專利名稱：含有聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯以及至少一種非離子表面活性劑的佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的佐劑系統(tǒng)，包括與至少一種另外的非離子表面活性劑并用的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯表面活性劑。優(yōu)選所述另外的非離子表面活性劑是辛苯聚糖(Octoxynol)。本發(fā)明提供了所述的新佐劑、包含它們的疫苗、及其制備方法和將其配成疫苗的方法。也提供了本發(fā)明的佐劑或疫苗在預(yù)防或治療疾病中的用途。還提供了一種增強(qiáng)使用本發(fā)明的佐劑和疫苗的宿主免疫反應(yīng)的方法。該佐劑用作粘膜佐劑特別有效，但也對(duì)全身有效。
除了避開了由于“懼針”而注射疼痛及對(duì)患者產(chǎn)生相關(guān)副作用的影響之外，粘膜接種疫苗是有吸引力的，因?yàn)橐呀?jīng)表明對(duì)于動(dòng)物來說，粘膜給予抗原可更高效率促使粘膜表面產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)，而粘膜表面是許多病原體的進(jìn)入通道。此外，已經(jīng)表明粘膜接種疫苗，例如鼻內(nèi)接種，不僅可在鼻粘膜，而且也在遠(yuǎn)處粘膜部位引起粘膜免疫性，如生殖器粘膜(Mestecky，1987，《臨床免疫學(xué)雜志》(Journal of ClinicalImmunology)，7，265-276；McGhee和Kiyono，《傳染性藥劑及疾病》(Infectious Agents and Disease)，1993，2，55-73)。盡管對(duì)這一領(lǐng)域進(jìn)行了許多研究，適合對(duì)人使用的安全和有效的粘膜佐劑仍有待確定。本發(fā)明提供了一個(gè)解決這一問題的方法。
已經(jīng)描述了某些非離子表面活性劑的醫(yī)療用途。例如，已描述了鼻內(nèi)給予聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯以增強(qiáng)鼻腔吸收胰島素(Hirai等1981，《國際藥劑學(xué)雜志》(International Journal of Pharmaceutics)，9，165-172；Hirai等1981，《國際藥劑學(xué)雜志》(International Journal ofPharmaceutics)，9，173-184)。
已有聚氧乙烯烷基醚作為油乳液或丙烯酸聚合物佐劑的成分的描述(JP 05 201877；US 3,919,411)。
其它非離子表面活性劑已經(jīng)被用于疫苗配制劑。例如，包含聚氧乙烯蓖麻油或辛酸/葵酸甘油酯、與聚氧乙烯脫水山梨醇單酯和抗原的混合物的疫苗制劑，在粘膜局部給予之后，能夠引起全身免疫反應(yīng)(WO94/17827)。該專利申請(qǐng)公開了非離子表面活性劑TWEEN20TM(聚氧乙烯脫水山梨醇單酯)和Imwitor742TM(辛酸/葵酸甘油酯)聯(lián)合，或TWEEN20TM和聚氧乙烯蓖麻油聯(lián)合使用在鼻內(nèi)免疫接種后能夠增強(qiáng)全身免疫反應(yīng)。在文獻(xiàn)(Gizurarson等1996《疫苗研究》(Vaccine Research)，5，69-75；Aggerbeck等1997，《疫苗》(Vaccine)，15，307-316；Tebbey等，Viral Immunol 1999；12(1)41-5)中描述了該配制劑針對(duì)鼻內(nèi)給予抗原的免疫反應(yīng)增強(qiáng)作用的詳細(xì)情況。
非離子表面活性劑已經(jīng)以一種方式形成了非離子表面活性劑囊泡(公知的NISV，US 5,679,355)。這種非離子表面活性劑的配制劑，常常在膽固醇存在下，形成雙類脂層囊泡，它在內(nèi)層水相中或雙類脂層本身中殘存抗原。
國際專利申請(qǐng)WO96/36352(US 5,653,987)描述了一種液體藥物制劑，它包含至少兩種吸收增強(qiáng)劑和水，主要為口服胰島素的傳送，其中每次吸收增強(qiáng)劑的量是以總配制劑的1-10％w/w的濃度存在。
表面活性劑常常用于油乳劑佐劑的配制劑全身給予，起穩(wěn)定油液滴的作用。例如，聚氧乙烯脫水山梨醇酯(TWEENTM)和脫水山梨醇脂肪酸酯(SPANTM)用于穩(wěn)定水乳膠中的油(EP 0 399 843 B，WO95/17210)。
本申請(qǐng)人在這里給出驚人的發(fā)現(xiàn)，聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯，與至少一種另外的非離子表面活性劑并用，一起作為有效的疫苗佐劑發(fā)揮作用。有利的是，該組合物可全身給予，但當(dāng)疫苗組合物采用粘膜給予時(shí)，也能有效誘導(dǎo)全身免疫反應(yīng)。本發(fā)明粘膜給予疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能至少與傳統(tǒng)疫苗全身注射后觀察到的免疫反應(yīng)一樣高。
本發(fā)明提供了安全有效的佐劑，它易于生產(chǎn)，并包括至少一種聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯和至少一種另外的非離子表面活性劑。本發(fā)明中使用的表面活性劑可以是水溶液或可形成顆粒結(jié)構(gòu)的懸浮液，如囊泡或膠束(micelle)。優(yōu)選該表面活性劑是水溶液或膠束的形式。
可被配入本發(fā)明的疫苗和佐劑的聚氧乙烯醚或酯包括通式(I)的分子
HO(CH2CH2O)n-A-R其中，n是1-50，A是鍵或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
因而，本發(fā)明的一個(gè)方案包括一種疫苗配制劑，該配制劑包含通式(I)的聚氧乙烯烷基醚，其中n為1至50，優(yōu)選4-24，更優(yōu)選6-12，最優(yōu)選9；成分R是C1-50，優(yōu)選C4-C20烷基，更優(yōu)選C12烷基。聚氧乙烯醚濃度應(yīng)在0.1-20％的范圍，優(yōu)選0.1-10％，更優(yōu)選0.1-1％的范圍。合適的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂酰醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
更優(yōu)選，所述聚氧乙烯烷基醚是聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)。聚氧乙烯月桂基醚的替換術(shù)語或名稱在CAS注冊(cè)中公開。聚氧乙烯-9-月桂基醚的CAS注冊(cè)號(hào)是9002-92-0。聚氧乙烯醚，如聚氧乙烯月桂基醚在《Merck索引》(第12版條目7717，Merck&Co.Inc.，Whitehouse Station，新澤西州，美國；ISBN 0911910-12-3)中公開，所述治療用途包括局部麻醉；止癢；和硬化劑活性。作為一類，這類聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯是非離子表面活性劑。環(huán)氧乙烷與十二烷醇反應(yīng)可形成Laureth 9，平均有9個(gè)環(huán)氧乙烷單位。在一個(gè)實(shí)施例中，使用了一個(gè)這樣的通式(I)的表面活性劑的混合物，本發(fā)明的文章中意指n＝混合物中所有表面活性劑中存在的環(huán)氧乙烷單位的平均數(shù)。
表面活性劑中聚氧乙烯部分的長度與烷基鏈長度的比率(即n烷基鏈長度的比率)，影響這類清潔劑(detergent)在水介質(zhì)中的溶解度。因而，本發(fā)明的佐劑可以是溶液或可以形成微粒結(jié)構(gòu)，如膠囊或囊泡。作為溶液，本發(fā)明的佐劑安全，采用例如通過一層0.22μm膜而易于消毒，給予(administer)簡單，并可以通過簡單方式制造，而無需與均一微粒結(jié)構(gòu)的形成相關(guān)的GMP和QC許可(issue)。一些聚氧乙烯醚，如laureth 9，能夠形成無囊泡溶液。然而，聚氧乙烯-8棕櫚酰醚(C18E8)能夠形成囊泡。因而，尤其期望聚氧乙烯-8棕櫚酰醚的囊泡與至少一種另外的非離子表面活性劑聯(lián)合使用，以形成本發(fā)明的佐劑。
優(yōu)選，本發(fā)明的佐劑化合物中存在的聚氧乙烯烷基醚成分具有溶血活性。聚氧乙烯烷基醚的溶血活性可體外測定，參考下述方法，以不引起紅細(xì)胞溶解的清潔劑(detergent)的最高濃度來表示
1.豚鼠新鮮血液，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在臺(tái)式離心機(jī)中洗滌3次。重新制成懸浮液至初始體積后，用PBS進(jìn)一步稀釋10倍。
2.將50μl該血液懸液加入到800μl含稀釋2倍的清潔劑的PBS中。
3.8小時(shí)后，肉眼或通過測定上清液的光密度評(píng)估溶血作用。出現(xiàn)紅色上清液，在570nm吸收光表明存在溶血。
4.結(jié)果用不再發(fā)生溶血的第一次清潔劑稀釋液的濃度來表示。
該生物學(xué)方法固有的實(shí)驗(yàn)可變性中，本發(fā)明的聚氧乙烯烷基醚或通式(I)的表面活性劑，優(yōu)選具有溶血活性，約0.5-0.0001％之間，更優(yōu)選0.05-0.0001％之間，甚至更優(yōu)選0.005-0.0001％之間，和最優(yōu)選0.003-0.0004％之間。理想地，所述聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯應(yīng)與聚氧乙烯-9月桂基醚或聚氧乙烯-8硬脂酰醚的溶血活性相似(即在10倍差異內(nèi))。
對(duì)于聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯中加入的至少一種另外的非離子表面活性劑，可以是具有合適的表面活性能力的任何清潔劑。合適的清潔劑在“表面活性劑系統(tǒng)”，EdAttwood和Florence(1983，Chapman和Hall)中描述。
優(yōu)選非離子表面活性劑不是落入通式(I)中的那些，如辛苯聚糖(octoxynol)和聚氧乙烯脫水山梨醇酯。尤其優(yōu)選的辛苯聚糖包括Triton X-45，叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)，Triton X-102，Triton X-114，Triton X-165，Triton X-205，Triton X-305，Triton N-57，Triton N-101，Triton N-128。特別優(yōu)選Triton X-100。辛苯聚糖系列，包括叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITONX100TM)在《Merck索引》的條目6858(1162頁，第12版，Merck&Co.Inc.，Whitehouse Station，新澤西州，美國；ISBN 0911910-12-3)中描述。
其它優(yōu)選非離子表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨醇酯，這些酯，包括聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)，在《Merck索引》的條目7742(1308頁，第12版，Merck&Co.Inc.，Whitehouse Station，新澤西州，美國；ISBN 0911910-12-3)中有描述。辛苯聚糖和聚氧乙烯脫水山梨醇酯都可從Sigma Inc.購買。優(yōu)選聚氧乙烯脫水山梨醇酯是聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。
本發(fā)明最優(yōu)選的佐劑包括聚氧乙烯烷基醚和辛苯聚糖，如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)。任選所述混合物可進(jìn)一步包括聚氧乙烯脫水山梨醇酯，如聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。最優(yōu)選，所述聚氧乙烯烷基醚是聚氧乙烯-9-月桂基醚，和所述辛苯聚糖是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITONX100TM)。向這些配制劑中，可加入離子型清潔劑，如膽汁鹽或膽酸的衍生物。
因而，佐劑配制劑可包括聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯(通式I)，辛苯聚糖，任選地包括聚氧乙烯脫水山梨醇酯，和任選地包括膽汁鹽或膽酸衍生物。本配制劑的優(yōu)選方案包括聚氧乙烯-9月桂基醚、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)、聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯和脫氧膽酸鈉。
聚氧乙烯烷基醚或酯，如聚氧乙烯-9月桂基醚，在本發(fā)明佐劑中的典型濃度將在0.001-20％的范圍，優(yōu)選0.001-10％和更優(yōu)選0.001-1％，和最優(yōu)選0.001-0.8％或約0.5％(w/v)。加入其中的另外的非離子表面活性劑不是聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯。每個(gè)另外的非離子表面活性劑典型地將在最終疫苗配制劑中以0.001-20％的濃度存在，更優(yōu)選0.01-10％，最優(yōu)選最多達(dá)約2％(w/v)。若存在兩種所述的另外的非離子表面活性劑，優(yōu)選它們?cè)谧罱K配制劑中以每種最多達(dá)約2％的濃度存在，典型地以每種最多達(dá)約0.6％的濃度存在。若存在3種或更多另外的非離子表面活性劑，它們通常以每種最多達(dá)約1％的濃度存在，典型地每種微量至高達(dá)約0.2％或0.1％。表面活性劑的任何混合物可存在于根據(jù)本發(fā)明的疫苗配制劑中。非離子表面活性劑，如上面討論的那些表面活性劑在最終疫苗組合物中優(yōu)選濃度如下辛-或壬-苯氧基聚氧乙醇(octyl-或nonylphenoxy polyoxyethanols)，如Triton X-100TM或Triton系列中的其它清潔劑從0.001％-20％，優(yōu)選0.001％-10％，更優(yōu)選0.001-1％，最優(yōu)選0.005-0.1％(w/v)；和若存在聚氧乙烯脫水山梨醇酯，如Tween 80TM0.01-1％，更優(yōu)選約0.1％(w/v)。
本發(fā)明的疫苗或佐劑配制劑中清潔劑的總濃度，包括聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯和一種或多種另外的非離子表面活性劑，典型的范圍是0.001-40％，優(yōu)選在0.001至20％之間，更優(yōu)選在0.001至10％之間，仍更優(yōu)選在0.001至1％之間，最優(yōu)選在0.001至0.7％(w/v)之間。
通過粘膜途徑給予本發(fā)明的疫苗制劑，如口腔/頰/腸/陰道/直腸或鼻粘膜途徑，可用于保護(hù)或治療易患病或已患病的哺乳動(dòng)物。這種給藥方式可以是小液滴、噴霧或干粉形式。霧化或煙霧化的疫苗配制劑也構(gòu)成本發(fā)明的一部分?？诜o藥的腸道制劑如抗胃膠囊(gastroresistant capsule)和粒劑、直腸或陰道給藥的栓劑也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明也可用于增強(qiáng)應(yīng)用于皮膚(經(jīng)皮或皮下傳輸)的抗原的免疫原性。另外，本發(fā)明的佐劑可經(jīng)非腸道途徑給予，例如肌內(nèi)或皮下給藥。當(dāng)用于鼻內(nèi)接種時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的疫苗的性質(zhì)是溶血性的。
根據(jù)給藥途徑，可使用多種給藥裝置。例如，鼻內(nèi)給藥使用的噴霧裝置，如可使用商售的AccusprayTM(Becton Dickinson)。
優(yōu)選鼻內(nèi)給藥的噴霧裝置是其性能不依賴于使用者施加的壓力的裝置。已知的這些裝置是有壓力極限的裝置。只有當(dāng)達(dá)到壓力極限時(shí)，液體才從噴嘴流出。這些裝置更易于形成小液滴液量規(guī)整的噴霧。本發(fā)明適用的有壓力極限的裝置是現(xiàn)有技術(shù)已知的，例如在WO91/13281和EP311 863B中有述。這種裝置可從Pfeiffer GmbH購買到。
優(yōu)選鼻內(nèi)裝置產(chǎn)生的小液滴(用水做液體來測定)范圍在1至200μm，優(yōu)選10至120μm。小于10μm有被吸入的危險(xiǎn)，因此小于10μm的小液滴最好不超過大約5％。120μm以上的小液滴不能象較小的小液滴一樣很好地?cái)U(kuò)散，因此超過120μm的小液滴最好不超過大約5％。
雙劑量傳輸(bi-dose delivery)是用于本發(fā)明疫苗的鼻內(nèi)傳輸裝置的進(jìn)一步優(yōu)選特征。雙劑量裝置含有一個(gè)疫苗劑量的兩個(gè)亞劑量(subdose)，一個(gè)亞劑量給予一個(gè)鼻孔。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)試劑盒(kit)，包括此處所述的含有本發(fā)明疫苗配制劑的鼻內(nèi)給藥裝置。
對(duì)于某些疫苗配制劑，可包括其它疫苗成分。同樣本發(fā)明的佐劑配制劑也可包括膽汁酸和膽酸的衍生物。優(yōu)選膽酸衍生物是其鹽，更優(yōu)選是其鈉鹽。膽汁酸及其衍生物的實(shí)例包括膽酸本身，脫氧膽酸、?；敲撗跄懰?鹽)、鵝脫氧膽酸、石膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸和前述膽汁酸的甘油-、?；?、氨基丙基-1-丙磺-、氨基丙基-2-羥基-1-丙磺-衍生物，或N，N-雙(3D葡糖酸氨基丙基)脫氧膽胺。特別優(yōu)選的實(shí)例是可存在于最終疫苗制劑中的脫氧膽酸鈉(NaDOC)。
優(yōu)選，當(dāng)本發(fā)明的佐劑配制劑是水溶液形式或無泡(non-vesicular)的懸浮液形式時(shí)，具有優(yōu)越性。這種配制劑易于重復(fù)制造，也易于消毒(通過具有450或220nm孔徑的膜終端過濾)并且易于以噴霧形式經(jīng)鼻粘膜給藥，同時(shí)佐劑的復(fù)雜物理結(jié)構(gòu)不發(fā)生降解。聚氧乙烯-9月桂基醚與TRITON-X 100TM聯(lián)用配成水溶液(也可存在小微團(tuán))。
本發(fā)明的一個(gè)方案，提供了一種誘發(fā)(inducing)或增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)的方法，包括將抗原與本發(fā)明的佐劑混合，并給宿主施用所述混合物。優(yōu)選，所述宿主的給藥途徑是通過粘膜表面，更優(yōu)選通過鼻粘膜。當(dāng)通過鼻粘膜給予混合物時(shí)，優(yōu)選混合物以噴霧形式給予。在一個(gè)優(yōu)選的誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法中，通過鼻內(nèi)給予本發(fā)明的疫苗來誘導(dǎo)全身免疫反應(yīng)。優(yōu)選增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法可以使用疫苗的初次劑量或加強(qiáng)劑量，并優(yōu)選該疫苗包含流感抗原或抗原制劑(antigenic preparation)。在這些方法中，鼻粘膜給藥的優(yōu)選佐劑配制劑是聚氧乙烯烷基醚和辛苯聚糖聯(lián)合使用，例如優(yōu)選聚氧乙烯-9月桂基醚和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)聯(lián)合，任選所述佐劑聯(lián)合劑中額外包括聚氧乙烯脫水山梨醇酯(例如一油酸酯，TWEEN 80TM)和/或膽汁鹽或膽酸衍生物，如脫氧膽酸鈉。
預(yù)知本發(fā)明的組合物可用于配制含有多種廣泛來源的抗原的疫苗。例如，抗原可包括人、細(xì)菌或病毒核酸、病原體衍生的抗原或抗原制劑、腫瘤衍生的抗原或抗原制劑，包括GnRH和IgE肽、重組產(chǎn)生的蛋白或肽和嵌合融合蛋白。
優(yōu)選本發(fā)明的疫苗配制劑含有一種能引起抗人病原體(humanpathogen)的免疫反應(yīng)的抗原或抗原組合物，該抗原或抗原組合物衍生自HIV-1、(如tat，nef，gp120或gp160)，人皰疹病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白如來自HSV1或HSV2的ICP27、巨細(xì)胞病毒((尤其是人巨細(xì)胞病毒)(如gB或其衍生物)、輪狀病毒(包括活性減毒病毒)、EB病毒(如gp350或其衍生物)、水痘帶狀皰疹病毒(Varicella Zoster Virus)(如gpI、II和IE63)、或來自肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或來自其它病毒病原體，如副粘病毒呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6，11，16，18，..)、黃病毒屬(如黃熱病毒、登革熱病毒、蜱媒腦炎病毒、日本腦炎病毒)或生長在卵或MDCK細(xì)胞中的流感病毒(活性完整(whole)或滅活病毒、分裂流感病毒(split influenza virus)、或Vero細(xì)胞或完整(whole)流感病毒顆粒(whole flu virosomes) (如R.Gluck，《疫苗》(Vaccine)，1992，10，915-920中描述)或純化的或其重組蛋白，如HA，NP，NA，或M蛋白，或它們的混合物(combination))、或來自細(xì)菌病原體如奈瑟菌屬，包括淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌(例如膠囊多糖及其共軛物(conjugate)、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、PilC、粘附素)；釀膿鏈球菌(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸質(zhì))、無乳鏈球菌、變異鏈球菌；杜克氏嗜血桿菌；莫拉氏菌屬，包括卡他莫拉氏菌，也包括已知的卡他布蘭漢氏菌(例如高和低分子量的粘附素和透明質(zhì)酸酶)；博德特氏菌屬，包括百日咳博德特氏菌(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素、腺苷酸環(huán)化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌和支氣管炎博德特氏菌；分枝桿菌屬，包括結(jié)核分枝桿菌(例如ESAT6、Antigen 85A，-B or-C抗原)、牛分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌；軍團(tuán)菌屬，包括嗜肺軍團(tuán)菌；埃希氏菌屬，包括產(chǎn)腸毒性大腸桿菌(例如定居因子、熱不穩(wěn)定毒素或其衍生物、熱穩(wěn)定毒素或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀菌毒素樣毒素或其衍生物)；弧菌屬，包括霍亂弧菌(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌屬，包括宋內(nèi)氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌；耶爾森氏菌屬，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(例如Yop蛋白)，鼠疫耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌；彎曲桿菌屬，包括空腸彎曲桿菌(例如毒素、粘附素和透明質(zhì)酸酶)和大腸彎曲桿菌；沙門氏菌屬，包括傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌；李斯忒氏菌屬，包括單核細(xì)胞增生李斯忒氏菌；螺桿菌屬，包括幽門螺旋桿菌(例如尿素酶、過氧化氫酶、空泡毒素)；假單胞菌屬，包括銅綠假單胞菌；葡萄球菌屬，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；腸球菌屬，包括糞腸球菌、屎腸球菌；梭菌屬，包括破傷風(fēng)梭菌(例如破傷風(fēng)毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(例如肉毒素及其衍生物)，艱難梭菌(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢桿菌屬，包括炭疽芽孢桿菌(例如肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)和其衍生物)；棒狀桿菌屬，包括白喉?xiàng)U菌(例如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋體屬，包括布氏疏螺旋體(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、嘎氏疏螺旋體(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、阿氏疏螺旋體(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、B.andersonii(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、赫氏蜱疏螺旋體；埃里希氏體屬，包括馬埃里希氏體和人顆粒細(xì)胞性埃里希氏病的病原體；立克次體屬，包括立氏立克次體；衣原體屬，包括砂眼衣原體(例如MOMP，肝磷脂結(jié)合蛋白)、肺炎衣原體(例如MOMP，肝素結(jié)合蛋白)，鸚鵡熱衣原體；鉤端螺旋體屬，包括問號(hào)鉤端螺旋體；密螺旋體屬，包括蒼白密螺旋體(例如稀有外膜蛋白、齒垢密螺旋體、豬痢疾密螺旋體；或來自寄生蟲，例如瘧原蟲屬，包括惡性瘧原蟲；弓形蟲屬，包括鼠弓形蟲(例如SAG2，SAG3，Tg34)；內(nèi)阿米巴屬，包括溶組織內(nèi)阿米巴；巴貝蟲屬，包括田鼠巴貝蟲；錐蟲屬，包括克氏錐蟲；賈第鞭毛蟲屬，包括藍(lán)氏賈第鞭毛蟲；利什曼蟲屬，包括大型利什曼蟲；肺囊蟲屬，包括卡氏肺囊蟲；毛滴蟲屬，包括陰道毛滴蟲；血吸蟲屬，包括曼氏血吸蟲；或來自酵母，例如念珠菌屬，包括白色念珠菌；隱球菌屬，包括新型隱球菌(C.neoformans)。
優(yōu)選細(xì)菌疫苗包括來自鏈球菌屬，包括肺炎鏈球菌(例如膠囊多糖和其共軛物、PsaA，PspA，鏈球菌溶血素、膽堿結(jié)合蛋白)和肺炎球菌溶血素蛋白抗原(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，《微生物病理》(Microbial Pathogenesis)，25，337-342)，和其突變解毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它優(yōu)選細(xì)菌疫苗包括來自嗜血菌屬，包括B型模式種流感嗜血菌(例如PRP及其耦合物)、非成型(nontypeable)流感嗜血菌，例如OMP26的抗原、高分子量粘附素(adhesins)、P5、P6、D蛋白和脂蛋白D、和肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白衍生肽(US 5,843,464)或其多拷貝變異體或融合蛋白。其它優(yōu)選細(xì)菌疫苗包括來自卡他莫拉氏菌(包括其外膜囊泡，和OMP106(WO 97/41731))和來自B型腦膜炎奈瑟氏球菌(包括其外膜囊泡，和NspA(WO96/29412))的抗原。
乙型肝炎表面抗原衍生物是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的，并包括其它的在歐洲專利申請(qǐng)EP-A-414 374；EP-A-0304 578和EP 198-474中提出的那些PreSl，PreS2 S抗原。在一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明的疫苗配制劑包括HIV-1抗原、gp120，尤其是當(dāng)它們?cè)贑HO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)。在進(jìn)一步的方案中，本發(fā)明的疫苗配制劑包括如上文定義的gD2t。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，疫苗含有權(quán)利要求的佐劑，包括來自被認(rèn)為是造成生殖器瘤的原因的人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原，(HPV6或HPV 11和其它)，和HPV病毒是形成子宮頸癌的原因(HPV16，HPV 18和其它)。
特別優(yōu)選的生殖器瘤預(yù)防或治療疫苗形式包括L1微?；驓ち?，以及優(yōu)選的融合蛋白形式，其包括一種或多種選自HPV6和HPV11蛋白E6、E7、L1和L2的抗原。
最優(yōu)選的融合蛋白形式是WO96/26277中公開的L2E7和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中公開的D(1/3)-E7蛋白。
優(yōu)選的用于預(yù)防或治療HPV子宮頸感染或HPV子宮頸癌的疫苗，其組分可包括HPV16或18抗原。例如，L1或L2抗原單體、或L1或L2抗原作為一種病毒樣微粒(VLP)同時(shí)出現(xiàn)，或單獨(dú)L1蛋白在VLP或衣殼粒結(jié)構(gòu)中單獨(dú)出現(xiàn)。這種抗原、病毒樣微粒和衣殼粒本身是已知的。例如參見WO94/00152，WO94/20137，WO94/05792和WO93/02184。
另外的早期蛋白，例如優(yōu)選的E7、E2或E5可單獨(dú)或作為融合蛋白被包括；特別優(yōu)選方案包括包含有L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。
特別優(yōu)選的HPV 16抗原包含與D蛋白載體融合的早期蛋白E6或E7以形成來自HPV16的蛋白D-E6或E7融合蛋白，或它們的混合物(combination)；或E6或E7與L2的混合物(WO 96/26277)。
或者，HPV 16或18早期蛋白E6和E7，可存在于一個(gè)單個(gè)分子中，優(yōu)選蛋白D-E6/E7融合。這種疫苗可任選地包括來自HPV 18的E6或E7蛋白二者之一或二者均有，優(yōu)選蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。
本發(fā)明的疫苗還可包括來自其它HPV株的抗原，優(yōu)選來自HPV6，11，31，33或45株的抗原。
本發(fā)明的疫苗進(jìn)一步包括來自可引起瘧疾的寄生蟲抗原。例如，優(yōu)選抗原來自惡性瘧原蟲，包括RTS，S和TRAP。RTS是一種雜交蛋白，包括惡性瘧原蟲的環(huán)狀子孢子(CS)蛋白的基本上所有C-末端部分，其通過乙型肝炎表面抗原的PreS2部分的四個(gè)氨基酸，與乙型肝炎病毒的表面(S)抗原連接。在國際專利申請(qǐng)PCT/EP92/02591中公開了它的全部結(jié)構(gòu)，公開號(hào)WO93/10152，權(quán)利要求優(yōu)先權(quán)是英國專利申請(qǐng)No.9124390.7。當(dāng)它在酵母中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生脂蛋白顆粒RTS，當(dāng)它與HBV的S抗原協(xié)同表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生已知的混合微粒RTS，S。TRAP抗原在國際專利申請(qǐng)No.PCT/GB89/00895中有描述，其公開號(hào)為WO90/01496。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案是瘧疾疫苗，其中抗原制劑包括RTS，S和TRAP抗原的混合物?？赡茏鳛楦麟A段瘧疾疫苗候選成分的其它瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲MSP1，AMA1，MSP3，EBA，GLURP，RAP1，RAP2，鉗合蛋白，PfEMP1，Pf332，LSA1，LSA3，STARP，SALSA，PfEXPl，Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfs16，Pfs48/45，Pfs230及其瘧原蟲屬的類似物。
本配制劑也可含有一種抗腫瘤抗原，并可用于免疫治療法治療癌癥。例如，發(fā)現(xiàn)佐劑配制劑可與腫瘤排斥抗原合用，如前列腺、胸部、結(jié)腸直腸、肺、胰腺、腎或黑色素瘤癌癥的排斥抗原。實(shí)例抗原包括用于治療黑色素瘤的MAGE 1和MAGE 3或其它MAGE抗原，PRAME，BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，《免疫學(xué)中的最新見解》(Current Opinions in Immunology)8，628-636頁；Van denEynde等人，《臨床和實(shí)驗(yàn)室研究的國際雜志》(International Journalof Clinical&Laboratory Research)(發(fā)表于1997)；Correale等人(1997)，《全國癌癥協(xié)會(huì)雜志》(Journal of the National CancerInstitute)89，293頁。事實(shí)上，在廣范圍的腫瘤類型中都能表達(dá)這些抗原，例如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。其它腫瘤特異性抗原適于與本發(fā)明的佐劑一同使用，包括但不限于前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu，KSA(GA733)，MUC-1和癌胚抗原(CEA)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方案，提供了一種疫苗，包括一種根據(jù)本發(fā)明的佐劑組合物和一種腫瘤排斥抗原。
另外的所述的抗原還可以是自身肽激素，如全長促性腺激素釋放激素(GnRH，WO 95/20600)，它是長為10個(gè)氨基酸的短肽，可用于治療許多癌癥，或應(yīng)用于免疫切除。
能預(yù)知本發(fā)明的組合物可用于配制含有來自疏螺旋體屬的抗原的疫苗。例如，抗原可包括核酸、病原體衍生的抗原或抗原制劑、重組產(chǎn)生的蛋白或肽和嵌合融合蛋白。特別地該抗原是OspA。OspA可以是宿主細(xì)胞(大腸桿菌(E.Coli))定義的完整成熟蛋白(full matureprotein)的脂化形式(Lipo-OspA)或非脂化衍生物。這種非脂化衍生物包括非脂化NS1-OspA融合蛋白，它具有流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)的前81個(gè)N端氨基酸，和完全OspA蛋白；以及另一種，MDP-OspA是OspA的非脂化形式，帶有3個(gè)另外的N端氨基酸。
本發(fā)明的疫苗可用于過敏的預(yù)防或治療。這種疫苗可包括過敏原特異性抗原(例如Der p1)和過敏原非特異性抗原(例如來自人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP 0 477 231 B1))。
本發(fā)明最優(yōu)選的疫苗和誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，包括流感病毒抗原。滅活流感病毒制劑可由常規(guī)含胚卵方法得到，或可通過任何一種用組織培養(yǎng)使病毒生長的新傳代方法(new generation method)得到。用于使病毒生長的合適細(xì)胞底物包括，比如狗腎細(xì)胞，如MDCK或來自MDCK的克隆的細(xì)胞、MDCK樣細(xì)胞、猴腎細(xì)胞，如AGMK細(xì)胞，包括非洲綠猴腎細(xì)胞、或其它任何適于產(chǎn)生用于制備疫苗目的的流感病毒的細(xì)胞類型。合適的細(xì)胞底物包括人細(xì)胞，如MRC-5細(xì)胞。合適的細(xì)胞底物不限于細(xì)胞系；例如原代細(xì)胞，比如雞胚成纖維細(xì)胞也可包括在內(nèi)。流感病毒抗原制劑可通過大量商售的處理方法中任何一種而得到，如專利DD 300 833中描述的分裂流感抗原處理方法?？少徺I得到的分裂流感包括SmithKline Beecham銷售的FluarixTM，同樣Fluarix與本發(fā)明的佐劑聯(lián)合使用構(gòu)成本發(fā)明優(yōu)選的疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的流感疫苗優(yōu)選一種多價(jià)流感疫苗，包括兩種或更多流感株。更優(yōu)選它是一種包含3株的三價(jià)疫苗。傳統(tǒng)流感疫苗通常包括流感的三種株，兩個(gè)A株和一個(gè)B株。然而，本發(fā)明并不排斥例如可能對(duì)流行情況有益的單價(jià)疫苗。一種單價(jià)大流行性流感疫苗將很可能含有來自單一A株的流感抗原。
因此，一種優(yōu)選的疫苗配制劑包括卵或組織培養(yǎng)流感抗原，優(yōu)選分裂流感抗原，一種聚氧乙烯烷基醚和至少一種另外的非離子表面活性劑，可視需要地包括膽汁鹽或膽酸的衍生物。這種疫苗的優(yōu)選方案包括分裂流感病毒抗原、聚氧乙烯-9月桂基醚和TRITON-X 100TM。任選地，這種最優(yōu)選的疫苗可進(jìn)一步包括一種聚氧乙烯脫水山梨醇酯，如TWEEN80TM和/或脫氧膽酸鈉。
每種疫苗劑量中的蛋白量被選定為能夠誘發(fā)免疫保護(hù)性反應(yīng)而在典型疫苗中不產(chǎn)生明顯的不利副作用的劑量。這一劑量會(huì)隨著使用的特異性免疫原及其如何產(chǎn)生(presented)而變化。一般來說，期望每一劑量包括1-1000μg蛋白，優(yōu)選1-500μg，優(yōu)選1-100μg，最優(yōu)選1-50μg。一個(gè)特定疫苗的最佳劑量可以通過標(biāo)準(zhǔn)研究確定，包括觀察受試者相稱的免疫反應(yīng)。初次疫苗接種后，受試者可接受一個(gè)和幾個(gè)充分間隔開的加強(qiáng)免疫接種。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案是通過另外的非離子表面活性劑能協(xié)同增強(qiáng)聚氧乙烯烷基醚的佐劑作用。在這點(diǎn)上，從聯(lián)用混合的佐劑配制劑產(chǎn)生的免疫反應(yīng)程度高于每一成分單獨(dú)使用時(shí)各自所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)之和，即可觀察到協(xié)同作用。另一情況，當(dāng)?shù)蛣┝康木垩跻蚁┟押土硗獾姆请x子表面活性劑產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，而甚至當(dāng)單獨(dú)使用一種或每個(gè)成分都不能產(chǎn)生明顯或可檢測到的免疫反應(yīng)時(shí)，也可觀察到協(xié)同作用。
本發(fā)明的一個(gè)方案是佐劑和疫苗配制劑，其包含聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯和至少一種另外的非離子表面活性劑，其中疫苗中存在的抗原不包載在非離子表面活性劑泡囊之內(nèi)。
本發(fā)明的疫苗也可通過口服途徑給予。在這種情況下，藥學(xué)上可接受的賦形劑也可包括堿性緩沖液或腸溶包被或微粒。本發(fā)明的疫苗也可通過陰道途徑給予。在這種情況下，藥學(xué)上可接受的賦形劑也可包括陰道霜?jiǎng)┖退▌┑娜榛瘎?、聚合物如CARBOPOL_，和其它已知的穩(wěn)定劑。本發(fā)明的疫苗也可通過直腸途徑給予。在這種情況下，藥學(xué)上可接受的賦形劑也可包括現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于形成直腸栓劑的蠟和聚合物。
本發(fā)明的配制劑可用于預(yù)防和治療目的。因此，本發(fā)明提供了一種治療哺乳動(dòng)物感染性疾病或癌癥、或過敏、或自身免疫性疾病的方法，或治療這些疾病的易感性的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步方案提供了一種佐劑混合物(adjuvant combination)和此處所述的用于藥物的疫苗。疫苗的制備通常在《疫苗的新趨勢及進(jìn)展》(New Trends and Developments inVaccines)，Voller等編，University Park出版，巴爾的摩，馬里蘭州，美國，1978中有述。
本發(fā)明的一個(gè)方案涉及非離子表面活性劑例如通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯和辛苯聚糖在制備佐劑配制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯、辛苯聚糖和抗原在制備疫苗配制劑中的應(yīng)用。如所述方法制備的所述佐劑和疫苗可視需要進(jìn)一步包括聚氧乙烯脫水山梨醇酯。在本發(fā)明的所有這些方案中，優(yōu)選聚氧乙烯烷基醚是聚氧乙烯-9月桂基醚，優(yōu)選的辛苯聚糖是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100TM)。
在本發(fā)明一個(gè)可選擇的相關(guān)方案中，本發(fā)明的佐劑可進(jìn)一步與其它佐劑聯(lián)合使用，包括霍亂菌毒素及其B亞單位、大腸桿菌熱不穩(wěn)定的腸毒素LT及其B亞單位LTB、和它們的解毒型如mLT；單磷酸類脂A(Monophosphoryl Lipid A)和其非毒性衍生物3-O-脫酰單磷酸類脂A(3D-MPL，在英國專利GB 2,220,211中有描述)、免疫學(xué)活性皂苷片段，如來自南美Quillaja Saponaria Molina樹的樹皮的Quil A及其衍生物(例如QS21，US專利5,057,540)，和寡核苷酸(oligonucleotide)佐劑系統(tǒng)CpG(如WO 96/02555中描述)，尤其是5’TCG TCG TTT TGT CGTTTT GTC GTT3’(SEQ ID NO.1)。
在本技術(shù)方案中，特別優(yōu)選聚氧乙烯烷基醚(如聚氧乙烯-9月桂基醚)、另外的非離子表面活性劑(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100TM)和3-O-脫酰單磷酸類脂A(3D-MPL)的佐劑混合物。該優(yōu)選方案可進(jìn)一步視需要地包括聚氧乙烯脫水山梨醇酯如TWEEN80TM，和/或膽汁鹽或膽酸衍生物如脫氧膽酸鈉。特別優(yōu)選包括該佐劑配制劑和流感抗原、尤其是分裂流感抗原的疫苗。
下列實(shí)施例用于解釋但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1，用于檢測血清(sera)中抗體(Ab)反應(yīng)的方法ELISA(酶脫免疫吸附測定)測定猴流感-特異性血清Ig Abs用PBS稀釋?duì)?丙酸內(nèi)酯(BPL)滅活流感病毒(由SSD GmBH廠家，Dresden，德國提供)1μg/ml HA，50μl/孔(μl/well)來包被MaxisorpNunc免疫平板(immunoplate)，在4℃下過夜。平板中的空位點(diǎn)用飽和緩沖液PBS含1％BSA、0.1％聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(TWEEN 20)填封(1小時(shí)，37℃)。接著，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線加入的參考血清的連續(xù)的2倍稀釋液(在飽和緩沖液中，50μl/孔)(具有中點(diǎn)滴定度(titer)的血清用ELISA單位/ml表示，被列入A行)和血清樣本(從1/100稀釋度開始并被列入B到H行)，37℃培養(yǎng)1小時(shí)30分鐘。接著用洗滌緩沖液(PBS，0.1％聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(TWEEN 20))洗滌(×3)平板。然后，在飽和緩沖液將生物素化山羊抗-人Ig(goat anti-human Ig)(Amersham)稀釋到1/3000，37℃培養(yǎng)(50μl/孔)1小時(shí)30分鐘。沖洗3次，隨后添加抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶結(jié)合物(Amersham)，洗滌平板5次并用50μl/孔的指示緩沖液(revelation buffer)(OPDA 0.4mg/ml(Sigma)和H2O20.03％在50mM pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液中)在室溫下培養(yǎng)20分鐘。加入50μl/孔H2SO42N，終止指示。用Biorad 3550免疫閱讀器(immunoreader)在492和630nm得到光學(xué)密度讀數(shù)。用SoftMaxPro軟件的4參數(shù)數(shù)學(xué)方法計(jì)算抗體滴定度。
猴流感-特異性血清Abs的血細(xì)胞凝集抑制(HAI)活性為了消除靈長類動(dòng)物血清中的血細(xì)胞凝集的非特異性抑制作用，這些(25μl)用100μl氯化(chlorure)鈣/硼酸鈣/硼酸鈉混合溶液在37℃培養(yǎng)過夜，所述混合溶液每ml霍亂弧菌神經(jīng)氨酸酶(BoerhingerMannheim)含有400受體破壞酶單位。加入2.5％檸檬酸鈉溶液75μl后，在56℃加熱血清30分鐘。加入50μl PBS溶液將血清最后稀釋到1/10th。接著，在96孔Greiner平板上用25μl PBS(從1/10開始，連續(xù)2倍稀釋)稀釋25μl處理過的血清。在室溫(RT)和攪拌下用30分鐘以4血細(xì)胞凝集單位濃度(即比激發(fā)紅細(xì)胞凝集的最后一次低4倍的稀釋度)加入BPL滅活完整病毒(25μl/孔)。接著在RT下用1小時(shí)加入雞紅細(xì)胞(25μl/孔)。最后平板在4℃下保存過夜再讀數(shù)。HAI滴定度相當(dāng)于抑制病毒誘導(dǎo)的血細(xì)胞凝集的最后血清稀釋度的倒數(shù)。
ELISA測定小鼠破傷風(fēng)類毒素(TT)特異性血清IgG用在PBS中(在平板的B至H行)稀釋的1μg/ml抗原(Behring提供的TT)的50μl/孔來包被Maxisorp Nunc免疫平板，或用在PBS(A行)中5μg/ml純化的山羊抗-小鼠(goat anti-mouse)Ig(Boerhinger)的50μl包被平板，在4℃下過夜。平板中的空位點(diǎn)用飽和緩沖液PBS(含1％BSA、0.1％聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(TWEEN 20)和4％標(biāo)準(zhǔn)小牛血清(NBS))填封(1小時(shí)，37℃)。接著，加入作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的IgG同型(isotype)混合物的連續(xù)2倍稀釋液(在飽和緩沖液中，50μl/孔)(使用Sigma的小鼠單克隆抗體IgG1、IgG2a和IgG2b的混合物，從200ng/ml開始并被列入A行)和血清樣本(從1/100稀釋度開始并被列入B到H行)，在37℃培養(yǎng)1小時(shí)30分鐘。接著用洗滌緩沖液(PBS，0.1％聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(TWEEN 20))洗滌(×3)平板。然后，在飽和緩沖液中稀釋到1/5000中的生物素化山羊抗-小鼠IgG(Amersham)，在37℃培養(yǎng)(50μl/孔)1小時(shí)30分鐘。沖洗3次，隨后添加抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶結(jié)合物(Amersham)，洗滌平板5次并用50μl/孔的指示緩沖液(OPDA 0.4 mg/ml(Sigma)和H2O20.03％在50mM pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液中)在室溫下培養(yǎng)20分鐘。加入50μl/孔H2SO42N，終止指示。用Biorad 3550免疫閱讀器在492和630nm處得到光密度讀數(shù)。用SoftMaxPro軟件的4參數(shù)數(shù)學(xué)方法計(jì)算抗體滴定度。
實(shí)施例2，laureth9與TWEEN80和TritonX100的聯(lián)合使用共同對(duì)已接觸抗原的恒河猴鼻內(nèi)流感疫苗的免疫原性的影響用噴霧裝置(麻醉下)給恒河猴每個(gè)鼻孔灌注含在100μl PBS中的每株β-丙酸內(nèi)酯滅活的A/北京/262/95和B/哈爾濱/7/94流感病毒25μgHA。28天后，用200μl溶液(每個(gè)鼻孔100μl，用噴霧裝置輸送)給猴子(4或5只/組)鼻內(nèi)(麻醉下)加強(qiáng)劑量，溶液在A聚氧乙烯-9-月桂基醚0.5％(L9)中；或在B聚氧乙烯-9-月桂基醚0.5％+TWEEN80(0.11％)+triton-X-100(0.074％)中含有30μg HA/BPL-滅活A(yù)/北京/262/95和B/哈爾濱/7/94流感病毒株；或通過C肌內(nèi)注射15μgHA/流感疫苗株，疫苗株含有與A和B相同的株。病毒抗原在由廠商(SSD GmBH，Dresden，德國)提供的種子庫的卵中生長。如實(shí)施例1所述測定血清中HAI和IgAb反應(yīng)。結(jié)果用加強(qiáng)免疫后提高4倍Ab的動(dòng)物所占的百分比來表示。
以往用0.5％聚氧乙烯-9-月桂基醚的經(jīng)驗(yàn)表明該配制劑對(duì)誘導(dǎo)抗流感全身免疫反應(yīng)有效。然而，如表1所示，通過添加另外的非離子表面活性劑可顯著改善佐劑輔助性(adjuvanticity)水平。這樣當(dāng)用TWEEN80和triton-X-100補(bǔ)充聚氧乙烯-9-月桂基醚時(shí)，該配制劑能夠象經(jīng)典非腸道途徑流感疫苗一樣有效地增強(qiáng)預(yù)先已建立的全身性IgAb反應(yīng)。
還測定血細(xì)胞凝集抑制(HAI)反應(yīng)(表2)，再一次，最好的鼻內(nèi)配制劑仍然是補(bǔ)充了TWEEN80和triton-X-100的聚氧乙烯-9-月桂基醚。該配制劑與傳統(tǒng)非腸道途徑疫苗的免疫原性相同。
表1，猴血清Ig反應(yīng)
表2，猴血清HAI滴定度
實(shí)施例3比較用laureth9加TWEEN80和triton-X-100配制成的鼻內(nèi)給予分裂流感疫苗與已被批準(zhǔn)使用的傳統(tǒng)非腸道途徑疫苗(FluarixTM)對(duì)健康成年受試者的免疫原性。
評(píng)估用laureth 9加TWEEN80和triton-X-100(A)配制的卵源分裂流感抗原的鼻內(nèi)配制劑，并與FluarixTM/α-Rix_(B)進(jìn)行比較。含有三種滅活分裂病毒抗原的配制劑由1998/1999季W(wǎng)HO推薦株制備。用于施與疫苗的裝置是來自Becton Dickinson的AccusprayTM鼻內(nèi)注射器，該裝置與傳統(tǒng)注射器工作原理類似，但具有一個(gè)含螺旋形通道的特殊針尖，當(dāng)給活塞施加壓力時(shí)，它可以產(chǎn)生噴霧。每個(gè)鼻孔被噴入100μl配制劑。
配制劑的成分鼻內(nèi)配制劑(A)含有下列滅活分裂病毒體1.30μg HA A/北京/262/95(HlNl)2.30μg HA A/悉尼/5/97(H3N2)3.30μg HA B/哈爾濱/7/94和磷酸鹽緩沖生理鹽水pH7.4±0.1、0.1％TWEEN80、0.015％Triton-X-100、0.0045％脫氧膽酸鈉和低于35μg/ml的乙基汞硫代水楊酸鈉。
一個(gè)制劑的體積是200μl(每個(gè)鼻孔100μl亞劑量)。
配制劑A中輔助入佐劑laureth 9以使終濃度達(dá)到0.5％(w/v)。
對(duì)比物FluarixTM/α-Rix_(B)是SmithKlineBeecham Biologicals的商售滅活三價(jià)分裂流感疫苗，肌內(nèi)給藥，劑量是500μl。
免疫原性研究用開放、對(duì)照和隨機(jī)化研究評(píng)價(jià)鼻內(nèi)分裂流感疫苗的免疫原性，該疫苗是由補(bǔ)充了TWEEN80和triton-X-100的laureth 9配制而成，并與傳統(tǒng)非腸道途徑疫苗(即FluarixTM)相比較。20個(gè)健康成年受試者(年齡18-40歲)接受一個(gè)劑量的FluarixTM，10個(gè)受試者接受一個(gè)劑量(兩個(gè)亞劑量，每個(gè)鼻孔一個(gè)亞劑量)的鼻內(nèi)流感疫苗。
連續(xù)8天以求得產(chǎn)生局部和全身癥狀，關(guān)于安全性和反應(yīng)原性，兩種疫苗都能被很好忍受。沒有報(bào)道與接種疫苗相關(guān)的嚴(yán)重副作用。
疫苗的免疫原性測定是通過評(píng)估血清血細(xì)胞凝集抑制(HI)滴定度來確定血清轉(zhuǎn)化率(對(duì)于每一疫苗株，其定義是與第0天相比，第21天血清HI滴定度至少增加到4倍的疫苗所占百分比)、轉(zhuǎn)化因數(shù)(對(duì)于每一疫苗株，其定義是與第0天相比，第21天的血清HI幾何均數(shù)滴定度(GMT)增加到倍數(shù))和血清保護(hù)率(其定義是，免疫接種后(對(duì)于每一疫苗株)血清HI滴定度≥40的疫苗所占百分比，接受其作為保護(hù)的指示)。另外，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定粘膜IgA抗體反應(yīng)。
接種一個(gè)劑量的FluarixTM或鼻內(nèi)配制劑后21天，HI血清陽性、血清轉(zhuǎn)化和血清保護(hù)率可見表3。
表3接種一個(gè)劑量后21天HI血清陽性、血清轉(zhuǎn)化和血清保護(hù)率
血清陽性(n，％)滴定度≥10的受試者數(shù)量和百分比血清保護(hù)(n，％)滴定度≥40的受試者數(shù)量和百分比血清轉(zhuǎn)化(n，％)從0到21天滴定度增加到至少4倍的受試者數(shù)量和百分比表4可見，在21天和0天之間(1個(gè)劑量)，特異性/總粘膜IgA抗體比率增加到2倍或4倍的受試者所占百分比。
表4在21天和0天之間(1個(gè)劑量)，特異性/總IgA比率增加到2倍或4倍的受試者所占百分比
總結(jié)上面制表中的免疫原性結(jié)果表明給予一個(gè)劑量的鼻內(nèi)配制劑與傳統(tǒng)非腸道途徑疫苗(FluarixTM)后21天，產(chǎn)生的血清陽性、血清轉(zhuǎn)化和血清保護(hù)水平相似。一個(gè)劑量之后，鼻內(nèi)配制劑通常比傳統(tǒng)非腸道途徑疫苗(FluarixTM)產(chǎn)生的粘膜IgA反應(yīng)更好。實(shí)施例4，laureth 9與Triton X100合用對(duì)已接觸抗原的小鼠鼻內(nèi)破傷風(fēng)類毒素疫苗的免疫原性的影響在本實(shí)施例中，我們?cè)u(píng)價(jià)了向低劑量和次于最佳劑量的Laureth-9中加入Triton X100后，對(duì)鼻內(nèi)增強(qiáng)破傷風(fēng)類毒素(TT)-特異性血清抗體的作用。雌性balb/c小鼠肌內(nèi)給予20％(2×50μl)人用劑量的商售DTPa疫苗(Diptheria，破傷風(fēng)，無細(xì)胞百日咳疫苗INFANRIXTMSmithKline Beecham，比利時(shí))。一個(gè)月后，用含5μgTT的APBS；B0.5％聚氧乙烯-9月桂基醚；C0.1％聚氧乙烯-9月桂基醚；D0.1％聚氧乙烯-9月桂基醚+0.02％Triton X100給小鼠鼻內(nèi)加強(qiáng)劑量(麻醉下，每個(gè)鼻孔5μl)，或用E通過肌內(nèi)加強(qiáng)注射DTPa疫苗(2×50μl)。加強(qiáng)后兩周，分析血清的TT-特異性IgG。
如

圖1所示，與0.5％的劑量相反，低劑量Laureth-9(0.1％)不能有效增強(qiáng)對(duì)TT的加強(qiáng)反應(yīng)。然而，通過補(bǔ)充Triton X100(p＜0.0001)可大大改善這一配制劑的輔佐性。引起的抗體反應(yīng)與商售DTPa疫苗誘導(dǎo)的反應(yīng)相似。
權(quán)利要求
1.一種佐劑組合物，其包含(a)通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯HO(CH2CH2O)n-A-R其中，n是1-50，A是鍵或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基；和(b)至少一種另外的非離子表面活性劑。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的佐劑組合物，其中所述的另外的非離子表面活性劑是辛苯聚糖。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2的佐劑組合物，其中所述的辛苯聚糖是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的佐劑組合物，還另外包括聚氧乙烯脫水山梨醇酯或膽酸或其衍生物或者還另外既包括聚氧乙烯脫水山梨醇酯也包括膽酸或其衍生物。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的佐劑組合物，其特征在于通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯是溶血的。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5的佐劑組合物，其特征在于用豚鼠血細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)測定聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯的溶血活性度在0.05-0.0001％的范圍內(nèi)。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求5或6的佐劑組合物，其中用豚鼠血細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)測定通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯的溶血活性與聚氧乙烯-9月桂基醚或聚氧乙烯-8-硬脂酰醚的溶血活性的差異在10倍之內(nèi)。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的佐劑組合物，包含通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯，其中n是4-24。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求8的佐劑組合物，其中n是9。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的佐劑組合物，包含通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯，其中R是C8-20烷基或苯基C8-20烷基。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求10的佐劑組合物，其中R是C12烷基。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)的佐劑組合物，包含通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯，其中A是鍵，從而形成醚。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的佐劑組合物，包含通式(I)的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯，其中A是-C(O)-，從而形成酯。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的佐劑組合物，其中通式(I)的聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯選自聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-月桂基酯、聚氧乙烯-9-硬脂酰醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚、聚氧乙烯-23-月桂基醚。
15.一種佐劑混合物，包含聚氧乙烯-9-月桂基醚和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的佐劑組合物，其中存在的清潔劑的總濃度為0.001-10％。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16的佐劑組合物，其中清潔劑的總濃度為0.001-1％。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求17的佐劑組合物，其中清潔劑的總濃度為0.001-0.7％。
19.一種佐劑混合物，包含與至少一種另外的免疫刺激劑聯(lián)合使用的權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的佐劑。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求19的佐劑混合物，其中至少一種另外的免疫刺激劑選自LT、CT、3D-MPL、CpG和QS21。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求20的佐劑組合物，其中CpG佐劑是TCCATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO.1)。
22.一種包含聚氧乙烯-9月桂基醚、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)和3D-MPL的佐劑混合物。
23.一種包含權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的佐劑的疫苗，其還包括抗原。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗，其中所述的抗原選自人免疫缺陷病毒、水痘帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、人巨細(xì)胞病毒、登革熱病毒、甲型、乙型、丙型或戊型肝炎、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、Hib、腦膜炎病毒；沙門氏菌屬、奈瑟菌屬、疏螺旋體屬、衣原體屬、博德特氏菌屬、鏈球菌屬、支原體屬、分枝桿菌屬、嗜血菌屬、瘧原蟲屬或弓形蟲屬、stanworth十肽；或腫瘤相關(guān)抗原(TMA)、MAGE、BAGE、GAGE、MUC-1、Her-2 neu、LnRH、CEA、PSA、KSA或PRAME。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求24的疫苗，其中所述的抗原是來自流感病毒的抗原或抗原制劑。
26.一種疫苗組合物，包含聚氧乙烯-9月桂基醚、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)和流感病毒抗原。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求23至26任一項(xiàng)的疫苗，其中疫苗是氣溶膠或噴霧形式。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求23至27任一項(xiàng)的疫苗，用于藥物。
29.權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的佐劑組合物在制備施用于患者粘膜表面或皮膚上的藥物中的應(yīng)用。
30.聚氧乙烯-9月桂基醚和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X100TM)的混合物在制備施用于患者粘膜表面上的疫苗中的應(yīng)用。
31.一種噴霧裝置，更具體地是一種雙劑量噴霧裝置，其中裝有權(quán)利要求23至27任一項(xiàng)的疫苗。
32.權(quán)利要求23至27任一項(xiàng)限定的疫苗組合物在制備用于治療病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染、過敏或癌癥的疫苗中的應(yīng)用。
33.一種治療哺乳動(dòng)物病原體感染或癌癥或過敏或?qū)@些疾病的易感性的方法，包括給哺乳動(dòng)物施與一種安全且有效量的權(quán)利要求23至27任一項(xiàng)的疫苗組合物。
34.一種治療哺乳動(dòng)物病原體感染或癌癥或過敏或?qū)@些疾病的易感性的方法，包括給哺乳動(dòng)物經(jīng)粘膜施與一種安全且有效量的權(quán)利要求23至27任一項(xiàng)的疫苗組合物。
35.一種治療哺乳動(dòng)物病原體感染或癌癥或過敏或?qū)@些疾病的易感性的方法，包括給哺乳動(dòng)物經(jīng)鼻內(nèi)施與一種安全且有效量的權(quán)利要求23至27任一項(xiàng)的疫苗組合物。
36.一種制備權(quán)利要求23至27任一項(xiàng)的疫苗組合物的方法，包括將(a)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)的佐劑組合物，(b)藥學(xué)上可接受的賦形劑，和(c)一種抗原或抗原組合物混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的佐劑系統(tǒng)，包括與至少一種另外的非離子表面活性劑并用的聚氧乙烯烷基醚或聚氧乙烯烷基酯表面活性劑。優(yōu)選所述另外的非離子表面活性劑是辛苯聚糖(TRITON
文檔編號(hào)A61P37/00GK1399539SQ00816263
公開日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月24日
發(fā)明者M·弗里德, P·赫爾曼德, V·亨德里克斯 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司