專利名稱：自然殺傷細胞的增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人的免疫系統(tǒng)細胞的制備方法。
背景技術(shù)：
動物體內(nèi)的自然殺傷細胞(以下，本發(fā)明說明書中有時省略為“NK細胞”)是承擔一部分免疫反應(yīng)的淋巴細胞系的細胞。該細胞具有各種各樣的功能，特別是由于對腫瘤細胞具有很強的殺傷活性，所以被認為是體內(nèi)清除已經(jīng)腫瘤化的或正在腫瘤化的異常細胞的免疫監(jiān)視系統(tǒng)的重要成員。因此，將該細胞有效地用于腫瘤治療的研究很早就開始了。
例如，將大量的淋巴因子之一的白細胞介素-2(以下本發(fā)明說明書中有時省略為“IL”)加到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)外周血單核細胞(以下記為PBMC)，對于人而言，PBMC培養(yǎng)1周左右，所謂的淋巴因子活化的殺傷細胞(以下有時省略為“LAK細胞”)開始增殖，而人們都知道其中含有很多NK細胞。從Rosenberg等人的研究(Rosenberg，S.A.，etal.，N.Engl.J.Med.313，pp.1485-1492，1985)以來，LAK細胞在腫瘤的過繼免疫療法中被廣泛使用。另外也知道LAK細胞對感染癥也有效，作為對付用抗生素難于治療的感染癥的措施已引起人們注意。然而為了使LAK細胞大量增殖需要進行2周以上的長時間培養(yǎng)，這往往會造成NK細胞的細胞殺傷活性大幅度下降，所以通過培養(yǎng)LAK細胞獲得NK細胞不是一個好的措施。
NK細胞的表面上存在NK活性抑制受體(以下省略為“NKIR細胞”)，如果存在與受體結(jié)合的分子，NK細胞的細胞殺傷活性會受到抑制(Gumperz，J.E.and Parham，P.，Nature，378，pp.245-248，1995)。一般來說，在正常細胞的表面有主要組織相容性抗原I類(以下有時稱之為“MHC-I”)分子表達，它們起著識別自己和非己的重要作用，但由于在MHC-I分子群中存在可結(jié)合NKIR的分子，所以通常測定NK細胞的細胞殺傷活性時，將人慢性白血病細胞株K562作為靶細胞進行活性測定。這是由于K562細胞幾乎不表達MHC-I分子。然而當要殺傷K562細胞時，NK細胞還要被活化、增殖。
最近，Strominger組開發(fā)了大量獲得NK細胞的方法，即對細胞表面幾乎不表達MHC-I的人B細胞株721.221進行放射線照射，使其成為喪失分裂能力的狀態(tài)，然后與PBMC一起混合培養(yǎng)5～6天，從中分離出NK細胞，再繼續(xù)培養(yǎng)，可大量獲得NK細胞。利用該方法從骨髓瘤患者獲得的NK細胞可以殺死不表達MHC-I的患者自己骨髓瘤細胞(Porgador，A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94，pp.，13140-13145，1997)。另外該方法雖然在使NK細胞增殖上很簡便，但作為NK細胞的靶細胞使用的721.221細胞株與K562細胞一樣實際上雖然少但有MHC-I表達(Hay，R.，American Type CultureCollection，personal communication)，所以與K562細胞相比，對使NK細胞增殖并不是特別有效。
另一方面，人NK細胞的細胞殺傷活性測定采用以下的標準方法，即以K562細胞作為靶細胞，首先使它以無機鹽形式攝入放射性51Cr，用放射線測定儀測定K562細胞死掉時游離到細胞外的51Cr的量。由于即使大量加入殺傷靶細胞的細胞(即效應(yīng)細胞)，但因為51Cr只從被殺死的K562細胞游離，所以該方法是靈敏度高、特異性強的方法。但也存在著避免不掉的處理放射性物質(zhì)帶來的危險的缺點。
對此，作為細胞殺傷性T淋巴細胞(以下有時稱之為“CTL”)的活性測定方法，本發(fā)明人提出了以粘附性細胞作為靶細胞的結(jié)晶紫染色法(以下有時也稱之為“CV法”)(Liu，S.Q.，et al.，Nature Medicine1，pp.267-271，1995)。該方法由于將靶細胞與效應(yīng)細胞混合培養(yǎng)后，將細胞彼此分離，對存活下來的靶細胞用結(jié)晶紫染色，然后用比色法進行定量，所以不需要放射性物質(zhì)，非常安全。
然而由于K562是懸浮性細胞，一旦與同樣是懸浮性細胞的效應(yīng)細胞混合，只分離靶細胞非常困難，所以在人NK細胞的活性測定中存在著CV法不適用的問題。如果利用具有象K562細胞對NK細胞那樣高的靈敏度，而且有粘附性的靶細胞，適宜用CV法，但這樣的報道到目前為止還未見到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供比以往知道的方法效率更高的NK細胞增殖法。更具體來說，本發(fā)明的課題在于提供與以往方法相比，效率在2倍以上，并可從PBMC有選擇地使NK細胞增殖，獲得保持高的細胞殺傷活性狀態(tài)的NK細胞的方法。另外本發(fā)明課題也提供通過具有上述特點的方法所生產(chǎn)的人NK細胞、以及與以往方法相比安全性更高的人NK細胞的細胞殺傷活性測定方法。
本發(fā)明人為了解決上述課題不懈努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在作為NK細胞的靶細胞的細胞群中，從許多的人培養(yǎng)細胞株群中篩選出在細胞培養(yǎng)中即使添加作為MHC-I表達誘導(dǎo)劑的干擾素γ(以下有時稱之為“IFNg”)，MHC-I分子表達也沒有增加的細胞株，在使用這樣細胞株中的特定細胞株時，可以獲得比K562細胞株更高的NK細胞增殖效果。本發(fā)明正是根據(jù)該發(fā)現(xiàn)完成的。
就是說，本發(fā)明提供包括對外周血單核細胞和人Wilm’s腫瘤細胞株HFWT進行混合培養(yǎng)工序在內(nèi)的使人自然殺傷細胞增殖的方法。按照本發(fā)明的優(yōu)選方案，可以提供使用從人個體、優(yōu)選腫瘤患者分離出的外周血單核細胞，使該個體自身的自然殺傷細胞增殖的上述方法；使用預(yù)先喪失增殖能力的人Wilm’s腫瘤細胞HFWT的上述方法；以及在白細胞介素-2存在下進行培養(yǎng)的上述方法。
例如，按照本發(fā)明的方法，通過將從腫瘤患者外周血分離的外周血單核細胞與人Wilm’s腫瘤細胞株HFWT一起培養(yǎng)，可以在保持原有高的細胞殺傷活性的基礎(chǔ)上使患者本人的NK細胞大量增殖。另外，本發(fā)明還提供包含使用通過這些方法制備的人自然殺傷細胞，以及用從腫瘤患者分離的外周血單核細胞，按照上述方法增殖的該腫瘤患者自身的自然殺傷細胞在內(nèi)的用于該腫瘤患者的腫瘤治療劑。
從另外的觀點來說，本發(fā)明提供人自然殺傷細胞的細胞殺傷活性的測定方法，即包括對外周血單核細胞和人Wilm’s腫瘤細胞株HFWT進行混合培養(yǎng)，對培養(yǎng)后存活下來的靶細胞進行染色的工序在內(nèi)的方法，如果按照該方法的優(yōu)選方案，可以提供在染色中使用結(jié)晶紫的上述方法。按照這些方法可以不使用放射性物質(zhì)，準確而簡便地測定人NK細胞的細胞殺傷活性。
附圖的簡單說明

圖1表示按照本發(fā)明的方法使用健康人1(40歲、女)的PBMC有選擇地培養(yǎng)NK細胞的結(jié)果。
圖2表示按照本發(fā)明的方法使用健康人2(27歲、男)的PBMC有選擇地培養(yǎng)NK細胞的結(jié)果。
圖3表示使用在例1的實驗3中得到的培養(yǎng)淋巴細胞群，進行細胞殺傷試驗的結(jié)果。
圖4表示在有選擇性培養(yǎng)NK細胞過程中添加白細胞介素的效果。圖中ILs表示在培養(yǎng)中使用4種白細胞介素時的結(jié)果，IL-2表示只添加白細胞介素-2時的結(jié)果。
圖5是作為在有選擇培養(yǎng)NK細胞過程中添加白細胞介素的效果，表示包括從健康人2和3得到的NK細胞的淋巴細胞群的細胞殺傷活性的圖。
圖6表示使用腫瘤患者的PBMC按照本發(fā)明的方法有選擇地使NK細胞增殖培養(yǎng)的結(jié)果。
圖7表示使用腫瘤患者的PBMC，以K562細胞或HFWT細胞作為靶細胞進行增殖培養(yǎng)時進行細胞殺傷試驗的結(jié)果。
實施發(fā)明的最佳方案本發(fā)明的方法是使人NK細胞增殖時，其特征為以人的Wilm’s腫瘤細胞株HFWT作為靶細胞與人PBMC進行混合培養(yǎng)。按照本發(fā)明的方法有選擇地使PBMC中的NK細胞增殖成為可能。人的Wilm’s腫瘤細胞株HFWT以細胞編號RCB0665寄存在理化研究所(日本國琦玉縣和光市廣澤2番1號)的細胞開發(fā)銀行(日本國筑波市高野臺三丁目1番1號)，通過申請可以獲得。
在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)方法并沒有特別限定，但通常可以按照下述方法進行培養(yǎng)。在通常的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中添加血清或血漿和支持淋巴細胞增殖的增殖因子，加入從人外周血分離的PBMC，將該培養(yǎng)物添加到HFWT細胞后進行培養(yǎng)。添加到培養(yǎng)基中的血清或血漿沒有特別限定，可以使用來自市售的各種動物的產(chǎn)品，來自人時優(yōu)選AB血型的，更優(yōu)選來自采集PBMC的本人的。濃度為1至30體積％左右。另外也可以使用能支持淋巴細胞增殖的無血清狀態(tài)培養(yǎng)基。
理想的增殖因子是白細胞介素-2(IL-2)，也可以使用從PBMC中使淋巴細胞增殖那樣的細胞因子組合，或刺激淋巴細胞增殖的植物凝集素類，或使用對從另一人個體(與采取PBMC對象不同的個體)采取的PBMC實施增殖能力喪失處理后的產(chǎn)物代替增殖因子。使增殖能力喪失的方法沒有特別限定，可以使用放射線照射或絲列霉素C處理等同行都知道的方法。優(yōu)選添加的IL-2的濃度為10～2,000國際單位/ml。
PBMC與HFWT細胞的比例沒有特別限定，做到10∶1左右最好。作為靶細胞的HFWT細胞由于是粘附性細胞，一般來說優(yōu)選使用保持原有粘附狀態(tài)、實施喪失增殖能力處理后的細胞。另外也可以將上述的細胞從粘附狀態(tài)物理性的剝落等成為懸浮狀態(tài)使用。而如果NK細胞活化后處于旺盛增殖的狀態(tài)，由于作為靶細胞的HFWT細胞被NK細胞迅速殺死，這種狀態(tài)下使用靶細胞時，沒有必要事先使其增殖能力喪失。PBMC的培養(yǎng)時沒有特別限定，優(yōu)選培養(yǎng)5天以上。雖然NK細胞一直維持著高活性狀態(tài)進行增殖，在NK細胞直至自然喪失增殖能力之前期間可繼續(xù)培養(yǎng)。
本發(fā)明提供人自然殺傷細胞的細胞殺傷活性的測定方法，其特征是將人Wilm’s腫瘤細胞株HFWT和人自然殺傷細胞進行混合培養(yǎng)，然后對培養(yǎng)后存活下來的靶細胞進行染色。該方法根據(jù)一般都知道的方法(Liu，S.Q.，et al.，Nature Medicine 1，pp.267-271，1995)實施，可以將NK細胞作為效應(yīng)細胞，將HFWT細胞作為靶細胞。染色時優(yōu)選使用結(jié)晶紫。由于HFWT細胞是粘附性細胞，所以如果按照本發(fā)明的方法可以不使用放射性物質(zhì)而準確且簡便地測定人NK細胞的活性。
實施例以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體地說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于下述的實施例。以下實施例用的細胞株是對寄存在理化研究所細胞開發(fā)銀行的人腫瘤細胞株209株進行篩選，其中慢性骨髓白血病細胞株K562(細胞編號RCB0027)、Wilm’s腫瘤細胞株HFWT(細胞編號RCB0665)、骨髓瘤細胞株HMV-I1(細胞編號RCB0777)、幾乎不表達MHC-I分子(但可確認后兩者有與K562細胞同種程度的微量的MHC-I的表達)，這些細胞在通過同行都知道的流式細胞測量法確認在培養(yǎng)過程中即使實施24小時添加IFNg處理，MHC-I表達完全沒有增強的基礎(chǔ)上使用。
已知在K562細胞內(nèi)存在許多變異體，原始株(Lozzio，C.B.andLozzio，B.B.，Blood，45，pp.321-334，1975)通過IFNg處理可誘導(dǎo)MHC-I表達。而且本實施例使用的K562細胞是從原始株變異來的，即便通過IFNg處理，原來MHC-I極低表達狀態(tài)也沒有變化。而Higashino細胞是從經(jīng)病理診斷確定為腦腫瘤的組織由理化研究所傳代培養(yǎng)的細胞，它是在通常培養(yǎng)下平時就強烈表達MHC-I和MHC-II的細胞。該細胞用作與幾乎不表達MHC-I的細胞株的比較對照。
例1健康人的NK細胞的選擇培養(yǎng)研究將HFWT細胞作為靶細胞時，是否可有選擇地使健康人PBMC中的NK細胞增殖。
<方法>
1.靶細胞的培養(yǎng)將1×105個靶細胞接種到24孔板的各個孔中。作為靶細胞可以使用Higashino、HFWT、K562、HMV-II，作為培養(yǎng)基使用添加了10％胎牛血清的Ham F12培養(yǎng)基。將這些細胞培養(yǎng)過夜后，照射50Gy的X光線，用PBS(-)洗滌3次，作為靶細胞用。
2.PBMC的制備按照同行人都知道的方法(Kawai，K.，et al.，Cancer Immunol.Immunother.35，pp.225-229，1992)從健康人的30ml外周血分離PBMC。而此時采集的血漿用PBS(-)稀釋成2倍后，在以下的培養(yǎng)中使用。使用濃度在2倍稀釋狀態(tài)下，體積比為10％(即血漿5％)。
3.PBMC的培養(yǎng)將懸浮于每一孔添加2ml血漿的RHAMα培養(yǎng)基(Kawai，K.，etal.，Cancer Immunol.Immunother.35，pp.225-229，1992)的1×106個PBMC接種在靶細胞上。向培養(yǎng)基中添加IL-1(終濃度167國際單位/ml，以下同樣表示終濃度)、IL-2(67國際單位/ml)、IL-4(67國際單位/ml)、IL-6(134國際單位/ml)。然后將其于37℃的二氧化碳氣體培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
4.流式細胞用同行都知道的方法，用分別與細胞表面抗原特異結(jié)合的單克隆抗體對培養(yǎng)的懸浮細胞群進行熒光染色，通過FACS(ベクトンデイツキンソン公司生產(chǎn))進行解析。這里使用的單克隆抗體中，抗CD3抗體用于識別T細胞，抗CD56抗體用于識別NK細胞。
5.細胞數(shù)的計算細胞數(shù)是使用タタイ式血球計數(shù)板計測的。
6.細胞殺傷活性的測定根據(jù)已經(jīng)報道的方法(Liu，S.Q.，et al.，Nature Medicine1，pp.267-271，1995)，通過CV法測定培養(yǎng)的淋巴細胞的殺傷活性。在本實施例中，使在向活的靶細胞中添加淋巴細胞前的靶細胞染色后的吸光度為100％。因此在經(jīng)24小時溫育后，在作為對照的只有靶細胞的孔(效應(yīng)細胞與靶細胞的比(以下為E/T)為0的孔)中，由于靶細胞增殖，所以細胞殺傷活性超過100％，這表明本實驗中靶細胞本身是正常的。
<結(jié)果>
表1的實驗1和實驗2以及圖1給出了使用健康人1(40歲、女)的PBMC得到的結(jié)果，表1的實驗3以及圖2給出了從健康人2(27歲、男)得到的結(jié)果。
表1靶細胞表面抗原不同的細胞的比例(％)CD3+ CD56- CD3- DD56+實驗1(培養(yǎng)13天)無 58.2 5.4Higashino96.0 0.2HFWT 19.8 54.6K562 47.8 17.6實驗2(培養(yǎng)14天)無 60.9 13.0Higashino84.8 5.4HFWT 7.3 75.9HMV-II 55.0 18.9實驗3(培養(yǎng)13天)無 74.4 7.2Higashino95.1 1.7HFWT 12.4 64.6本實施例中使用的4種IL組合，適用于誘導(dǎo)培養(yǎng)具有同時識別MHC-I分子和抗原肽這樣殺傷性質(zhì)的CTL(Liu，S.Q.，et al.，CancerImmunol Immunotherapy，39，pp.279-285，1994)。健康人的PBMC通常含有8～25％的NK，就象表1所表示的那樣，用CD3+CD56-表示的T細胞在以Higashino細胞作為靶細胞時雖然可達到96％，但用CD3-CD56+表示的NK細胞在用健康人1的PBMC的實驗1中幾乎消失了，而實驗2也只剩下5.4％了。另外在以表面上幾乎不表達MHC-I分子的HFWT細胞作為靶細胞時，T細胞的比例反而大幅度下降，NK細胞的比例可上升到54.6％。這一比例也明顯比以同樣表面上幾乎不表達MHC-I分子的K562細胞作為靶細胞時的結(jié)果(17.6％)高。即使在實驗2也沒有改變這一傾向，NK細胞的比例在以HFWT細胞為靶細胞時達到75.9％，也比同樣表面上幾乎不表達MHC-I分子的HMV-II細胞作為靶細胞時(18.9％)高。
就剛從健康人2的外周血制備的PBMC來看，CD3+CD56-的T細胞為55.4％，而CD3-CD56+的NK細胞為13.2％。如表1的實驗3所示，培養(yǎng)13天后，以Higashino細胞作靶細胞時，T細胞占95.1％，幾乎無NK細胞；相反，以HFWT細胞作靶細胞時，NK細胞增加到64.6％。而且，如表1所示，健康人1的PBMC的細胞增殖在以Higashino細胞和HFWT細胞作為靶細胞時明顯比以HMV-II細胞作為靶細胞以及沒有靶細胞時高。而健康人2的情形(圖2)是來自PBMC的細胞以HFWT細胞作為靶細胞比以Higashino細胞作為靶細胞時能更有效地增殖。
另外圖3給出了使用在實驗3中得到的培養(yǎng)淋巴細胞群進行細胞殺傷實驗的結(jié)果。以Higashino細胞作為靶細胞得到的培養(yǎng)淋巴細胞群由于是將4種IL組合后進行培養(yǎng)，預(yù)料會變成CTL，實際上該淋巴細胞群能極有效地殺死在進行細胞殺傷活性測定時作為靶細胞存活下來的Higashino細胞。即便在E/T為0時(即只有靶細胞時)，24小時內(nèi)靶細胞增殖到147％的條件下，E/T為2時存活下來的靶細胞為47.6％。E/T為8時存活下來的靶細胞卻僅有7.5％。此時E/T比例越低存活下來的靶細胞的比例就會變得越高，可以看出明顯的用量依賴關(guān)系。但是，當細胞殺傷活性測定時的靶細胞是活的HFWT細胞時，以Higashino細胞為靶細胞得到的淋巴細胞群沒有將HFWT細胞全部殺死，表明這樣得到的培養(yǎng)淋巴細胞群是典型的CTL。
另一方面，以HFWT細胞作為靶細胞得到的培養(yǎng)淋巴細胞群能極有效地殺死活的HFWT細胞。E/T為2時存活下來的靶細胞為18.5％。而E/T為8時存活下來的靶細胞下降到-9.2％(負值是測定誤差所至)。此時E/T比例越低存活下來的靶細胞的比例就會變得越高，可以看出明顯的用量依賴關(guān)系。因此通過以細胞殺傷活性測定時存活下來的HFWT細胞作為靶細胞可以準確地測定NK細胞的細胞殺傷活性。
另外，在該培養(yǎng)淋巴細胞群中含有12.4％的T細胞，明顯低于活的HFWT細胞，但由于也殺Higashino細胞，所以可推定其中不只是含有NK細胞，而且也含有一些CTL。E/T為2時存活下來的靶細胞為60.5％，而E/T為8時存活下來的靶細胞變成了21.8％。因此，由這些實驗表明，如果以HFWT細胞作為靶細胞，可以從PBMC中選擇性地、而且有效地使保持高的細胞殺傷活性的NK細胞增殖。
例2有選擇培養(yǎng)NK細胞時所必需的白細胞介素例1顯示，將喪失增殖能力的HFWT細胞作為靶細胞，可以從健康人的PBMC有選擇地增殖培養(yǎng)NK細胞，在培養(yǎng)中使用了4種IL。在本例子中使用了只添加對淋巴細胞來說最低限度需要的IL-2的培養(yǎng)基，以HFWT細胞作為靶細胞對NK細胞進行有選擇地培養(yǎng)。方法除了添加到培養(yǎng)基中的IL的種類改變之外其它與例1完全一樣。但是只添加IL-2時的濃度為500國際單位/ml。另外，在研究用流式細胞法培養(yǎng)的細胞群時，為了識別NK細胞，除了抗CD56抗體外也使用了抗CD16抗體。
如圖4所示，以HFWT細胞作為靶細胞，對取自健康人1、健康人2和健康人3(56歲，男)的全部的PBMC都進行培養(yǎng)時，無論是添加4種IL，還是只添加IL-2，增殖大致相同。如圖4(C)所示，取自健康人3的PBMC不使用靶細胞，而且在只添加IL-2的培養(yǎng)中，細胞增殖變得很慢。
健康人1的PBMC，用當初只有8.0％的CD3-CD56+表示的NK細胞比例，在培養(yǎng)14天后追加靶細胞進行再刺激時，即使作為IL只加IL-2培養(yǎng)，在培養(yǎng)17天后也達到了77.3％。沒有進行這樣的再刺激的健康人2的PBMC在培養(yǎng)13天后，即使在只添加IL-2的培養(yǎng)中，用CD3-CD56+表示的NK細胞比例也達到90.7％，而用CD16+表示的NK細胞比例為79.1％，用CD16+CD56+表示的NK細胞比例為78.2％。即使是健康人3，這樣的傾向也沒有變，在培養(yǎng)13天后，即使在只添加IL-2的培養(yǎng)中，用CD3-CD56+表示的NK細胞比例也達到74.9％，而用CD16+表示的NK細胞比例為76.5％，用CD16+CD56+表示的NK細胞比例達到75.7％。
圖5給出了從健康人2和3得到的幾乎都變成了NK細胞的淋巴細胞群的細胞殺傷活性的結(jié)果。此時存活下來的靶細胞是HFWT。無論是健康人2還是健康人3的場合都得到了活性非常高的NK細胞，在以HFWT細胞作為靶細胞有選擇地對PBMC中的NK細胞進行培養(yǎng)時添加的IL只用IL-2就可以，可以有選擇地高效地使保持原有高細胞殺傷活性的NK細胞增殖。
例3從腫瘤患者的PBMC中有選擇地對NK細胞進行增殖培養(yǎng)在例1和例2中使用了健康人的PBMC，而在本例子中使用腫瘤患者的PBMC，研究能否有選擇地對NK細胞進行增殖培養(yǎng)。實驗按照例1方式進行，但作為培養(yǎng)PBMC時的靶細胞使用HFWT細胞或K562細胞，作為IL只添加IL-2，濃度為500國際單位/ml。研究用流式細胞法培養(yǎng)的細胞群時，為了識別NK細胞，除了使用抗CD56抗體外，還追加使用了抗CD16抗體?；颊?51歲、男)為診斷為gliosarcoma的腦腫瘤患者，是采集了在例1和例2中使用的Higashino細胞的本人。
圖6給出了結(jié)果。來自PBMC的淋巴細胞的增殖用HFWT細胞作為靶細胞比K562細胞好。從1×106個細胞開始，累計增殖的淋巴細胞數(shù)的最高值在以K562細胞作為靶細胞時為3.05×107個，而以HFWT細胞作為靶細胞時達到15.6×107個。表2給出了來自PBMC的細胞群的組成。表2靶細胞 表面抗原不同的細胞的比例(％)CD3+CD56-CD3-CD56+CD16+CD56+培養(yǎng)13天HFWT 0.4 83.8 54.7K562 1.9 81.5 51.7無論是在以K562細胞為靶細胞進行增殖培養(yǎng)，還是以HFWT細胞作為靶細胞增殖培養(yǎng)的任一場合，用CD3-CD56+表示的NK細胞比例在82％左右，而用CD16+CD56+表示的NK細胞比例在53％左右，兩種場合幾乎一樣。得到的淋巴細胞群的細胞殺傷活性在以活的HFWT細胞作為靶細胞進行測定時，結(jié)果無論是以K562細胞還是以HFWT細胞作為靶細胞增殖培養(yǎng)的淋巴細胞群都有非常強的細胞殺傷活性(圖7)。
產(chǎn)業(yè)上利用可能性與以往方法相比通過本發(fā)明可以更有效地對人NK細胞進行增殖培養(yǎng)，可很容易地得到大量的NK細胞。以腫瘤患者的PBMC作為材料通過本發(fā)明得到的NK細胞，由于不存在排斥反應(yīng)等問題可以返回到該患者本人的體內(nèi)，適用于腫瘤治療和感染癥治療。
權(quán)利要求
1.一種人的自然殺傷細胞的增殖方法，其特征在于，包括將外周血單核細胞和人Wilm’s腫瘤細胞株HFWT進行混合培養(yǎng)的工序。
2.權(quán)利要求1記載的方法，其中，使用從人個體分離的外周血單核細胞，使該人個體自身的自然殺傷細胞增殖。
3.權(quán)利要求2記載的方法，其中，人個體是腫瘤患者。
4.權(quán)利要求1～3中任一項記載的方法，其中，使用預(yù)先已喪失增殖能力的人的Wilm’s腫瘤細胞株HFWT。
5.權(quán)利要求1～4中任一項記載的方法，其中，是在有白細胞介素-2存在下進行培養(yǎng)的。
6.一種人自然殺傷細胞，其特征在于，可按照權(quán)利要求1～5中任一項記載的方法制備。
7.一種用于腫瘤患者的腫瘤治療劑，其特征在于，包含使用從腫瘤患者分離的外周血單核細胞，按照權(quán)利要求1記載的方法使其增殖的該腫瘤患者自身的自然殺傷細胞。
8.一種方法，是人自然殺傷細胞的細胞殺傷活性的測定方法，其特征在于，包括將人的Wilm’s腫瘤細胞株HFWT與人的自然殺傷細胞進行混合培養(yǎng)，對培養(yǎng)后存活的靶細胞進行染色的工序。
9.權(quán)利要求8記載的方法，其中，在染色中使用結(jié)晶紫。
全文摘要
人自然殺傷細胞的增殖方法，包括將外周血單核細胞和人Wilm’s腫瘤細胞株HFWT進行混合培養(yǎng)的工序。例如，使用從人個體分離出的外周血單核細胞，可以使該人個體本身的自然殺傷細胞增殖，可以有效地使保持高細胞殺傷活性的自然殺傷細胞增殖。
文檔編號A61K35/14GK1399675SQ00816316
公開日2003年2月26日 申請日期2000年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月26日
發(fā)明者大野忠夫, 西條薰 申請人:理化學研究所