專利名稱：：一種高效檢測臨床樣品中結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及臨床微生物核酸診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種靈敏度高、特異性強、高效檢測臨床樣品中結(jié)核分支桿菌核酸的技術(shù)，該技術(shù)還包括一種快速、高效液化痰的方法，而且液化過程對痰內(nèi)分支桿菌無殺死作用。
背景技術(shù)：
：分支桿菌科只包括分支桿菌一個屬，按是否引起人和多種哺乳動物的結(jié)核病來區(qū)分，分支桿菌屬又分為結(jié)核分支桿復(fù)合體(mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)和非結(jié)核分支桿菌(nontuberculosismycobacterium，NTM);結(jié)核分支桿菌復(fù)合體包括結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis,MTB)、牛分支桿菌(M.bovis)、非洲分支桿菌(M.africanum)和田鼠分支桿菌(M.micoti)，結(jié)核分支桿菌和牛分支桿菌是引起人結(jié)核病的病原，非洲分支桿菌是引起非洲熱帶國家人結(jié)核病的病原。結(jié)核分支桿菌可存在于結(jié)核患者咳出的霧滴中，其大小為15pm，當(dāng)易感人群吸入該顆粒并進入呼吸道末梢時可引起感染。在肺泡內(nèi)結(jié)核分支桿菌可被巨噬細胞吞噬并向全身擴散，通常宿主細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)限制了結(jié)核分支桿菌的增殖與擴散。但有些結(jié)核分支桿菌在感染很多年內(nèi)可保持休眠狀態(tài)。隱性感染結(jié)核分支桿菌的患者(即潛伏期感染患者)，通常純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗陽性，但無癥狀和無傳染性。通常隱性感染結(jié)核的患者有10%的可能轉(zhuǎn)化為活動性結(jié)核。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計，2005年全國報告肺結(jié)核發(fā)病1259308人，死亡6713人，發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)均居全國法定報告甲、乙、丙類傳染病發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)第一位；而2004年肺結(jié)核發(fā)病970279人，死亡i435人，2005年與2004年相比，發(fā)病率增長29.03%。由以上統(tǒng)計數(shù)字看，我國肺結(jié)核病的防治l:作仍然任重而道遠。從全球范圍來看，世界上有二分之一的人口感染了潛伏性結(jié)核病，并面臨發(fā)展為活動性結(jié)核病的危險。在許多國家，艾滋病毒加快了結(jié)核病流行，同時多藥耐藥性也日益成為一大威脅。每年有170萬人死于結(jié)核病，其中許多死亡的原因是感染未能得到診斷或確診太晚以至丁無法治愈。每年患活動性結(jié)核病的估計有卯0萬人，其中大多數(shù)仍未得到實驗室確認(rèn)的診斷。每年采用最普遍的檢測方法——痰涂片顯微鏡檢査診斷和報告的結(jié)核病病例僅為大約220萬例。其它病例是通過一種往往效率低、有時還耗費資金的綜合方法來診斷，即肺部X線影像、細菌培養(yǎng)和推測。因此，2006年10月25日，在日內(nèi)瓦由熱帶病研究與培訓(xùn)特別規(guī)劃(TDR)和促進創(chuàng)新診斷方法基金會發(fā)布的新報告《結(jié)核病診斷方法全球需求和市場潛力》，其主要結(jié)論為"在改進結(jié)核病檢測方面存在著一個相當(dāng)大的尚未開發(fā)的全球市場，可供低收入和中等收入國家診斷結(jié)核病開展更為有效和更可負擔(dān)得起的檢測。今天大多數(shù)結(jié)核病例發(fā)生在這些國家。"該報告認(rèn)為，就目前所使用的診斷技術(shù)而言，在全世界結(jié)核病患者或生活在結(jié)核病高危地區(qū)的人當(dāng)中，大多數(shù)人都很難獲得迅速而準(zhǔn)確的檢測。這是閔為第一，痰作為肺結(jié)核臨床檢測的主要標(biāo)本，其液化方法至今沒有很好解決，因而結(jié)核分支桿菌核酸擴增檢測技術(shù)和分離培養(yǎng)難以診斷潛伏期感染患者。臨床上普遍使用的NaOH、NaOH-NALC、油酸、硫酸等方法雖然可以有效液化痰，但都很大程度(20~90%)地殺死痰樣品中的結(jié)核分支桿菌。臨床上涂片檢査要求每毫升痰液中桿菌的量至少為5X10^1X104,而分離培養(yǎng)要求10~100個桿菌，對于潛伏期結(jié)核分支桿菌感染患者每毫升痰液中桿菌的量一般在1X1(^以下，涂片檢齊顯然不適用，而痰經(jīng)過液化之后損失大部分乃至全部的結(jié)核分支桿菌，造成核酸擴增和分離培養(yǎng)難以診斷潛伏期感染患者。而報告《結(jié)核病診斷方法全球需求和市場潛力》指出，全球每年有2.04億人次需要作潛伏期感染檢測。第二，痰涂片檢査、X線影像、培養(yǎng)檢測可能沒有準(zhǔn)確地査明活動性結(jié)核病，尤其是艾滋病毒陽性患者。呼吸道和消化道是分支桿菌傳染人的主要途徑，結(jié)核臨床檢測標(biāo)本包括痰、支氣管肺泡灌洗液和支氣管沖洗液、胃沖洗液、血、尿、糞、體液、組織等標(biāo)本，艾滋病毒陽性患者通過消化道、血液等途徑感染分支桿菌之后顯然不能通過上述方法檢出桿菌。第三，痰涂片檢査、X線影像、培養(yǎng)檢測可能無法嚴(yán)格區(qū)分潛伏性和活動性結(jié)核病，以及疾病對藥物的敏感性和耐藥性。因此，以痰樣品為例，準(zhǔn)確、迅速診斷結(jié)核首先需要一種快速、有效液化痰而且液化過程對痰內(nèi)分支桿菌無殺死作用的方法，再結(jié)合靈敏度高、特異性好、快速的檢測技術(shù)以達到此S的。核酸擴增技術(shù)(NucleicAcidAmplification,NAA)就是這樣一類檢測技術(shù)，具體包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、核酸序列依賴性擴增(NucleicAcidSequence-BasedAmplification,NASBA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(:LigaseChainReaction,LCR)等，這類檢測技術(shù)可以在臨床標(biāo)本中直接檢測和鑒定分支桿菌，避免進行長時間的培養(yǎng)。近年來，臨床檢測單位逐漸廣泛的使用一種熒光PCR擴增檢測病原體核酸的技術(shù)，尤其在乙肝病毒檢測領(lǐng)域?；赥aqman技術(shù)的熒光PCR技術(shù)關(guān)鍵是在普通PCR的一對特異性引物基礎(chǔ)上增加了一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針，該探針同樣與病原體核酸特異性結(jié)合，具體設(shè)計為與病原體核酸雙鏈DNA的正義鏈或反義鏈互補結(jié)合，而且結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域的中間，探針5'端常標(biāo)記FAM熒光素，是熒光報告基團，3'端常標(biāo)記TAMRA熒光素，是熒光淬滅基團；當(dāng)PCR反應(yīng)進行到延伸階段時，耐熱DNA聚合酶同時引導(dǎo)與模板DNA正義鏈和反義鏈互補結(jié)合的引物從5'—3'方向延伸，聚合酶具有的5—3外切酶活性切斷己結(jié)合到正義鏈或反義鏈某一條鏈上的Taqman探針，消除3'端熒光淬滅基團對5'端熒光報告基團的淬滅作用從而發(fā)出熒光，檢測系統(tǒng)通過檢測熒光可推測PCR產(chǎn)物數(shù)量。閃為理論上擴增反應(yīng)的每次延伸階段，結(jié)合到雙鏈擴增產(chǎn)物一條單鏈上的探針數(shù)量與起始擴增產(chǎn)物數(shù)量相等，而探針斷裂發(fā)光之后擴增產(chǎn)物數(shù)量已經(jīng)擴增為原來的兩倍，因此熒光信號強弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比。該方法的靈敏度和特異性已被廣泛承認(rèn)。核酸擴增檢測商業(yè)化產(chǎn)品英文名為CDAT(commercialdirectamplificationtest),目前通過美國FDA認(rèn)證的結(jié)核CDAT產(chǎn)品只有Roche公司的AMPL1CORM.TUBERCULOSl'S和Gen-Probe公司的AmplifiedM.tubercuiosisDirect(AMTD2)，兩個產(chǎn)品的檢測靶序列分別是結(jié)核分支桿菌16srRNA基因和16srRNA。AMPLICOR采用PCR核酸擴增檢測技術(shù)，擴增分支桿菌種共有的16srRNA基因584bp片段，擴增產(chǎn)物通過結(jié)核分支桿菌復(fù)合群特異性的探針鑒別；其檢測靈敏度(在所有種類的呼吸道樣本)與病人標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌的含量和分布呈強相關(guān)，在肺以外的樣本和涂片陰性的樣本檢測靈敏度低。因此AMPLICOR被FDA認(rèn)證為只可檢測涂片陽性標(biāo)本。而Gen-ProbeAMTD2采用NASBA等溫核酸擴增檢測技術(shù)，是等溫轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的擴增反應(yīng)，RNA擴增產(chǎn)物通過吖啶酯標(biāo)記的結(jié)核分支桿菌復(fù)合群特異性DNA探針的核酸保護實驗鑒定。16srRNA在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)約為1000~10000copies/cell，因此AMTD2檢測靈敏度極高，被FDA認(rèn)證為可檢測涂片陽性和涂片陰性標(biāo)本；其主要缺點是沒有設(shè)置內(nèi)標(biāo)，不能進行擴增反應(yīng)抑制的檢測。同時上述兩種產(chǎn)品價格昂貴，所使用的液化方法是NaOH-NALC方法，該方法在一定程度上殺死痰樣品中的結(jié)核分支桿菌，因此難以檢測潛伏期感染患者痰中的結(jié)核分支桿菌。美國CDC2000年更新的開放性TB的診斷標(biāo)準(zhǔn)是采集病人不同三天的痰樣本用于AFB鏡檢和培養(yǎng)。如果AFB涂片陰性，CDAT(商業(yè)化核酸擴增檢測)在第一次標(biāo)本收集時即進行，否則用于檢測涂片陽性的樣本。如果涂片陽性而CDAT檢測陰性，需要檢測擴增反應(yīng)抑制物。如果至少連續(xù)兩次的涂片陽性，CDAT陰性而且不存在抑制物，則假設(shè)病人是非結(jié)核分支桿菌感染。如果樣本檢測結(jié)果是涂片陰性而CDAT陽性，而且第二份樣本的檢査結(jié)果也是如此，病人可假定為TB患者。最后，如果連續(xù)兩次樣本的檢測結(jié)果，CDAT和涂片都是陰性，病人可假定為開放性TB排除，而最終的排除要依靠臨床觀察判斷。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，潛伏期結(jié)核感染患者如果CDAT(商業(yè)化核酸擴增檢測)兩次檢測結(jié)果卩l(xiāng)l性可假定為TB患者。痰是結(jié)核檢測的主要樣品，痰液化方法解決以后將極大地提高潛伏期結(jié)核感染患者的檢出率，從而早期發(fā)現(xiàn)和早期治療結(jié)核病，有利于結(jié)核病的防控工作。今天大多數(shù)結(jié)核病例發(fā)生在低收入和中等收入國家，診斷結(jié)核病要求更為有效和更可負擔(dān)得起的檢測，因此商業(yè)化核酸擴增檢測要求價格適中；由于我國的基于Taqman技術(shù)的熒光PCR檢測試劑產(chǎn)業(yè)己經(jīng)發(fā)展到一定階段，因此可以開發(fā)價格適中的檢測試劑。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種有效液化痰且不殺死痰內(nèi)分支桿菌的方法，結(jié)合靈敏度高、特異性好、價格適中的核酸擴增檢測技術(shù)，用于快速、準(zhǔn)確地檢測臨床樣品中的結(jié)核分支桿菌。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的就是提供一種快速準(zhǔn)確檢測臨床樣品中結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的技術(shù)。在本發(fā)明的第一方面提供了一種快速、高效液化痰的方法，根據(jù)該方法配制的液化試劑適用于結(jié)核病等呼吸道疾病的痰樣品前處理，它包括步驟在臨床檢測的痰樣品中直接添加15倍體積的液化試劑，旋渦振蕩器上振蕩混勻30slmin，室溫靜置1520min，3000g4000g離心15min，棄上清，沉淀用于下一步的核酸提取。在另一優(yōu)選例中，痰樣品用所述的液化方法液化，在室溫靜置152()min以后如果樣品溶液中仍有粘稠的痰，則重復(fù)"旋渦振蕩器上振蕩混勻30slmin，室溫靜置1520min"的步驟，直到樣品溶液呈現(xiàn)底部黃色碎片狀沉淀而上部澄清，則繼續(xù)進行離心步驟。在另一優(yōu)選例中，所述的液化方法提供一種液化試劑，其成分選自下組0.51%的西吡氯銨，1040%Na3PO4，0.150/o的NALC，5500mg/ml的溶菌酶，0.015%的0丁丁，5500mg/ml的蛋白酶K，l400/o的NaCl，110%檸檬酸三鈉，0.001l%NaN3以及它們的混合物。在本發(fā)明的第二方面提供一種結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸檢測方法，該方法采用熒光PCR擴增檢測方法，包括步驟樣品DNA提取和熒光PCR擴增檢測。在特異性擴增條件下，在熒光PCR反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)和實時熒光檢測，檢測的熒光信號強弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比，反應(yīng)結(jié)束以后通過設(shè)定熒光閾值來判定擴增產(chǎn)物是否存在，所述的反應(yīng)體系中含有特異性擴增結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的引物對，還含有結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針。在另一優(yōu)選例中，提供一種檢測結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的遺傳標(biāo)記物，它具有SEQIDNO:l中連續(xù)的80300個核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性擴增結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的引物對，引物1序列與SEQIDNO:l所示的序列相同，引物2與SEQIDNO:l所示的序列互補，引物序列選自下組引物l:5'~CTACGCAGCAGATCCCCA—3'，SEQIDNO:2引物2:5'~GCACCGCCCAACTCGTT—3'SEQIDNO:3在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針是Taqman探針，并且可發(fā)出不同波長熒光。在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸檢測方法靈敏度高，以中國藥品與生物制品檢定所提供的結(jié)核分支桿菌靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過DNA提取之后檢測，靈敏度達到10個菌/ml(圖l);特異性強，以中國藥品與生物制品檢定所提供的肺炎球菌、布氏桿菌及鳥分支桿菌等十三種非結(jié)核分支桿菌樣品經(jīng)過DNA提取之后檢測，結(jié)果全部是陰性，無熒光擴增曲線(圖2)。在本發(fā)明的第二方面，將上述兩項相對獨立乂相互關(guān)聯(lián)的發(fā)明所貫徹實施，提供一種臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法，該方法包括步驟-(1)痰樣品液化；(2)樣品DNA提取；(3)以抽提的DNA為模板，在熒光PCR擴增反應(yīng)液中加入所述的特異性擴增結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的引物對和所述的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針，進行熒光PCR擴增反應(yīng)；(4)結(jié)果分析，反應(yīng)結(jié)束以后通過設(shè)定熒光閾值來判定擴增產(chǎn)物是否存在，存在擴增產(chǎn)物就表示樣品中存在結(jié)核分支桿菌復(fù)合體。在另一優(yōu)選例中，含相同數(shù)量卡介苗分支桿菌的兩份卡介苗梯度稀釋菌液，一份不經(jīng)過痰液化步驟直接用所述臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法檢測，一份添加到非結(jié)核病人的濃痰樣品中作為模擬臨床樣品用所述臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法檢測，熒光PCR擴增結(jié)果顯示兩份樣品的C,值相差小于1，表明雖然經(jīng)過痰液化步驟但是痰樣品中DNA沒有損失(圖3)圖1所述結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸檢測方法靈敏度檢測結(jié)果圖2所述結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸檢測方法特異性檢測結(jié)果圖3所述臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法檢測卡介苗菌液與卡介苗模擬臨床樣品，檢測結(jié)果對照實施方式本發(fā)明人經(jīng)過大量臨床試驗，發(fā)現(xiàn)臨床普遍使用的NaOH、NaOH-NALC、油酸、硫酸等痰液化方法不同程度地引起痰中分支桿菌損失，以上方法都具有酸堿度過高的特點，因此本發(fā)明的液化方法思路從pH值中性而且可分解痰中粘蛋白的物質(zhì)入手，選定西吡氯銨，NALC，Na3P04,溶菌酶，DTT，蛋白酶K,NaCl,檸檬酸三鈉，NaN3作為液化試劑成分，經(jīng)過廣泛而深入的研究，摸索上述成分的最佳濃度及反應(yīng)條件，最終建立快速、有效液化痰的方法，并且該方法操作步驟簡單，與目前臨床使用的NaOH-NALC方法一致，最關(guān)鍵的是經(jīng)實驗證明，該液化方法不會引起痰中分支桿菌損失。分支桿菌分泌抗原Ag85B基因編碼分支桿菌分泌抗原Ag85B，該蛋白參與分支菌酸的生物合成，在液體培養(yǎng)基生長的和巨噬細胞生長的結(jié)核分支桿菌細胞中都豐富表達，而且在體內(nèi)也表達，主要是肺結(jié)核病人顯示出對此蛋白極強的抗體反應(yīng)。本發(fā)明人經(jīng)過對結(jié)核分支桿菌和非結(jié)核分支桿菌的基因序列廣泛而深入的研究，認(rèn)為分支桿菌的Ag85B基兩特別適合作為檢測結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的序列，針對該序列設(shè)計的探針只檢測結(jié)核分支桿菌復(fù)合體。這樣，在單管PCR反應(yīng)中通過檢測熒光擴增曲線可快速簡便地鑒定結(jié)核分支桿菌復(fù)合體，而非結(jié)核分支桿菌及其他病原體無熒光擴增曲線。本文所用術(shù)語"結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針"指能夠結(jié)合于分支桿菌屬結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的擴增產(chǎn)物，但不結(jié)合于非結(jié)核分支桿菌等其它分支桿菌屬細菌或其它屬細菌的擴增產(chǎn)物的熒光探針。術(shù)語"結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸檢測方法"指能夠檢測各種細菌培養(yǎng)物等簡單樣品的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體檢測方法，該檢測方法特征在于其步驟包括DNA提取和熒光PCR擴增檢測。術(shù)語"臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法"指能夠檢測各種臨床樣品的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體檢測方法，臨床樣品包括痰、支氣管肺泡灌洗液和支氣管沖洗液、胃沖洗液、血、尿、糞、體液、組織等，該檢測方法特征在于除DNA提取、熒光PCR擴增檢測之外，還包括臨床結(jié)核痰樣品的前處理方法，以便于高效率收集、濃縮、保護分支桿菌核酸。由于除痰以外的其他臨床樣品其前處理可借鑒成熟方法，因此本發(fā)明的核酸擴增檢測方法同樣可以靈敏、特異地檢測此類樣品。本發(fā)明方法能檢測并鑒定分支桿菌屬結(jié)核分支桿菌復(fù)合體，該復(fù)合體包括結(jié)核分支桿菌、牛分支桿菌、田鼠分支桿菌和非洲分支桿菌。本發(fā)明優(yōu)選的擴增區(qū)域為分支桿菌Ag85B基因序列，不同種的分支桿菌在該區(qū)域的核苷酸序列存在區(qū)別，可用于它們的分類。根據(jù)本發(fā)明指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠配制痰液化試劑，并設(shè)計和合成引物及結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針，用于臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的實時熒光PCR擴增檢測等檢測技術(shù)。在本發(fā)明中，除痰樣品的處理方法及檢測所針對的靶序列與現(xiàn)有技術(shù)不同之外，諸如從樣品抽提DNA、引物的標(biāo)記、熒光PCR擴增和檢測等步驟的條件都與現(xiàn)有技術(shù)相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以用常規(guī)條件進行上述各種步驟。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，實時熒光PCR擴增結(jié)果表明，結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性探針的熒光信號，僅在結(jié)核分支桿菌復(fù)合體標(biāo)本表現(xiàn)陽性，而在非結(jié)核分支桿菌標(biāo)本均表現(xiàn)為陰性，這表明該探針有效而特異。另一優(yōu)選實施例中，臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法檢測含相同數(shù)量卄介苗分支桿菌的兩份卡介苗梯度稀釋菌液，一份為卡介苗梯度稀釋菌液不經(jīng)過痰液化步驟直接檢測，一份添加到非結(jié)核病人的濃痰樣品中作為模擬臨床樣品檢測，熒光PCR擴增結(jié)果顯示兩份樣品的C,值相差小于1，表明雖然經(jīng)過痰液化步驟但是痰樣品中結(jié)核分支桿菌DNA沒有損失。本發(fā)明主要特點在于可簡便快速地檢測和鑒定結(jié)核分支桿菌復(fù)合體。所使用的痰樣品液化方法對結(jié)核分支桿菌復(fù)合體DNA無破壞作用，操作簡單、快速，易被臨床接受?；诜种U菌Ag85B基因設(shè)計的引物對可有效地特異性擴增，而結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性炎光探針則特異性檢測結(jié)核分支桿菌。有效的痰液化技術(shù)結(jié)合靈敏度高、特異性強的核酸檢測技術(shù)，可高效、快速檢測潛伏期結(jié)核感染病人，達到早期診斷的目的。以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例11菌株來源本研究中的涉及的非分支桿菌屬細菌包括肺炎球菌(pneumococcus)、布氏桿菌(brucella)，分支桿菌屬細菌包括戈登分支桿菌(M.gordonae)、瘰疬分支桿菌(M.marinum)、蟾蜍分支桿菌(M.xenopi)、堪薩斯分支桿菌(M.kansasii)、鳥分支桿菌(M.avium)、胞內(nèi)分支桿菌(M.intracellulare)、偶發(fā)分支桿菌(M.fortuitum)、猿分支桿菌(M.simiae)、土分支桿菌(M.terrae)、草分支桿菌(M.phlei)、結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)、膿腫分支桿菌(M.abscessus)、恥垢分支桿菌(M.smegmatis)、胃分支桿菌(M.gastri)，結(jié)核分支桿菌靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品l、10、100、1000cfu/ml，以上菌株及標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供。卡介苗由上海生物制品所提供。2樣品前處理模擬臨床結(jié)核感染病人的痰樣品中加入15倍體積的液化試劑，旋渦振蕩器上振蕩混勻30slmin，室溫靜置1520min，3000g4000g離心15min，棄上清，沉淀用于核酸提取。該模擬臨床結(jié)核感染病人的痰樣品為非結(jié)核病人的濃痰加梯度稀釋的卡介苗菌液?？ń槊缬胠ml滅菌雙蒸水溶解，依次作10"、10'2、10—3、10—4、10—5稀釋，10—2、10—3、10—4稀釋的卡介苗菌液100ul添加到lm濃痰中經(jīng)上述方法液化以后作核酸提取和熒光PCR擴增檢測，與100ull(T2、10—3、10—4稀釋的卡介苗菌液的檢測結(jié)果對照。3核酸提取核酸提取采用商品化柱抽提試劑，沉淀中加入裂解液400ul，蛋白酶K100nl，用Tip頭吸打混勻，70'C裂解10分鐘；核酸提取柱套在2ml離心管內(nèi)，將裂解好的樣品溶液加到核酸提取柱上，10000rpm離心lmin,棄收集液；在核酸提取柱內(nèi)加入500ul洗滌液A，10000rpm離心lmin，棄收集液；在核酸提取柱內(nèi)加入500ul洗滌液B，10000rpm離心lmin，棄收集液；14000rpm離心lmin，棄離心管，換一新的2ml離心管；在核酸提取柱柱面中央小心加入50ul滅菌雙蒸水，靜置2min，10000rpm離心lmin,收集液用于核酸擴增。分支桿菌培養(yǎng)菌液分別取lOOlM加裂解液IOO"I，蛋白薛K20ul，用Tip頭吸打混勻，7(TC裂解10分鐘，以下步驟及反應(yīng)液用量同上述核酸提取步驟。結(jié)核分支桿菌靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品lml10000rpm離心15分鐘，棄上清，留取離心管底部100u1液體，加裂解液lOOul,蛋白酶K20ul，用Tip頭吸打混勻，7(TC裂解10分鐘，以下步驟及反應(yīng)液用量同上述核酸提取步驟。4PCR擴增引物序列分別為引物l:5'—CTACGCAGCAGATCCCCA—3'引物2:5'""GCACCGCCCAACTCGTT—3'結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針設(shè)計為5'~CCGTTCCCGCAATAAACCCATAGCC—3'兩引物的終濃度0.5uM,探針終濃度0.3uM，Mg2+終濃度3.5mM，dNTP終濃度0.2mM，處理樣15nl，TaqDNA聚合酶用量lU/30ul。以非結(jié)核病人的痰處理樣品為陰性對照。實時熒光分別在ABIPE7500、RocheLightcycler上進行。為減少污染使用了UNG酶，并用dUTP代替dTTP。ABIPE7500與RocheLightcycler反應(yīng)體積都為30nl，UNG酶用量0.2U,兩引物的終濃度0.5uM，探針終濃度0.3uM，Mg2+終濃度3.5mM,dNTP終濃度0.2mM，處理樣本15"I，TaqDNA聚合酶用量1U/30u1。反應(yīng)程序不同，ABIPE7500為50。C2min，94。C2min，94°C10s—65°C4.5s循環(huán)45次；RocheLightcycler為50'C2min,94'C2min，94'C3s—65°C45s循環(huán)45次。分別用兩種儀器自配軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。5結(jié)果分析在含結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針的反應(yīng)管中，僅結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)物和模擬臨床結(jié)核樣品呈現(xiàn)S型熒光擴增曲線，顯示陽性結(jié)果；其他菌株培養(yǎng)物和陰性對照標(biāo)本無熒光擴增曲線，顯示陰性結(jié)果。Lightcycler的檢測結(jié)果見圖。本發(fā)明所述的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸檢測方法靈敏度高，中國藥品生物制品檢定所提供的結(jié)核分支桿菌靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為1、10、100、1000cfu/ml，經(jīng)過DNA提取之后檢測，靈敏度達到10個cfu/ml(圖l)，符合中國藥品生物制品檢定所對結(jié)核核酸擴增檢測試劑靈敏度的要求；特異性強，以中國藥品生物制品檢定所提供的菌株培養(yǎng)物，經(jīng)過DNA提取之后檢測，僅兩個結(jié)核分支桿菌樣品顯示陽性，其它分支桿菌以及肺炎球菌、布氏桿齒全部顯示陰性(圖2)。為驗證本發(fā)明的痰液化方法對分支桿菌無殺死作用，以含相同數(shù)量卡介苗分支桿菌的兩份卡介苗菌液，一份不經(jīng)過痰液化步驟直接用本發(fā)明所述的臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法檢測，一份添加到非結(jié)核病人的濃痰中作為模擬臨床樣品，用所述臨床樣品結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法檢測，熒光PCR擴增結(jié)果顯示兩份樣品的C,值相差小于1(見表l)，表明雖然經(jīng)過痰液化步驟但是痰樣品中分支桿菌DNA沒有損失(圖3)。表1卡介苗菌液與卡介苗模擬臨床樣品檢測結(jié)果對照<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此處應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落入本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表一種高效檢測臨床樣品中結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的方法薛樹仁SEQ1:SEQIDNO:1978bpDNA結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)1atgacagacgtgagccgaaagattcgagcttggggacgccgattgatgatcggcacggca61gcggctgtagtccttccgggcctggtggggcttgccggcggagcggcaaccgcgggcgcg121ttctcccggccggggctgccggtcgagtacctgcaggtgccgtcgccgtcgatgggccg(:181gacatcaaggttcagttccagagcggtgggaacaactcacctgcggtttatctgctcgac241ggcctgcgcgcccaagacgactacaacggctgggatatcaacaccccggcgttcgagtgg301tactaccagtcgggactgtcgatagtcatgccggtcggcgggcagtccagcttctacagc361gactggtacagcccggcctgcggtaaggctggctgccagacttacaagtgggaaaccttc421ctgaccagcgagctgccgcaatggttgtccgccaacagggccgtgaagcccaccggcagc481gctgcaatcggcttgtcgatggccggctcgtcggcaatgatcttggccgcctaccacccc541cagcagttcatctacgccggctcgctgtcggccctgctggacccctctcaggggatgggg601cctagcctgatcggcctcgcgatgggtgacgccggcggttacaaggccgcagacatgtgg661ggtccctcgagtgacccggcatgggagcgcaacgaccctacgcagcagatccccaagctg721gtcgcaaacaacacccggctatgggtttattgcgggaacggcaccccgaacgagttgggc781ggtgccaacatacccgccgagttcttggagaacttcgttcgtagcagcaacctgaagttc841caggatgcgtacaacgccgcgggcgggcacaacgcc卿tcaacttcccgcccaacggc901acgcacagctgggagtactggggcgctcagctcaacgccatgaagggtgacctgcagagt961tcgttaggcgccggctgaSEQIDNO:218bpDNA人工合成etacgcageagateccca序列表SEQIDNO:317bpDNA人工合成gcaccgcccaactegttSEQIDNO:425bpDNA人工合成ccgttcccgcaataaacccatagec權(quán)利要求1.一種快速、有效液化痰的方法，根據(jù)該方法配制的液化試劑適用于結(jié)核病等呼吸道疾病的痰樣品前處理，它包括步驟在臨床檢測的痰樣品中直接添加1～5倍體積的液化試劑，旋渦振蕩器上振蕩混勻30s～1min，室溫靜置15～20min，3000g～4000g離心15min，棄上清，沉淀用于下一步的核酸提取。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，根據(jù)所述的方法配制的液化試劑，其成分選自下組0.5P/o的西吡氯銨,1040。/。Na3P04，0.15%的NALC，5500mg/ml的溶菌酶，0.015%的DTT,5500mg/ml的蛋白酶K，140。/。的NaCl，110%擰檬酸三鈉，0.001l%NaN3以及它們的混合物。3.—種結(jié)核分支桿菌復(fù)合體熒光PCR擴增檢測方法，它包括步驟在特異性擴增條件下，在熒光PCR擴增反應(yīng)體系中進行PCR擴增反應(yīng)和實時熒光檢測，檢測的熒光信號強弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比，反應(yīng)結(jié)束以后通過設(shè)定熒光閾值來判定擴增產(chǎn)物是否存在，其特征在于，所述的反應(yīng)體系中含有特異性擴增結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的引物對，還含有結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針。4.一種檢測結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，它具有SEQIDNO:l中連續(xù)的80300個核苷酸。5.如權(quán)利要求3所述的方法，所述的特異性擴增結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的引物對選自下組引物l:5'—CTACGCAGCAGATCCCCA—3，，SEQIDNO:2引物2:5'"GCACCGCCCAACTCGTT—3'SEQIDNO:3引物1序列與SEQ1DNO:l所示的序列相同，引物2與SEQIDNO:l所示的序列互補。6.如權(quán)利要求3所述的方法，所述的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。該探針是T叫man探針，并且可發(fā)出不同波長熒光。7.—種高效檢測臨床樣品中結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法，該方法將權(quán)利要求1所述的方法與權(quán)利要求3所述的方法結(jié)合并貫徹實施，包括以下步驟(1)痰樣品液化；(2)樣品DNA提??；(3)以抽提的DNA為模板，在炎光PCR擴增反應(yīng)液中加入所述的特異性擴增結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的引物對和所述的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體特異性熒光探針，進行熒光PCR擴增反應(yīng)；(4)結(jié)果分析，反應(yīng)結(jié)束以后通過設(shè)定熒光閾值來判定擴增產(chǎn)物是否存在，存在擴增產(chǎn)物就表示樣品中存在結(jié)核分支桿菌復(fù)合體。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于含相同數(shù)量卡介苗菌的模擬臨床痰樣品與卡介苗稀釋菌液經(jīng)痰液化以后作核酸提取和熒光PCR擴增檢測，結(jié)果顯示兩份樣品的Ct值相差小于1，表明雖然痰樣品經(jīng)過液化步驟但是其中結(jié)核分支桿菌DNA沒有損失?？ń槊缬胠ml滅菌雙蒸水溶解，依次作10—\10—2、10-3、10—4、10—5稀釋，10—2、10—3、10—4稀釋的100ul卡介苗菌液添加到lml健康人痰作為模擬臨床樣品，與10—2、10—3、10—4稀釋的100ul卡介苗菌液的檢測結(jié)果對照。全文摘要痰是結(jié)核臨床檢測的主要樣品，但目前使用的痰處理方法在處理過程中不同程度地殺死分支桿菌，造成結(jié)核分支桿菌檢出率嚴(yán)重下降。本發(fā)明首先提供一種快速、有效液化痰的方法，其特征在于操作步驟簡單、液化效果好，其優(yōu)勢是液化過程對痰內(nèi)分支桿菌無殺死作用。本發(fā)明并且提供一種靈敏度高、特異性強的結(jié)核分支桿菌復(fù)合體核酸的檢測方法，根據(jù)結(jié)核分支桿菌復(fù)合體Ag85B基因序列設(shè)計特異性引物和Taqman熒光探針，通過熒光PCR擴增方法檢測Ag85B基因的特異性擴增產(chǎn)物，從而檢測結(jié)核分支桿菌復(fù)合體。本發(fā)明由上述兩項相對獨立又相互關(guān)聯(lián)的發(fā)明所貫徹實施，提供一種高效、快速、靈敏度高、特異性強的檢測臨床樣品中結(jié)核分支桿菌復(fù)合體的方法。文檔編號C12Q1/68GK101191145SQ20061015488公開日2008年6月4日申請日期2006年11月28日優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日發(fā)明者薛樹仁申請人:薛樹仁