一種用于細胞培養(yǎng)基的玉米活性肽添加劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)基添加劑，特別是涉及一種用于細胞培養(yǎng)基的玉米活性 肽添加劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 培養(yǎng)基是決定體外培養(yǎng)細胞生長代謝的最直接、最重要的環(huán)境因素。動物細胞培 養(yǎng)基通常含有血清等動物源添加物，而隨著全球瘋牛病的流行爆發(fā),血清等動物來源添加 物的使用，給生物制藥工業(yè)帶來感染性海綿狀腦?。═SEs)病毒及其它危險物質(zhì)的安全性風 險驟然上升。全世界的藥品監(jiān)管機構(gòu)要求藥物生產(chǎn)商在制藥生產(chǎn)中減少牛源成分的使用， 相關(guān)立法機關(guān)也越來越反對在制藥領(lǐng)域使用牛血清等動物源成分。美國食品及藥品管理局 (FDA)和歐洲藥品管理局（EMA)嚴格控制在商業(yè)化生產(chǎn)培養(yǎng)基過程中使用動物源成分，以保 證病人最終的服藥安全。同時，血清及其他動物源的培養(yǎng)基添加物中含有生長因子、轉(zhuǎn)運蛋 白、貼壁因子、激素等大分子蛋白質(zhì)，為抗體藥物、疫苗等生物制品后期分離純化帶來壓力， 最終影響產(chǎn)品得率，增加生產(chǎn)成本。因此，非動物源細胞培養(yǎng)添加物的開發(fā)及應(yīng)用符合當前 的發(fā)展方向，目前已成為動物細胞體外培養(yǎng)及生物制藥領(lǐng)域的重要課題。
[0003] 玉米黃粉是玉米經(jīng)濕磨法工藝制得粗淀粉乳，再經(jīng)蛋白質(zhì)分離得到麩質(zhì)水，然后 濃縮干燥制得的，其是玉米濕法加工淀粉時的主要副產(chǎn)物，含有60%以上的蛋白質(zhì)，還含有 無機鹽和多種維生素。玉米活性肽是以玉米黃粉為原料，經(jīng)預(yù)處理、生物酶水解、多級分離 提純、濃縮干燥等工藝制備出的小分子肽類混合物，其是天然玉米蛋白資源生物加工和轉(zhuǎn) 化利用領(lǐng)域的尖端產(chǎn)品。玉米活性肽來源于植物蛋白，避免了血清等動物性成分中潛在的 病毒微生物污染等問題；其批次間質(zhì)量一致，有利于提高細胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性；其不含 大分子蛋白，有益于細胞產(chǎn)品下游分離純化。
[0004] 玉米活性肽營養(yǎng)物質(zhì)豐富，在其加工及儲藏過程中易受細菌微生物污染，進而產(chǎn) 生大量細菌內(nèi)毒素，將其作為細胞培養(yǎng)添加劑使用時會改變細胞形態(tài)、破壞細胞膜結(jié)構(gòu)、誘 導(dǎo)細胞凋亡等，對體外培養(yǎng)的細胞生長產(chǎn)生不利影響。除此之外，由于不同的加工工藝對制 備的玉米活性肽產(chǎn)品的組成具有較大影響，而動物血清成分較為復(fù)雜，很多成分至今尚不 清楚，因此無法確定某種或某些成分的存在或者缺失是否會對細胞的生長產(chǎn)生不良影響， 從而給玉米活性肽在無血清培養(yǎng)基添加劑上的應(yīng)用造成一定的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種玉米活性肽添加劑及其應(yīng)用，該玉米活性肽內(nèi)毒素含量低，在 作為細胞培養(yǎng)基添加劑應(yīng)用時，可與多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行復(fù)配，用于對多種細胞系進行無 血清培養(yǎng)，并且還能促進細胞增殖，提高細胞活力以及增強細胞產(chǎn)物表達。
[0006] 本發(fā)明還提供一種用于細胞培養(yǎng)基的玉米活性肽的制備方法，其操作簡便，酶解 效率高，并且可將小分子的活性肽與大分子蛋白、細菌內(nèi)毒素及小分子鹽類進行高效地分 離，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明提供的一種用于細胞培養(yǎng)基的玉米活性肽添加劑，其中分子量小于1000 道爾頓的低聚肽占總蛋白的質(zhì)量百分比彡90%，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、 VNAP、PSSQ、TQPGPQ中的一種或多種。
[0008] 進一步地，所述低聚肽還包括AY、NAP、PVIN、AYPQ中的一種或多種。
[0009] 進一步地，所述玉米活性肽添加劑中內(nèi)毒素的含量<200EU/g，特別是內(nèi)毒素含量 <50EU/g。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明提供的玉米活性肽添加劑，其是通過依次采用非特異性蛋白酶和特異 性蛋白酶對玉米黃粉進行酶解后，經(jīng)分離純化制得的。
[0011] 本發(fā)明所述的非特異性蛋白酶指的是對所作用的底物的特異性低、具有較寬的底 物特異性的一類蛋白酶，如堿性蛋白酶，其可水解多種蛋白質(zhì)分子的肽鏈生成多肽或氨基 酸；又如菠蘿蛋白酶，其能分解多種蛋白質(zhì)以及肽、脂和酰胺等。本發(fā)明所述的特異性蛋白 酶指的是底物特異性相對嚴格、僅能作用于蛋白質(zhì)分子中某些特定肽鍵的一類蛋白酶，如 羧肽酶催化水解含羧基的末端氨基酸所形成的肽鍵等。
[0012] 在本發(fā)明具體方案中，所述非特異性蛋白酶選自木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋 白酶和菠蘿蛋白酶中的一種或多種，所述特異性蛋白酶選自羧肽酶、風味蛋白酶中的一種 或兩種；特別是，所述非特異性蛋白酶選自木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋 白酶中的兩種或兩種以上。本發(fā)明先采用特異性蛋白酶對玉米黃粉進行酶解，然后采用非 特異性蛋白酶對酶解產(chǎn)物進一步進行酶解，兩者配合使用能夠達到較高的酶解效率，并且 酶解液中的活性肽、特別是小分子量的活性肽的含量高。
[0013] 進一步地，所述非特異性蛋白酶的酶量為每克蛋白2000?6000單位，其中包括 0?1000單位酶量的木瓜蛋白酶、500?2000單位酶量的堿性蛋白酶、500?2000單位酶 量的中性蛋白酶和0?1500單位酶量的菠蘿蛋白酶中的兩種或多種；所述特異性蛋白酶 的酶量為每克蛋白2000?3000單位，其中包括500?2000單位酶量的羧肽酶和1000? 2000單位酶量的風味蛋白酶中的一種或兩種。在本發(fā)明中，各蛋白酶的酶活力單位定義為： 在試驗條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生lg酪氨酸的酶量定義為一個酶活力單位；并且所述 每克蛋白中的蛋白具體指的是玉米黃粉中的蛋白，即玉米黃粉中每含有1克蛋白時加入相 應(yīng)單位酶量的各蛋白酶。
[0014] 采用本發(fā)明所述非特異性蛋白酶和特異性蛋白酶對玉米黃粉進行酶解，可以產(chǎn)生 多種分子量小于1000道爾頓的低聚肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)技術(shù) 手段從酶解液中分離純化出所述低聚肽，例如離心、微濾、超濾等。在本發(fā)明具體方案中，所 述分離純化包括離心、微濾、陽離子交換、納濾和超濾中的一種或多種；特別是，本發(fā)明所述 分離純化具體為：對酶解液依次進行離心、微濾、陽離子交換、納濾和超濾，其中所述微濾采 用孔徑為50?500nm的濾膜進行，所述納濾采用截留分子量為100?300道爾頓的濾膜進 行，所述超濾采用截留分子量為5000?13000道爾頓的濾膜進行。
[0015] 本發(fā)明還提供上述玉米活性肽添加劑在細胞無血清培養(yǎng)上的應(yīng)用。
[0016] 進一步地，所述細胞包括CH0細胞、Vero細胞、HEK-293細胞、BHK-21細胞、 MARC-145細胞、雜交瘤細胞、MDCK細胞中的一種或多種。
[0017]本發(fā)明還提供上述玉米活性肽添加劑在促進細胞增殖、提高細胞活力和/或增強 細胞產(chǎn)物表達上的應(yīng)用。
[0018]進一步地，所述細胞選自CH0細胞、Vero細胞、HEK-293細胞、BHK-21細胞、 MARC-145細胞、雜交瘤細胞、MDCK細胞中的一種或多種。
[0019] 本發(fā)明還提供一種無血清培養(yǎng)基，包括上述任一所述的玉米活性肽添加劑，所述 玉米活性肽添加劑在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0. 01?20g/L，優(yōu)選為1?10g/L，進一 步優(yōu)選為2?4g/L。
[0020] 本發(fā)明還提供上述任一所述的玉米活性肽添加劑的制備方法，包括如下步驟：
[0021] 1)首先采用非特異性蛋白酶對玉米黃粉進行第一酶解處理，制得第一酶解液；然 后采用特異性蛋白酶對所述第一酶解液進行第二酶解處理，制得玉米蛋白酶解液；
[0022] 2)將所述玉米蛋白酶解液進行離心，依次對離心上清液進行微濾、陽離子交換、納 濾和超濾，制得玉米活性肽；其中所述微濾采用孔徑為50?500nm的濾膜進行，所述納濾采 用截留分子量為1〇〇?300道爾頓的濾膜進行，所述超濾采用截留分子量為5000?13000 道爾頓的濾膜進行。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明所提供的制備方法，所述非特異性蛋白酶的酶量為每克蛋白2000? 6000單位，其中包括0?1000單位酶量的木瓜蛋白酶、500?2000單位酶量的堿性蛋白酶、 500?2000單位酶量的中性蛋白酶和0?1500單位酶量的菠蘿蛋白酶中的兩種或多種；所 述特異性蛋白酶的酶量為每克蛋白2000?3000單位，其中包括500?2000單位酶量的羧 肽酶和1000?2000單位酶量的風味蛋白酶中的一種或兩種。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所 采用的酶的組成來調(diào)節(jié)所述第一酶解處理和第二酶解處理的條件，如酶解溫度和pH值等。
[0024] 進一步地，所述步驟1)具體包括：將玉米黃粉與水混合制成蛋白溶液后，以每克 蛋白2000?6000單位的酶量向所述蛋白溶液中加入所述非特異性蛋白酶，于40?60°C下 第一酶解處理1. 5?4. 5小時，制得第一酶解液；再以每克蛋白2000?3000單位的酶量向 所述第一酶解液中加入所述特異性蛋白酶，于40?60°C下第二酶解處理2?3小時后，滅 酶，制得玉米蛋白酶解液。所述滅酶可以具體為：將第二酶解處理后的酶解液加熱至85? 13CTC 保溫 10 ?20min。
[0025] 進一步地，在進行所述第一酶解處理之前還包括：將所述蛋白溶液加熱至90? 95°C并保溫15?60min，使蛋白溶液中的蛋白變性，有利于后續(xù)的酶解處理。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明所提供的制備方法，步驟2)所述離心的轉(zhuǎn)速為4000?12000r/min，所 述離心可以采用碟式分離機進行。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明所提供的制備方法，步驟2)中所述微濾具體包括：先采用孔徑為 200?500nm的濾膜對所述離心上清液進行第一微濾，制得第