greene，J.M.，deBethizy，J.D.(1992)Drug.Metab.Dispos.，20，192-197；Jacob.P.III.，Benowitz，N.L.，和Shulgin，A.J.(1988)Pharmacol.Biochem.Behav.，30，249-253)。
如圖3所示，NNK是對實驗室動物的前致癌物，并主要在肝和肺中由CYP酶代謝。NNK活化的主要步驟是由CYP為媒介的α-羥基化，在反應中，NNK轉化為不穩(wěn)定代謝物甲基-重氮氫氧化物，它向DNA提供甲基并產(chǎn)生O6MeG。O6MeG已經(jīng)用作衍生自NNK致癌物的前誘變生物指標。
報導CYP與A/J小鼠中NNK和NNN的α-羥基化有關，誘導DNA的甲基化，形成O6-甲基鳥嘌呤(O6MeG)使得GC→AT發(fā)生轉變錯配，并且它活化K-ras原-癌基因(Brown，B.G.，Ching-jey，G.C.，Paul，H.A.，Chin，K.L.，和David，J.D.(1999)Toxicol Scien.，47，33-39)。
因此，提出通過體外或體內(nèi)使用抗CYP酶底物如煙堿或可替寧的底物競爭性抑制劑，有效抑制NNK通過CYP引起的肺癌，這是由于它抑制NNK代謝(α-羥基化)的活化(Brunnemann，K.D.等人(1991)Crit Rev Toxicol.，21(4)，235-40)。圖4顯示在NNN，煙堿和NNK之間的結構相似性，它們與細胞色素P4502A6的代謝有關。
煙堿的主要代謝物可替寧，以及其后的代謝物酮酸和羥基酸，被快速代謝并由尿排泄。此代謝因人而異?？商鎸帲岷土u基酸是由吸煙影響的唯一因素，而不是致癌物。此外，它們用作競爭性抑制劑以抑制煙草特異性亞硝胺通過肝中存在的CYP轉化成致癌物。因此，快速代謝為可替寧的煙堿可降低吸煙的傷害，與煙堿轉化為衍生物如NNK、NNA和NNN相比，能更有效地抑制癌癥，發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供用于快速分解由吸煙引起的有害化學物質的功能藥劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供可抑制致癌物如煙堿和煙堿衍生物產(chǎn)生的功能藥劑。
為完成這些目的，本發(fā)明提供一種用于分解煙堿的功能藥劑，通過干燥包括如下物質的組合物來制備(a)50-500重量份從綠茶葉提取的綠茶有效成分的粉末；(b)7.5-75重量份桑樹葉沸水浸漬提取物；(c)3-30重量份蘋果汁；(d)3-30重量份甘草根沸水浸漬提取物；和(e)1.5-15重量份干桔皮沸水浸漬提取物。
本發(fā)明也提供一種用于分解煙堿的功能飲料，通過將0.1-5wt％功能藥劑與水混合來制備該功能飲料。
本發(fā)明也提供一種功能藥劑的制備方法，包括(a)通過提取和過濾銀杏果、芹菜、蘋果和檸檬，制備果實和蔬菜濾液；(b)在100℃下提取甘草根和干桔皮，混合桑樹葉，并對其進行提取和過濾以制備葉子和草藥濃縮物；和(c)混合步驟(a)的果實和蔬菜濾液，步驟(b)的葉子和草藥濃縮物及綠茶粉末，將其過濾和噴霧干燥以制備粉末。


圖1顯示從煙堿產(chǎn)生的亞硝胺。
圖2顯示煙堿變成可替寧的代謝。
圖3顯示4-(甲基亞硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的代謝機理。
圖4顯示在NNN(N’-亞硝基降煙堿)，煙堿和NNK之間的結構相似性，它們與細胞色素P4502A6的代謝有關。
圖5是顯示由直接混合法，本發(fā)明功能藥劑對煙堿分解性的圖。
圖6是顯示使用FLCFR5細胞株測量本發(fā)明功能藥劑對煙堿分解性的圖。
圖7是顯示在已經(jīng)吸收功能藥劑的細胞中，本發(fā)明功能藥劑對煙堿分解性的圖。
圖8是顯示將功能藥劑和煙堿一起注入zenopus卵母細胞中時，本發(fā)明功能藥劑對煙堿分解性的圖。
圖9是顯示臨床檢驗方法來檢驗本發(fā)明功能藥劑對煙堿分解性的圖。
圖10是顯示攝取本發(fā)明功能藥劑的吸煙者(A)和作為對照攝取水的吸煙者(B)尿中可替寧濃度的圖。
圖11是顯示攝取本發(fā)明功能劑的吸煙者和作為對照攝取水的吸煙者尿中平均可替寧濃度的圖。
圖12是在每個人飲用功能藥劑或水之后，吸煙者尿中包含的煙堿的平均值。
圖13是顯示功能藥劑、粉狀綠茶、EGCG(表焙兒茶素-3-沒食子酸鹽)、槲皮素、維生素C和兒茶素，對于亞硝基嗎啉產(chǎn)生的抑制效果的圖。
圖14是顯示煙堿代謝的圖。
圖15是顯示功能藥劑、槲皮素、兒茶素和粉狀綠茶對CYP酶活性的抑制效果的圖。
圖16是顯示功能藥劑、槲皮素、兒茶素和粉狀綠茶對CYP 1A2酶活性的抑制效果圖。
圖17是顯示功能藥劑、EGCG、槲皮素、兒茶素和粉狀綠茶，在高濃度(A)下和低濃度(B)下，對純化的CYP 1A2酶活性的抑制效果圖。
圖18是顯示功能藥劑、槲皮素、兒茶素和粉狀綠茶對NNK誘變性的抑制效果圖。
圖19是顯示功能藥劑、槲皮素、兒茶素和粉狀綠茶對由苯并芘引起的誘變性的抑制效果圖。
圖20是顯示功能藥劑、粉狀綠茶、槲皮素和兒茶素的自由基清除效果的圖。
圖21是顯示通過使用SOD試劑盒，功能藥劑、粉狀綠茶、槲皮素和兒茶素清除O2-效果的圖。
圖22是顯示包含在功能藥劑溶液中槲皮素含量的HPLC圖。
圖23是顯示在使用功能藥劑抑制NNK誘導肺癌的試驗中，A/J小鼠體重的圖。
具體實施例方式
在提高體內(nèi)煙堿分解性的研究期間，本發(fā)明人研究的是當把天然食品加入到包含許多兒茶素和EGCG的綠茶和包含槲皮素的蘋果提取物中時，它變成優(yōu)異的功能藥劑以分解和抑制煙草有害成分的產(chǎn)生。
通過干燥組合物，制備本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑，組合物包括(a)50-500重量份從綠茶葉提取的綠茶有效成分的粉末；(b)7.5-75重量份桑樹葉的沸水浸漬提取物；(c)3-30重量份蘋果汁；(d)3-30重量份甘草根的沸水浸漬提取物；和(e)1.5-15重量份干桔皮的沸水浸漬提取物。
本發(fā)明的功能藥劑進一步包含通過干燥組合物而制備的提取物，組合物包括(a)7.5-75重量份銀杏果提取物；(b)3-30重量份芹菜提取物；和(c)3-30重量份檸檬提取物。
本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑優(yōu)選包括(a)100-200重量份從綠茶葉提取的綠茶有效成分的粉末；(b)15-30重量份桑樹葉；(c)15-30重量份銀杏果；(d)6-12重量份芹菜；(e)6-12重量份檸檬；(f)6-12重量份蘋果；(g)6-12重量份甘草根；和(h)3-6重量份干桔皮。
本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑的干燥方法可以是常規(guī)干燥方法，優(yōu)選噴霧干燥方法。
功能藥劑可單獨使用或包含在多于一種藥物的組合物中。包括功能藥劑的組合物可包括多于一種的藥物稀釋劑，藥物稀釋劑選自鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油和乙醇，但稀釋劑并不僅限于此。適當?shù)南♂寗┝杏凇度鹈黝D的藥物科學》(Remington’s Pharmaceutical Science)(Mack Publishingco，Easton PA)的書面文本中。
功能藥劑或包含功能藥劑的組合物可通過口服或胃腸外途徑用藥。胃腸外給藥表示通過不是口服途徑的藥物給藥，它包括直腸、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、吸入、眼內(nèi)和皮下引入。
包含功能藥劑的藥物劑型可以采用任何形式來制備，如口服劑形式、可注射溶液或局部制劑。藥物劑型的例子如下膏藥、顆粒、洗劑、擦劑、檸檬飲料、芳香水、粉劑、糖漿、眼軟膏、液體和溶液、氣霧劑、提取物、酏劑、藥膏、流浸膏、乳劑、懸浮劑、煎劑、浸漬劑、片劑、栓劑、注射劑、醑劑、敷劑、膠囊、乳膏、錠劑、酊劑、糊劑和丸劑。
劑型可優(yōu)選制備用于口服和注射給藥，并且最優(yōu)選為口服形式如片劑、膠囊、軟膠囊、含水藥物、顆粒等。
在制備制劑中，不添加任何賦形劑將功能藥劑填入軟膠囊中，或與載體混合或稀釋之后，形成為適當?shù)膭┬?。合適載體的例子是淀粉、水、鹽水、林格溶液、葡萄糖和在先前報告中描述的任何成分(例如《瑞明頓的藥物科學》(Remington’s Pharmaceutical Science)，Mack Publishing co，EastonPA)。
本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑可用作健康飲料或食品添加劑，并優(yōu)選用作食品、食品添加劑、藥物、飲料、或飲料添加劑。也優(yōu)選將0.1-5wt％功能藥劑與水混合以制備功能飲料。
本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑或飲料促進煙堿的分解，抑制那些是致癌物的亞硝基化合物的產(chǎn)生。同樣，功能藥劑抑制細胞色素P4501A2酶活性，因而防止由NNK形成致癌物。此外，它還顯示出抗氧化效果、抑制由NNK和苯并芘導致的誘變性并可降低肺癌的增殖速率。
本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑包括約0.32mg/mg的兒茶素和56ng/mg的槲皮素。
通過過濾果實和蔬菜，濃縮葉子和草藥，將它們混合并干燥，而制備功能藥劑。
通過洗滌，研磨，提取和過濾如下物質而制備果實和蔬菜濾液7.5-75重量份銀杏果，3-30重量份芹菜，3-30重量份檸檬，和3-30重量份蘋果。過濾可以是常規(guī)方法，更優(yōu)選使用篩網(wǎng)或硅藻土。最優(yōu)選使用100目網(wǎng)和硅藻土過濾，以防止在水相中的沉淀。同樣，在過濾步驟中，優(yōu)選在第一次提取之后，向軟泥中加入適度數(shù)量的水并再次攪拌、提取、過濾以有效提取有效成分。在0-7℃下貯存果實和蔬菜濾液。
葉子和草藥濃縮物的制備是通過向提取槽中加入400-4000重量份水、3-30重量份甘草根和1.5-15重量份干桔皮，升高溫度到100℃進行提取。然后，在向提取槽中加入100-1000重量份水之后，加入7.5-75重量份桑樹葉。在60-95℃下進行提取10-40分鐘。通過過濾和濃縮提取物而制備葉子和草本植物濃縮物。以上過濾方法優(yōu)選是常規(guī)方法，更優(yōu)選可以使用篩網(wǎng)、外殼過濾(housing filtration)或硅藻土。最優(yōu)選的方法是采用100目網(wǎng)，1μm外殼過濾器和硅藻土的過濾。在第一次提取之后，將400-4000重量份水進一步加入到剩余的軟泥中，通過再次提取和過濾，可以制備葉子和草本植物濃縮物。
混合和粉末制備步驟包括將50-500重量份從綠茶葉提取的綠茶有效成分的粉末與以上果實和蔬菜濾液、葉子和草藥濃縮物混合，通過高速離心分離機除去沉淀物并干燥。干燥可以是常規(guī)方法，優(yōu)選噴霧干燥。
進一步參考以下實施例更詳細解釋本發(fā)明。然而，這些實施例不應當在任何意義上解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1用于分解煙堿的功能藥劑果實和蔬菜濾液的制備步驟將60kg去皮而未干燥的銀杏果，24kg洗滌的芹菜，24kg蘋果和24kg檸檬在研磨機中研磨之后，壓榨。將100L水在壓榨之后加入到軟泥中，攪拌30分鐘，再次壓榨并與第一次壓榨液混合。將壓榨的液體通過100目網(wǎng)和硅藻土過濾，在4℃下貯存。
葉子和草藥濃縮物的制備步驟在向1.5噸罐中加入0.5噸水之后，將24kg甘草根和12kg干桔皮加入，在100℃下提取2小時。在向其中加入0.2噸水之后，將60kg桑樹葉加入，首先在80℃下提取30分鐘。將第一提取物單獨貯存，同時將0.5噸水加入到軟泥中，在80℃下另外提取30分鐘。將第一和第二提取物混合，通過100目網(wǎng)，1μm外殼過濾器和硅藻土過濾，濃縮。
混合和噴霧干燥的步驟將100kg從綠茶葉提取的綠茶有效成分的粉末與果實和蔬菜濾液以及葉子和草藥濃縮物均勻混合，用高速離心分離機除去沉淀物之后，通過噴霧干燥制備煙堿分解藥劑。
實施例2用于分解煙堿的功能飲料將100ml水與實施例1中的用于分解煙堿的功能藥劑0.1-5g混合，制備用于分解煙堿的功能飲料。
實施例3用于分解煙堿的功能藥劑的效果試驗為證實實施例1中制備的功能藥劑中是否存在可分解煙堿的物質，分別直接將水和用于分解煙堿的功能藥劑與煙堿混合，測量煙堿分解性。水是對照物。
在Eppendorf管(1.5ml)中均勻混合200μl的1mM煙堿(目錄號N3876，Sigma)和200μl功能藥劑溶液(0.3％)。在0，10，20，30，60，和120分鐘之后，產(chǎn)生的可替寧用可替寧定量方法定量測定并如圖5所示。試驗溫度是25℃。
本試驗使用改進的Barlow方法，該方法簡單且更精確，在1987年開發(fā)(Barlow，R.D.，Stone，R.B.，Wald，N.J.，和Puhakainen，E.J.(1987)Clin.Chim.Acta.，165，45-52)。具體方法如下。
將200μl樣品和標準物加入到1.5ml聚丙烯管中的緩沖溶液或蒸餾水中。為提高試驗結果的可靠性，每個樣品使用三個管。將100μl的4M乙酸鈉緩沖溶液(pH4.7)，40μl的1.5M KCN，40μl的0.4M氯胺-T，200μl溶于50％(V/V)乙腈的78mM巴比土酸依次加入到樣品中，并混合10秒。將混合物在室溫(25℃)下反應15分鐘，在加入40μl的1M偏亞硫酸氫鈉之后停止反應。在490nm下測量吸光度，與標準可替寧相比較將樣品定量化。
同樣，在15和37℃下進行相同的試驗。不同溫度試驗的原因是檢查涉及可替寧產(chǎn)生的過程是化學反應或生物催化劑(如酶)相關的反應。不同溫度試驗的結果幾乎與在25℃下試驗的結果相同。
如圖5所示，盡管加入本發(fā)明功能藥劑的可替寧吸光度只有3.0，而加入水的可替寧吸光度僅為1.3。因此，確認在本發(fā)明的功能藥劑中存在煙堿分解物質。此外，當沒有功能藥劑時，從煙堿到分解產(chǎn)物的轉變時間非常緩慢(約10-20分鐘)。相反，觀察到在功能藥劑下，顯著產(chǎn)生可替寧。這顯示本發(fā)明的功能藥劑與試管中的煙堿反應，因而促進煙堿的分解。
實施例4細胞培養(yǎng)中煙堿分解性的測量將煙堿和功能藥劑處理到細胞上，并把從煙堿產(chǎn)生的可替寧數(shù)量定量化。一般情況下，由煙堿、可替寧、硫氰酸酯和碳氧血紅蛋白的量，測量吸煙者的吸煙量。然而，煙堿的半衰期為30分鐘，它不如可替寧穩(wěn)定，可替寧的半衰期為24小時。
通過培養(yǎng)衍生一周的人體肝細胞衍生的FLCFR5細胞并將它們分成小數(shù)量，而制備原種細胞。為定量化，將分開的肝細胞培養(yǎng)一周直到100％的鋪滿。然后，將它們進一步在包含煙堿的培養(yǎng)基(5％FBS加入的DMEM(Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基)，1mM煙堿)中培養(yǎng)一周。將120μl功能藥劑溶液(0.3％)加入到培養(yǎng)的細胞中并培養(yǎng)，然后在10，20，30，60，120分鐘之后收集細胞。將收集的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次或四次并用刮刀收集。用離心分離器收集細胞并加入100μl的PBS(4℃)之后，由超聲發(fā)生器(Vibra Cell-200，Newton，Conn.，USA)間歇破碎細胞30秒，在490nm下用DBA方法測量吸光度。同樣，水作對照物用相同的方法測試。
圖6是顯示功能藥劑的煙堿分解性的圖，它顯示施加本功能藥劑的細胞比對照產(chǎn)生更多的可替寧。
此外，當已經(jīng)吸收了用于分解煙堿的功能藥劑于細胞中時，對新引入煙堿的分解性也被證實。
將FLCFR5細胞在包含功能藥劑的培養(yǎng)基(每1ml培養(yǎng)基含有120μl功能藥劑)中預培養(yǎng)6小時。在預培養(yǎng)之后，將細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，在包含煙堿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由相同的方法測量細胞中的可替寧數(shù)量。
圖7顯示已經(jīng)吸收了功能藥劑的細胞中功能藥劑對煙堿的分解性。已經(jīng)吸收功能藥劑的細胞比沒有吸收功能藥劑的細胞產(chǎn)生更多的可替寧。當與圖6的細胞比較時，其功能藥劑是隨后加入的，兩種情況下產(chǎn)生的可替寧數(shù)量相似。這意味著在功能藥劑的長期攝入和就在吸煙之前攝入之間沒有顯著的差異。
圖6和7中煙堿分解性的結果具有與圖5直接混合方法中相同的模式。這可解釋如下。具有煙堿分解性的成分容易穿過細胞膜并在細胞中保持穩(wěn)定性。物質穩(wěn)定性具有相同的模式，而與胞齡無關。當對等分成完全鋪滿狀態(tài)的細胞進一步培養(yǎng)時，觀察到的相同模式是它們可達到60-100％的鋪滿。當存在功能藥劑時，顯著促進煙堿的分解。在通常觀念下，對于飲用綠茶的吸煙者，由功能藥劑促進煙堿分解和可替寧的產(chǎn)生，是由于維生素C的補充，這與由兒茶素吸收煙堿不一致。這是由于在綠茶提取物存在下，從煙堿向可替寧的加速轉變不能用這些理由解釋。因此，我們可提出其它假定功能藥劑的一種未知成分涉及該轉變或由完全不同的機理促進從煙堿向可替寧的轉變。一種兒茶素通過吸收沉淀如煙堿的毒性物質的沉淀理論，可解釋細胞中游離煙堿的降低。然而，觀察到在功能藥劑的存在下，當培養(yǎng)時間增加時，可替寧的數(shù)量增加。這意味著功能藥劑的一種未知成份，而不是兒茶素，影響著煙堿的分解。
實施例5通過使用zenopus未成熟卵細胞測量煙堿分解性為消除注入煙堿或功能藥劑的時間和吸收入細胞的時間之間的間隙，將煙堿或功能藥劑直接注入zenopus未成熟卵細胞(卵母細胞)中并測量煙堿分解性。
從母體分離未成熟卵細胞并選擇IV或V階段直徑為1.0-1.2mm的細胞，將卵細胞在15℃下在OR2溶液中培養(yǎng)一天(Byrd，G.D.，Chang，K-M.，Greene，J.M.，deBethizy，J.D.(1992)Drug.Metab.Dispos.，20，192-197)。在培養(yǎng)之后，使用之前用鑷子(鐘表匠)直接除去未成熟卵細胞的保護膜，除去多個未成熟卵細胞的保護膜可通過使用III型膠原酶(Sigma)來制備(Lee DH.(1998)J.Biochem.Molecular Biology，31(2)，196-200)。
用微操作器將1mM煙堿和120μl功能藥劑溶液(0.3％)的混合溶液500nl注入未成熟卵細胞中。在注入之后，將未成熟卵細胞分別在15℃，25℃(正常溫度)，和32℃下培養(yǎng)，在0，10，20，30，60，120秒收集并在OR2溶液中進行勻漿(杜恩斯勻漿器)。由離心分離除去勻漿的卵黃，取上清液以定量化測定可替寧。此外，為排除注入方法的影響，在用于細胞培養(yǎng)試驗的煙堿和功能藥劑濃度下，在OR2介質培養(yǎng)物中培養(yǎng)相同的時間，確認功能藥劑的煙堿分解性。
圖8是顯示當在zenopus卵母細胞中注入功能藥劑和煙堿時，本發(fā)明功能藥劑煙堿分解性的圖。它顯示比圖6更高的煙堿分解性。同樣，根據(jù)培養(yǎng)溫度測量zenopus卵母細胞的反應性，但沒有差異。
實施例6
臨床試驗的煙堿分解性測量為證明功能藥劑的煙堿分解性，進行臨床試驗。在臨床試驗中，每天吸15-25支煙的健康二十歲男子(17-20人)作為試驗對象，煙草是“THIS”(商標，市場購得)。
為保證試驗，將試驗重復幾次并平均。在不同的日子測試飲用功能藥劑的試驗組和飲用水的對照組。如果可能，使在試驗期間身體條件和試驗時間相一致。試驗對象如通常那樣吸煙，試驗方法如圖9所示。
立即在-20℃下貯存收集的第一次，第二次和第三次尿液。在48小時之后，對尿液中煙堿的重要代謝物可替寧定量測定。詳細方法如下。
將500μl的尿液或標準樣品放入1.5ml管中。為保證試驗結果的可靠性，每個樣品使用兩個管。將250μl的4M乙酸鈉緩沖溶液(pH4.7)，100μl的1.5M KCN，100μl的0.4M氯胺-T，500μl溶于50％(v/v)乙腈的78mM巴比土酸依次加入到樣品中，混合10秒。將混合物在室溫(25℃)，100rpm下反應15分鐘，加入100μl的1M偏亞硫酸氫鈉之后停止反應。在490nm下測量吸光度，與標準曲線相比較將樣品定量化。
圖10是顯示已攝取用于分解煙堿的功能藥劑的吸煙者煙堿分解性的圖。(A)是對照，在試驗對象飲水并吸煙之后，將尿液中的可替寧定量化。(B)是在試驗對象飲用功能藥劑并吸煙之后，將尿液中的可替寧定量化。從37個吸煙者收集第一次，第二次和第三次尿液。
圖11是顯示攝取了本發(fā)明的功能藥劑的吸煙者平均可替寧濃度的圖。由于攝取功能藥劑的組的尿液中可替寧含量比對照組更大，從而證實功能藥劑具有高的煙堿分解性。
圖12是在飲用功能藥劑或水之后吸煙的吸煙者每個人尿液中含有可替寧的平均值。將每人第二次或第三次尿液可替寧的值除以第一次尿液的平均值，并將功能藥劑與水比較。
煙堿分解速率是基于第二次和第三次尿液中產(chǎn)生的可替寧。當排出第一次，第二次和第三次尿時，尿中所有的可替寧被排泄，可確認煙堿分解成可替寧。同樣，試驗組的煙堿分解速率(可替寧產(chǎn)生速率)是對照組的約兩倍。這顯示本發(fā)明的功能藥劑促進身體內(nèi)煙堿向可替寧的分解。
另外制備包括功能藥劑的片劑。
將吸煙超過兩年的健康四十歲男子(20-30人)分成兩組并試驗2天。
試驗對象每小時吸煙一次，持續(xù)8小時，期間收集五次尿液。向組I的試驗對象給藥三次每次兩片，向組II給藥一次六片，收集尿液。
<試驗方法>
對照(組I和組II)飲水&吸煙→在1小時之后，第一次收集尿液，飲水&吸煙→在1小時之后，第二次收集尿液，飲水&吸煙→在1小時之后，第三次收集尿液，飲水&吸煙→在1小時之后，吸煙→在1小時之后，第四次尿收集，飲水&吸煙→在1小時之后，吸煙→在1小時之后，吸煙→在1小時之后，第五次收集尿液。
組I服用兩個片劑，飲水&吸煙→在1小時之后，第一次收集尿液，飲水&吸煙→在1小時之后，第二次尿收集尿液&吸煙→在1小時之后，第三次收集尿液，服用兩個片劑，飲水&吸煙→在1小時之后，吸煙→在1小時之后，第四次收集尿液，服用兩個片劑，飲水&吸煙→在1小時之后，吸煙-＞在1小時之后，吸煙-＞在1小時之后，第五次收集尿液。
組II服用六個片劑，飲水&吸煙→在1小時之后，第一次收集尿液，飲水&吸煙→在1小時之后，第二次收集尿液&吸煙→在1小時之后，第三次收集尿液，飲水&吸煙→在1小時之后，吸煙→在1小時之后，第四次收集尿液，飲水&吸煙→在1小時之后，吸煙→在1小時之后，吸煙→在1小時之后，第五次收集尿液。
立即在-20℃下貯存收集的尿液。在48小時之后，將尿中煙堿的重要代謝物可替寧進行定量化。

表1當以片劑給藥時，與僅飲用水相比，尿中可替寧數(shù)值增加60-100％。試驗期間從組I收集的尿液中含有的可替寧保持在一個濃度，而組II尿液中的可替寧濃度，在10hr之后幾乎與對照組的相同。
實施例7功能藥劑對亞硝基嗎啉產(chǎn)生的抑制效果此試驗涉及體外試驗，體外試驗是關于當亞硝化劑如亞硝酸、亞硝酸酯、硫代酸酯、無水亞硝酸、亞硝酰鹵、金屬亞硝酰和無機金屬亞硝酸鹽配合物，與胺或包含其它氮的化合物反應，以形成致癌物如亞硝胺或N-亞硝基化合物時，功能藥劑是否抑制以上致癌物的產(chǎn)生。
試驗的進行是根據(jù)美國專利No.5,087,671(用于清除亞硝化劑的聚合物)和通過應用DBA(直接巴比土酸)方法，該方法用來檢測尿液中的可替寧，以及氣相色譜的預處理方法(Joseph，D.，Lajos H.，Nigel，H.，Stanley，I.R.，和Timothy，T.(1992)J.Chromatogr.，579，93-98)。
亞硝胺副產(chǎn)物主要是胺和亞硝化劑反應的結果。首先從亞硝酸鹽如亞硝酸鈉(NaNO2)或亞硝酸鉀(KNO2)在酸中形成亞硝化劑，形成的產(chǎn)物是亞硝酸(HNO2)。
(化學反應式1)
胺或含氮化合物亞硝化劑亞硝胺EGCG、槲皮素、兒茶素、維生素C和粉狀綠茶用作對照組。每個試樣以2.5，5，10，15，20mg/ml的濃度使用。不包含嗎啉的200mM硝酸鈉用作陰性對照物。每個反應中，不含有亞硝化劑NaNO2的試樣作為空白。
將每個試樣按照濃度加入到15ml的corning試管中，并標明空白、測試樣和陰性對照。將1ml冰乙酸加入到每個試管中，將100μl的2M NaNO2加入到除空白的每個試管中，加入蒸餾水使總體積為2ml。在37℃下反應10分鐘之后，加入176μl嗎啉使其濃度為2M，在37℃下進一步反應30分鐘。加入3.8ml的5N NaOH以設定pH10-12而停止反應。根據(jù)DBA方法，對試樣進行測量，與空白組(未加入NaNO2)和陰性對照組(未加入嗎啉和加入200mM NaNO2)比較。結果見圖13。
如以下計算公式1測量亞硝基嗎啉的產(chǎn)生速率(NMOR％)。
(計算公式1)NMOR％＝[(t0-空白)-(t30-空白)]/(t0-空白)空白；不包含亞硝化劑NaNO2的試樣t0；包含200mM的NaNO2而沒有嗎啉的試樣t30；在亞硝基嗎啉產(chǎn)生中正常反應的試樣。
如圖13所示，本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑在20mg/ml濃度下，顯示出和純化的槲皮素或兒茶素一樣的對從嗎啉產(chǎn)生亞硝基嗎啉有75％的抑制。即，本發(fā)明的功能藥劑抑制致癌物亞硝基化合物的產(chǎn)生。
實施例8用于分解煙堿的功能藥劑對細胞色素P450活性抑制效果的試驗細胞色素P450(以下稱為“CYP”)是在肺或肝中用來解毒的主要酶。各種CYP在肝中各有不同的功能，其中CYP2A6、2B6、2C8、2C9、2D6、2E1、2F1涉及從煙堿到可替寧代謝(Yamazaki，H.，Inui，Y.，Yun，C.H.，Guengerich，F(xiàn).P.，和Shimada，T.(1992)Carcinogenesis，13，1789-1794；Code，E.，Crespi，C.，Penman，B.，Gonzalez，F(xiàn).，Chang，T.，和Waxman，D.(1997)DurgMetab.Dispos.，25，985-993)。NNK是對實驗室動物的前致癌物，它由CYP1A2、2A6和3A4代謝成致癌物。圖14顯示煙堿的代謝。
本試驗在由Aroclor 1254(Sigma，USA)誘導大鼠(Sprague-Dawley鼠)肝的CYP，并取出肝之后，測量各種試驗材料對與NNK活化相關的CYP的抑制效果。詳細的試驗方法如下。
以500mg/kg的劑量，將Aroclor 1254注入7周齡雄性大鼠(Sprague-Dawley鼠)的腹部。在5天之后，將肝在無菌狀態(tài)下取出，用0.15M的KCl溶液在4℃下勻漿。勻漿后在9000g離心分離10分鐘，分離得到上清液并用于試驗。通過使用如下物質測量CYP的活性戊氧基試鹵靈(pentoxyresorufin)(Sigma，美國)，它是CYP 2B/1/2/4的底物；乙氧基試鹵靈(ethoxyresorufin)(Sigma，美國)，它是CYP 1A1的底物和甲氧基試鹵靈(methoxyresorufin)(Sigma，美國)，它是CYP 1A2的底物。同樣，將EGCG，槲皮素，兒茶素和粉狀綠茶用作對照組和實施例1的功能藥劑比較。從肝取出的上清液和每種CYP的具體底物，使用以上的反應試樣(抑制材料)對CYP活性的抑制效果進行比較。如果底物被酶分解并顯示熒光，則用熒光分光光度計(在522nm下激發(fā)和在586nm下發(fā)射)測量酶活性。每個試樣的濃度為0.1、0.5、1.0和2.0mg/ml，從肝取出的蛋白質數(shù)量固定為500μg/ml。每種底物含有2.5μM原液，在加入10μl之后最終變成25nM。20μl的5mM β-NADPH(Sigma，美國)用作輔酶。然后，加入50mM Tris-HCl(pH7.4)緩沖溶液將最終體積變成1ml。反應在37℃下進行20分鐘，加入2ml甲醇之后停止，在2000rpm下離心分離2分鐘。用RF-5301 PC熒光分光光度計(SHIMADZU，日本)從上清液測量酶活性(在522nm下激發(fā)和在586nm下發(fā)射)。結果顯示于圖15。
圖15是顯示本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑是否影響CYP酶活性的圖。(A)顯示槲皮素的CYP抑制效果，(B)顯示兒茶素的情況，(C)顯示功能藥劑的情況，(D)顯示粉狀綠茶的情況。PROD表示戊氧基試鹵靈脫烷基酶(CYP 2B1/2/4)，EROD表示乙氧基試鹵靈脫烷基酶(CYP 1A1)，和MROD表示甲氧基試鹵靈脫烷基酶(CYP 1A2)。功能藥劑抑制所有的PROD、EROD和MROD。
圖16顯示由本發(fā)明功能藥劑對CYP 1A2酶活性的抑制效果。抑制CYP1A2的活性的順序為槲皮素＞＞功能藥劑＞＞兒茶素＝粉狀綠茶。確認1.0mg/ml的功能藥劑能完全抑制CYP 1A2的活性。
此外，用純化的RECOSystem CYP 1A2(PanVera Co，美國)，測量功能藥劑，EGCG，槲皮素，兒茶素和粉狀綠茶的酶活性抑制效果。
酶混合物的組合物包括0.5uM CYP1A2，0.2μM NADPH P450還原酶，0.5μg/uL CHAPS，0.1μg/uL脂質體(二月桂酰基磷脂酰膽堿、二油?；字Ｄ憠A、二月桂?；字Ｄ憠A(1∶1∶1))，3mM還原性谷胱甘肽和50mMHEPES/KOH(pH7.4)。緩沖溶液是1M磷酸鉀/磷酸鈉。將768μl三級蒸餾水，126.7μl的CYP 1A2緩沖溶液，和5.3μl的1mM甲氧基試鹵靈順序加入以制備950μl溶液，在37℃下加熱。將5μl酶活化抑制材料加入到85μl緩沖溶液和底物混合物中，以分別制備0.1、0.5、1.0和2.0mg/ml的最終濃度。反應在37℃下開始，同時加入5μl的CYP 1A2酶混合物和5μl的50mMNADPH。將反應保持20分鐘，加入1ml甲醇停止。通過使用RF-5301 PC熒光分光光度計(SHIMADZU，日本)測量酶活性。
圖17是顯示本發(fā)明的功能藥劑對純化的CYP 1A2酶活性抑制效果的圖。抑制CYP 1A2的活性的順序是EGCG＞＞功能藥劑＞＞槲皮素＞＞粉狀綠茶＞＞兒茶素。確認0.1mg/ml的功能藥劑( )完全抑制純CYP 1A2的活性。
實施例9用于分解煙堿的功能藥劑的抗突變效果NNK(4-甲基亞硝氨基-1-3-吡啶基-1-丁酮)以確定的濃度(約0.1-0.5ng)包含在煙草中，并且當煙堿在體內(nèi)代謝時也可形成。這是體內(nèi)毒性非常大的物質。NNK在身體內(nèi)由酶如P450代謝后誘導肺癌。同樣，苯并芘以少量包含在煙草中并且是誘變劑。
為確認本發(fā)明的功能藥劑是否具有抗突變的效果，能抑制由NNK(Chemsyn.Lab.美國)和苯并芘(Sigma，美國)誘導的突變，用要求組氨酸的細菌株鼠傷寒沙門氏菌TA100和TA1535，進行艾姆斯試驗(Maron，D.，Ames，B.N.(1983)沙門菌誘變性試驗的改進方法，突變研究(Revised methodsfor the Salmonella mutagenicity test.Mutation Research)113，173-215)。
以500mg/kg的劑量，將Aroclor 1254(Sigma，美國)注入7周齡雄性大鼠(Sprague-Dawley鼠)的腹部。在5天之后，將肝臟在無菌狀態(tài)下取出，用0.15M的KCl溶液在4℃下勻漿。勻漿后在9000g下離心分離10分鐘，分離上清液以制備S-9混合溶液，用于試驗。S-9混合物溶液的組成是5ml的0.2M磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)，0.4ml的0.1M NADP，0.05ml的1M葡萄糖-6-磷酸，0.2ml的0.4M MgCl2，1.65M KCl，3.35ml三級蒸餾水和1ml肝，得到10ml的S-9混合物溶液。試驗材料是EGCG，槲皮素，兒茶素，粉狀綠茶和功能藥劑，它們在由0.2μm過濾器過濾之后使用。
將鼠傷寒沙門氏菌TA100和TA1535在營養(yǎng)的培養(yǎng)基(Difo.Lab.美國)中培養(yǎng)12小時。將0.1ml的12小時培養(yǎng)溶液，0.1ml試驗材料，0.5ml的S-9混合溶液，0.1ml的NNK(10mg/ml)或0.1ml苯并芘(20μg/ml)混合。將最終試驗材料處理為具有2，1，0.5，0.25，0.125μg/板的濃度。在37℃下靜置混合物20分鐘之后，將2ml上清液瓊脂(包含0.05mM組氨酸，0.05mM生物素)加入，將它們鋪展到His-板培養(yǎng)基上。每容量的板培養(yǎng)基具有3個片。在37℃下培養(yǎng)48小時之后，記錄菌落的數(shù)目，這些菌落是回收的突變體。抗突變活性指示為His+回收突變體的抑制速率。根據(jù)以下計算公式2得出突變的抑制效果。
(計算公式2)突變的抑制效果(％)＝100×[(a-b)/(a-c)]a由變異原誘導的His+回收突變體的菌落數(shù)目b由變異原和試驗材料誘導的His+回收突變體的菌落數(shù)目c自然His+回收突變體的菌落數(shù)目圖18顯示由本發(fā)明用于分解煙堿的功能藥劑對NNK誘變性抑制效果的結果。(A)和(B)顯示由功能藥劑(■)、粉狀綠茶(●)、槲皮素(◆)和兒茶素(▲)對鼠傷寒沙門氏菌TA100突變的抑制效果。(C)和(D)顯示由功能藥劑(■)、粉狀綠茶(●)、槲皮素(◆)和兒茶素(▲)對鼠傷寒沙門氏菌TA1535突變的抑制效果。包含在培養(yǎng)基中的NNK濃度是1mg/板。
僅采用NNK處理的鼠傷寒沙門氏菌TA100自然回收突變體的數(shù)目是173±13，鼠傷寒沙門氏菌TA1535自然回收突變體的數(shù)目是39±12。相反，當處理NNK和0.5mg/板的功能藥劑時，很難形成鼠傷寒沙門氏的菌落。因此，可以確認存在對于突變的抑制效果。
圖19是顯示使用本發(fā)明功能藥劑和試驗材料，由苯并芘引起的突變的抑制效果。它顯示由功能藥劑(■)、粉狀綠茶(●)、槲皮素(◆)和兒茶素(▲)對鼠傷寒沙門氏菌TA100突變的抑制效果。包含在培養(yǎng)基中的苯并芘濃度是2μg/板。用苯并芘處理的鼠傷寒沙門氏菌TA100自然回收突變體的數(shù)目是128±9。相反，本發(fā)明的功能藥劑有效抑制由苯并芘的突變產(chǎn)生。
實施例10用于分解煙堿的功能藥劑的抗氧化效果盡管許多疾病的原因仍然不清楚，但是已知毒性自由基是引起許多種疾病的媒介，如動脈硬化(Palinski，W.，Rosenfeld，M.E.，Yla，H.S.，Gurtner，G.C.，Socher，S.S.，Butler，S.W.，Carew，T.E.，Steinberg，D.，和Witztum，J.L.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.，86，1372-1376)、由于血管收縮的局部貧血(Hammond，B.，Kontos，H.A.，和Hess，M.L.(1985)Can.J.Physiol.Pharmacol.，63，173-187)、炎癥(Cheeseman，K.H.，和Forni，L.G.(1988)Biochem.Pharmacol.，37，4225-4233)、癌癥(Weitzman，S.A.，Weitberg，A.B.，Clark，E.P.，和Stossel，T.P.(1985)Science，227，1231-1233)和關節(jié)風濕病(Fantone，J.C.，和Ward，P.A.(1985)Human Pathol.，16，973-978)。因此，自由基清除劑可期望成為通過降低自由基水平的有效的治療法。因而，已經(jīng)研究了安全、有效抗氧劑的開發(fā)。
在本試驗中，通過使用DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)和SOD(超氧化物歧化酶)試劑盒(Wako，日本)測試功能藥劑，粉狀綠茶，槲皮素和兒茶素的O2-清除效果。
將DPPH溶于以2∶1比例混合的乙醇和水的溶劑中，設定濃度為2×10-4M。使功能藥劑，粉狀綠茶，槲皮素和兒茶素的濃度為DPPH的1/10或更小。將1.5ml的DPPH放入比色杯中，將1.5ml抗氧劑溶液加入并均勻混合。混合后馬上測量吸光度隨時間的變化(523nm)并計算分解速率。
(計算公式3)分解速率＝(DPPH的初始吸光度-在加入每個試樣之后不同時間的吸光度)/DPPH的初始吸光度×100SOD試劑盒的原理是當黃嘌呤氧化酶對黃嘌呤起作用時，產(chǎn)生O2-。產(chǎn)生的O2-降低共存的NO2-TB(四唑氮藍)而顯示成色反應。然而，超氧化物歧化酶(SOD)或除去產(chǎn)生O2-的材料能抑制成色反應。通過使用此原理，可以測量對產(chǎn)生的O2-的抑制效果。涉及O2-清除效果的試驗方法如下。將0.4mM黃嘌呤，0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)和0.1ml各試樣加入到1ml的0.048單位/ml黃嘌呤氧化酶中。將它們均勻混合，在37℃下加熱20分鐘。通過加入2ml的69mM SDS(十二烷基硫酸鈉)停止酶反應，在560nm下測量吸光度。水用作對照物。用相同的方法進行酶和試劑的空白試驗。表2顯示詳細情況。

表2抗氧化效率的計算方法如下。
(計算公式4)SOD活化值(抑制速率％)＝(EB1-EB1-B1)-(ES-ES-B1)/(EB1-EB1-B1)×100圖20是顯示使用DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)測定功能藥劑、粉狀綠茶、槲皮素和兒茶素，自由基清除效果的圖。EGCG的DPPH自由基清除效果比功能藥劑和兒茶素高兩倍。然而，功能藥劑的DPPH自由基清除效果比粉狀綠茶高四倍。
圖21是顯示通過使用SOD試劑盒測定功能藥劑、粉狀綠茶、槲皮素和兒茶素的O2-清除效果的圖。槲皮素顯示最高的抗氧化效果，功能藥劑顯示與純化的兒茶素有相同效果。
實施例11槲皮素的定量化槲皮素是獨特地從光合作用的植物發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物。當進行正常的飲食時，大約每天消耗約25mg槲皮素。
此外，近來槲皮素主要在臨床中用作抗癌藥物(Ferry，D.R.，Smith，A.，Malkhandi，J.，F(xiàn)yfe，D.W.，deTakats，P.G.，Anderson，D.，Baker，J.，Kerr，D.J.(1996)Cancer Res.2(4)659-68)。已報導了許多證據(jù)表明槲皮素優(yōu)異地用作抗癌藥物。報導槲皮素在10μM濃度下，抑制細胞株的繁殖如乳癌(Scambia，G.，Ranelletti，F(xiàn).O.，Benedetti，Panici，P.，Piantelli，M.，Bonanno，G.，De Vincenzo，R.，F(xiàn)errandina，G.，Pierelli，L.，Capelli，A.，Mancuso，S.(1991)Cancer Chemother Pharmacol.28(4)255-8)，白血病(Larocca，L.M.，Piantelli，M.，Leone，G.，Sica，S.，Teofili，L.，Panici，P.B.，Scambia，G.，Mancuso，S.，Capelli，A.，Ranelletti，F(xiàn).O.(1990)急性淋巴樣和髓樣白血病中的II型雌激素結合位置雌激素和黃酮類化合物的生長抑制效果(Type IIoestrogen binding sites in lymphoid and myeloid leukaemiasgrowth inhibitoryeffect of oestrogen and flavonoids)Br J Haematol.75(4)489-96)，子宮癌(Scambia，G.，Ranelletti，F(xiàn).O.，Benedetti，Panici，P.，Bonanno，G.，DeVincenzo，R.，Piantelli，M.，Mancuso，S.(1990)槲皮素和順氯氨鉑對卵巢癌細胞生長的協(xié)同抗增生活性(Synergistic antiproliferative activity of quercetinand cisplatin on ovarian cancer cell growth)Anticancer Drug.1(1)45-8)，胃癌(Yoshida，M.，Sakai，T.，Hosokawa，N.，Marui，N.，Matsumoto，K.，F(xiàn)ujioka，A.，Nishino，H.，Aoike，A.(1990)FEBS Lett.15；260(1)10-3)，和結腸癌(Agullo，G.，Gamet，L，Besson，C.，Demigne，C.，Remesy，C.(1994)Cancer Lett.25；87(1)55-63)。
在本試驗中，將用于分解煙堿的功能藥劑中含有的槲皮素定量化。為提取包含在功能藥劑或粉狀綠茶中的槲皮素，將它們?nèi)苡诩状己虳MSO(4∶1)混合提取溶液中，劇烈攪拌30秒。在9000rpm下對混合的溶液進行離心分離10分鐘，取出上清液。將上清液和等量的蒸餾水混合，注入反相柱(Delta-pak C18，300，Waters510)。流動相是56％的0.1M乙酸銨(pH5.15)和44％甲醇，流量是0.3mL/min。在375nm下由M720吸光度檢測器(Yongin，Co.韓國)測量吸光度。
圖22是顯示由HPLC(高效液相色譜)定量化的，在用于分解煙堿的功能藥劑中的槲皮素含量的圖。圖22中A的(a)顯示槲皮素濃度60，120，160ng的標準峰和B的(b)顯示功能藥劑溶液的槲皮素峰(數(shù)目8)，因而功能藥劑包含56ng/mg的槲皮素。然而，如圖22的C所示，甚至在5mg的粉狀綠茶中也沒有檢測出槲皮素峰。
實施例12功能藥劑的抗癌活性在煙草煙霧中發(fā)現(xiàn)的致癌物中，NNK對誘導各種實驗動物的肺癌顯示出高特異性(Hoffmann，D.，Rivenson，A.，Chung，F(xiàn)-L.，和Hecht，S.S.(1991)Crit.Rev.Toxicol.，21，305-311；國際癌癥研究機構(International Agency forResearch on cancer)(1986)Tobacco Smoking，38卷，Lyon，法國IARC)。同樣，NNK是一種亞硝胺，是在煙草中發(fā)現(xiàn)的強致癌物。已經(jīng)有許多涉及綠茶，特別是EGCG抑制肺癌產(chǎn)生的效果的文章(Wang，Z.Y.，Hong，J.Y.，Huang，M.T.，Reuhl，K.R.，Conney，A.H.和Yang，C.S.(1992)Cancer Res.52，1943-1947；Xu，Y.，Ho，C.T.，Amin，S.G.，Han，C.，和Chung，F(xiàn).L.(1992)Cancer Res.52，3875-3879；Chung，F(xiàn).L.，Wang，M.，Rivenson，A.，latropoulos，M.J.，Reinhardt，J.C.，Pittman，B.，Ho，C.T.和Amin，S.G.(1998)Cancer Res.58，4096-4101)。
A/J小鼠，3周齡，購自SLC Inc.(日本)。將動物保持在特定的無病原體條件和標準條件 (五個小鼠/籠；20±5℃，50±15％，12h亮-暗循環(huán))的環(huán)境中。在PBS中制備NNK的原液(5mg/ml)。使用由Xu等人(1992)建立的模型研究功能藥劑對NNK誘導的腫瘤發(fā)生的效果。
當A/J小鼠為6周齡時，將24只雄性小鼠分成以下三組N-組(5只動物，僅有水)，C-組(10只動物，飼以NNK和水)和T-組(9只動物，飼以NNK和功能藥劑)。在動物試驗中，在給予NNK之前三周，每個組是以水和0.6％功能藥劑作為飲用源。在三周之后，除N-組以外，向其它組(C-組和T-組)給藥每周三次，共10周。向A/J小鼠給予NNK的單一i.p.劑量(34.95mg/kg體重)。
在六周之后，將動物稱重，吸入二氧化碳處死。在生物測定期間，小鼠可隨意得到食物和水(或功能藥劑)，將粉末進料器清潔并用新鮮飲食補充三次。對于給藥期間每周記錄體重一次，對于生物測定的剩余時間，每個月記錄體重一次。
對所有的動物進行完全尸體解剖，完全解剖由韓國化學技術研究院(Korea Research Institute of Chemical Technology，KRICT)進行。將肺、肝和胃取出，稱重，在10％中性緩沖福爾馬林中固定。在固定之后，將組織修整，嵌入石蠟中，切片成5μm厚，用蘇木精和曙紅著色。為擴展評價，將肺在大約3mm間距下連續(xù)切片。用顯微鏡檢查所有的截面。通過將有腫瘤的動物數(shù)目除以每組中動物數(shù)目確定腫瘤發(fā)生率。
測量每組的平均重量并示于圖中。
圖23是顯示各組中A/J小鼠重量的圖，它指示用于分解煙堿的功能藥劑對NNK誘導的肺癌產(chǎn)生的抑制效果。
鼠菌落的篩選指示在肺腫瘤生物測定結束時，沒有病毒或細菌感染。在處死時，在喂給NNK+功能藥劑的小鼠肝、肺和胃上，沒觀察到涉及毒性的顯著病理學變化。本試驗中的表3顯示功能藥劑作為化學預防劑對肺腫瘤發(fā)生的效果。
表3顯示功能藥劑對肺癌產(chǎn)生的抑制效果。
如希望的那樣，N-組小鼠沒有自然腫瘤的發(fā)生。C-組的結果是在10周之后，55.6％(80/144)的小鼠帶有支氣管-肺泡腺瘤。當在飲水中給予0.6％功能藥劑時(T-組)，顯著降低肺腺瘤(43.6％，55/126)。此外，在支氣管-肺泡增生的病灶中，T-組的腫瘤發(fā)生率顯著地從69.4％降低到46.8％。此外，也在C-組(3個小鼠)和T-組(2個小鼠)的一些小鼠中觀察到肝微肉芽瘤的發(fā)生。在兩個組沒有觀察到胃腫瘤的發(fā)生。此結果顯示在NNK處理的小鼠中，功能藥劑對肺腫瘤形成的抑制效果。與C-組相比，T-組的腫瘤發(fā)生率相應于這些組中肺腫瘤形成降低了17％。

(N正常，+最小，++適度，+++中等)表3如上所述，本發(fā)明的功能藥劑或飲料促進煙堿的分解和抑制致癌物一亞硝基化合物的產(chǎn)生。此外，功能藥劑抑制細胞色素P4501A2的活性而抑制由NNK產(chǎn)生致癌物，并顯示抗氧劑效果以及抑制由NNK和苯并芘引起的突變和肺癌的產(chǎn)生。
實施例13毒性試驗1.動物物種和品系特定的無病原體Sprague-Dawley鼠(BioGenomics Inc.)sprague-Dawley鼠是毒性試驗中使用最廣泛的試驗動物的一種。由于容易獲得該鼠的基本信息，這在用該鼠來評定試驗結果中是非常有益的資料。此外，大鼠已經(jīng)由保證人選擇以滿足嚙齒類物種中毒性測試的規(guī)范性要求。
使24只4周齡、重72.2-81.3g的雄鼠進行7天的檢疫和在SPF條件下馴化之后，用于實驗。在處理的當天，體重為105.7-118.7g的20只雄鼠用于此研究。使24只4周齡、重69.1-80.3g的雌鼠進行7天的檢疫和在SPF條件下馴化之后，用于實驗。在處理當天體重為97.7-112.4g的20只健康雌鼠用于此研究。
2.飼養(yǎng)條件環(huán)境條件動物室(動物護理區(qū)III中的No.2室)保持在23±3℃的溫度，55±15％的相對濕度，10-20次/hr的空氣通風，以及150-300勒克斯的光強度。使用12hr亮/暗循環(huán)。在動物設施中的所有人員穿著的消毒服裝、軟帽、口罩和手套均在121℃下高壓滅菌20min。在由美國實驗動物護理委任協(xié)會(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)批準的設施中進行此試驗。所有的程序由我們的實驗動物護理和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批準。
在整個檢疫和觀察期間，5只動物飼養(yǎng)在不銹鋼網(wǎng)籠(22OW×41OL×200Hmm)中。
3.飲食用于實驗動物的粒料購自PMJ國際營養(yǎng)股份有限公司(PMJ NutritionalInternational Inc)。γ-射線輻照(10.8kGy)，并隨意給予。
由UV照射自控出水裝置隨意給水。
在韓國Daejeon區(qū)域衛(wèi)生與環(huán)境研究院對水進行分析。
4.給藥方法劑量選擇由于試驗項目是開發(fā)為食品添加劑，所以希望此項目的毒性非常低。因此，選擇5000mg/kg用于作為極限試驗劑量的最高劑量，然后以2.5的通常比例，分別選擇2000和800mg/kg作為中等和低劑量。也加入對照組。

表4試驗項目在處理之前，功能藥劑立即溶于消毒蒸餾水后使用，并通過由高劑量組逐步稀釋來制備低劑量組的藥液。載體對照鼠(the vehicle controlrats)僅供給消毒蒸餾水。
途徑和處理將鼠在給藥之前禁食過夜，試驗項目通過管飼法口服給藥。在給藥之后，將鼠繼續(xù)禁食3-4小時。
給藥用管飼法以單一劑量對鼠給藥，采用10ml/kg體重的劑量體積。根據(jù)處理當日的體重計算施加的體積。
5.觀察、測量和檢查死亡率和臨床觀察每小時檢查臨床體征和死亡率直到給藥之后6小時，然后一天一次到第14天。
體重在本實驗項目進行之前，和在處理之后的第1，3，7，和14天測量動物的單個體重。
6.結果死亡率和致死劑量在試驗期間，兩種性別中均沒有發(fā)現(xiàn)由于本試驗項目的處理而致動物死亡。因此，預測試驗項目的致死劑量在兩種性別中認為是大于5000mg/kg。
臨床病征在任何劑量組中，沒有觀察到由于試驗項目處理導致的臨床病征。
總體發(fā)現(xiàn)在處理之后第14天尸體解剖時，在任何劑量組中沒發(fā)現(xiàn)處理相關的效果。
為評價由單一口服劑量的功能藥劑的急性毒性，分別在0，800，2000，和5000mg/kg體重的劑量水平下，分別向5只雄性和雌性Sprague-Dawley鼠由管飼法給予功能藥劑。在14天觀察期間測量的參數(shù)是死亡率、臨床病征、體重變化和總體發(fā)現(xiàn)。
在Sprague-Dawley鼠的死亡率、臨床體征，、體重變化和尸體解剖發(fā)現(xiàn)中，沒有與處理相關的效果。在最高劑量組中，在平均極限試驗劑量的5000mg/kg劑量水平下進行試驗項目，研究結果顯示高致5000mg/kg體重的功能藥劑單一口服劑量對大鼠并不引起急性毒性效果。
根據(jù)結果，得出的結論是在5000mg/kg或以下功能藥劑的單一口服劑量，對Sprague-Dawley鼠并不引起任何毒性效果，而且對于兩種性別，最小致死劑量認為是大于5000mg/kg體重。
權利要求
1.一種用于分解煙堿的功能藥劑，通過干燥包括如下物質的組合物來制備(a)50-500重量份從綠茶葉提取的綠茶有效成分的粉末；(b)7.5-75重量份桑樹葉沸水浸漬的提取物；(c)3-30重量份蘋果汁；(d)3-30重量份甘草根沸水浸漬的提取物；和(e)1.5-15重量份干桔皮沸水浸漬的提取物。
2.如權利要求1所述的用于分解煙堿的功能藥劑，其中該藥劑進一步含有包括如下物質的組合物(a)7.5-75重量份銀杏果提取物；(b)3-30重量份芹菜提取物；和(c)3-30重量份檸檬提取物。
3.如權利要求1所述的用于分解煙堿的功能藥劑，其中該藥劑用作食品、食品添加劑、藥物、飲料或飲料添加劑。
4.如權利要求1所述的用于分解煙堿的功能藥劑，其中該藥劑是包裝為膠囊形式。
5.一種用于分解煙堿的功能飲料，是通過將0.1-5wt％權利要求1所述的功能藥劑與水混合而制備的。
6.一種制備用于分解煙堿的功能藥劑的方法，包括(a)通過提取和過濾銀杏果、芹菜、蘋果和檸檬制備果實和植物的濾液；(b)在100℃下提取甘草根和干桔皮，混合桑樹葉，并對其進行提取和過濾以制備葉子和草藥的濃縮物；和(c) 混合步驟(a)中果實和蔬菜的濾液、步驟(b)中葉子和草藥的濃縮物以及綠茶有效成分的粉末，并對其進行過濾和噴霧干燥以制備粉末。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分解煙堿的功能藥劑及其制備方法。藥劑包括天然植物提取物，如綠茶葉、桑樹葉、銀杏果、芹菜、檸檬、蘋果、干桔皮和甘草根。本發(fā)明的功能藥劑促進煙堿的分解和抑制致癌物的產(chǎn)生。此外，功能藥劑顯示出抗氧劑效果，抑制突變和顯著降低肺癌的發(fā)病率。
文檔編號A61P39/02GK1492737SQ02805327
公開日2004年4月28日 申請日期2002年2月21日 優(yōu)先權日2001年2月21日
發(fā)明者鄭鐘文, 金志勛, 金恩珠, 樸明奎 申請人:鄭鐘文, 再生生物技術有限公司