專利名稱：一株降低烤煙煙葉亞硝胺的惡臭假單胞菌t2-2及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域和煙草陳化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及利用一種人工分離的微生物菌株，該菌株是一種降低煙草特有亞硝胺的反硝化細(xì)菌。所述的菌株為惡臭假單胞菌T2-2。本發(fā)明還涉及到該菌株在烤煙上部煙葉人工陳化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的發(fā)展，吸煙與健康問(wèn)題已得到廣泛的關(guān)注，煙草及其煙草制品和煙氣中的有害物質(zhì)，特別是有致癌性的煙草特有亞硝胺(TSNA)對(duì)人體的危害更加引起世界各國(guó)的重視，如今人們最關(guān)心的就是如何最大限度降低煙草中TSNA的含量問(wèn)題。 煙草特有亞硝胺(Tobacco-Specific Nitrosamines,簡(jiǎn)稱TSNA)是一組僅發(fā)現(xiàn)于煙草及其煙草制品和煙氣的致癌物質(zhì)，主要包括N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)，4-(N-甲基-亞硝基)-I-(3-吡啶基)-I- 丁酮(NNK)，N-亞硝基新煙草堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)等四種成分。其中NNN和NNK有顯著的致癌作用，而NAB和NAT則無(wú)明顯的致癌作用。煙葉中的TSNA幾乎都產(chǎn)生于調(diào)制期間，但其自身性狀對(duì)TSNA形成的影響也是非常明顯的。因此，降低煙葉中的TSNA需要從工業(yè)和農(nóng)業(yè)兩方面著手。農(nóng)業(yè)上，從栽培和育種的角度來(lái)降低TSNA，不屬于本發(fā)明的研究范疇；工業(yè)上，在調(diào)制過(guò)程中降低TSNA，一般來(lái)說(shuō)，常常需要使用化學(xué)試劑，而化學(xué)試劑的大量使用往往也帶來(lái)一系列負(fù)面問(wèn)題，如對(duì)環(huán)境的污染，還有對(duì)煙葉品質(zhì)的影響等，目前，絕大多數(shù)研究都是通過(guò)物理吸附的方法，即在卷煙濾嘴中加入沸石等，此方法對(duì)煙氣中TSNA降低率相當(dāng)高，但其造價(jià)非常昂貴，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，利用生物降低煙草TSNA就具有重要的社會(huì)意義及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。TSNA為4種亞硝胺的混合物，不能直接篩選降解TSNA的菌株，只能通過(guò)降低其前體物質(zhì)——煙堿和硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量，達(dá)到最終降低TSNA的目的，其中，硝酸鹽、亞硝酸鹽含量微少，是限制性因素，因此，本發(fā)明通過(guò)降解硝酸鹽、亞硝酸鹽途徑來(lái)降低TSNA。惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)T2-2是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物工程室篩選得到的一株可高效降低煙草特有亞硝胺的反硝化細(xì)菌?？緹熒喜繜熑~陳化試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株具有較好的應(yīng)用效果它對(duì)降低煙草亞硝胺有顯著效果(P < 0. 05)，其中，NNN和NNK的降低率分別達(dá)到28. 33%和57. 83%。國(guó)內(nèi)外對(duì)煙草特有亞硝胺的研究工作，取得了一定進(jìn)展，目前來(lái)說(shuō)，大多數(shù)研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，有待進(jìn)一步研究開發(fā)成產(chǎn)品加以應(yīng)用，且研究多數(shù)集中在白肋煙，關(guān)于降低烤煙中TSNA的研究鮮少報(bào)道。祝明亮(公開號(hào)CN 1579260A,2005)等從大量煙草內(nèi)生細(xì)菌中篩選出一株銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa KenLXP30),處理調(diào)制后能降低78. 23 98. 72%白肋煙TSNA含量。但銅綠假單胞菌有致病性，不適于作用煙草這種生活消費(fèi)品。祝明亮(公開號(hào)CN 1580237A，2005)等從大量煙草內(nèi)生細(xì)菌中篩選出一株放射根瘤菌KenLXR34 (Rhizobium radiobacter KenLXR34)菌株，接種葉面噴霧處理調(diào)制后，能降低55. 46%白肋煙TSNA含量。汪安云(2006)等研究表明從白肋煙TRM品種葉片中分離得到一株能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的菌株，該菌株為根瘤土壤桿菌屬，定名為Agrobateriumtumefaciens,噴灑菌株處理的煙葉中TSNA含量有明顯的降低，比同一時(shí)期對(duì)照煙葉中TSNA含量降低了 81.3%。這兩株菌的效果明顯，但是發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，且作用對(duì)象都為白肋煙新鮮煙葉。與上述菌株相比，本發(fā)明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) T2-2是一種降低烤煙煙草特有亞硝胺的反硝化細(xì)菌，可應(yīng)用于好氧與微氧環(huán)境，發(fā)酵工藝操作簡(jiǎn)單，發(fā)酵時(shí)間短，生長(zhǎng)條件適宜，在普通培養(yǎng)基中即可生長(zhǎng)良好，方便大規(guī)模生產(chǎn)。該菌株具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，應(yīng)用領(lǐng)域更廣，包括栽培，陳化，復(fù)烤前后和煙絲等方面。本發(fā)明涉及的該菌株在烤煙上部煙葉人工陳化中的應(yīng)用，彌補(bǔ)了烤煙中降低TSNA研究報(bào)道稀少的遺憾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一株可以在好氧條件下生長(zhǎng)的 能夠降低烤煙煙葉特有亞硝胺(TSNA)的菌株，利用該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)菌劑，降低烤煙煙葉中特有亞硝胺的含量，為卷煙生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)煙葉原料。申請(qǐng)人:從烤煙煙葉中分離得到一株好氧條件下生長(zhǎng)的能夠降低煙草特有亞硝胺的反硝化細(xì)菌，該菌株是惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) T2-2,于2011年3月21日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2011074，經(jīng)過(guò)16S rDNA序列測(cè)定，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) T2-2的微生物學(xué)特征短桿狀，無(wú)芽孢，革蘭氏陰性菌，V. P實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，甲基紅實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶陰性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，亞硝酸鹽還原陽(yáng)性(具體特征見實(shí)施例I)。本發(fā)明所提供的細(xì)菌為所篩選的一株好氧反硝化菌，系本發(fā)明人從大量烤煙煙葉表面細(xì)菌菌株中篩選出來(lái)的，具有顯著降低烤煙TSNA的作用。本發(fā)明所述的惡臭假單胞菌T2-2菌株的應(yīng)用方法是發(fā)酵培養(yǎng)一收集菌體一制備菌懸液一噴灑上部烤煙一人工陳化一卷煙。惡臭假單胞菌T2-2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)的條件為180rpm，28°C，12h。惡臭假單胞菌T2-2菌株的發(fā)酵菌體的收集在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，8000rpm，8min離心沉淀菌體。惡臭假單胞菌T2-2菌株的發(fā)酵菌體通過(guò)麥云度法(見趙斌和何紹江，2002)可制備成108CFU/mL的菌懸液。惡臭假單胞菌T2-2菌株108CFU/mL的菌懸液在烤煙上部煙葉的噴灑用量為煙葉質(zhì)量的10%，以煙葉噴灑后手捏不成團(tuán)為宜。惡臭假單胞菌T2-2菌株制備的108CFU/mL菌懸液噴灑人工陳化烤煙上部煙葉的條件為處理溫度28°C、相對(duì)濕度45%，處理時(shí)間21天。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方式
》。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是I.本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，即利用微生物的方法，通過(guò)降解TSNA的前體物質(zhì)——硝酸鹽、亞硝酸鹽,來(lái)降低TSNA含量，比傳統(tǒng)的物理化學(xué)降低TSNA含量的方法更為方便、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。2.本發(fā)明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2是一株好氧反硝化菌株，可應(yīng)用于好氧與微氧環(huán)境，發(fā)酵工藝操作簡(jiǎn)單，發(fā)酵時(shí)間短，生長(zhǎng)條件適宜，在普通培養(yǎng)基中即可生長(zhǎng)良好，方便大規(guī)模生產(chǎn)。3.本發(fā)明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2是從烤煙煙葉表面篩選出來(lái)的，比一般的外源細(xì)菌更容易在烤煙煙葉上生長(zhǎng)。4.本發(fā)明涉及的惡臭假單胞菌T2-2在烤煙上部煙葉人工陳化中的應(yīng)用，完善了關(guān)于降低烤煙TSNA研究報(bào)道稀少的不足。5.本發(fā)明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2，該菌株對(duì)TSNA的降低率較高，用無(wú)菌水配成菌懸液后，對(duì)烤煙上部煙葉葉面進(jìn)行噴霧處理，與對(duì)照相比，煙葉中TSNA的關(guān)鍵組分NNN 和 NNK，分別下降 NNN 28. 33% 和 NNK 57. 83%。


序列表SEQ ID NO : I是惡臭假單胞菌T2-2菌株的16S rRNA的核苷酸序列。圖I :是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 :是本發(fā)明惡臭假單胞菌T2-2在100X油鏡下的菌體形態(tài)。圖3 :是本發(fā)明惡臭假單胞菌T2-2在Giltay培養(yǎng)基中的顏色、產(chǎn)氣變化。圖4 :是用無(wú)菌水處理烤煙上部煙葉后，陳化過(guò)程中Ck的硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量變化曲線。圖中CK為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即用無(wú)菌水處理烤煙上部煙葉。圖5 :是惡臭假單胞菌T2-2對(duì)烤煙上部煙葉處理后，陳化過(guò)程中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量變化。圖6 :是不同濃度惡臭假單胞菌T2-2處理烤煙上部煙葉后，在14d時(shí)硝酸鹽含量和2Id時(shí)亞硝酸鹽含量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例I惡臭假單胞菌T2-2的分離、篩選及微生物學(xué)分類鑒定(I)本發(fā)明所獲得的惡臭假單胞菌T2-2是這樣篩選分離的a、選取20g烤煙煙葉進(jìn)行馴化；馴化初始，將來(lái)自于武漢卷煙廠倉(cāng)庫(kù)的不同煙葉產(chǎn)地(湖北省、云南省)自然存放2年的煙葉，未經(jīng)過(guò)人工陳化處理的烤煙煙葉用已滅菌的剪刀剪碎，選取20g置入300mL反硝化液體培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中，28°C下培養(yǎng)2 5d ;10倍稀釋涂分離培養(yǎng)基平板，得到單菌落，多次經(jīng)LB平板劃線純化后，轉(zhuǎn)入斜面保藏。b、從斜面中挑取少許菌接到裝有8mL LB培養(yǎng)液的PA瓶中活化，12h后，按V/V計(jì)I 2%接種量接種到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，放入搖床，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下培養(yǎng)10h。取ImL發(fā)酵液接入裝有反硝化培養(yǎng)基的三角瓶中，得到對(duì)總氮去除率達(dá)到50%以上的菌株。C、將總氮去除率達(dá)到50%以上的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取ImL發(fā)酵液接到裝有Giltay培養(yǎng)基的試管中，放入28°C恒溫箱中培養(yǎng)10 14d。期間觀察試管的變色、產(chǎn)氣情況,如圖3。Giltay管中最先變色并最先產(chǎn)氣的,其反硝化的能力最強(qiáng)。該Giltay培養(yǎng)基試管是這樣實(shí)現(xiàn)的將制備好的Giltay液體培養(yǎng)基,加入大試管(20mmX200mm)中,把纏有細(xì)線的小試管(12mmX75mm)倒立放入大試管中，將小試管的氣體排盡，塞住大試管，留部分細(xì)線在大試管外，便于小試管的提升和降落，滅菌備用。上述篩選分離中所需的培養(yǎng)基配方為反硝化培養(yǎng)基(或稱富集培養(yǎng)基):KN032.Og/L、MgSO4 7H20 0. 2g/L、K2HPO4O. 5g/L和酒石酸鉀鈉20. Og/L ;加蒸餾水至IL ;滅菌前將pH調(diào)至7. 2 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20mino分離培養(yǎng)基KN032.0g/L、MgS04 *7H20 0. 2g/L、K2HP040. 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. Og/L，瓊脂15 20g/L ;加蒸餾水至IL ;滅菌前調(diào)pH至7. 2 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。LB培養(yǎng)基蛋白胨10. Og/L,酵母提取物5. Og/L和氯化鈉10. Og/L,瓊脂15 20g/ L ;加蒸餾水至IL ;滅菌前調(diào)pH至7. 2 7. 4 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。Giltay培養(yǎng)基A溶液:1. Og KNO3,1. Og天冬酰胺和5mL I % BTB酒精溶液；加蒸餾水至 500mL ；B 溶液8. 5g 檸檬酸鈉，I. Og MgSO4 7H20，0. 05g FeCl3 6H20,1. Og KH2PO4,0. 2g CaCl2 *2H20 ;加蒸餾水至500mL。將A溶液和B溶液這兩種溶液混合；滅菌前調(diào)pH至7. 0 ;在115°C高壓蒸汽下滅菌30min。(2)傳統(tǒng)微生物學(xué)分類鑒定I.形態(tài)特征菌落呈白色，光滑，邊緣整齊，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色呈陰性。2. 16S rDNA 鑒定方法a.本發(fā)明的惡臭假單胞菌T2-2基因片段長(zhǎng)度為1420bp，該菌的Genebank登錄號(hào) JF699758b. 16S rDNA引物設(shè)計(jì)與PCR過(guò)程其具體步驟如下將惡臭假單胞菌T2_2(保藏號(hào)為CCTCC NO M2011074)菌株接種于LB培養(yǎng)基，180rpm，28°C震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體，懸浮后加入溶菌酶，采用CTAB法和SDS法破壁(張瑞福，2003)，采用苯酚-氯仿-異戊醇提取基因組DNA (顏?zhàn)臃f和王海林，1998)，用 16S rRNA 通用引物正向引物 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，對(duì)其 16S rRNA 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增的產(chǎn)物交由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。PCR條件為94°C，5min ；95°C,40s, 55 (-1°C / 循環(huán))°C，30s，72°C，25s，6 循環(huán)；95 °C, 40s, 55 °C, 45s, 72 °C, I. 5min，30 循環(huán)；72°C,5min,10°C,5min。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1420bp，其核苷酸序列表如序列表SEQ ID NO:I所示。3.生理生化檢測(cè)對(duì)分離到的分離菌T2-2進(jìn)行37項(xiàng)相關(guān)生理生化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與GeorgeM. Garrity ((Bergeyj s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VIII, 1974 年版中提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株(Pseudomonas putida biovar B)的生理生化結(jié)果完全一致，最終將本發(fā)明的分離菌T2-2鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida),其生理生化特征如表I。表I惡臭假單胞菌T2-2的生理生化實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一株在好氧條件下生長(zhǎng)能降低烤煙煙葉亞硝胺的反硝化細(xì)菌，其特征在于，該菌株是惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)T2-2,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2011074，其16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.一株在好氧條件下生長(zhǎng)能降低烤煙煙葉亞硝胺的反硝化細(xì)菌的培養(yǎng)方法，其特征在于如下步驟 a、制備一級(jí)種子取保藏號(hào)為CCTCCNO :M2011074的惡臭假單胞菌T2-2斜面種子在在LB培養(yǎng)基平板上劃線，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12hz至出現(xiàn)游離單菌落，得到一級(jí)種子； b、制備二級(jí)種子液用接種環(huán)取一環(huán)步驟a的一級(jí)種子，接種于裝有50mL的LB液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，培養(yǎng)溫度為28°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為12h，使OD6tltl至.2.0，得到二級(jí)種子液； C、發(fā)酵培養(yǎng)取步驟b的二級(jí)種子液以V/V計(jì)為0. 5 3. 0%的接種量接入裝有20 .40mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，控制搖床溫度為26 30°C，轉(zhuǎn)速為160 .200rpm,起始pH為6. 8 7. 6，發(fā)酵周期為36 60h，得到惡臭假單胞菌； 其中 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及配制方法如下蛋白胨8. 0 5. Og/L，酵母提取物3. 0 .8. Og/L,氯化鈉8. 0 15. Og/L,瓊脂15 20g/L ;補(bǔ)充蒸懼水至IL ;滅菌前調(diào)pH至7. 0 .8.0 ;在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
3.權(quán)利要求I所述的菌株在降解烤煙煙葉亞硝胺中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一株降低煙草特有亞硝胺(TSNA)的菌株篩選及其應(yīng)用。本發(fā)明分離的細(xì)菌為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)T2-2，其保藏號(hào)為CCTCC NOM2011074。本發(fā)明的主要特征是，從大量烤煙煙葉表面細(xì)菌中篩選出一株能夠明顯降低煙草特有亞硝胺含量的菌株——惡臭假單胞菌T2-2，通過(guò)液體發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)后，T2-2菌懸液噴施于上部烤煙煙葉表面處理，煙葉中TSNA中的關(guān)鍵組分NNN和NNK，分別下降NNN 28.33％和NNK 57.83％。
文檔編號(hào)A24B15/20GK102732440SQ201110090798
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者何結(jié)望, 冀志霞, 吳風(fēng)光, 孫政, 李丹, 李琳, 陳守文 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)