專利名稱：重組恥垢分支桿菌其制備及在治療膀胱腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)制品及其制備方法及在制備藥物上的用途，具體涉及重組恥垢分枝桿菌疫苗、其制備方法、及在制備用于治療淺表型膀胱腫瘤、原位癌、無法手術(shù)治療的晚期腫瘤及膀胱腫瘤術(shù)后防治復(fù)發(fā)等藥物中的應(yīng)用。
(二)、技術(shù)背景眾所周知膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，其主要特點是發(fā)病率、復(fù)發(fā)率高、惡性程度低。據(jù)統(tǒng)計目前的發(fā)病率可高達(dá)30/10萬，初次發(fā)病時70-80％的膀胱腫瘤為淺表乳頭狀瘤，但單純手術(shù)切除復(fù)發(fā)率達(dá)50-92％。每次復(fù)發(fā)其病理分級增高，最終發(fā)展為浸潤性癌轉(zhuǎn)移而致死。目前，用于防治膀胱腫瘤的卡介苗的有如下缺點1.臨床上應(yīng)用卡介苗給藥劑量大(65-130mg/次)2.用藥次數(shù)多3.副作用多50％以上的病人伴有尿路刺激癥狀、血尿和發(fā)燒等副作用，少數(shù)病人還可發(fā)生尿道結(jié)核、膀胱結(jié)核、甚至全身粟粒性結(jié)核，嚴(yán)重時可導(dǎo)致病人死亡4.生長周期長，制備困難，生產(chǎn)成本高?？ń槊缟L周期為一個月。IL-2也具有防治膀胱腫瘤的作用，但費用高。
恥垢分枝桿菌(M.smegmatis mc2155)是一種已知的快生長型分枝桿菌，它是從土壤中分離出來的非致病性分枝桿菌，在顯微鏡下通過抗酸染色可以觀察到紅色桿狀或短棒狀細(xì)菌。目前未見有恥垢分枝桿菌在藥學(xué)上應(yīng)用的文獻(xiàn)報道及應(yīng)用，也未見有恥垢分枝桿菌重組基因疫苗及應(yīng)用的文獻(xiàn)報道。
(三)、發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一就是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的以上不足而設(shè)計一種重組膀胱腫瘤基因疫苗。該疫苗利用來源于土壤的非致病性恥垢分支桿菌所具有的免疫原性強、無毒副作用、無致病性、繁殖周期短、生產(chǎn)成本低的特點，采用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了分枝桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒，將IL-2基因?qū)氲椒种U菌中，研制了一種安全有效、無毒副作用、生產(chǎn)成本低廉的新型膀胱腫瘤基因疫苗。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種制備所述重組恥垢分支桿菌。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供重組恥垢分支桿菌在藥學(xué)上的應(yīng)用。
本發(fā)明解決所述技術(shù)問題之一是采用這樣的技術(shù)方案實現(xiàn)的即一種重組恥垢分支桿菌，其特征是a.由恥垢分枝桿菌和由分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒，人結(jié)核桿菌熱休克蛋白70啟動子cDNA，堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽cDNA及人白細(xì)胞介素-2cDNA組成的分枝桿菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)成；b.經(jīng)基因工程重組后的恥垢分支桿菌，在含有卡那霉素抗性的Lemco broth培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定生長傳代，即為本重組菌；表現(xiàn)為黃白色菌落，通過蛋白印跡分析法和ELLSA免疫分析法檢測到其中的IL-2蛋白表達(dá)。
本發(fā)明解決所述技術(shù)問題之二是通過這樣的技術(shù)方案實現(xiàn)的，即一種重組恥垢分支桿菌的制備方法，其特征在于第一步，將含有堪薩斯分枝桿菌和編碼基因的重組質(zhì)粒pIJK-1，根據(jù)其全長序列，設(shè)計一對引物分別帶有NcoI和XbaI酶切位點，從中擴增出堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽基因，將含有人結(jié)核分枝桿菌hsp70的啟動子和編碼基因重組質(zhì)粒pY6013，經(jīng)NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信號肽基因構(gòu)建4.5kb的重組質(zhì)粒pY-α；第二步，重組質(zhì)粒pHIG53含有人白細(xì)胞介素-2編碼基因，PCR擴增不含信號肽的人白細(xì)胞介素-2編碼基因片斷；重組質(zhì)粒pY-α用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶HindII和XbaI酶切消化，將目的基因片段和載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成中間克隆載體pY-α-IL-2
第三步，將分枝桿菌質(zhì)粒pRR3用限制性內(nèi)切酶ScaI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重組質(zhì)粒pY-α-IL-2用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，與載體pRR3進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成4.54kb大小的分支桿菌穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2；第四步，利用電穿孔轉(zhuǎn)化法將穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌M.smegmatis mc2155中，構(gòu)建了表達(dá)人IL-2的分枝桿菌菌株，即重組恥垢分枝桿菌。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提出重組恥垢分枝桿菌在制備治療膀胱腫瘤藥物上的應(yīng)用。
本發(fā)明具有安全有效，造價底，使用方便，無痛苦、無毒副作用，對防治膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)療效好等特點。


本發(fā)明有如下附圖附圖1為重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建示意圖；附圖2為重組恥垢分枝桿菌免疫反應(yīng)柱狀比較圖；附圖3為重組恥垢分枝桿菌免疫反應(yīng)柱狀比較圖；附圖4為重組恥垢分枝桿菌免疫反應(yīng)毒性線段比較圖；附圖5為T24細(xì)胞增值反應(yīng)柱狀比較圖；附圖6為BTT739細(xì)胞增值反應(yīng)柱狀比較圖；附圖7為EJ細(xì)胞增值增值反應(yīng)柱狀比較圖；附圖8為BIU87細(xì)胞增值反應(yīng)柱狀比較圖。
(五)、實施及實驗以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述參見附圖1，重組質(zhì)粒pY6013含有人結(jié)核分枝桿菌hsp70的啟動子和編碼基因，該DNA片段定向克隆于pUC19的XbaI和EcoRI位點上。重組質(zhì)粒pIJK-1含有堪薩斯分枝桿菌和編碼基因，根據(jù)其全長序列，設(shè)計一對引物分別帶有NcoI和XbaI酶切位點，從中擴增出堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽基因，然后將克隆載體pY6013分別經(jīng)NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信號肽基因構(gòu)建4.5kb的重組質(zhì)粒pY-α。
重組質(zhì)粒pHIG53含有人白細(xì)胞介素-2編碼基因。PCR擴增不含信號肽的人白細(xì)胞介素-2編碼基因。
重組質(zhì)粒pY-α用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶HindII和XbaI酶切消化，將目的片段和載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成中間克隆載體pY-α-IL-2；分枝桿菌質(zhì)粒pRR3用限制性內(nèi)切酶ScaI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重組質(zhì)粒pY-α-IL-2用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，與載體pRR3進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成4.54kb大小的分支桿菌穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2。
利用電穿孔轉(zhuǎn)化法將穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌M.smegmatis mc2155中，構(gòu)建了表達(dá)人IL-2的分枝桿菌菌株。
將重組恥垢分枝桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集生長良好、無污染的菌苔，經(jīng)一系列處理后，以無致敏原性的保護劑配置成原液，再按每毫升含0.75mg的濃度配成菌苗，采用真空冷凍干燥技術(shù)分裝而成。使用時用生理鹽水50ml稀釋2支本產(chǎn)品，搖動使其充分混勻，稀釋后應(yīng)在半小時內(nèi)使用，以防分枝桿菌死亡或污染。將稀釋后的分枝桿菌經(jīng)尿道注入膀胱，變換體位，保留半小時。依據(jù)病情，一般1周灌一次。
本發(fā)明可以這樣實現(xiàn)即在膀胱腫瘤手術(shù)中，用2ml生理鹽水稀釋本產(chǎn)品，在切除腫瘤后，膀胱粘膜局部注射。
重組恥垢分枝桿菌疫苗抗腫瘤活性的研究1、重組膀胱腫瘤基因疫苗株對小鼠免疫功能的影響(1)實驗步驟a.重組分枝桿菌菌株生長至OD600為1-1.5，用PBS沖洗重懸使其OD600值相同，雌性BALB/c經(jīng)腹腔注射200μl重組分枝桿菌菌液。
b.注射后6和16周，分別處死小鼠(每個時間點用4至6只小鼠)。取脾臟放于RPMI培養(yǎng)基中。用70μm孔徑的塑料網(wǎng)過濾脾臟，使其產(chǎn)生單細(xì)胞懸液，沖洗后放于與上面相同的培養(yǎng)基中，使其濃度為4×106/ml。
c.取1ml體積用于細(xì)胞增埴3H-Tdr摻入法分析。加入PPD(分枝桿菌抗原20μg/ml)，于作用后72小時前每6小時加入3H-Tdr，測定其放射活性，以檢測小鼠中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
d.淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的測定從正常小鼠和重組分枝桿菌免疫小鼠的脾臟中分離淋巴細(xì)胞，以不同的效應(yīng)比加入，MTT法測定其抗腫瘤活性。(2)結(jié)果a.重組基因疫苗介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參見附圖2、3，如圖所示，接種后16周，重組疫苗組較正常對照組免疫活性有明顯升高(t檢驗P＜0.001)。
b.正常小鼠與重組疫苗免疫小鼠淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性比較參見附圖4，由圖可見重組疫苗組較正常對照組在體外的細(xì)胞毒活性上有明顯的差別(P＜0.05)。
2、重組膀胱腫瘤基因疫苗對膀胱移行癌細(xì)胞的作用(1)實驗步驟a.人膀胱腫瘤細(xì)胞株EJ、BIU87、T24及鼠源性膀胱移行癌細(xì)胞BTT739生長在含有10％牛血清、10mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
b.重組膀胱腫瘤基因疫苗抗腫瘤細(xì)胞增殖分析將消化好的4種膀胱腫瘤細(xì)胞懸液接種于將消化好的3種膀胱腫瘤細(xì)胞懸液接種于96孔平底培養(yǎng)板上，使細(xì)胞數(shù)5×107/ml，每孔加入100μl，使每孔為1000-5000個細(xì)胞，培養(yǎng)16小時。野生型或重組的分枝桿菌以最佳濃度(5×105CFU/ml)加入到對數(shù)培養(yǎng)中期的細(xì)胞中，37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)24、48、72小時后，更換培養(yǎng)液，無菌條件下每孔加入0.5μCi的[3H]-TdR，再繼續(xù)孵育16小時后，終止反應(yīng)，收集細(xì)胞于9999型玻璃纖維濾紙上，濾紙經(jīng)紅外線烘干后置入閃爍瓶中，加入PPO/POPOP/二甲苯閃爍液，用液閃計數(shù)器進(jìn)行[3H]-TdR摻入量的測定，記錄cpm值，計算變化率。公式為變化率＝(實驗組cpm值/對照組cpm值)×100％。
c.重組膀胱腫瘤基因疫苗抗腫瘤細(xì)胞毒分析將野生型分枝桿菌及重組膀胱腫瘤疫苗所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞放入96孔V形底板中，每組設(shè)3復(fù)孔置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)4小時，用[3H]-TdR摻入法測定細(xì)胞毒性。
(2)結(jié)果a.我們的實驗數(shù)據(jù)表明重組膀胱腫瘤基因疫苗抗腫瘤細(xì)胞增殖活性是BCG的100倍，4種膀胱腫瘤細(xì)胞株的結(jié)果基本一致。重組膀胱腫瘤基因疫苗在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面較野生型分枝桿菌有明顯的效果，具體結(jié)果見附圖5-8。
b.不同效應(yīng)細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞毒比較。每種細(xì)胞下的數(shù)值分別代表效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性的平均值。野生型與重組型無明顯差別。
靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞EJBIU87T24 BTT739LAK765467594852 4650WT-SMAK271928301816 2124IL-2-SMAK 302932372935 2732Vect-SMAK 341836302824 29373、重組膀胱腫瘤基因疫苗對荷瘤鼠免疫治療作用的研究(1)實驗步驟10周齡近交系同基因鼠T739 40只分為4組，每組各10只，前3組腋下接種BTT739腫瘤細(xì)胞1×105/鼠，選擇最佳不同時相點處死動物，觀察腫瘤形成情況，制備荷瘤小鼠動物模型。
實驗小組分四組a.空白對照組荷瘤小鼠給予PBS治療b.BCG組荷瘤小鼠給予野生型BCG菌株治療c.分枝桿菌組荷瘤小鼠給予野生型分枝桿菌治療d.重組膀胱腫瘤基因疫苗組荷瘤小鼠給予重組膀胱腫瘤基因疫苗治療4組實驗組分別于接種腫瘤后0、2、6、9、13天于接種腫瘤部位給予治療，腫瘤直徑達(dá)到1.44cm時處死小鼠。
(2)結(jié)果40只小鼠在實驗過程中有39只在注射部位長出腫瘤，重組膀胱腫瘤基因疫苗組有1只沒有腫瘤生長。
結(jié)果經(jīng)多因素分析表明腫瘤生長及存活時間上有明顯差異(p＝0.0066)，重組膀胱腫瘤疫苗在體內(nèi)表現(xiàn)出一定殺腫瘤活性，說明重組膀胱腫瘤基因疫苗可以成為一種新型的抗膀胱腫瘤制劑。
權(quán)利要求
1.一種重組恥垢分支桿菌，其特征是a.由恥垢分枝桿菌和由分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒，人結(jié)核桿菌熱休克蛋白70啟動子cDNA，堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽cDNA及人白細(xì)胞介素-2cDNA組成的分枝桿菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)成；b.經(jīng)基因工程重組后的恥垢分支桿菌，其特性不變，同時在含有卡那霉素抗性的Lemco broth培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定。即為本重組菌生長傳代，表現(xiàn)為黃白色菌落，通過蛋白印跡分析法和ELLSA免疫分析法檢測到其中的IL-2蛋白表達(dá)。
2.一種制備重組恥垢分支桿菌的方法，其特征在于第一步，將含有堪薩斯分枝桿菌和編碼基因的重組質(zhì)粒pIJK-1，根據(jù)其全長序列，設(shè)計一對引物分別帶有NcoI和XbaI酶切位點，從中擴增出堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽基因，將含有人結(jié)核分枝桿菌hsp70的啟動子和編碼基因重組質(zhì)粒pY6013，經(jīng)NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信號肽基因構(gòu)建4.5kb的重組質(zhì)粒pY-α；第二步，重組質(zhì)粒pHIG53含有人白細(xì)胞介素-2編碼基因，PCR擴增不含信號肽的人白細(xì)胞介素-2編碼基因片斷；重組質(zhì)粒pY-α用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶HindII和XbaI酶切消化，將目的基因片段和載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成中間克隆載體pY-α-IL-2；第三步，將分枝桿菌質(zhì)粒pRR3用限制性內(nèi)切酶ScaI消化，并用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重組質(zhì)粒pY-α-IL-2用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，與載體pRR3進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建成4.54kb大小的分支桿菌穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2；第四步，利用電穿孔轉(zhuǎn)化法將穿梭表達(dá)載體pR-α-IL-2轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌M.smegmatis mc2155中，構(gòu)建了表達(dá)人IL-2的分枝桿菌菌株，即重組恥垢分枝桿菌。
3.重組恥垢分枝桿菌在用于制備膀胱腫瘤藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治和治療膀胱腫瘤的重組微生物制劑,即重組恥垢分枝桿菌,由恥垢分枝桿菌和分枝桿菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)成,后者是由分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒,人結(jié)核桿菌熱休克蛋白70啟動子cDNA,堪薩斯分枝桿菌α抗原信號肽cDNA及人白細(xì)胞介素－2cDNA組成。主要用于治療淺表型膀胱腫瘤、原位癌、無法手術(shù)治療的晚期腫瘤及膀胱腫瘤術(shù)后防治復(fù)發(fā)等。將本產(chǎn)品的成品制劑用一定量的生理鹽水稀釋,灌入膀胱腫瘤患者的膀胱中,變換體位保留一定時間即可,也可在膀胱腫瘤手術(shù)中,用2ml生理鹽水稀釋本產(chǎn)品,在切除腫瘤后,膀胱粘膜局部注射。
文檔編號A61P13/10GK1339583SQ0112892
公開日2002年3月13日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者靳鳳爍, 姚建忠 申請人:靳鳳爍, 姚建忠