專利名稱：乳酸菌治療和/或預(yù)防賈第鞭毛蟲病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠防止腸賈第鞭毛蟲小腸細(xì)胞定殖的乳酸菌，或其培養(yǎng)上清，分別用于治療和/或預(yù)防與腸賈第鞭毛蟲胃腸定殖相關(guān)的疾病。本發(fā)明還涉及具有上述特征的雙歧桿菌菌株和應(yīng)用乳酸菌制備可吸收載體，如食物或藥物組合物，治療和/或預(yù)防腸賈第鞭毛蟲對(duì)小腸的感染的用途。
腸賈第鞭毛蟲是有鞭毛的原生動(dòng)物，它對(duì)個(gè)體胃腸道的感染可以導(dǎo)致疾病，如腹痛、稀軟便甚或嚴(yán)重腹瀉。它的生活周期有兩個(gè)階段，包囊期和滋養(yǎng)體期，這些不同的形式可以使微生物在不同的甚至惡劣的環(huán)境中存活。
包囊是處于靜息狀態(tài)的四核卵形細(xì)胞，是賈第鞭毛蟲病傳播的原因。個(gè)體攝入包囊后，通過(guò)接觸胃酸和/或消化酶而激發(fā)脫囊反應(yīng)。然后被稱為滋養(yǎng)體的寄生蟲出現(xiàn)了，它是雙核半梨形細(xì)胞，大約10um大小，前端寬而后部窄。其腹側(cè)大部分被腹盤覆蓋，相信腹盤至少可以部分解釋滋養(yǎng)體對(duì)小腸表面的粘附作用。
脫囊后，滋養(yǎng)體可能持續(xù)存在于感染個(gè)體的小腸中，甚至長(zhǎng)達(dá)數(shù)年。如果滋養(yǎng)體在腸液的沖擊下被帶到下游，它們又開(kāi)始形成包囊以適應(yīng)新的環(huán)境。
包囊隨糞便排出，可以忍受多種極端環(huán)境條件，包括不同的溫度、pH和張力條件。一個(gè)感染個(gè)體每天可能排出9×108個(gè)包囊，而已經(jīng)證實(shí)，低達(dá)10個(gè)包囊就足以導(dǎo)致另一個(gè)個(gè)體的感染。腸賈第鞭毛蟲的傳播有多種不同途經(jīng)，但主要傳播途經(jīng)為污染的水源和食物。人與人之間直接播散已經(jīng)通過(guò)一些日護(hù)中心和醫(yī)院爆發(fā)得到支持。此外，還發(fā)現(xiàn)野生動(dòng)物也是腸賈第鞭毛蟲的感染儲(chǔ)存宿主，可能對(duì)病原體的播散起一定作用。
賈第鞭毛蟲病與其他腸道疾病一樣，在嬰兒和兒童中更加嚴(yán)重。感染通常與腹瀉和吸收不良有關(guān)，導(dǎo)致兒童生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，可能最終導(dǎo)致新生兒死亡。
但是，大約一半的感染者沒(méi)有癥狀，并成為病原體播散的根源，因?yàn)槿狈θ魏慰烧鐒e的癥狀，沒(méi)有得到相應(yīng)的治療。
盡管對(duì)腸賈第鞭毛蟲的研究已經(jīng)傾注了大量努力，但賈第鞭毛蟲病的發(fā)病機(jī)理仍然不能僅用單一的毒力因素來(lái)解釋，迄今為止，也沒(méi)有分離到毒性化合物。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，賈第鞭毛蟲定殖的胃腸道在光學(xué)顯微鏡下形態(tài)各異，從粘膜結(jié)構(gòu)正常到幾乎全部絨毛萎縮。電子顯微鏡研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在超微結(jié)構(gòu)改變，如微絨毛的縮短和斷裂(Chavez et al.，Experimental Parasitol.80(1995)，133-138)。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)構(gòu)異常通常伴隨微絨毛膜內(nèi)乳糖酶、蔗糖酶和麥芽糖酶活性的降低，以及小腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的損害(Buret et al.，Gastroenterology 103(1992)，506-513；Roberts-Thomson et al.，Gastroenterology.71(1976)，57-61)。
除了上述兩種形式，腸賈第鞭毛蟲還發(fā)生了表面結(jié)構(gòu)的極端變化，并進(jìn)化了保護(hù)性蛋白家族，所述蛋白覆蓋所有暴露表面(Aley et al.，Infect.Agents Dis.4(1995)，161-166；Muller，et al.，Infect.Immun.64(1996)，1385-1390；Nash et al.，J.Euk.Microbiol.42(1995)，604-609)。這些變異的表面蛋白(VSPs)可以保護(hù)滋養(yǎng)體避免免疫和環(huán)境因素的侵害，這樣賈第鞭毛蟲可以逃避宿主的防御系統(tǒng)攻擊，并可在高度降解環(huán)境中存活，如在哺乳動(dòng)物腸道中繁殖。VSPs的修飾大約每6-13代發(fā)生一次，使宿主免疫系統(tǒng)很難或幾乎不可能針對(duì)病原體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。免疫和環(huán)境壓力還可以選擇不同的VSP表型。而且，還有報(bào)導(dǎo)，在脫囊后可以發(fā)生VSPs抗原轉(zhuǎn)換(Gillin et al.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)，679-705)。
人賈第鞭毛蟲病與固有層和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加相關(guān)，提示T細(xì)胞激活可能是微絨毛損害的原因。但是，與沒(méi)有沒(méi)有抑制的動(dòng)物相比，在小鼠中誘導(dǎo)免疫抑制卻導(dǎo)致對(duì)微絨毛相關(guān)酶更加嚴(yán)重的影響，提示在腸賈第鞭毛蟲感染過(guò)程中，上皮損傷似乎不僅僅依賴于免疫功能。
對(duì)賈第鞭毛蟲病的常見(jiàn)治療是給予抗生素，如屬于硝基咪唑類的藥物。但是，在流行地區(qū)對(duì)治療的反應(yīng)卻非常不一致(Katelaris et al.，Aliment.Pharmacol.Ther.8(1994)，187-192)。而且，由于小腸天然菌群的至少部分損傷，應(yīng)用這些抗生素通常伴隨嚴(yán)重的副反應(yīng)，如長(zhǎng)期腹瀉甚或其他致病微生物，如酵母菌導(dǎo)致的胃腸道感染。
因此，在本領(lǐng)域存在這樣一種需求，即為賈第鞭毛蟲病尋找其他治療方法，或者預(yù)防病原體對(duì)個(gè)體的感染。
因此本發(fā)明將問(wèn)題定為提供治療或預(yù)防腸賈第鞭毛蟲感染的其他方法。
這一問(wèn)題可通過(guò)下述方法解決，即應(yīng)用能夠防止腸賈第鞭毛蟲粘附小腸細(xì)胞的乳酸菌乳酸菌或雙歧桿菌上清液制備可吸收載體，治療和/或預(yù)防與腸賈第鞭毛蟲胃腸定殖相關(guān)的疾病。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，分別提供了新型乳酸菌和雙歧桿菌，能夠防止腸賈第鞭毛蟲粘附小腸細(xì)胞，所述細(xì)菌選自NCC90(I-2332)，NCC189(I-2333)或NCC200(I-2334)。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，這些微生物業(yè)已于1999年11月30日保藏在巴斯德研究所，并獲得上述保藏號(hào)。本發(fā)明還涉及含有這些微生物的食物和藥物組合物。
載體中包括的微生物數(shù)量大約為106-1012pfu(空斑形成單位)。包含的微生物可以就是這樣的，也可任選在從培養(yǎng)基中基本純化后。此外，載體還可以包括這些微生物的培養(yǎng)上清，在制備載體之前，優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行濃縮。
可吸收載體可以是食物，也可以是藥物組合物，如奶、酸奶、凝乳、奶酪、發(fā)酵奶、基于奶的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品、奶粉、嬰兒配方或其他類型的寵物食品。這些載體可以，例如通過(guò)應(yīng)用具有相應(yīng)特征的微生物發(fā)酵起始物質(zhì)來(lái)容易地生產(chǎn)。此外，微生物或其任選濃縮培養(yǎng)上清可以分別以液體或固體的形式加入載體。藥物組合物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行制備，包括將微生物和/或其任選濃縮培養(yǎng)上清加入載體，所述藥物組合物如片劑、液體細(xì)菌懸液、干的或濕的口服添加劑、干的或濕的管飼制劑。根據(jù)給藥方式，經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員可以選擇相信是適宜的劑型。
附圖中，

圖1顯示了添加105滋養(yǎng)體/cm2后，Portland-1菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附作用；圖2顯示了應(yīng)用未分化HT-29細(xì)胞進(jìn)行粘附試驗(yàn)的結(jié)果；圖3顯示了UNO菌株粘附于分化Caco-2細(xì)胞的掃描電鏡圖；圖4顯示了腸賈第鞭毛蟲在上皮細(xì)胞刷狀緣導(dǎo)致的微絨毛損害；圖5A顯示了賈第鞭毛蟲、乳酸菌和Caco-2細(xì)胞共同孵育的結(jié)果；圖5B顯示了Caco-2單層細(xì)胞與乳酸菌預(yù)孵育的結(jié)果；
圖6A顯示了一個(gè)粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中Portland-1和WB與本發(fā)明乳酸菌中和上清接觸；圖6B顯示了一個(gè)粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中WB和CIDCA與本發(fā)明乳酸菌中和上清接觸；圖7A顯示了WB菌株在酸性上清(pH4)(DMEM∶上清＝1∶1)中孵育1個(gè)小時(shí)獲得的結(jié)果；圖7B顯示，上清的中和(pH7)消除了抑制效果；圖8A顯示了WB菌株在不同pH La10菌株上清中孵育獲得的結(jié)果；圖8B顯示了應(yīng)用MRS稀釋酸性上清的結(jié)果；圖9顯示應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析菌株WB1在37℃酸化處理的MRSpH5(DMEM∶MRS＝1∶1)中孵育1小時(shí)的上清。
圖10顯示了寄生蟲在內(nèi)含100uCi3H腺嘌呤pH4或7的TYI-S-33培養(yǎng)基中預(yù)孵育后的孵育結(jié)果。
在導(dǎo)致本發(fā)明的研究過(guò)程中，發(fā)明者假定，治療和/或預(yù)防賈第鞭毛蟲病的病因?qū)W方法可能是，應(yīng)用可能拮抗寄生蟲的細(xì)菌在小腸定殖。
相信腸賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體對(duì)上皮細(xì)胞的粘附是在人類和動(dòng)物中感染的關(guān)鍵步驟。盡管賈第鞭毛蟲的粘附機(jī)制還沒(méi)有徹底闡明，有證據(jù)支持腹盤、滋養(yǎng)體能收縮的元件、水力和機(jī)械力、以及血凝素涉及介導(dǎo)連接。
考慮到乳酸是賈第鞭毛蟲生活周期的重要因素，因此應(yīng)用培養(yǎng)的消化道細(xì)胞樣細(xì)胞研究了腸賈第鞭毛蟲與乳酸菌的相互作用。
為了這一目的，應(yīng)用了下述微生物寄生蟲菌株和培養(yǎng)基微生物菌株細(xì)菌菌株La1(約氏乳桿菌)(I-1225)和La10(嗜酸乳桿菌)(I-2332)來(lái)自Nestec的收藏(洛桑，瑞士)。菌株CIDCA 536(兩岐雙岐桿菌)和CIDCA 538(嬰兒雙歧桿菌)來(lái)自Centro de Investigaciony Desarrollo enCriotecnologia de Alimentos的收藏(Universidad Nacional de La Plata，阿根廷)，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏，分別獲得保藏號(hào)I2333和I-2334。
腸賈第鞭毛蟲菌株P(guān)ortland-1(ATCC 30888)，UNO/04/87/1(ATCC50184)，New Orleans-1(ATCC 50137)和WB(ATCC 30957)從美國(guó)類型培養(yǎng)收藏處(Rockville，USA)購(gòu)得。
細(xì)菌在添加了0.05％半胱氨酸鹽酸(Sigma)的MRS肉湯中37℃生長(zhǎng)24小時(shí)。孵育在無(wú)氧條件下進(jìn)行(BBL GasPak Plus)。
原生動(dòng)物在Keister改良TYI-S-33培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基包括(每升)胰酶消化物(Difco)，20g；酵母提取物(BBL)，10g；葡萄糖(Merck)，10g；牛膽鹽(Difco)，0.75g；NaCl(Difco)，2g；L-半胱氨酸鹽酸(Sigma)，2g；抗壞血酸鈉鹽(Fluka)，0.2g；K2HPO4(Merck)，1g；KH2PO4(Merck)，0.6g；檸檬酸銨鐵(Sigma)，22.8mg；成熟牛血清(Sigma)，100ml；青霉素/壯觀霉素(Gibco，1000IU/ml，1000ug/ml)，15ml。還測(cè)試了用馬血清(Gibco)取代牛血清的結(jié)果。在濾器滅菌(濾孔0.22um)前應(yīng)用1N NaOH將pH調(diào)整到6.9。添加了10％馬血清的Keister改良培養(yǎng)基不支持Portland-1菌株的生長(zhǎng)，盡管孵育時(shí)間延長(zhǎng)到11天，也不論曾經(jīng)出現(xiàn)過(guò)滋養(yǎng)體開(kāi)始粘附到試管壁上的事實(shí)。在孵育的前5天，觀察到高比例的能動(dòng)寄生蟲。但之后，觀察到滋養(yǎng)體的膠著和能動(dòng)細(xì)胞的顯著減少。向這些損傷細(xì)胞中添加牛血清(10％)在24小時(shí)后又有生長(zhǎng)。為了增加賈第鞭毛蟲的可粘附面積，應(yīng)用25cm2的組織培養(yǎng)瓶(塑料瓶)。培養(yǎng)基一直加到瓶頸部位，以保持無(wú)氧條件。該過(guò)程導(dǎo)致在2-3天孵育后，可以收獲大約107滋養(yǎng)體/瓶，并且寄生蟲在瓶壁形成匯合的單層。
亞培養(yǎng)通過(guò)下述步驟進(jìn)行，在冰浴中冷卻培養(yǎng)物(5-10分鐘)，分離粘附的滋養(yǎng)體，然后在新鮮培養(yǎng)基中孵育0.2ml如此獲得的懸液。孵育在37℃進(jìn)行72小時(shí)，并使用不同的容器(玻璃或塑料)。腸賈第鞭毛蟲菌株的保存如上所述分離滋養(yǎng)體，并懸浮于TYI-S-33培養(yǎng)基中。將在TYI-S-33培養(yǎng)基中制備的兩倍濃縮防凍液(DMSO，蔗糖)分成三等分，以2分鐘的間隔添加到懸液中。防凍液的終濃度為DMSO 12％(v/v)，蔗糖4％(w/v)。在開(kāi)始冷凍循環(huán)前，將懸液(大約1×106滋養(yǎng)體/ml)在室溫平衡20分鐘。
用聚苯乙烯(壁厚4cm)隔熱分裝小瓶，置于-80℃。冷凍滋養(yǎng)體的再激活在37℃水浴中解凍分裝小瓶，并以寄生蟲懸液/新鮮培養(yǎng)基＝0.5/7的比率在TYI-S-33培養(yǎng)基中立即孵育。培養(yǎng)物在37℃暗室孵育。
本發(fā)明還通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)行說(shuō)明。
作為小腸細(xì)胞模型，應(yīng)用了Caco-2和HT29細(xì)胞系。對(duì)這些消化道細(xì)胞樣細(xì)胞的粘附作用通過(guò)下述方法進(jìn)行檢測(cè)實(shí)施例1滋養(yǎng)體的放射標(biāo)記寄生蟲在YTI-S-33培養(yǎng)基中孵育，并加入2.6-7.1uCi/ml的2-3H腺嘌呤(2Ci/mmol，1mCi/ml，Amersham Life Science)，或甲基-3H胸腺嘧啶(2Ci/mmol，1mCi/ml，Amersham Life Science)。在37℃孵育48-72小時(shí)。
滋養(yǎng)體在含有7.1uCi/ml的3H腺嘌呤或3H胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，DPM/寄生蟲比率差異非常大(表1)。盡管胸腺嘧啶的濃度比腺嘌呤高10倍，但整合卻非常低，結(jié)果分別為0.08和2.8DPM/寄生蟲。
表1加入7.1uCi/ml放射標(biāo)記堿基后賈第鞭毛蟲Portland-1菌株對(duì)3H的整合
表2顯示了腸賈第鞭毛蟲整合腺嘌呤的結(jié)果。通過(guò)應(yīng)用濃度低達(dá)2.5uCi/ml的腺嘌呤，可以獲得適宜的放射標(biāo)記。在這些條件中，DPM/寄生蟲范圍從Portland-1菌株的0.3到UNO菌株的1.6。
表2不同賈第鞭毛蟲菌株對(duì)2-3H腺嘌呤的整合結(jié)果是至少兩次測(cè)定的平均值
實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基添加了非必需氨基酸，青霉素(12IU/ml)，壯觀霉素(12ug/ml)，慶大霉素(47ug/ml)和未激活胎牛血清(20％v/v)。通過(guò)每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，在6孔組織培養(yǎng)板上制備單層細(xì)胞。孵育在37℃，10％CO2/90％空氣的條件下進(jìn)行。在每個(gè)培養(yǎng)雙日更新培養(yǎng)基。應(yīng)用49-51代細(xì)胞進(jìn)行粘附試驗(yàn)，只應(yīng)用匯合后晚期的單層細(xì)胞(至少培養(yǎng)2周)。
未分化HT-29細(xì)胞(美國(guó)類型培養(yǎng)收藏處，Rockville，MD)在DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基包括4.5g/l葡萄糖(Seromed，Biochrom KG，柏林，德國(guó))，并添加了Glutamax 1(0.01％v/v；L-丙氨酰-谷氨酰胺200mM，GIBCO，巴塞爾，瑞士)，慶大霉素(0.57mg/ml，GIBCO，巴塞爾，瑞士)和胎牛血清(10％v/v，GIBCO，巴塞爾，瑞士)。細(xì)胞在52代時(shí)應(yīng)用。實(shí)施例3粘附試驗(yàn)在獲得匯合的單層滋養(yǎng)體后，棄去培養(yǎng)基，這樣可以清除沒(méi)有粘附到表面的寄生蟲。如述收獲寄生蟲，并用含有11.4mM半胱氨酸HCl的DMEM(Gibco)洗滌3次。應(yīng)用1％聚甲醛稀釋寄生蟲(1∶2)，然后應(yīng)用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
將懸浮于DMEM-CYS(DMEM+11.4mM半胱氨酸鹽酸)中的放射標(biāo)記滋養(yǎng)體加入Caco-2細(xì)胞單層中，在37℃，5％CO2/95％空氣的條件下孵育1小時(shí)。然后應(yīng)用DMEM-CYS在37℃洗滌3遍，分離未結(jié)合的滋養(yǎng)體。
洗滌后，每孔加入1ml 1N NaOH，室溫孵育平板1小時(shí)。將細(xì)胞裂解液置于閃爍瓶中，再用PBS洗板。用β計(jì)數(shù)器(RackBeta Spectral，LKB，Wallac)測(cè)定放射活性。實(shí)施例4預(yù)孵育試驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)物用PBS洗滌3次。將在DMEM中調(diào)整至1×108CFU/ml的懸液加入Caco-2細(xì)胞單層中，在37℃孵育平板1小時(shí)。在細(xì)菌懸液粘附后，加入調(diào)整至1×105寄生蟲/ml的放射標(biāo)記滋養(yǎng)體。實(shí)施例5共同孵育試驗(yàn)在含有Caco-2單層細(xì)胞的6孔組織培養(yǎng)平板中，將含有1×105放射標(biāo)記賈第鞭毛蟲/ml的1ml寄生蟲懸液等分與1ml細(xì)菌懸液(1×108CFU/ml)混合。如上所述進(jìn)行粘附試驗(yàn)。實(shí)施例6乳酸菌上清對(duì)腸賈第鞭毛蟲粘附的作用乳酸菌培養(yǎng)物以900g離心15分鐘，并用4N NaOH中和上清(pH6.9-7.4)。在含有Caco-2單層細(xì)胞的6孔組織培養(yǎng)平板中，將溶于DMEM-CYS的含有1×105放射標(biāo)記滋養(yǎng)體/ml的1ml懸液與1ml中和上清混合。如上所述進(jìn)行粘附試驗(yàn)。試驗(yàn)還包括適宜的對(duì)照，對(duì)照是MRS，或用乳酸將MRS酸化至pH4.5，然后再中和到pH7。
將寄生蟲懸液(DMEM-cys)與等體積上清在37℃孵育1小時(shí)，進(jìn)行預(yù)孵育試驗(yàn)。在另一系列實(shí)驗(yàn)中，寄生蟲在純上清或MRS稀釋的上清中懸浮。孵育后，將賈第鞭毛蟲懸浮于DMEM中，并加入Caco-2細(xì)胞。
在40ml培養(yǎng)物中，通過(guò)在含有100uCi3H腺嘌呤的TYI-S-33培養(yǎng)基中孵育寄生蟲，進(jìn)行生長(zhǎng)評(píng)價(jià)。應(yīng)用籃綠激發(fā)光進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析(FACScanTM)。實(shí)施例7掃描電鏡檢查在24孔組織培養(yǎng)板內(nèi)，Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)于圓形玻璃片(直徑10mm)上，然后如示進(jìn)行滋養(yǎng)體粘附。通過(guò)在4℃添加溶于PBS的2.5％戊二醛進(jìn)行標(biāo)本固定16小時(shí)。室溫應(yīng)用2％四氧化鋨進(jìn)行后固定2小時(shí)，然后涂片在系列梯度乙醇溶液中(乙醇水溶液30，50，70，90，100％)脫水。最后，在臨界點(diǎn)應(yīng)用CO2干燥樣本，金封片，然后應(yīng)用Philips SEM 505在加速電壓30KV進(jìn)行檢查。實(shí)施例8腸賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附作用將總計(jì)105滋養(yǎng)體加入如實(shí)施例2所述的caco-2培養(yǎng)物中。粘附試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。無(wú)論單層細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)間，大約5％獲得粘附。對(duì)塑料表面的粘附非常高(21.8±2.4％)。
應(yīng)用未分化HT-29細(xì)胞進(jìn)行的粘附試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。獲得的菌株P(guān)ortland-1和WB的值分別為7.0±1.2％和5.5±0.6％。
菌株UNO對(duì)分化Caco-2細(xì)胞的粘附掃描電鏡圖如圖3所示。絕大多數(shù)賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體以腹側(cè)粘附于單層細(xì)胞。還見(jiàn)到一些寄生蟲以背側(cè)面向Caco-2細(xì)胞(箭頭)。也許圖4可以更清晰地顯示，滋養(yǎng)體粘附使腸細(xì)胞樣細(xì)胞刷狀緣產(chǎn)生了損傷痕跡。
賈第鞭毛蟲、乳酸菌和Caco-2細(xì)胞的共同孵育并未改變粘附(圖5A)。而且，Caco-2單層細(xì)胞與乳酸菌的預(yù)孵育也沒(méi)有干擾寄生蟲的粘附(圖5B)。實(shí)施例9乳酸菌培養(yǎng)物上清對(duì)腸賈第鞭毛蟲粘附Caco-2細(xì)胞的影響根據(jù)本發(fā)明，菌株P(guān)ortland-1和WB與中和的乳酸菌上清共同孵育，可以使Portland-1菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附降低19％(La1菌株)-40％(La10菌株)(圖6A)。對(duì)于菌株WB，數(shù)值范圍為20％(菌株CIDCA536)-40％(菌株La10)(圖6B)。盡管菌株之間的差異尚不能建立，但菌株La10與對(duì)照MRS相比，無(wú)論對(duì)Portland-1(P＝0.06)還是WB(P＝0.04)菌株均顯示了顯著差異。
考慮到應(yīng)用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行共同孵育實(shí)驗(yàn)的兼容pH范圍非常狹窄，試驗(yàn)通過(guò)下述步驟進(jìn)行，包括應(yīng)用上清預(yù)孵育寄生蟲，然后在進(jìn)行粘附試驗(yàn)前，再把它們懸浮于DMEM-半胱氨酸中。菌株WB與酸性上清(pH4)(DMEM∶上清＝1∶1)孵育1小時(shí)，可以使粘附降低15％(MRS)-大約3％(研究的所有菌株)(圖7A)。上清的中和(pH7)可以消除這種抑制作用，并發(fā)現(xiàn)粘附增加(圖7B)。
WB菌株與不同pH La10菌株上清孵育獲得的結(jié)果如圖8A所示。在pH4和5，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與對(duì)照MRS相比存在任何差異，但在pH6和7，發(fā)現(xiàn)粘附更高。
應(yīng)用MRS稀釋酸性上清可以導(dǎo)致pH的上升，上清稀釋1/8時(shí)粘附下降(相對(duì)濃度0.125，pH4.07，圖8B)。
應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析菌株WB1懸液發(fā)現(xiàn)存在大小(FSC)和胞漿復(fù)雜性(SSC)差異，所述菌株WB1懸液在酸化到pH5的MRS(DMEM∶MRS＝1∶1)中37℃孵育1小時(shí)(圖9)。將預(yù)孵育寄生蟲在pH4或7含有100uCi3H腺嘌呤的TYI-S-33培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，顯示了整合差異(圖10)。無(wú)論在MRS還是上清樣本中孵育28小時(shí)，pH4時(shí)檢測(cè)的腺嘌呤整合率都很低。盡管有些寄生蟲粘附到瓶壁上，但它們都不活動(dòng)。酸化到pH4.05然后又中和的MRS肉湯顯示的DPM值比對(duì)照值低20％。菌株La10中和上清的值大約是對(duì)照值的80％，在0.09水平差異顯著。在pH7的MRS和上清中，均發(fā)現(xiàn)大量聚合的寄生蟲。
賈第鞭毛蟲對(duì)不同細(xì)胞系的粘附結(jié)果(圖1和2)提示，非特異性粘附似乎是該系統(tǒng)的一個(gè)重要特征，因?yàn)樵诜只?xì)胞(培養(yǎng)不同時(shí)間的Caco-2)和未分化細(xì)胞(HT-29)間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。而且，對(duì)塑料表面的粘附也非常高。滋養(yǎng)體對(duì)Caco-2單層細(xì)胞的粘附顯然導(dǎo)致了微絨毛損傷(圖4)。
在細(xì)菌粘附后，通過(guò)洗滌步驟去除寄生蟲的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致單層細(xì)胞損傷，使排除值似乎并不可信。損傷的程度有賴于洗滌溶液，從DMEM-cys對(duì)微絨毛的抹除(掃描電鏡圖)到PBS對(duì)細(xì)胞的分離。考慮到上述發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)如下進(jìn)行，其中單層細(xì)胞與懸浮于DMEM-cys的細(xì)菌預(yù)孵育，但在加入寄生蟲前不進(jìn)行洗滌步驟。通過(guò)將寄生蟲、細(xì)菌和Caco-2細(xì)胞共同孵育，進(jìn)行另一序列實(shí)驗(yàn)。獲得的結(jié)果(圖5)與鞭毛運(yùn)動(dòng)和可收縮元件介導(dǎo)的滋養(yǎng)體“活性”粘附一致。不能運(yùn)動(dòng)的乳酸菌不能與寄生蟲競(jìng)爭(zhēng)粘附。
關(guān)于乳酸菌培養(yǎng)物上清的作用，業(yè)已顯示，它們能夠抑制賈第鞭毛蟲粘附。沒(méi)有任何理論支持，目前認(rèn)為這種抑制作用可能主要是由于乳酸菌分泌的特定有機(jī)酸。
應(yīng)用乳酸酸化的MRS預(yù)孵育寄生蟲顯示了細(xì)胞大小和胞漿復(fù)雜性的顯著變化，而且無(wú)論上清還是MRS對(duì)照，對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附均下降。在這些條件下，寄生蟲的活力受到高度影響，與下述實(shí)驗(yàn)所示一樣，所示實(shí)驗(yàn)中經(jīng)處理寄生蟲在新鮮TYI-S-33培養(yǎng)基中孵育。
在pH4與乳酸接觸后，寄生蟲的生長(zhǎng)基本停止，盡管一些寄生蟲仍能粘附到瓶壁上。在這些條件下，乳酸對(duì)于賈第鞭毛蟲似乎是致死性的。在pH7，乳酸的抑制作用仍然存在，酸化MRS和La10菌株上清之間的差異可以這樣解釋，即假定由于新鮮MRS和失去效能的上清間緩沖能力的差異導(dǎo)致乳酸濃度不同。
在應(yīng)用上清預(yù)孵育寄生蟲過(guò)程中，形成賈第鞭毛蟲聚合，這可能是在pH6和7粘附值非常高的原因(圖8)。如前所述，賈第鞭毛蟲粘附的主要機(jī)制懸液寄生蟲活力，盡管在應(yīng)用pH4的上清處理滋養(yǎng)體后顯示，死的原生動(dòng)物也可以粘附。但這些寄生蟲不能繁殖，因此不能有效導(dǎo)致寄生蟲病。而且，中和的乳酸菌培養(yǎng)上清減緩了賈第鞭毛蟲的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致聚合，不能粘附。
考慮到上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，已經(jīng)很清楚，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的乳酸菌可能成功用于治療或預(yù)防賈第鞭毛蟲病。
權(quán)利要求
1.能夠防止腸賈第鞭毛蟲粘附小腸細(xì)胞的乳酸菌或雙歧桿菌培養(yǎng)上清在制備用于治療和/或預(yù)防與腸賈第鞭毛蟲胃腸道定殖相關(guān)疾病的可吸收載體中的用途。
2.選自NCC533(I-1225)，NCC90(I-2332)，NCC189(I-2333)，NCC200(I-2334)的乳酸菌或雙歧桿菌在制備用于治療和/或預(yù)防與腸賈第鞭毛蟲胃腸道定殖相關(guān)疾病的可吸收載體中的用途。
3.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的用途，其中載體中包括的微生物數(shù)量為106-1012cfu/g。
4.前述任意權(quán)利要求的用途，其中可吸收載體是食物組合物或藥物組合物。
5.權(quán)利要求4的用途，其中食物組合物選自奶、酸奶、凝乳、奶酪、發(fā)酵奶、基于奶的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品、奶粉、嬰兒配方或?qū)櫸锸称贰?br> 6.權(quán)利要求4的用途，其中藥物組合物的形式是片劑、液體細(xì)菌懸液、干的口服添加劑、濕的口服添加劑、干的管飼制劑或濕的管飼制劑。
7.選自NCC90(I-2332)，NCC189(I-2333)，NCC200(I-2334)的乳酸菌。
8.食物或藥物組合物，其中含有選自NCC533(I-1225)，NCC90(I-2332)，NCC189(I-2333)，NCC200(I-2334)或雙歧桿菌NCC189(I-2333)或NCC200(I-2334)的微生物，用于治療和/或預(yù)防與腸賈第鞭毛蟲胃腸道定殖相關(guān)的疾病。
9.食物或藥物組合物，包括能夠防止腸賈第鞭毛蟲粘附小腸細(xì)胞的乳酸菌上清，用于治療和/或預(yù)防與腸賈第鞭毛蟲胃腸道定殖相關(guān)的疾病。
10.權(quán)利要求8或9的組合物，是奶、酸奶、凝乳、奶酪、發(fā)酵奶、基于奶的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵谷物的產(chǎn)品、奶粉、嬰兒配方或?qū)櫸锸称罚蛘咂湫问绞瞧瑒?、液體細(xì)菌懸液、干的口服添加劑、濕的口服添加劑、干的管飼制劑或濕的管飼制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠防止腸賈第鞭毛蟲小腸細(xì)胞定殖的乳酸菌或雙歧桿菌上清液在制備用于治療和/或預(yù)防與腸賈第鞭毛蟲胃腸定殖相關(guān)的疾病的可吸收載體中的用途。本發(fā)明還涉及具有上述特征的雙歧桿菌特異菌株和可吸收載體,如含有這樣的上清液或微生物的食物或藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1382056SQ00814779
公開(kāi)日2002年11月27日 申請(qǐng)日期2000年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月26日
發(fā)明者E·施夫林, P·佩雷茨 申請(qǐng)人:雀巢制品公司