一種自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)基及自然殺傷細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)基及自然殺傷 細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞（naturalkiller cell，NK)，又稱NK細(xì)胞，被認(rèn)為是機(jī)體抗感染、 抗腫瘤的第一道天然防線，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié) 有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細(xì)胞胞漿豐富，含有較 大的嗜天青顆粒，顆粒的含量與NK細(xì)胞的殺傷活性呈正相關(guān)。NK細(xì)胞作用于靶細(xì)胞后殺傷 作用出現(xiàn)早，在體外1小時(shí)、體內(nèi)4小時(shí)即可見到殺傷效應(yīng)。NK細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫 瘤細(xì)胞（包括部分細(xì)胞系）、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織細(xì)胞（如血細(xì)胞）、寄生蟲等，因 此NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第II型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主 反應(yīng)。活化的NK細(xì)胞可合成和分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷 靶細(xì)胞的作用?？梢?，NK細(xì)胞的培養(yǎng)具有十分重要的意義。
[0003] 目前大部分NK細(xì)胞培養(yǎng)體系采用胎牛血清加基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，但是采用胎牛血 清培養(yǎng)會(huì)存在異源血清所帶來的潛在危險(xiǎn)。為此，也曾有報(bào)道用添加細(xì)胞因子IL-2或 IL-15的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細(xì)胞以避免異源血清帶來的風(fēng)險(xiǎn)，但擴(kuò)增NK的效果不明顯， 純度相對(duì)較低；無法達(dá)到臨床所需的細(xì)胞數(shù)量。
[0004] 因此，進(jìn)一步研宄無異源血清的且能夠大量擴(kuò)增NK，并獲得高純度NK的培養(yǎng)基和 培養(yǎng)方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)基及自然 殺傷細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法。以本發(fā)明提供的培養(yǎng)基及擴(kuò)增培養(yǎng)方法培養(yǎng)自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增 效率高，純度良好。
[0006] 本發(fā)明提供的擴(kuò)增培養(yǎng)自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括：無血清培養(yǎng)基、人血漿、 IL-2、IL-21、IL-15 和OKT-3。
[0007] 無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合 成培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基的基本配方包括：胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖粘連蛋白。
[0008] 人血漿即人體血液中的液體成分，人的血細(xì)胞懸浮于其中。本發(fā)明采用人血漿，降 低異源性血清存在的潛在危險(xiǎn)。
[0009] 11-2即白細(xì)胞介素-2(1拉61'16111^11-2，11-2)，又名1'細(xì)胞生長因子〇'〇611 growthfactor，TCRF)?？纱龠M(jìn)NK細(xì)胞的增殖，維持NK細(xì)胞長期生長。
[0010] IL-21即白細(xì)胞介素-21 (interleukin-21，IL-21)，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖。
[0011] 幾-15即白細(xì)胞介素-15(1拉61'16111^11-15，11-15)，生物學(xué)作用與11-2相似。
[0012] OKT-3為鼠源性抗人T淋巴細(xì)胞⑶3抗原單克隆抗體，目前未見OKT-3對(duì)NK細(xì)胞 活性或增殖特性影響的相關(guān)專利。
[0013] 在一些實(shí)施例中，IL-2的濃度為100U/mL?400U/mL。
[0014] 在另一些實(shí)施例中，IL-2的濃度為200U/mL?300U/mL。
[0015] 在一些實(shí)施例中，IL-21的濃度為5ng/mL?100ng/mL。
[0016] 在另一些實(shí)施例中，IL-21的濃度為40ng/mL?60ng/mL。
[0017] 在一些實(shí)施例中，IL-15的濃度為5ng/mL?100ng/mL。
[0018] 在另一些實(shí)施例中，IL-15的濃度為40ng/mL?60ng/mL。
[0019] 在一些實(shí)施例中，0KT-3的濃度為5ng/mL?100ng/mL。
[0020] 在另一些實(shí)施例中，0KT-3的濃度為40g/mL?60g/mL。
[0021] 在一些實(shí)施例中，人血漿的體積分?jǐn)?shù)為5?15%。
[0022] 在另一些實(shí)施例中，人血漿的體積分?jǐn)?shù)為10%。
[0023] 在一些實(shí)施例中，無血清培養(yǎng)基采用LONZAX-VIV0 15。
[0024] LONZAX-VIV0 15由L0NZA公司生產(chǎn)，目前常用于培養(yǎng)人類單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞細(xì) 胞、粒細(xì)胞或自然殺傷（NK)細(xì)胞，但對(duì)NK細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，NK細(xì)胞擴(kuò)增效果不佳。
[0025] 本發(fā)明通過在無血清培養(yǎng)基中添加人血漿、IL-2、IL-21、IL-15和0KT-3,提高了 NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增后的NK細(xì)胞純度。與僅添加細(xì)胞因子IL-2和細(xì)胞因子IL-15的 對(duì)照組相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基對(duì)NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率也有顯著的提高。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種自然殺傷細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0027] 步驟1:從人外周血中分離自然殺傷細(xì)胞；
[0028] 步驟2 :以本發(fā)明提供的培養(yǎng)基重懸自然殺傷細(xì)胞，37°C，C02體積分?jǐn)?shù)為5 %，培 養(yǎng)。
[0029] 在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)為：每3天補(bǔ)充本發(fā)明提供的培養(yǎng)基使自然殺傷細(xì)胞的密 度為 0. 5X106個(gè)/mL?1. 0X10 6個(gè) /mL。
[0030]作為優(yōu)選，培養(yǎng)為：每3天補(bǔ)充本發(fā)明提供的培養(yǎng)基使自然殺傷細(xì)胞的密度為 0? 5X106個(gè)/mL〇
[0031] 每3天補(bǔ)充本發(fā)明提供培養(yǎng)基可以保證自然殺傷細(xì)胞在培養(yǎng)基中的量不至于過 高，從而避免NK細(xì)胞的增殖過早進(jìn)入平穩(wěn)期。采用本發(fā)明提供的方法，從第6天開始，NK細(xì) 胞增殖即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在培養(yǎng)了 13天后NK細(xì)胞始終保持對(duì)數(shù)增長，在培養(yǎng)14天后，NK細(xì)胞 仍保持對(duì)數(shù)增長，且純度維持在95%以上。說明本發(fā)明提供的方法能夠有效提高NK細(xì)胞的 擴(kuò)增效率，并能夠使NK細(xì)胞的擴(kuò)增較長時(shí)間的維持在對(duì)數(shù)期，且使細(xì)胞保持較高的純度。
[0032] 在一些實(shí)施例中，重懸的自然殺傷細(xì)胞的密度為0. 5 X 106個(gè)/mL?1. 0 X 106個(gè)/ mL〇
[0033] 作為優(yōu)選，重懸的自然殺傷細(xì)胞的密度為0. 5X 106個(gè)/mL。
[0034] 在一些實(shí)施例中，自然殺傷細(xì)胞的純度不低于90%。
[0035] 作為優(yōu)選，自然殺傷細(xì)胞的純度為95%?96%。
[0036] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，步驟1具體包括：以Ficoll淋巴分離液分離人血細(xì)胞獲得 外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)分選獲得自然殺傷細(xì)胞。
[0037] 本發(fā)明提供了包含無血清培養(yǎng)基、人血漿、IL-2、IL-21、IL-15和0KT-3的擴(kuò)增培 養(yǎng)自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基用于擴(kuò)增培養(yǎng)NK細(xì)胞，可以避免外源血清 帶來的風(fēng)險(xiǎn)，擴(kuò)增效率高且獲得NK細(xì)胞純度高。采用本發(fā)明提供的方法擴(kuò)增NK細(xì)胞，能夠 使NK細(xì)胞的擴(kuò)增較長時(shí)間的維持在對(duì)數(shù)期。且培養(yǎng)獲得的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性 良好。
【附圖說明】
[0038] 圖1示PBMC細(xì)胞和NK細(xì)胞的形態(tài)；其中，圖1-a示PBMC形態(tài)（100倍）；圖1-b 示NK細(xì)胞形態(tài)（100倍）；
[0039] 圖2示分選前后細(xì)胞流式檢測結(jié)果；其中，圖2-a示分選前流式檢測的結(jié)果；圖 2_b示分選后流式檢測的結(jié)果；
[0040] 圖3示實(shí)施例6培養(yǎng)14天后的NK細(xì)胞的流式檢測結(jié)果；
[0041] 圖4示實(shí)施例6獲得的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明提供了一種自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)基及自然殺傷細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方 法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和 范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0043] 本發(fā)明采用的試劑和儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0044] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0045] 實(shí)施例1本