專利名稱：：tau蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease)和其它tauo病(tauopathies)。阿爾茨海默病(AD)是最常見的慢性神經(jīng)變性疾病，其在臨床上的特征在于進(jìn)行性和不可逆的認(rèn)知和行為功能喪失。這種疾病可能持續(xù)10年以上，從輕度癥狀開始到極其嚴(yán)重的表現(xiàn)。AD危害了約10％的65歲以上人群和20％的80歲以上人群。隨著西方社會(huì)的不斷增長(zhǎng)，患病人數(shù)正在上升僅在美國(guó)就已經(jīng)有500萬(wàn)患者，且截至到2000年年底，世界上大約有1800萬(wàn)人患癡呆。在他們中，認(rèn)為有大約三分之二的病例、即1200萬(wàn)人將成為阿爾茨海默病。它是心臟病、癌癥和中風(fēng)之后的西方世界中的第四大殺手?；及V呆的人的數(shù)量正在快速增加。到2025年，在發(fā)達(dá)國(guó)家患癡呆的人的數(shù)量將會(huì)為1980年的2倍。護(hù)理這些患者的社會(huì)成本是巨大的。例如，據(jù)估計(jì)美國(guó)社會(huì)用于診斷和控制AD、主要是用于監(jiān)護(hù)的成本目前每年在800億美元。目前，既沒(méi)有AD癥狀發(fā)生前的診斷試驗(yàn)、也不能治愈AD。因此，在臨床上是在癥狀發(fā)生而基本上排除其它形式的癡呆后才能診斷該病。巴伐利亞精神病學(xué)家AloisAlzheimer在93年前的1907年觀察到的AD大腦中的傳統(tǒng)指征老年(神經(jīng)炎)斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)的累積仍然保留為AD的神經(jīng)病理學(xué)特征。胞內(nèi)神經(jīng)原纖維結(jié)構(gòu)(神經(jīng)原纖維纏結(jié)、營(yíng)養(yǎng)不良性軸突和神經(jīng)纖維網(wǎng)絲)的常見共同特征在于成對(duì)螺旋纖絲(PHFs)。PHFs的主要蛋白亞單位是異常高磷酸化形式的微管結(jié)合蛋白tau(Grundke-Iqbal等，1986；Wischik等，1988a，b)。帶有神經(jīng)原纖維改變的神經(jīng)元變性，且這種變性的程度直接與受侵害個(gè)體的癡呆程度有關(guān)(Blessed等，1968)。正常tau是主要分布至軸突的微管結(jié)合蛋白。tau蛋白參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元且可能是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體中的微管(MT)裝配、空間結(jié)構(gòu)和特性(Drewes等，1998；Drubin和Kirschner，1986；LoPresti等，1995)。tau蛋白由位于第17染色體上的單一基因編碼，且在來(lái)自成人大腦的組織提取物中以多同種型(isoform)被檢測(cè)到(Goedert等，1989；HimmlerA.，1989；Kosik等，1989)。tau蛋白的異質(zhì)性部分是由于可選剪接所導(dǎo)致的，從而在成人大腦中產(chǎn)生6個(gè)同種型。這些不同的同種型的區(qū)別在于在氨基末端區(qū)上存在或不存在29-或58-氨基酸插入片段，以及在稱作微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域的tau羧基末端區(qū)上添加或缺失了銜接重復(fù)(可以重復(fù)3或4次)。該區(qū)由不完全重復(fù)的31或32個(gè)氨基酸殘基組成。在人體中，最小的tau同種型在MT結(jié)合結(jié)構(gòu)域上含有帶有三個(gè)銜接重復(fù)的352個(gè)氨基酸殘基且不含氨基末端插入片段，而最長(zhǎng)同種型含有441個(gè)殘基，帶4個(gè)重復(fù)片段和兩氨基末端插入片段。為簡(jiǎn)便起見，在本專利申請(qǐng)中所有的編號(hào)均指的是含有Goedert等(1989)的全部插入片段(441個(gè)氨基酸長(zhǎng))的最長(zhǎng)人tau蛋白同種型htau40。已知許多神經(jīng)疾病帶有含微管結(jié)合蛋白tau的絲狀細(xì)胞包涵體，這些神經(jīng)疾病例如有阿爾茨海默病(AD)、進(jìn)行性核上麻痹(PSP)、皮質(zhì)基底(corticobasal)的變性(CBD)、皮克病(Pick’sdisease)(PiD)和共同稱作帶有與第17染色體相關(guān)的帕金森綜合征的額顳癡呆的一組相關(guān)疾病(FTDP-17)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakobdisease)(CJD)、拳擊性癡呆(dementiapugilistica)(DP)、格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinkerdisease)(GSSD)、雷維小體病和亨廷頓舞蹈病(Huntingtondisease)(Dickinson等，1998；DiFiglia等，1997；Forno，1986；Hirano和Zimmerman，1962；Nishimura等，1995；Prusiner1996；Reed等，1998；Roberts，1998；Schmidt等，1996；Shankar等，1989；Spillantini等，1998)。盡管這些疾病中包含的病因?qū)W、臨床癥狀、病理學(xué)發(fā)現(xiàn)和生化組成不同，但是出現(xiàn)的證據(jù)提示涉及正常細(xì)胞蛋白聚集成各種絲狀包涵體的機(jī)制相差無(wú)幾。認(rèn)為啟動(dòng)生成用于纖絲裝配的核心或種子的微管結(jié)合蛋白tau的最初構(gòu)象改變是關(guān)鍵特征。該過(guò)程可以受到正常蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、某些基因的突變或缺失和結(jié)合正常蛋白質(zhì)且由此改變其構(gòu)象的因素的影響。tau蛋白是極為親水性的?？梢砸子趶拇竽X組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取它。比較而言，提取自阿爾茨海默病態(tài)大腦組織的絲狀tau是相對(duì)不溶性的。不溶性和正?？扇苄缘膖au在翻譯后修飾的程度不同，除磷酸化外，還包括糖基化、糖化、遍在蛋白化和外消旋化(Kenessey等，1995；Ko等，1999；Mori等，1987；Wang等，1996；Yan等，1994)。尚不了解修飾tau蛋白以參與AD中纖絲形成的機(jī)制。tau是已知的最可溶性蛋白之一(Cleveland1977a，b；Lee等1988)，且由此AD中它的聚集特別令人費(fèi)解。tau的磷酸化影響了tau形成聚集物的可能性，從而產(chǎn)生了刺激或抑制作用，推斷這取決于磷酸化位點(diǎn)(Crowther等，1994；Schneider等，1999)。許多體外研究證明在有還原劑二硫蘇糖醇(DTT)、不飽和游離脂肪酸類、RNA或糖胺聚糖類存在的情況下，正常tau可以被轉(zhuǎn)化成纖絲(Goedert等，1996；Kampers等，1996；Perez等，1996；Wilson和Binder，1997)。此外，通過(guò)Cys322上氧化生成的交聯(lián)tau的存在也可以加速纖絲形成過(guò)程(Schweers等，1995)。不同纖絲裝配研究中不同的參數(shù)已經(jīng)包括了tau蛋白濃度、pH，而溫育的離子強(qiáng)度高于生理?xiàng)l件下存在于胞質(zhì)中的離子強(qiáng)度許多倍。掃描透射電鏡(STEM)對(duì)體外形成的tau纖絲進(jìn)行的檢驗(yàn)顯示這些纖絲不同于天然成對(duì)螺旋纖絲(Ksiezak-Reding，1998)。在沒(méi)有聚糖或RNA存在的情況下，在含有未磷酸化或磷酸化野生型tau、正常tau的樣品中沒(méi)有可檢測(cè)到的PHF-樣纖絲。對(duì)化學(xué)交聯(lián)的肝素處理的tau的研究表明肝素處理誘導(dǎo)tau蛋白中的構(gòu)象改變(Paudel和Li，1999)。與體外數(shù)據(jù)共同提示(a)微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)au纖絲裝配而言是重要的；和(b)tau纖絲的形成要求tau的構(gòu)象改變。這些研究同時(shí)表明所述的tau修飾中沒(méi)有一種能夠單獨(dú)誘導(dǎo)與阿爾茨海默病的臨床表現(xiàn)相關(guān)的絲狀tau形成。對(duì)引起導(dǎo)致疾病情況中纖絲形成的tau改變而言重要的因素的確定和描述對(duì)開發(fā)癥狀發(fā)生前的診斷標(biāo)記和干預(yù)tauo病進(jìn)展的治療劑而言是重要的。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于阿爾茨海默病或其它tauo病中的早期治療干預(yù)的可靠藥物靶物。此外，希望提供能夠特異性檢測(cè)該藥物靶物并與之發(fā)生相互作用的特異性單克隆抗體。這種抗體不僅應(yīng)適合于在癥狀發(fā)生前檢測(cè)所述分子、而且也應(yīng)適合于抑制和消除該分子，由此適合于阿爾茨海默病或其它tauo病的癥狀發(fā)生前的診斷、治療和預(yù)防。使用本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這些目的，而本發(fā)明在一個(gè)方面中涉及對(duì)構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常形式具有特異性的抗體，所述的抗體對(duì)正常tau蛋白而言是非特異性的。這類tau蛋白的異常形式代表一族新的分子，它們是在構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的位于神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外的可溶和不溶性的、優(yōu)選異常截短的形式(Novak等，1991，1993)。使用本發(fā)明可以證實(shí)這些構(gòu)象不同形式的在本說(shuō)明書中稱作″tauons″的tau蛋白是種子、即與阿爾茨海默病臨床表現(xiàn)相關(guān)的絲狀tau形成的自我繁殖過(guò)程中的成核中心，由此tauons是阿爾茨海默病的重要治療靶物。本發(fā)明的tauons可以是異常截短的tau蛋白。使用本發(fā)明的抗體可以在體外和神經(jīng)元內(nèi)抑制tauons的生物活性。這些抗體具有在AD癥狀發(fā)生前的I、II和III期中對(duì)存在的tauons進(jìn)行染色的能力，從而使它們適合于該病的癥狀發(fā)生前的診斷。對(duì)本發(fā)明的抗體而言，關(guān)鍵是僅不同構(gòu)象形式的tau蛋白(即″tauon″)由這種抗體識(shí)別，而正常的tau蛋白不與本發(fā)明的抗體結(jié)合。在本發(fā)明的過(guò)程中，將微管結(jié)合蛋白tau的AD截短形式純化至同質(zhì)且證實(shí)是來(lái)自阿爾茨海默病態(tài)神經(jīng)元的絲狀tau分離物的主要部分。氨基酸序列數(shù)據(jù)顯示tauons的主鏈與蛋白質(zhì)tau的主鏈沒(méi)有區(qū)別，而tauons在免疫學(xué)上區(qū)別于正常人tau的方面可能在于本發(fā)明構(gòu)象特異性單克隆抗體所揭示的不同構(gòu)象。這類抗體的具體實(shí)例是由保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)、保藏號(hào)為00082216的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體DC-11和保藏在ECACC、保藏號(hào)為00082215的雜交瘤細(xì)胞系DC-11/I產(chǎn)生的單克隆抗體DC-11/I。由本發(fā)明提供的該族單克隆抗體通過(guò)識(shí)別tauon-特定構(gòu)象而不識(shí)別正常人可溶性tau來(lái)確定。與正常人tau相比不同的構(gòu)象在病理學(xué)上是由迄今為止來(lái)自阿爾茨海默病患者測(cè)試樣品中tau分子N-末端或C-末端或兩末端上的異常截短所導(dǎo)致的。令人關(guān)注的是不同構(gòu)象與tau同種型和磷酸化水平無(wú)關(guān)。這種使tauons獲得典型構(gòu)象的不可缺少的病理學(xué)要求是存在大量脯氨酸和微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域和截短側(cè)翼區(qū)。此外，tauons區(qū)別于正常tau的方面可能在于其病理活性，即tauons代表啟動(dòng)tau聚集和由正常tau和微管蛋白裝配的tauons解裝配微管的種子、即成核中心。與本發(fā)明抗體、尤其是DC-11族單克隆抗體一起預(yù)保溫的tauons沒(méi)有表現(xiàn)出解裝配的能力或由正常tau和微管蛋白裝配微管。此外，tauons在對(duì)分化的人神經(jīng)元微注射時(shí)明顯導(dǎo)致由微管結(jié)合的tau部分取代內(nèi)源性tau、神經(jīng)元收縮并使細(xì)胞變性。如果將tauons與本發(fā)明的單克隆抗體一起微注射，那么在分化的神經(jīng)元中沒(méi)有觀察到神經(jīng)變性改變。這一結(jié)果表明本發(fā)明的抗體、尤其是DC-11單克隆抗體抑制神經(jīng)元內(nèi)tauons活性，且由此可以用作胞內(nèi)藥物(例如用作胞內(nèi)治療抗體、即內(nèi)體(intrabodies))。在免疫組織學(xué)方面，正如使用本發(fā)明抗體所觀察到的，tauons已經(jīng)在AD的transenthorinal和enthorinal區(qū)中的前-α-神經(jīng)元內(nèi)的癥狀發(fā)生前I、II和III期出現(xiàn)，因此，在適當(dāng)偶聯(lián)示蹤物后，可以將本發(fā)明的抗體用于活體的AD癥狀發(fā)生前的診斷。優(yōu)選本發(fā)明的抗體與抗體DC-11相比表現(xiàn)出對(duì)tau的構(gòu)象不同形式(″tauon″)至少50％、優(yōu)選至少90％的特異性。可以通過(guò)任意用于檢測(cè)抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)檢測(cè)特異性，例如ELISA試驗(yàn)、放射性免疫測(cè)定、使用懸臂連接的結(jié)合配偶體的原子力顯微術(shù)等。一般來(lái)說(shuō)，與構(gòu)象不同的tau蛋白、尤其是其異常截短形式發(fā)生特異性反應(yīng)而不與正?？扇苄詔au反應(yīng)的所有抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，認(rèn)為本發(fā)明的抗體與分子發(fā)生″特異性反應(yīng)″，條件是它能夠與分子結(jié)合而由此使該分子與所述抗體偶聯(lián)。術(shù)語(yǔ)″表位″指的是可以由抗體識(shí)別和結(jié)合的抗原部分。抗原可以帶有一個(gè)或一個(gè)以上的表位?！蹇乖迥軌蛘T導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生能夠結(jié)合該抗原表位的抗體。上述所指的特異性反應(yīng)指的是該抗原可以以高度選擇性方式與其相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，而不與由其它抗原產(chǎn)生的眾多其它抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明特別優(yōu)選的抗體來(lái)源于保藏的雜交瘤細(xì)胞系DC-11(ECACC保藏號(hào)00082216)和DC-11/I(ECACC保藏號(hào)00082215)，它們表現(xiàn)出高度特異性和選擇性，且與tau的構(gòu)象不同形式(″tauon″)反應(yīng)而不與正常的可溶性tau反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)任意用于檢測(cè)抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)檢測(cè)特異性，例如ELISA試驗(yàn)、放射性免疫測(cè)定等。本文所用的″抗體″用以指包括完整分子及其片段及其合成和生物衍生物，諸如例如不含F(xiàn)ab、F(ab’)2和Fv片段，游離或例如在pIII或pVIII或其它表面蛋白上的絲狀噬菌體表面或細(xì)菌表面上表達(dá)，其能夠結(jié)合抗原。Fab、F(ab’)2和Fv片段缺乏完整抗體的Fc片段、從循環(huán)中更為快速地清除，且可以具有較低的非特異性抗體組織結(jié)合能力。此外，易于改造Fv抗體(通常稱作小抗體(minibody))以在其C-末端上攜帶特異性示蹤物，并用于AD的活體早期癥狀發(fā)生前診斷，這是因?yàn)橛杀景l(fā)明抗體識(shí)別的AD的I、II和III期與智力下降無(wú)關(guān)。在本發(fā)明中，優(yōu)選單克隆抗體或單克隆抗體片段。因此，本發(fā)明在另一個(gè)方面中還涉及產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)″tau″指的是如M.Goedert等1989所述的含有全部可選的剪接插入片段的人微管結(jié)合蛋白tau的最長(zhǎng)同種型。按照本申請(qǐng)的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及屬于tau蛋白的構(gòu)象不同形式的tau蛋白的異常截短形式，所述的tau蛋白的構(gòu)象不同形式可由本發(fā)明的抗體特異性識(shí)別。因此，本發(fā)明涉及一族新的位于神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外的可溶和不溶性異常截短形式的tau蛋白，它們?cè)跇?gòu)象上不同于正常的tau且稱作″tauons″?！錿auons″由此是可以由本發(fā)明所述抗體特異性識(shí)別的tau蛋白的構(gòu)象不同形式。用于本發(fā)明的tauons包括SEQIDNo.1的序列，且可以進(jìn)一步側(cè)翼接有其它氨基酸(參見SEQIDNo.2、3)。tauons適宜在約100-400個(gè)氨基酸范圍內(nèi)，且在該范圍內(nèi)代表tau蛋白的截短形式。本發(fā)明的tauons可以在N-或C-末端或兩末端被異常截短(參見附圖2-13)。本文所用的術(shù)語(yǔ)″異常截短的″指的是用本發(fā)明提供的tauon特異性單克隆抗體在患病的AD神經(jīng)元中鑒定的tau肽(″tauons″)?？梢酝ㄟ^(guò)使用許多任意眾所周知的合成重組技術(shù)來(lái)制備人tau蛋白的異常截短形式tauons。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在本領(lǐng)域中廣泛實(shí)施了用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞、構(gòu)建載體、提取信使RNA、制備cDNA文庫(kù)的大部分技術(shù)，且大部分本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知描述具體條件和步驟的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)源資料。然而，為方便起見，將下面的段落用作指導(dǎo)原則。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的最常用原核生物系統(tǒng)為大腸桿菌(E.coli)，然而，也可以使用其它微生物菌株，諸如芽孢桿菌屬(Bacilli)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；假單胞菌屬(Pseudomonas)的不同種類；或其它細(xì)菌菌株。在這類原核系統(tǒng)中，使用了含有來(lái)源于與宿主相容的種類的復(fù)制位點(diǎn)和控制序列的質(zhì)粒載體。常用的原核控制序列包括用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子，可選的操縱子以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。目前各種真核宿主也用于產(chǎn)生重組外源蛋白質(zhì)。當(dāng)在細(xì)菌中時(shí)，可以用直接產(chǎn)生所需蛋白的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化真核宿主，但更常見的情況是提供信號(hào)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分泌。真核系統(tǒng)具有另外的優(yōu)點(diǎn)，即它們能夠加工可以在編碼高級(jí)生物體蛋白質(zhì)的基因組序列中出現(xiàn)的內(nèi)含子。真核系統(tǒng)還提供了各種加工機(jī)制，這些機(jī)制例如使某些氨基酸殘基糖基化、氧化或發(fā)生衍生作用、構(gòu)象控制等。常用的真核系統(tǒng)包括酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞和高級(jí)植物細(xì)胞。所列實(shí)例并未窮盡。合適的啟動(dòng)子是可得到的，它們對(duì)用于這些宿主類型中的每一種而言是相容性和可操作的，且是終止序列和增強(qiáng)子，諸如例如桿狀病毒多角體啟動(dòng)子。如上所述，啟動(dòng)子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。例如，在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，可以通過(guò)添加重金屬離子來(lái)誘導(dǎo)MTII啟動(dòng)子。用于構(gòu)建適合于所需宿主的表達(dá)系統(tǒng)的具體實(shí)例對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。為了所述蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)，將編碼它的DNA適當(dāng)連入所選擇的表達(dá)系統(tǒng)，然后將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)入相容的宿主細(xì)胞，隨后在發(fā)生外源基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)和維持該細(xì)胞。通過(guò)裂解該細(xì)胞或從培養(yǎng)基中回收這種方式產(chǎn)生的本發(fā)明tauons，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的?？梢酝ㄟ^(guò)首先用連接混合物轉(zhuǎn)化適宜的宿主來(lái)證實(shí)用于質(zhì)粒構(gòu)建的正確連接。正如本領(lǐng)域中可理解的，用氨芐青霉素、四環(huán)素或其它抗生素抗性或使用其它標(biāo)記來(lái)篩選成功的轉(zhuǎn)化體，這取決于質(zhì)粒的構(gòu)建方式。本發(fā)明由此涉及tauons制品、尤其是基本上不含其它蛋白的來(lái)自人或重組來(lái)源的tauons制品、尤其是來(lái)自正常tau蛋白的tauons制品。可以通過(guò)一定方法來(lái)提供這類制品，所述的方法包括使用本發(fā)明抗體進(jìn)行免疫親和的步驟。優(yōu)選本發(fā)明的制品在總蛋白中含有80％以上的tauons、尤其是95％以上的tauons。此外，本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)阿爾茨海默病腦組織樣品或體液樣品中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式tauons的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的抗體和用于裝載所述探針的適宜容器。能夠在試劑盒中提供所述抗體以用于檢測(cè)或分離tauons。借助于本發(fā)明抗體可以檢測(cè)tauon蛋白，并從包括transenthorinal、enthorinal區(qū)和海馬的阿爾茨海默病態(tài)神經(jīng)元在內(nèi)的各種來(lái)源中分離它?？梢詫凑者@種方式分離的tauons進(jìn)一步用作例如對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種的免疫原，以便構(gòu)建產(chǎn)生針對(duì)tauons而不識(shí)別正常全長(zhǎng)tau的特異性單克隆抗體的雜交瘤。該方法包括下列步驟鑒定來(lái)自阿爾茨海默病態(tài)腦組織transenthorinal、enthorinal和海馬區(qū)的神經(jīng)元并使其釋放入防止tauons異常構(gòu)象的溶液中。在制備和純化后，將tauons用作免疫原，每隔一個(gè)月經(jīng)皮下注入小鼠。將來(lái)自這些動(dòng)物的脾臟用于構(gòu)建產(chǎn)生針對(duì)tauons的單克隆抗體的雜交瘤。使用首先由Khler和Milstein介紹的充分建立的雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)這些雜交瘤(參見M.Khler和C.Milstein，“分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)”(″ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPre-DefinedSpecificity″)，《自然》(Nature)，256，pp.495-497，1975)。在足夠長(zhǎng)時(shí)間的免疫接種后，從動(dòng)物的脾臟、淋巴結(jié)或外周血液中得到產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞。優(yōu)選這些淋巴細(xì)胞獲自脾臟。然后通常在有諸如聚乙二醇(PEG)這樣的融合劑存在的情況下使脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以將任意數(shù)量的骨髓瘤細(xì)胞系用作融合配偶體；例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653骨髓瘤細(xì)胞系。隨后使包含所需雜交瘤的所得細(xì)胞生長(zhǎng)在諸如HAT培養(yǎng)基這樣的選擇培養(yǎng)基中，其中未融合的親本骨髓瘤或淋巴細(xì)胞最終死亡。僅雜交瘤細(xì)胞存活，且可以在限制條件下生長(zhǎng)至得到分離的克隆。例如，通過(guò)使用已經(jīng)用于免疫接種的抗原的免疫測(cè)定技術(shù)篩選雜交瘤上清液中存在的具有所需特異性的抗體。然后在有限稀釋條件下或在軟瓊脂上亞克隆陽(yáng)性克隆，且可以分離產(chǎn)生的單克隆抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中所公知的技術(shù)使按照這些方法生產(chǎn)的雜交瘤在體外或體內(nèi)增殖(腹水中)。用于純化(purfying)單克隆抗體的常用方法包括硫酸銨沉淀、離子交換、層析法和親和層析法(例如，參見H.Zola等，“用于單克隆抗體產(chǎn)生和性質(zhì)鑒定的技術(shù)”(″TechniquesfortheProductionandCharacterizationofMonoclonalAntibodies″)-《單克隆雜交瘤抗體技術(shù)與應(yīng)用》(MonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications)，J.G.R.Hurell(編輯)，pp.51-52(CRCPress1982))。優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步含有用于檢測(cè)所述抗體與所述構(gòu)象不同的tau蛋白之間結(jié)合情況的工具。優(yōu)選次級(jí)抗體、尤其是特異性標(biāo)記的次級(jí)抗體。此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以使用磁珠技術(shù)以及應(yīng)用抗體的其它蛋白質(zhì)鑒定方法。該方法包括在來(lái)自人的測(cè)試樣品中鑒定異常截短的tau蛋白tauon的步驟。本文所用的″測(cè)試樣品″指的是來(lái)自懷疑含有tauons的人的生物樣品。測(cè)試樣品可以包括含異常截短的tau蛋白的腦組織，諸如海馬組織或額皮質(zhì)組織；或所述的測(cè)試樣品可以包括腦脊液(CSF)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的測(cè)試樣品包括CSF，且所鑒定的蛋白是CSF-tauon。異常截短的tau蛋白tauons的鑒定適宜包括鑒定測(cè)試樣品中的抗原的步驟，該抗原能夠結(jié)合與異常截短的tau蛋白tauons發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，其中所述的tauons包含序列(SEQIDNo.1)，且側(cè)翼接有氨基酸以使得所述的tauons的長(zhǎng)度在約100-400個(gè)氨基酸的范圍，且特征在于不同于正?？扇苄缘鞍譼au的tauon的特異構(gòu)象；或該抗原能夠結(jié)合與異常截短的tau蛋白tauons發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，其中所述的tauons包含序列(SEQIDNo.1)，且側(cè)翼接有氨基酸以使得所述的tauons的長(zhǎng)度在約100-400個(gè)氨基酸的范圍，且特征在于不同于正?？扇苄缘鞍譼au的tauon特異構(gòu)象。tauon的存在表明與AD患者和其它患tauo病(tauopathies)的患者體內(nèi)tauons的累積有關(guān)的疾病。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及患者體液中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟將所述體液與本發(fā)明的抗體混合、檢測(cè)所述抗體與構(gòu)象不同的tau蛋白(tauon)之間存在的結(jié)合情況，且可選地測(cè)定與所述抗體結(jié)合的構(gòu)象不同的tau蛋白的量。tauon的存在表明包括AD和其它tauo病(tauopathies)在內(nèi)的疾病的人體內(nèi)tauons的累積有關(guān)的疾病?；颊叩捏w液可以是來(lái)自懷疑含有tauons的人的任意生物測(cè)試樣品。這種體液可以包括腦組織，諸如海馬組織或額組織或皮質(zhì)組織或腦脊液(CSF)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的體液包括CSF且所鑒定的蛋白質(zhì)是CSF-tauons。正如本領(lǐng)域中可以理解的，可以通過(guò)生化或細(xì)胞化學(xué)方法或通過(guò)諸如許多免疫測(cè)定生產(chǎn)商的手冊(cè)中所述的酶免疫測(cè)定法便利地完成這種對(duì)tauons的鑒定。當(dāng)使用生化方法時(shí)，優(yōu)選使用0.01-10g、尤其是0.5-1g的含有患病tau蛋白的組織；使其在凝膠上遷移并通過(guò)Western印記來(lái)鑒定。認(rèn)為這類技術(shù)確實(shí)適于在沒(méi)有已經(jīng)證實(shí)不與本發(fā)明抗體反應(yīng)的年齡匹配的對(duì)照組的情況下進(jìn)行。細(xì)胞化學(xué)方法染色已經(jīng)證實(shí)與正常組織無(wú)反應(yīng)性。通過(guò)ELISA檢測(cè)來(lái)自患AD的患者和患非-AD神經(jīng)性疾病以及正常受試者的CSF以便對(duì)tauons的水平進(jìn)行定量。與患非AD神經(jīng)性疾病的患者和對(duì)照組相比，AD患者體內(nèi)的CSFtauon水平顯著增加。在AD中，發(fā)現(xiàn)這種顯著增加與發(fā)作的年齡、載脂蛋白E基因型和臨床階段無(wú)關(guān)。對(duì)ADCSF蛋白的Western印記顯示了幾種具有與異常截短的tau蛋白一致的50-15kD的表觀分子量免疫反應(yīng)帶。這些結(jié)果表明CSF-tauons反映出由AD進(jìn)展導(dǎo)致的患病tau漸進(jìn)累積。本發(fā)明的抗體在另一個(gè)方面中可以用于制備治療阿爾茨海默病患者的藥物?？梢詫⒃摽贵w以生物技術(shù)方式修飾成裝配有靶向序列的單鏈分子，其能夠?qū)⑺龅姆肿愚D(zhuǎn)運(yùn)入表達(dá)tauons的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。在本AD細(xì)胞模型內(nèi)，抗體結(jié)合tauons并干擾其病理作用(正常tau的結(jié)合)，且增加tau蛋白的異常截短形式的降解。使用異常截短的tau蛋白及其與阿爾茨海默病嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行的體外試驗(yàn)(tau蛋白結(jié)合、纖絲裝配、微管解裝配)證實(shí)它們是重要的藥物靶物。通過(guò)下列實(shí)施例和附圖來(lái)更具體地描述本發(fā)明，但它們不應(yīng)用來(lái)限制本發(fā)明。附圖1表示tauon制備的概述；附圖2表示tauon氨基酸序列的總示意圖；附圖3表示最小tauon；附圖4表示C-末端截短的tauon；附圖5表示N-末端截短的tauon；附圖6表示tau的示意圖；附圖7表示人tau37；附圖8表示人tau39；附圖9表示人tau40；附圖10表示人tau43；附圖11表示人tau44；附圖12表示人tau46；且附圖13表示大鼠的大tau。實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)tauons具有特異性的DC11族單克隆抗體的制備作為免疫接種用抗原的可溶性和不溶性tauons的制備(附圖1)為了從人AD大腦中分離tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法開發(fā)了一種新方法。選擇表現(xiàn)出具有短期死后延緩(postmortemdelay)(PMD)的ADI.-III.Braak’s階段改變特征的人大腦。選擇包括enthorinal和transenthorinal區(qū)、扁桃體和海馬區(qū)的顳葉塊。解剖該組織并立即浸入最低必需培養(yǎng)基(Gibco)中。將組織精細(xì)切碎并壓過(guò)150μm目網(wǎng)篩。在該階段將大腦樣品分成兩個(gè)等分部分樣品A和樣品B。將樣品A進(jìn)一步在20mMpH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMβ-巰基乙醇、5mMEGTA、1mMEDTA、5mMMgSO4、5mM芐脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化鈉、5μg/ml亮抑酶肽、1.5μg/ml胃酶抑制劑和2μg/ml抑酶肽中處理并在4℃下以25000xg離35分鐘以除去細(xì)胞碎片。然后以200000xg40分鐘使上清液沉淀。在室溫下將所得沉淀用8M脲萃取70分鐘并在室溫下以300000xg旋轉(zhuǎn)45分鐘。將上清液對(duì)頻繁更換的pH7.6的10mMTRIS透析24小時(shí)且然后對(duì)100mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEDTA、2mMEGTA、1mM二硫蘇糖醇、0.75mMNaCl、0.1mM苯甲基磺酰氟和50mMNaF、pH2.7透析24小時(shí)。通過(guò)以200000xg離心40分鐘而除去沉淀的蛋白質(zhì)。將200000xg上清液對(duì)pH6.4的25mMMES、0.5mMMgCl2、0.1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇透析、且隨后在用相同緩沖液平衡的磷酸纖維素柱上進(jìn)行分級(jí)分離。使2mg/ml的蛋白質(zhì)上柱并用20ml線性梯度的NaCl(0-1M)的平衡緩沖液溶液洗脫。通過(guò)Western印跡評(píng)價(jià)用0.1-0.8MNaCl洗脫的蛋白質(zhì)，并通過(guò)真空離心蒸發(fā)濃縮(speedvacuum)設(shè)備濃縮。將樣品B放入玻璃勻化器內(nèi)10個(gè)體積的冷緩沖液(10mMTRIS，1mMEGTA，0.8MNaCl，10％蔗糖，pH7.4)中。在4℃下以27000xg離心30分鐘后，保留上清液并將沉淀與所述緩沖液一起勻化，且以27000xg離心30分鐘。合并來(lái)自兩次離心的27000xg上清液、調(diào)節(jié)至1％(wt/vol)N-月桂?；“彼岷?％(vol/vol)β-巰基乙醇，并在37℃下的搖動(dòng)器上保溫3小時(shí)。在以35000rpm離心30分鐘后，將沉淀在補(bǔ)充了1％巰基乙醇的5ml勻化緩沖液中勻化并通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾。將濾液以35000rpm離心1小時(shí)。將沉淀重新懸浮于pH6.8的50mMTris中，并用2.5％甲酸萃取2分鐘，且然后以10000xg離10分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。在4℃下將上清液對(duì)pH7.4的10mMTris透析過(guò)夜，并如上所述進(jìn)行離心。使用真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮所得上清液(級(jí)分II)，并通過(guò)SDS-PAGE、隨后通過(guò)Western印跡評(píng)價(jià)。保留來(lái)自用2.5％甲酸萃取后含有不溶性tauons(級(jí)分III)的樣品B的沉淀并用于免疫接種和斑點(diǎn)試驗(yàn)。合并級(jí)分(I、II和III)中的Tauons，并用作對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種的抗原(參見附圖1)。產(chǎn)生DC-11族單克隆抗體的雜交瘤的制備將6周齡Balb/c小鼠分成3組(A，B，C)。使前2組(A，B)接觸溶于弗氏完全佐劑(Sigma)的50μg抗原，且間隔3周加強(qiáng)接種5次溶于弗氏不完全佐劑的50μg相同抗原(Ag)。在A組中，將所有劑量注入足墊，在B組中經(jīng)皮下給予Ag的劑量。對(duì)第3組小鼠僅將溶于PBS中的一個(gè)劑量直接注入脾(脾內(nèi)免疫接種)，并在該接觸抗原后的1周將脾用于融合。融合前3天時(shí)經(jīng)靜脈內(nèi)對(duì)A組和B組中的小鼠注射50μg溶于PBS的免疫原。按照Kontsekova等1988的方法使來(lái)自免疫接種小鼠的脾細(xì)胞與NS/O骨髓瘤細(xì)胞融合。將108個(gè)脾細(xì)胞與2×107個(gè)NS/O骨髓瘤細(xì)胞混合(比例5∶1)，并在補(bǔ)充了10％二甲亞砜的不含血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)內(nèi)的1ml50％PEG1550(Serva)中融合1分鐘。將融合的細(xì)胞以2.5×105個(gè)脾細(xì)胞/孔的密度重新懸浮于96-孔平板上的DMEM中，該DMEM含有20％馬血清、L-谷氨酰胺(2mM)、次黃嘌呤(0.1mM)、氨基蝶呤(0.004mM)、胸苷(0.016mM)和艮他霉素(40U/ml)。將細(xì)胞在37℃下保溫10天，并通過(guò)ELISA和免疫組織化學(xué)篩選用于產(chǎn)生抗-tauon特異性單克隆抗體的生長(zhǎng)的雜交瘤。通過(guò)ELISA進(jìn)行抗tauons抗體篩選將ELISA用于檢測(cè)針對(duì)tauons的雜交瘤培養(yǎng)物上清液中的單克隆抗體。使用如上所述制備且具有下列改變的tauons作為固相。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳從級(jí)分中分離真空離心蒸發(fā)濃縮的合并物，并通過(guò)按照Donofrio等(1986)的方法經(jīng)電洗脫回收tau蛋白的截短形式，且通過(guò)SDS-PAGE評(píng)價(jià)。在4℃下用異常截短的tau蛋白PBS溶液將微量滴定板包被過(guò)夜(10μg/ml，50μl/孔)。在用1％脫脂奶粉封閉以減少非特異性結(jié)合后，將該平板用PBS-0.05％Tween20洗滌，并在37℃下與50μl/孔的培養(yǎng)物上清液一起保溫1小時(shí)。用與辣根過(guò)氧化物酶(DAKO)綴合的綿羊抗小鼠Ig檢測(cè)結(jié)合的單克隆抗體。用鄰苯二胺溶液作為過(guò)氧化物酶底物使反應(yīng)顯色，并用50μl2MH2SO4終止該反應(yīng)。使用MultiscanMCC/340ELISA讀出器(Labsystems)測(cè)定492nm處的吸收度。將至少兩倍于陰性對(duì)照值的讀取值看作是陽(yáng)性的。按照Kontsekova等1991的步驟在軟瓊脂上進(jìn)一步亞克隆陽(yáng)性培養(yǎng)物。重新篩選用于產(chǎn)生特異性抗-tauon單克隆抗體的分離的亞克隆?？箃auon抗體的免疫組織化學(xué)篩選如下在AD大腦組織上重新篩選在抗-tauonELISA中鑒定為陽(yáng)性而對(duì)正常tau鑒定為陰性的單克隆抗體的特異性在冠狀板上將尸解時(shí)取出的AD患者的大腦切成1cm間隔的切片并儲(chǔ)存在-20℃下。將海馬、enthorinal、顳、額、枕和頂葉皮層塊固定在4℃的4％緩沖低聚甲醛中4天以上。在振動(dòng)切片機(jī)上切一系列額切片(50μm)并儲(chǔ)存在4℃下的PBS(pH7.0)中。用98％冷甲酸將自由移動(dòng)的振動(dòng)切片機(jī)切片預(yù)處理2-3分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來(lái)自相同動(dòng)物種類。在37℃下將切片與ELISA(如上所述)中陽(yáng)性的單克隆抗體一起保溫60分鐘。在室溫下與第二生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時(shí)。使用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和6mg3-3-二氨基聯(lián)苯胺-4HCl(SIGMA)、250mgNiCl2(MERCK)的含100μlH2O2的10ml0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6)使免疫反應(yīng)顯色。通過(guò)在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988；Cuello等，1993，Thorpe和Kerr，1994)。實(shí)施例2使用DC-11族單克隆抗體對(duì)異常截短的tau蛋白(tauons)進(jìn)行的定量測(cè)定如上所述分離tauons。單克隆抗體DC30(識(shí)別正常和病理性tau)與DC-11族單克隆抗體(對(duì)異常截短的tau具有特異性)的組合對(duì)由AD-大腦制備的測(cè)試樣品中的tauons進(jìn)行量化。通過(guò)蛋白質(zhì)A柱層析法從不含血清的培養(yǎng)基中純化抗體。在4℃下用濃度為10μg/ml(50μl/孔)的DC-11單克隆抗體混合物的PBS溶液將高結(jié)合微量滴定板(Nunc)的孔包被過(guò)夜。通過(guò)加入200μl1％的脫脂奶粉的磷酸緩沖鹽水(PBS)在室溫下60分鐘而將孔中的非特異性結(jié)合飽和。將該平板用PBS-0.05％Tween20(v/v)洗3次。加入含濃度為100-1000pg/ml的重組tauons的PBS液的連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和含有50μl用量的AD-tauons測(cè)試樣品。在37℃下保溫60分鐘后，洗滌平板，并加入在PBS中1/5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗體DC30(50μl/孔)、在37℃下持續(xù)60分鐘。在最終的洗滌后，向各孔中加入50μl的鄰苯二胺溶液和0.003％H2O2，并將平板在黑暗中保溫20分鐘。用50μl的2MH2SO4使反應(yīng)終止。用ELISA讀出器MultiscanMC344(Labsystems，F(xiàn)inland)上讀取492nm處的吸收度。根據(jù)獲得的數(shù)值構(gòu)建重組tauons的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定測(cè)試樣品中tauons的相應(yīng)濃度。實(shí)施例3通過(guò)Western印跡、使用單克隆抗體DC-11檢測(cè)tauons。使純化的重組全長(zhǎng)tau和異常截短的tau蛋白tauons上樣5-20％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠，并使其在Laemmli(1970)的變性條件下遷移。SDS-PAGE后，在pH12的10mMCAPS緩沖液中，將轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜(Milipore)上的步驟在350mA、冷卻下進(jìn)行1小時(shí)。印記后在PBS中洗滌該膜，并在室溫下用1％脫脂奶粉PBS液封閉1小時(shí)。將轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)與單克隆抗體DC-11一起在4℃下保溫過(guò)夜。在用PBS-0.05％Tween20(v/v)洗滌后，使用按1/1000稀釋的用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的大鼠抗小鼠免疫球蛋白并在室溫下保溫1小時(shí)。然后將該膜在PBS-Tween20中洗滌4次、用底物溶液(12mg4-氯-1-萘酚(naphtol)、4ml甲醇、16mlPB、0.03％v/vH2O2)使反應(yīng)顯色，并在H2O中終止該反應(yīng)。結(jié)果表明抗體DC-11僅識(shí)別異常截短的tau即tauons，相反，單克隆抗體DC30是普遍識(shí)別所有已知來(lái)自許多種類(人、猴、牛、豬、大鼠、小鼠)的tau同種型的全tau抗體，而與其翻譯后修飾的狀態(tài)無(wú)關(guān)。實(shí)施例4tauons的免疫組織化學(xué)鑒定DC-11族單克隆抗體適合于在不同類型免疫組織化學(xué)方法中使AD-大腦中的tauons顯色。光學(xué)顯微鏡標(biāo)記在冠狀板上將尸解時(shí)取出的患AD患者的大腦切成1cm間隔的切片并儲(chǔ)存在-20℃下。將海馬、entorhinal、顳、額、枕和頂葉皮層塊固定在4℃的4％緩沖低聚甲醛中4天以上。在振動(dòng)切片機(jī)上切一系列額切片(50μm)并儲(chǔ)存在4℃下的PBS(pH7.0)中。用98％冷甲酸將自由移動(dòng)的振動(dòng)切片機(jī)切片預(yù)處理2分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來(lái)自相同動(dòng)物種類。在37℃下將切片與單克隆抗體DC-11一起保溫60分鐘。在室溫下與第二生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時(shí)。使用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和6mg3-3-二氨基聯(lián)苯胺-4HCl(SIGMA)、250mgNiCl2(MERCK)的含100μlH2O2的10ml0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6)使免疫反應(yīng)顯色。通過(guò)在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988；Cuello等，1993，Thorpe和Kerr，1994)。光學(xué)顯微鏡雙標(biāo)記用98％冷甲酸將自由移動(dòng)的振動(dòng)切片機(jī)切片預(yù)處理2-3分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來(lái)自相同動(dòng)物種類。在37℃下將切片與在封閉溶液(5％馬血清、PBS、0.1％Triton)中按1∶1000稀釋的第一種過(guò)氧化物酶綴合的單克隆抗體DC-11一起保溫60分鐘、在0.06％DAB、0.01％H2O2的PBS溶液(pH7.2)中展開。通過(guò)在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)。在37℃下將相同切片與第二單克隆抗體一起保溫60分鐘。在室溫下與生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時(shí)。使用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和0.06％3-3-二氨基聯(lián)苯胺-4HCl(SIGMA)、0.01％H2O2、2.5％NiCl2(MERCK)的0.1M乙酸鹽緩沖液使免疫反應(yīng)顯色，并通過(guò)在0.1M乙酸鹽緩沖液中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988；Cuello，1993)。使用快速甲酚紫(cresylviolet)進(jìn)行的復(fù)染在完成免疫組織化學(xué)染色后，將切片置于載玻片上并放入56℃下的恒溫器中60分鐘。在保溫后將載玻片浸入蒸餾(destilled)水中5分鐘、在4℃下用快速甲酚紫溶液染色5-10分鐘、用水沖洗并轉(zhuǎn)入96％乙醇，直到除去大部分甲酚紫染色、用二甲苯(xylen)凈化并用Entellan固定。免疫熒光染色用98％冷甲酸將自由移動(dòng)的振動(dòng)切片機(jī)切片(30μm)預(yù)處理2分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。在37℃下將切片與第一種初級(jí)單克隆抗體DC-11一起保溫60分鐘，然后在室溫下與按照本領(lǐng)域中所用的標(biāo)準(zhǔn)方法與在PBS/Triton中按1∶500稀釋的FITC-綴合的山羊抗體小鼠次級(jí)抗體(Immunotech)一起保溫30分鐘。在用PBS洗滌后，在37℃下將切片與TRITC-綴合的初級(jí)抗體一起保溫60分鐘，并固定在0.1％對(duì)苯二胺/甘油溶液中。實(shí)施例5使用tauons進(jìn)行的微管裝配和微管結(jié)合試驗(yàn)微管蛋白純化通過(guò)溫度依賴性微管聚合與解聚循環(huán)、隨后通過(guò)磷酸纖維素(WatmanP11磷酸纖維素)離子交換層析法(Valee，1986)從自當(dāng)?shù)赝涝讖S獲得的鮮豬腦中分離微管蛋白。微管裝配試驗(yàn)在+4℃下將純化的tauons(5mM)與預(yù)凈化的純化微管蛋白(10mM)和GTP(1mM)在裝配緩沖液(100mMPIPESpH6.9，2mMEGTA，1mMMgSO4)中混合。該微管蛋白的濃度低于自發(fā)裝配的臨界濃度(Black，1987)。將樣品用移液管吸入預(yù)熱至37℃的石英池中。在熱穩(wěn)定控制的分光光度計(jì)(LKB)中以分光光度方式測(cè)定濁度的改變，并記錄為10s間隔的OD350改變、持續(xù)30分鐘的期限。微管結(jié)合試驗(yàn)如上所述確定含微管的tauons的結(jié)合曲線(Gustke，1992)。在37℃下，在有GTP(1mM)和紫杉醇(20μM)存在的情況下，將純化的微管蛋白在結(jié)合緩沖液(100mMPIPESpH6.9、1mMEGTA、1mMMgSO4、1mMDTT)中保溫10分鐘。用分別不干擾tauons或正常tau蛋白及其它MAPs結(jié)合的紫杉醇穩(wěn)定微管(Valee，1986；Wallis，1993)，由此消除微管裝配的影響。加入濃度分別為2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM的Tauons。在37℃下以43000xg離心35分鐘后，將沉淀重新懸浮于P緩沖液(50mMPIPESpH6.9、1mMEGTA、0.2mMMgCl2、5mMDTT、500mMNaCl)中。在SDS-PAGE凝膠上分析上清液與沉淀(Laemmli，1970)、用銀染色(Bloom，1987)。在HPScanJet(Hewlett-Packard)掃描儀上掃描凝膠，并應(yīng)用公共域NIHImage程序(美國(guó)國(guó)家健康研究所(U.S.NationalInstitutesofHealth)研發(fā)并可在國(guó)際互連網(wǎng)上獲得，網(wǎng)址http//rsb.info.nih.gov/nih-image/)在Macintosh計(jì)算機(jī)上進(jìn)行分析。使用內(nèi)標(biāo)法和校正曲線將帶強(qiáng)度轉(zhuǎn)化成濃度。實(shí)施例6重組tauons的制備使用″EraseaBaseSystem″(Promega)、按照技術(shù)手冊(cè)制備tau蛋白的重組截短形式。該系統(tǒng)基于從5’突出端開始特異性消化插入DNA的外切核酸酶III。在恒溫下消化率是均勻的。通過(guò)NdeI-EcoRI限制位點(diǎn)將tau基因克隆入pET17b載體產(chǎn)生pET/T40。向該基因的C-末端添加KpnI限制位點(diǎn)和KpnI位點(diǎn)的全部三個(gè)讀框下游中的三個(gè)終止密碼子。EcoRI酶留下5’突出端作為exoIII的底物。KpnI留下耐exoIII消化的3’突出端。將用EcoRI、KpnI/NEB雙消化和乙醇沉淀的1μgpET/T40載體在20μllxExoIII緩沖液中稀釋，并在37℃/消化率450個(gè)堿基/分鐘條件下用80uexoIII消化。在添加ExoIII后，就1份樣品而言，間隔30s將2.5μl樣品轉(zhuǎn)入冰上的7.μlS1-核酸酶混合物/1.5uS1-核酸酶中。在室溫下將收集的樣品保溫30分鐘以除去剩余的單鏈尾。用KlenowDNA聚合酶形成鈍端。直接用樣品的連接混合物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)PstI-XhoI限制性酶切篩選亞克隆，并使用pET載體中T7-引物對(duì)合適的構(gòu)建體測(cè)序。重組tauons的表達(dá)、純化和定量在大腸桿菌BL21(DE3)(Studier，1986)中表達(dá)Tauons。將單細(xì)菌菌落接種入500ml的LBAMP(LB培養(yǎng)基，100μg/ml氨芐青霉素)。使細(xì)菌培養(yǎng)物在37℃下的旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上生長(zhǎng)，直到其OD600達(dá)到0.6-0.8，然后通過(guò)添加IPTG(0.4mM終濃度)誘導(dǎo)。3小時(shí)后，通過(guò)在4℃下以5000g離心15分鐘使細(xì)菌細(xì)胞沉淀(Sigma6K15，轉(zhuǎn)子12500)，將細(xì)胞沉淀迅速冷凍在液氮中，且儲(chǔ)存在-70℃下至進(jìn)一步應(yīng)用為止。為了制備細(xì)胞裂解物，將細(xì)菌沉淀重新懸浮于緩沖液A中(20mMPIPESpH6.9、50mMNaCl、1mMEGTA、1mMMgSO4、2mMDTT、0.1mMPMSF)，通過(guò)在冰上超聲處理6分鐘使細(xì)胞破碎，并通過(guò)在+2℃下以45000rpm離心15分鐘而除去細(xì)胞碎片(轉(zhuǎn)子TLA-120.2，BeckmannOptimaTLX)。通過(guò)0.22μm濾膜(Millipore)過(guò)濾上清液，并立即在磷酸纖維素柱(磷酸纖維素WhatmanP11)上通過(guò)離子交換層析純化tauons。在使樣品上柱后，用10個(gè)床體積的緩沖液A洗滌該柱。用20ml線性梯度的NaCl(50mM-0.5M)緩沖液A洗脫Tauons。收集1ml級(jí)分，并在SDS-PAGE上鑒定含有蛋白質(zhì)的那些級(jí)分。合并含有tauons的級(jí)分，并在4℃下對(duì)PBS透析3×60分鐘。將來(lái)自透析液的等分部分真空干燥(SpeedVac)并儲(chǔ)存在-20℃下。通過(guò)PAGE、使用連續(xù)稀釋的牛血清白蛋白(BSA)作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記對(duì)重組tauons進(jìn)行定量。用考馬斯藍(lán)染色凝膠、干燥并使用ScionImage(Beta3b，ScionCorp.)計(jì)算BSA和tau帶的強(qiáng)度。構(gòu)建BSA的校正曲線并用于對(duì)tauons定量。實(shí)施例7從人AD-大腦中分離tauons為了從人AD大腦中分離tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法開發(fā)了一種新的方法。選擇表現(xiàn)出具有短期死后延緩(PMD)的ADI.-III.Braak’s階段改變特征的人大腦。選擇包括enthorinal和transenthorinal區(qū)、扁桃體和海馬區(qū)的顳葉塊。解剖該組織并立即浸入最低必需培養(yǎng)基中(Gibco)。將組織精細(xì)切碎并壓過(guò)150μm目網(wǎng)篩。在該階段將大腦樣品分成兩個(gè)等分部分樣品A和樣品B。將樣品A進(jìn)一步在20mMpH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMβ-巰基乙醇、5mMEGTA、1mMEDTA、5mMMgSO4、5mM芐脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化鈉、5μg/ml亮抑酶肽、1.5μg/ml胃酶抑制劑和2μg/ml抑酶肽中處理并在4℃下以25000xg離心35分鐘以除去細(xì)胞碎片。然后以200000xg40分鐘使上清液沉淀。在室溫下將所得沉淀用8M脲萃取70分鐘并在室溫下以300000xg旋轉(zhuǎn)45分鐘。將上清液對(duì)頻繁更換的pH7.6的10mMTRIS透析24小時(shí)，且然后對(duì)100mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEDTA、2mMEGTA、1mM二硫蘇糖醇、0.75mMNaCl、0.1mM苯甲基磺酰氟和50mMNaF、pH2.7透析24小時(shí)。通過(guò)以200000xg離心40分鐘而除去沉淀的蛋白質(zhì)。將200000xg上清液對(duì)pH6.4的25mMMES、0.5mMMgCl2、0.1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇透析，且隨后在用相同緩沖液平衡的磷酸纖維素柱上進(jìn)行分級(jí)分離。使2mg/ml的蛋白質(zhì)上柱并用線性梯度的NaCl(0-1M)的平衡緩沖液溶液洗脫。通過(guò)Western印跡評(píng)價(jià)用0.1-0.8MNaCl洗脫的蛋白質(zhì)，并通過(guò)真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮。將樣品B放入玻璃勻化器內(nèi)10個(gè)體積的冷緩沖液(10mMTRIS，1mMEGTA，0.8MNaCl，10％蔗糖，pH7.4)中。在4℃下以27000xg離心30分鐘后，保留上清液，并將沉淀與所述緩沖液一起勻化，且以27000xg離心30分鐘。合并來(lái)自兩次27000xg離心的上清液、調(diào)節(jié)至1％(wt/vol)N-月桂?；“彼岷?％(vol/vol)β-巰基乙醇，并在37℃下的搖動(dòng)器上振動(dòng)保溫3小時(shí)。在以35000rpm離心30分鐘后，將沉淀在補(bǔ)充了1％巰基乙醇的5ml勻化緩沖液中勻化并通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾。將濾液以35000rpm離心1小時(shí)。將沉淀重新懸浮于pH6.8的50mMTris中，并用2.5％甲酸萃取2分鐘，然后以10000xg離心10分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。將上清液對(duì)pH7.4的10mMTris在4℃下透析過(guò)夜，并如上所述進(jìn)行離心。使用真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮所得上清液，并通過(guò)SDS-PAGE、隨后通過(guò)Western印跡評(píng)價(jià)。實(shí)施例8從人、豬和牛大腦組織中純化正常tau通過(guò)對(duì)Lindwall和Cole.，1984方法進(jìn)行修改的方法純化tau。將大腦組織(1mg/ml)在0.1mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEGTA、1MNaClpH6.5中勻化，并在4℃下以100000xg離心90分鐘。將上清液制成0.5％(v/v)2-巰基乙醇溶液、在100℃下加熱5分鐘并在4℃下以20000xg離心30分鐘。將該第二次的上清液制成45％的(NH4)2SO4飽和溶液，且如上所述以20000xg離心，并將所得沉淀重新懸浮于不含NaCl的MES緩沖液中。在用2.5％(v/v)高氯酸沉淀并進(jìn)一步以20000xg離心后，將最終的上清液對(duì)pH7.4的5mMTris4℃透析過(guò)夜。實(shí)施例9由tauons逐漸導(dǎo)致的正常tau結(jié)合和聚集成纖絲纏結(jié)將量逐漸增加的正常tau(5-100μg/100ul)與固定量的分離自級(jí)分I的(10μg/100ul)tauons混合。使該反應(yīng)在100ml終體積的結(jié)合緩沖液(含有2mMEGTA、2％牛血清白蛋白、0.5mMMgCl2、1μM抑酶肽和20μM亮抑酶肽的pH7.6的100mMMES)中進(jìn)行。在室溫下使該混合物發(fā)生相互作用45分鐘，然后置于150μl80％蔗糖結(jié)合緩沖液溶液，以100000xg離心1小時(shí)。除去上部的150μl，并對(duì)剩余部分超聲處理以便通過(guò)放射性免疫-斑點(diǎn)-印記測(cè)定法測(cè)定tauons與正常tau之間的相互作用。蔗糖層中存在tau表明tauon結(jié)合了健康的tau。實(shí)施例10DC-11族單克隆抗體抑制神經(jīng)元變性將神經(jīng)元母細(xì)胞瘤細(xì)胞和生長(zhǎng)因子一式三份置于培養(yǎng)皿上。第一組僅接受tauons，而第二組接受tauons和DC-11單克隆抗體的混合物。用免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染的tauons在室溫下將細(xì)胞在含有80mMPIPES、1mMMgCl2、1mMEGTA，pH6.6的0.2％TritonX100中透化5分鐘。在相同緩沖液中用2％低聚甲醛將細(xì)胞冰上固定15分鐘。通過(guò)間接免疫熒光抗生物素蛋白羅丹明檢測(cè)系統(tǒng)(Sigma)檢測(cè)Tauons。神經(jīng)元分化早期抑制的檢測(cè)使細(xì)胞與分化誘導(dǎo)因子一起生長(zhǎng)。評(píng)價(jià)分化水平。帶有tauons而不含抗體的該組細(xì)胞具有的分化能力顯著下降。然而，用tauons和抗體混合物處理的組分化至與來(lái)自用無(wú)關(guān)蛋白處理的對(duì)照組的細(xì)胞相差無(wú)幾的水平。參考文獻(xiàn)BlackMM(1987)Comparisonoftheeffectsofmicrotubule-associatedprotein2andtauonthepackingdensityofinvitroassembledmicrotubulesProcNatlAcadSciUSA847783-7787BlessedG，TomlisonBE，RothM(1968)Theassociationbetweenqualitativemeasauresofdementiaandsenilechangeincerebralgreymatterofelderlysubjects.BrJPsychiatry114797-811.BloomH，BeierH，GrossHS(1987)Improvedsilverstainingofplantproteins，RNAandDNAinpolyacrylamidegels.Electrophoresis893-99.ClevelandDW，HwoSY，KirschnerMW(1977a)Psysicalandchemicalpropertiesofpurifiedtaufactorandtheroleoftauinmicrotubuleassembly.JMolBiol116227-247ClevelandDW，HwoSYKirschnerMW(1977b)Purificationoftauamicrotubule-associatedproteinthatinducesassemblyofmicrotubulesfrompurifiedtubulin.JMolBiol116207-225CrowtherRA，OlesenOF，SmithMJ，JakesR，GoedertM(1994)AssemblyofAlzheimer-likefilamentsfromfull-lengthtauprotein.FEBSLetter337135-138CuelloAC，CotéSL，Ribeiro-Da-SilvaA(1993)Currentprotocolsforlightmicroseopyimmunohistochemistry.ImmunohistochemistryIIJohnWileyandsonsCichester，148-167.DicksonDW，F(xiàn)eanyMB，YenS-H，MattiaceLA；DaviesP(1998)Cytoskeletalpathologyinnon-Alzheimerdegener-ativedementianewlesionsindiffuseLewybodydisease，Pick′sdisease，andcorticobasaldegeneration.JNeuralTransm4731-46DiFigliaM，SappE，ChaseKO，DaviesSW，BatesGP，VonsattelJP，AroninN(1997)Aggregationofhuntingtininneuronalintra-nuclearinclusionsanddystrophicneuritesinbrain，Science2771990-1993DonofrioJC，CoorrodJD，KarathanasisV，CoelinghKV(1986)ElectroelutionforpurificationofinfluenzaAmatrixproteinforuseinimmunoassay.13107-120DrewesG，EbnethA，MandelkowEM(1998)MAPsMARKsandmicrotubuledynamics.TrendsBiochemSci23307-311DrubinDG，KirschnerMW(1986)Tauproteinfunctioninlivingcells.JCellBiol1032739-2746FornoLS(1986)TheLewybodyinParkinson′sdisease，InYahrMD，BergmannKJ(eds)Parkinson′sDisease，AdvancesinNeurology，Vol.45，RavenPressNewYorkpp.35-43GoedertM，SpillantiniMG，JakesR，RutherfordD，CrowtherRA(1989)Multipleisoformsofhumanmicrotubule-associatedproteintausequencesandlocalizationinNeurofibrillarytanglesofAlzheimer′sdisease.Neuron3519-526GoedertM，JakesR，SpillantiniM，HasegawaM，SmithMJ，CrowtherRA(1996)Assemblyofmicrotubule-assoeiatedproteintauintoAlzheimer～likefilamentsinducedbysulfatedglycosaminoglycans.Nature383550-553GreenbergSH，DaviesP(1990)ApreparationofAlzheimerpairedhelicalfilamentsthatdisplaysdistincttauproteinsbypolyacrylamidegelelectrophoresis.ProcNatlAeadSciUSA875827-5831Grundke-IqbalI，IqbalK，TungY-C，QuinlanM，WisniewskiHM，BinderLI.(1986)AbnormalphosphorylationofthemicrotubuleassociatedproteintauinAlzheimercytoskeletalpathology.ProcNatlAcadSciUSA834913-17.GustkeN，SteinerB，MandelkowEM，BiernatJ，MeyerHE，GoedertM，MandelkowE(1992)TheAlzheimer-likephosphorylationoftauproteinreducesmicrotubulebindingandinvolvesSer-ProandThr-Promotifs.FEBSLett307199-205.HimmerA(1989)Structureofthebovinetaugenealternativelysplicedtranscriptsgeneratesaproteinfamily.MolCellBiol91389-1396HiranoA，ZimmermanHM(1962)Alzheimer′sneurofibrillarychanges.ArchNeurol773-88KampersT，F(xiàn)riedhoffP，BiernatJ，MandelkowEM，MandelkowE(1996)RNAstimulatesaggregationofmicrotubule-associatedproteintauintoAlzheimer-likepairedhelicalfilaments.FEBSLett399344-349KenesseyA，YenS-H，LiuW-K，YangX-R，DunlopDS(1995)DetectionofD-aspartateintauproteinsassociatedwithAlzheimerpairedhelicalfilaments.BrainRes675183-189KissA，PalkovitsM，SkirbollLR(1988)Lightmicroscopictriple-coloredimmunohistochemicalstainingonthesamevibratomesectionusingtheavidin-biotin-peroxidasecomplextechnique.Histochem88353-356KopkeE，TungY-Ch，ShaikhS，AlonsoAC，IqbalK，Crundke-IqbalI(1993)Microtubule-associatedproteintauabnormalphosphorylationofanon-pairedhelicalfilamentpoolinAlzheimerdisease.JBiolChem26824374-24384KontsekováE，NovákM，KontsekP，BcreekL，LessoJ.(1988)Theeffectofpostfusioncelldensityonestablishmentofhybridomas.FoliaBiol(Praque)3418-22KontsekováE，NovákM，MácikováI，KontsekP.(1991)One-stepmethodforestablishlng8-azaguanille-resistanthybridomassuitableforthepreparationoftriomas.JImmunolMethodS145247-250KcsikKS，OrecchioLD，BakalisS，NeveRL(1989)Developm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leGlySerLeuAspAsnIleThrHisVal505560ProGlyGlyGlyAsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArg65707580GluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys859095SerProValValSer100<210>2<211>400<212>PRT<213>人類<400>2MetAlaGluProArgGlnGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGlnGlyGlyTyrThrMetHis202530GlnAspGlnGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GlnThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAspValThrAlaProLeuVal65707580AspGluGlyAlaProGlyLysGlnAlaAlaAlaGlnProHisThrGlu859095IleProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGlyIleGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGlnAlaArgMetVal115120125SerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly130135140AlaAspGlyLysThrLysIleAlaThrProArgGlyAlaAlaProPro145150155160GlyGlnLysGlyGlnAlaAsnAlaThrArgIleProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProProLysSerGly180185190AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThrProGlySer195200205ArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArgGluProLys210215220LysValAlaValValArgThrProProLysSerProSerSerAlaLys225230235240SerArgLeuGlnThrAlaProValProMetProAspLeuLysAsnVal245250255LysSerLysIleGlySerThrGluAsnLeuLysHisGlnProGlyGly260265270GlyLysValGlnIleIleAsnLysLysLeuAspLeuSerAsnValGln275280285SerLysCysGlySerLysAspAsnIleLysHisValProGlyGlyGly290295300SerValGlnIleValTyrLysProValAspLeuSerLysValThrSer305310315320LysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHisLysProGlyGlyGlyGln325330335ValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArgValGlnSer340345350LysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHisValProGlyGlyGlyAsn355360365LysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArgGluAsnAlaLysAla370375380LysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSerProValValSer385390395400<210>3<211>142<212>PRT<213>人類<400>3ValProGlyGlyGlySerValGlnIleValTyrLysProValAspLeu151015SerLysValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHisLys202530ProGlyGlyGlyGlnValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLys354045AspArgValGlnSerLysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHisVal505560ProGlyGlyGlyAsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArg65707580GluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys859095SerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnVal100105110SerSerThrGlySerIleAspMetValAspSerProGlnLeuAlaThr115120125LeuAlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu130135140<210>4<211>381<212>PRT<213>人類<400>4MetAlaGluProArgGlnGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGlnGlyGlyTyrThrMetHis202530GlnAspGlnGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GlnThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAlaGluGluAlaGlyIleGly65707580AspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGlnAla859095ArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLys100105110AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLysIleAlaThrProArgGlyAla115120125AlaProProGlyGlnLysGlyGlnAlaAsnAlaThrArgIleProAla130135140LysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProPro145150155160LysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThr165170175ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArg180185190GluProLysLysValAlaValValArgThrProProLysSerProSer195200205SerAlaLysSerArgLeuGlnThrAlaProValProMetProAspLeu210215220LysAsnValLysSerLysIleGlySerThrGluAsnLeuLysHisGln225230235240ProGlyGlyGlyLysValGlnIleValTyrLysProValAspLeuSer245250255LysValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHisLysPro260265270GlyGlyGlyGlnValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAsp275280285ArgValGlnSerLysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHisValPro290295300GlyGlyGlyAsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArgGlu305310315320AsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSer325330335ProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSer340345350SerThrGlySerIleAspMetValAspSerProGlnLeuAlaThrLeu355360365AlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu370375380<210>5<211>410<212>PRT<213>人類<400>5MetAlaGluProArgGlnGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGlnGlyGlyTyrThrMetHis202530GlnAspGlnGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GlnThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAspValThrAlaProLeuVal65707580AspGluGlyAlaProGlyLysGlnAlaAlaAlaGlnProHisThrGlu859095IleProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGlyIleGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGlnAlaArgMetVal115120125SerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly130135140AlaAspGlyLysThrLysIleAlaThrProArgGlyAlaAlaProPro145150155160GlyGlnLysGlyGlnAlaAsnAlaThrArgIleProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProProLysSerGly180185190AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThrProGlySer195200205ArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArgGluProLys210215220LysValAlaValValArgThrProProLysSerProSerSerAlaLys225230235240SerArgLeuGlnThrAlaProValProMetProAspLeuLysAsnVal245250255LysSerLysIleGlySerThrGluAsnLeuLysHisGlnProGlyGly260265270GlyLysValGlnIleValTyrLysProValAspLeuSerLysValThr275280285SerLysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHisLysProGlyGlyGly290295300GlnValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArgValGln305310315320SerLysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHisValProGlyGlyGly325330335AsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArgGluAsnAlaLys340345350AlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSerProValVal355360365SerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSerSerThrGly370375380SerIleAspMetValAspSerProGlnLeuAlaThrLeuAlaAspGlu385390395400ValSerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu405410<210>6<211>441<212>PRT<213>人類<400>6MetAlaGluProArgGlnGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGlnGlyGlyTyrThrMetHis202530GlnAspGlnGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GlnThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAspValThrAlaProLeuVal65707580AspGluGlyAlaProGlyLysGlnAlaAlaAlaGlnProHisThrGlu859095IleProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGlyIleGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGlnAlaArgMetVal115120125SerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly130135140AlaAspGlyLysThrLysIleAlaThrProArgGlyAlaAlaProPro145150155160GlyGlnLysGlyGlnAlaAsnAlaThrArgIleProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProProLysSerGly180185190AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThrProGlySer195200205ArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArgGluProLys210215220LysValAlaValValArgThrProProLysSerProSerSerAlaLys225230235240SerArgLeuGlnThrAlaProValProMetProAspLeuLysAsnVal245250255LysSerLysIleGlySerThrGluAsnLeuLysHisGlnProGlyGly260265270GlyLysValGlnIleIleAsnLysLysLeuAspLeuSerAsnValGln275280285SerLysCysGlySerLysAspAsnIleLysHisValProGlyGlyGly290295300SerValGlnIleValTyrLysProValAspLeuSerLysValThrSer305310315320LysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHisLysProGlyGlyGlyGln325330335ValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArgValGlnSer340345350LysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHisValProGlyGlyGlyAsn355360365LysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArgGluAsnAlaLysAla370375380LysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSerProValValSer385390395400GlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSerSerThrGlySer405410415IleAspMetValAspSerProGlnLeuAlaThrLeuAlaAspGluVal420425430SerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu435440<210>7<211>383<212>PRT<213>人類<400>7MetAlaGluProArgGlnGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGlnGlyGlyTyrThrMetHis202530GlnAspGlnGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysAlaGluGluAla354045GlyIleGlyAspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisVal505560ThrGlnAlaArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAsp65707580AspLysLysAlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLysIleAlaThrPro859095ArgGlyAlaAlaProProGlyGlnLysGlyGlnAlaAsnAlaThrArg100105110IleProAlaLysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGly115120125GluProProLysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySer130135140ProGlyThrProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrPro145150155160ProThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrProProLys165170175SerProSerSerAlaLysSerArgLeuGlnThrAlaProValProMet180185190ProAspLeuLysAsnValLysSerLysIleGlySerThrGluAsnLeu195200205LysHisGlnProGlyGlyGlyLysValGlnIleIleAsnLysLysLeu210215220AspLeuSerAsnValGlnSerLysCysGlySerLysAspAsnIleLys225230235240HisValProGlyGlyGlySerValGlnIleValTyrLysProValAsp245250255LeuSerLysValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHis260265270LysProGlyGlyGlyGlnValGluValLysSerGluLysLeuAspPhe275280285LysAspArgValGlnSerLysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHis290295300ValProGlyGlyGlyAsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThrPhe305310315320ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyr325330335LysSerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsn340345350ValSerSerThrGlySerIleAspMetValAspSerProGlnLeuAla355360365ThrLeuAlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu370375380<210>8<211>352<212>PRT<213>人類<400>8MetAlaGluProArgGlnGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGlnGlyGlyTyrThrMetHis202530GlnAspGlnGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysAlaGluGluAla354045GlyIleGlyAspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisVal505560ThrGlnAlaArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAsp65707580AspLysLysAlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLysIleAlaThrPro859095ArgGlyAlaAlaProProGlyGlnLysGlyGlnAlaAsnAlaThrArg100105110IleProAlaLysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGly115120125GluProProLysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySer130135140ProGlyThrProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrPro145150155160ProThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrProProLys165170175SerProSerSerAlaLysSerArgLeuGlnThrAlaProValProMet180185190ProAspLeuLysAsnValLysSerLysIleGlySerThrGluAsnLeu195200205LysHisGlnProGlyGlyGlyLysValGlnIleValTyrLysProVal210215220AspLeuSerLysValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnIleHis225230235240HisLysProGlyGlyGlyGlnValGluValLysSerGluLysLeuAsp245250255PheLysAspArgValGlnSerLysIleGlySerLeuAspAsnIleThr260265270HisValProGlyGlyGlyAsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThr275280285PheArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleVal290295300TyrLysSerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSer305310315320AsnValSerSerThrGlySerIleAspMetValAspSerProGlnLeu325330335AlaThrLeuAlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu340345350<210>9<211>412<212>PRT<213>人類<400>9MetAlaGluProArgGlnGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGlnGlyGlyTyrThrMetHis202530GlnAspGlnGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GlnThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAlaGluGluAlaGlyIleGly65707580AspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGlnAla859095ArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLys100105110AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLysIleAlaThrProArgGlyAla115120125AlaProProGlyGlnLysGlyGlnAlaAsnAlaThrArgIleProAla130135140LysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProPro145150155160LysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThr165170175ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArg180185190GluProLysLysValAlaValValArgThrProProLysSerProSer195200205SerAlaLysSerArgLeuGlnThrAlaProValProMetProAspLeu210215220LysAsnValLysSerLysIleGlySerThrGluAsnLeuLysHisGln225230235240ProGlyGlyGlyLysValGlnIleIleAsnLysLysLeuAspLeuSer245250255AsnValGlnSerLysCysGlySerLysAspAsnIleLysHisValPro260265270GlyGlyGlySerValGlnIleValTyrLysProValAspLeuSerLys275280285ValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHisLysProGly290295300GlyGlyGlnValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArg305310315320ValGlnSerLysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHisValProGly325330335GlyGlyAsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArgGluAsn340345350AlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLysSerPro355360365ValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSerSer370375380ThrGlySerIleAspMetValAspSerProGlnLeuAlaThrLeuAla385390395400AspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu405410<210>10<211>686<212>PRT<213>大鼠<400>10MetAlaGluProArgGlnGluPheAspThrMetGluAspGlnAlaGly151015AspTyrThrMetLeuGlnAspGlnGluGlyAspMetAspHisGlyLeu202530LysGluSerProProGlnProProAlaAspAspGlySerGluGluPro354045GlySerGluThrSerAspAlaLysSerThrProThrAlaGluAspVal505560ThrAlaProLeuValGluGluArgAlaProAspLysGlnAlaThrAla65707580GlnSerHisThrGluIleProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGly859095IleGlyAspThrProAsnMetGluAspGlnAlaAlaGlyHisValThr100105110GlnGluProGlnLysValGluIlePheSerGlnSerLeuLeuValGlu115120125ProGlyArgArgGluGlyGlnAlaProAspSerGlyIleSerAspTrp130135140ThrHisGlnGlnValProSerMetSerGlyAlaProLeuProProGln145150155160GlyLeuArgGluAlaThrHisGlnProLeuGlyThrArgProGluAsp165170175ValGluArgSerHisProAlaSerGluLeuLeuTrpGlnGluSerPro180185190GlnLysGluAlaTrpGlyLysAspArgLeuGlySerGluGluGluVal195200205AspGluAspIleThrMetAspGluSerSerGlnGluSerProProSer210215220GlnAlaSerLeuAlaProGlyThrAlaThrProGlnAlaArgSerVal225230235240SerAlaSerGlyValSerGlyGluThrThrSerIleProGlyPhePro245250255AlaGluGlySerIleProLeuProAlaAspPhePheSerLysValSer260265270AlaGluThrGlnAlaSerProProGluGlyProGlyThrGlyProSer275280285GluGluGlyHisGluAlaAlaProGluPheThrPheHisValGluIle290295300LysAlaSerAlaProLysGluGlnAspLeuGluGlyAlaThrValVal305310315320GlyAlaProAlaGluGluGlnLysAlaArgGlyProSerValGlyLys325330335GlyThrLysGluAlaSerLeuLeuGluProThrAspLysGlnProAla340345350AlaGlyLeuProGlyArgProValSerArgValProGlnLeuLysAla355360365ArgValAlaGlyValSerLysAspArgThrGlyAsnAspGluLysLys370375380AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrGlyAlaLysIleAlaThrProArg385390395400GlyAlaAlaThrProGlyGlnLysGlyThrSerAsnAlaThrArgIle405410415ProAlaLysThrThrProSerProLysThrProProGlySerGlyGlu420425430ProProLysSerGlyGluArgSerGlyTyrSerSerProGlySerPro435440445GlyThrProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrProPro450455460ThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrProProLysSer465470475480ProSerAlaSerLysSerArgLeuGlnThrAlaProValProMetPro485490495AspLeuLysAsnValArgSerLysIleGlySerThrGluAsnLeuLys500505510HisGlnProGlyGlyGlyLysValGlnIleIleAsnLysLysLeuAsp515520525LeuSerAsnValGlnSerLysCysGlySerLysAspAsnIleLysHis530535540ValProGlyGlyGlySerValHisIleValTyrLysProValAspLeu545550555560SerLysValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnIleHisHisLys565570575ProGlyGlyGlyGlnValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLys580585590AspArgValGlnSerLysIleGlySerLeuAspAsnIleThrHisVal595600605ProGlyGlyGlyAsnLysLysIleGluThrHisLysLeuThrPheArg610615620GluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys625630635640SerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnVal645650655SerSerThrGlySerIleAspMetValAspSerProGlnLeuAlaThr660665670LeuAlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGlnGlyLeu67568068權(quán)利要求1.對(duì)構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常形式具有特異性的抗體，所述的抗體對(duì)正常tau蛋白是非特異的。2.權(quán)利要求1的抗體，該抗體來(lái)源于在ECACC中保藏的具有保藏號(hào)00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-11和DC-11/I。3.權(quán)利要求1或2的抗體，該抗體與由所述在ECACC中保藏的具有保藏號(hào)00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-11或DC-11/I產(chǎn)生的抗體相比，對(duì)所述tau的構(gòu)象上不同形式具有至少50％的特異性、尤其是具有至少90％的特異性。4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的抗體，其特征在于它是合成抗體。5.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。6.構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式，所述tau蛋白的構(gòu)象上不同形式可由權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的抗體特異性識(shí)別。7.權(quán)利要求6的tau蛋白形式，其特征在于該蛋白質(zhì)與正常tau相比在N-末端或C-末端或兩末端上被異常截短，且所述的tau蛋白形式至少包括正常tau蛋白質(zhì)序列中的100個(gè)氨基酸-400個(gè)氨基酸。8.用于檢測(cè)或分離腦組織或體液樣品中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的抗體和用于裝載探針的適宜容器。9.權(quán)利要求8的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步含有用于檢測(cè)所述抗體與所述構(gòu)象不同的tau蛋白之間結(jié)合情況的工具，優(yōu)選次級(jí)抗體、尤其是特異性標(biāo)記的次級(jí)抗體。10.權(quán)利要求8或9的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步含有用于對(duì)所述構(gòu)象不同的tau蛋白、尤其是構(gòu)象不同的tau蛋白標(biāo)準(zhǔn)制品定量的工具。11.患者腦組織或體液中構(gòu)象不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟將所述的體液與權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的抗體混合、檢測(cè)所述抗體與所述構(gòu)象不同的tau蛋白之間存在的結(jié)合情況，且可選地測(cè)定與所述抗體結(jié)合的構(gòu)象不同的tau蛋白的量。12.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的抗體在制備用于治療阿爾茨海默病患者的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及對(duì)在構(gòu)象上不同于正常tau且不與正常tau蛋白結(jié)合的異常截短形式的tau蛋白具有特異性的抗體、在構(gòu)象上不同的tau蛋白(“tauons”)和與阿爾茨海默病和相關(guān)tauo病(tauopathies)有關(guān)的診斷和治療方面。文檔編號(hào)A61K39/395GK1492879SQ02805313公開日2004年4月28日申請(qǐng)日期2002年1月29日優(yōu)先權(quán)日2001年2月2日發(fā)明者M(jìn)·諾瓦克,M諾瓦克申請(qǐng)人:阿克松神經(jīng)科學(xué)研究和發(fā)展股份有限公司,阿克松神經(jīng)科學(xué)研究和發(fā)展股份有限公