專利名稱：與植物疾病抗性相關(guān)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景發(fā)明領(lǐng)域細(xì)菌，真菌和病毒感染產(chǎn)生食品和纖維的植物對農(nóng)民和消費(fèi)者造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，稻瘟病是栽培水稻經(jīng)濟(jì)破壞性最大的疾病，它由絲狀真菌Magnaporthe grisea引起(Ou，1985)。(文獻(xiàn)目錄在說明書結(jié)尾提供)。該疾病在全世界大多數(shù)水稻生長區(qū)發(fā)生，每年使農(nóng)民損失50億美元(Moffat，1994)。該疾病顯著減少水稻產(chǎn)量，特別是在溫帶水淹區(qū)和熱帶高地水稻生態(tài)系統(tǒng)中。使用抗性栽培品種是控制該疾病最經(jīng)濟(jì)和有效的方法。隨著轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)的進(jìn)展，可以鑒定天然的宿主防御機(jī)制并轉(zhuǎn)移與這些機(jī)制相關(guān)的基因至商業(yè)栽培品種中或控制在商業(yè)栽培品種中該基因的表達(dá)。期望該基因的表達(dá)可賦予轉(zhuǎn)基因植物以疾病抗性。
背景技術(shù)：
在最近幾十年里，對稻瘟病真菌的遺傳抗性已了解了很多。盡管宿主防御該病原體的分子機(jī)制大多數(shù)未知，但相信稻瘟病真菌以其它葉片病原體典型的方式感染水稻植物。當(dāng)分生孢子落在葉片表面時開始M.grisear感染。在一滴水中，分生孢子產(chǎn)生芽管，生長并分化成一種特化的感染結(jié)構(gòu)，稱為附著器，它牢固地附著于植物表面(Bourett和Howard，1990)。特化的細(xì)胞產(chǎn)生巨大的膨壓，用于穿透下面的植物表面(Howard，1994)。經(jīng)過病原體侵入穿透進(jìn)植物細(xì)胞可能損傷該細(xì)胞結(jié)構(gòu)并激活應(yīng)答創(chuàng)傷的基因。
在植物中，涉及創(chuàng)傷防御反應(yīng)的兩種促細(xì)胞分裂原激活蛋白(“MAP”)激酶已被鑒定(Usami等，1995；Bogre等，1997)。Usami等(1995)報(bào)道了一種MAP激酶，它由包括雙子葉植物和單子葉植物的各種植物物種創(chuàng)傷的葉片誘導(dǎo)。在苜蓿中的另一種MAP激酶，p44MMK4由創(chuàng)傷激活。創(chuàng)傷后，p44MMK4的活性在1分鐘內(nèi)升高，但在30分鐘內(nèi)又降至基礎(chǔ)水平。已證實(shí)MAP激酶，PMK1在稻瘟病真菌M.grisea的附著器形成和感染生長中起作用(Xu和Hamer，1996)。
在哺乳動物和酵母中MAP激酶信號級聯(lián)是參與將胞外刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)成胞內(nèi)應(yīng)答的一個主要途徑(Shyy和Chien，1997，Gabay等，1997，Sameiima等，1997)。MAP激酶是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一個特定類型，且參與各種生理學(xué)過程，如細(xì)胞生長，分化，癌變和對環(huán)境壓力的應(yīng)答(Herskowitz，1995，Cohen，1997)。在哺乳動物中，MAP激酶或胞外信號調(diào)節(jié)的激酶(“ERKs”)最初被鑒定為促細(xì)胞分裂原(誘導(dǎo)增生的物質(zhì))的轉(zhuǎn)導(dǎo)物。后來，MAP激酶也顯示出與信號激素，神經(jīng)遞質(zhì)和分化信號有關(guān)(Marshall，1994)。目前，MAP激酶途徑在酵母和哺乳動物中最清楚且已鑒定了幾個不同的MAP激酶途徑(Ruis和Schuller，1995)。MAP激酶級聯(lián)的基本組件是一組特異性的3個功能上互相關(guān)聯(lián)的激酶。由上游(即，反應(yīng)次序較早的)激酶通過在所有MAP激酶中接近激酶結(jié)構(gòu)域Ⅷ的保守蘇氨酸和酪氨酸殘基磷酸化引起MAP激酶的活化(Marshall，1994；Hirt，1997)。這些雙重特異性MAP激酶激酶(MAPKKs)僅能催化特異性MAP激酶的活化且不能互相替代。MAPKKs本身通過屬于MAPKK激酶(MAPKKKs)類型，或者是raf和mos蛋白質(zhì)的上游激酶經(jīng)磷酸化被激活(Marshall，1994；Hirt，1997)。
在植物中，已從苜蓿(Jonak等，1993；1995)，擬南芥屬(Mizoguchi等，1994)，豌豆(Stafstrom等，1993)，矮牽牛(Decroocq-Ferrant等，1995)，煙草(Wilson等，1993)和歐芹(Ligterink等，1997)鑒定了編碼MAP激酶的一些基因。與哺乳動物激酶相似，已顯示AtMAPK1和AtMAPK2參與細(xì)胞增生(Jonak等，1993，Mizoguchi等，1994)。在植物中也已鑒定了一些應(yīng)激誘導(dǎo)的MAP激酶，它們應(yīng)答寒冷，炎熱，創(chuàng)傷，干旱和機(jī)械應(yīng)力(Bogre等，1997，Jonak等，1996；Seo等，1995，Ligterink等，1997；Zhang和Klessig，1997)。真菌誘導(dǎo)劑與歐芹細(xì)胞中的質(zhì)膜受體以高親和性結(jié)合迅速激活48KDMAP激酶ERMA(Ligterink等，1997)。激活的ERMK轉(zhuǎn)位進(jìn)細(xì)胞核，在細(xì)胞核中其可參與防御基因的轉(zhuǎn)錄激活。最近，鑒定了MAP激酶p48 SIP在煙草細(xì)胞中被水楊酸(SA)處理激活，該激酶是激活一些植物防御反應(yīng)的內(nèi)源性信號(Zhang和Klessig，1997)。
這些研究表明MAP激酶是針對病原體感染的植物防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個重要成份。Ligterink等(1997)和Zhang和Klessig(1997)已分別發(fā)現(xiàn)歐芹懸浮細(xì)胞中的誘導(dǎo)物應(yīng)答MAP激酶和煙草懸浮細(xì)胞中的SA-活化的MAP激酶。然而，沒有證據(jù)表明MAP激酶被植物物種中的天然病原體感染活化。因此，需要鑒定與該防御機(jī)制相關(guān)的MAP激酶基因和在宿主植物中表達(dá)該基因(或調(diào)節(jié)其表達(dá))的方法以賦予疾病抗性。
本發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)了新的MAP激酶基因和它所編碼的蛋白質(zhì)。根據(jù)序列分析，該新基因是MAP激酶基因家族的一個新成員，它編碼519個氨基酸的59KD蛋白質(zhì)。將它命名為BIMK1，以表示稻瘟病誘導(dǎo)的MAP激酶。BIMK1被稻瘟病真菌M.grisea強(qiáng)烈誘導(dǎo)且推測參與針對稻瘟病感染的水稻防御反應(yīng)。
在一個方面，本發(fā)明涉及含有該新的MAP激酶基因的脫氧核糖核酸(“DNA”)，其信使核糖核酸(“mRNA”)轉(zhuǎn)錄物和其所編碼的蛋白質(zhì)。在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及含有有效連接到植物活性啟動子上的該新基因的表達(dá)載體和用該載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和植物。
在另一方面，本發(fā)明涉及賦予植物，特別是單子葉植物，如水稻，小麥，玉米，大麥和蘆筍疾病抗性的方法，包括遺傳修飾植物以實(shí)現(xiàn)該新的MAP激酶基因的表達(dá)。
附圖的簡要描述

圖1是使用標(biāo)記的BIMK1 cDNA作探針對限制性酶消化的水稻基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析的放射自顯影照片。
圖2是使用標(biāo)記的BIMK1 cDNA作探針對M.grisea接種后不同時間點(diǎn)從水稻葉組織分離的總RNA(50mg)進(jìn)行Northem分析的放射自顯影照片。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在水稻中鑒定，克隆并測序了編碼命名為BIMK1的MAP激酶的基因。在SEQ ID NO1中提供了包括5＇和3＇未翻譯區(qū)的全長克隆的序列。從核苷酸13到核苷酸1569的區(qū)域編碼519個氨基酸的59KD的蛋白質(zhì)，其序列在SEQ ID NO:2中顯示。BIMK1基因從用稻瘟病病原體Magnaporthe grisea感染的水稻中分離出。
本發(fā)明提供了一種分離的DNA，它基本上具有SEQ ID NO1的核苷酸13到1569之間的序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離的mRNA，它互補(bǔ)于基本上具有SEQ ID NO1的核苷酸13到1569之間的序列的脫氧核糖核酸。本發(fā)明還提供了一種分離的蛋白質(zhì)，它基本上具有SEQ ID NO2所示的序列。本文使用的“分離的”指核酸或蛋白質(zhì)存在于不同于其天然環(huán)境的環(huán)境中。例如，它可以在克隆或表達(dá)載體中被克隆，可存在于細(xì)菌細(xì)胞中，可與用于轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞的其它手段相聯(lián)系或可存在于在自然狀態(tài)下與其無聯(lián)系的植物中。本文使用的術(shù)語“基本上具有序列”指主要是所指序列的序列，前提是核酸或蛋白質(zhì)保留了天然分子的激酶功能。因此，包含不明顯降低該蛋白質(zhì)功能的保守取代，缺失和添加。
與BIMK1基因區(qū)域互補(bǔ)的探針，引物，反義分子和其它核酸分子可用于其擴(kuò)增和分析，其表達(dá)的調(diào)節(jié)等。因此，本發(fā)明提供了在嚴(yán)格雜交條件下能與上述DNA分子(或其互補(bǔ)序列)雜交的DNA或RNA分子。該條件在本領(lǐng)域中是熟知的，且包括當(dāng)DNA或RNA分子與靶DNA相應(yīng)的區(qū)域之間有至少大約57％，優(yōu)選至少大約80％，最優(yōu)選至少大約90％-100％的同源性時能形成穩(wěn)定的雜交體的那些條件。使用常規(guī)重組DNA技術(shù)可將DNA摻入植物或細(xì)菌細(xì)胞中。一般來說，該技術(shù)包括將該DNA插入表達(dá)載體中，該表達(dá)載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的編碼蛋白質(zhì)的序列所必需的元件和一個或多個標(biāo)記序列以利于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或植物。
許多植物活性啟動子在本領(lǐng)域是已知的且可用于實(shí)現(xiàn)本文所公開的核酸序列的表達(dá)。合適的啟動子包括，例如，nos啟動子，小亞基葉綠素A/B結(jié)合多肽，花椰菜花葉病毒35S啟動子，和與MAP激酶基因，如植物中的BIMK1天然相聯(lián)的啟動子。SEQ ID NO6提供了BIMK1編碼序列上游的5＇非翻譯區(qū)序列。該區(qū)域含有該基因推斷的啟動子。SEQIDNO6與BIMK1編碼區(qū)5＇端重疊，在1378-80位置出現(xiàn)ATG起始密碼子?！癟ATA”盒出現(xiàn)在序列的1302-1306位。除了指導(dǎo)本文所述的MAP激酶DNA的表達(dá)外，該啟動子具有用作植物活性啟動子的一般用途，特別是用于實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在單子葉植物，如水稻中的表達(dá)。
一旦本發(fā)明分離的DNA被克隆進(jìn)表達(dá)載體中，可使用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物中。術(shù)語“植物細(xì)胞”包含來自植物的任何細(xì)胞，包括來自未分化的組織，如愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物，以及植物種子，花粉或植物胚的任何細(xì)胞。適于轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織，根組織，分生組織，原生質(zhì)體，下胚軸，子葉，盾片，苗端，根，未成熟胚，花粉和花藥。
轉(zhuǎn)化植物的一種技術(shù)是經(jīng)過將該植物的組織與用含有根據(jù)本發(fā)明的DNA的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種物接觸。一般來說，該方法包括用細(xì)菌懸液接種植物組織且在無抗生素的再生培養(yǎng)基中在25-28℃培養(yǎng)組織48至72小時。
來自土壤桿菌屬的細(xì)菌可有利地用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。該細(xì)菌的合適種類包括根癌土壤桿菌和毛根病土壤桿菌。根癌土壤桿菌(例如，菌株LBA4404或EHA105)由于其熟知的轉(zhuǎn)化植物的能力而特別有用。
用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一方法包括將惰性或生物活性顆粒推進(jìn)植物細(xì)胞。這一技術(shù)在美國專利號4，945，050，5，036，006和5，100，792中公開，這些專利都屬于Sanford等，本文以參考文獻(xiàn)引用。一般來說，該方法包括在有效穿透細(xì)胞外表面且摻進(jìn)其內(nèi)部的條件下將惰性或有生物學(xué)活性的顆粒推進(jìn)細(xì)胞。當(dāng)使用惰性顆粒時，可經(jīng)過用含有本發(fā)明分離的DNA的載體包裹顆粒將該載體導(dǎo)入細(xì)胞。也可將生物學(xué)活性顆粒(例如，分別含有需要導(dǎo)入的DNA的干酵母細(xì)胞，干細(xì)菌或噬菌體)推進(jìn)植物細(xì)胞組織。
轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一方法是電穿孔方法。該方法包括混合原生質(zhì)體和所需的DNA，經(jīng)過電脈沖在細(xì)胞膜上形成孔以便將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，從而轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。該方法通常具有高度可重復(fù)性，且用該方法可將各種基因?qū)雴巫尤~植物，特別是水稻植物中(Toriyama等，1998，Shimamoto等，1989和Rhodes等，1988)。
與電穿孔方法相似的是將所需基因與原生質(zhì)體混合且用聚乙二醇(“PEG”)處理混合物，從而將基因?qū)朐|(zhì)體的方法。該方法與電穿孔方法的區(qū)別在于使用PEG代替電脈沖(Zhang W.等，1998，Datta等，1990和Christou等，1991)。
其它方法包括1)用核酸培養(yǎng)種子或胚(Topfer R等，1989，Ledoux等，1974)；2)處理花粉管，(Luo等，1988)；3)脂質(zhì)體方法(Caboche，1990和Gad等，1990)和4)顯微注射方法(Neuhaus G.等，1987)。
用于從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物的已知方法可用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。一般來說，可將外植體，愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物暴露于合適的化學(xué)環(huán)境中(例如，細(xì)胞分裂素和生物素)使新生長的細(xì)胞可分化并產(chǎn)生胚，然后再生出根和幼苗。
據(jù)信本發(fā)明的分離的DNA可用于在單子葉植物(“單子葉”)，和雙子葉植物(“雙子葉”)中增強(qiáng)對引起疾病的病原體的抗性。優(yōu)選用于商業(yè)上重要的單子葉植物，如水稻，小麥，大麥，玉米和蘆筍。
在天然存在BIMK1基因的植物中，經(jīng)過控制該內(nèi)源性基因的表達(dá)而不是用含有該基因的載體轉(zhuǎn)化該植物可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)疾病抗性。例如，經(jīng)過修飾或取代調(diào)節(jié)該基因表達(dá)的內(nèi)源性啟動子，增強(qiáng)子或其它控制信號可實(shí)現(xiàn)該控制，例如實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的表達(dá)或編程性表達(dá)。
BIMK1預(yù)期的蛋白質(zhì)序列攜帶絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化性功能的所有11個保守的結(jié)構(gòu)域。用M.grisea接種后早到4小時時迅速誘導(dǎo)BIMK1的表達(dá)，表明BIMK1參與對稻瘟病真菌的防御反應(yīng)。
在雙子葉中已鑒定了一些應(yīng)激誘導(dǎo)的MAP激酶。如下面表1所示，這些基因的蛋白質(zhì)序列顯示出70-75％的同源性。例如，歐芹ERMK和煙草SIMK具有74.4％的蛋白質(zhì)相同性。然而，如表1所示，BIMK1與從雙子葉植物分離的這兩個應(yīng)激相關(guān)的MAP激酶僅具有大約50％的相同性。這表明在單子葉和雙子葉植物物種中MAP激酶具有序列差異。除了序列差異外，BIMK1比所有克隆的MAP激酶基因長大約500bp。該基因的3＇區(qū)含有與動物中ADH基因相似的結(jié)構(gòu)域。在對稻瘟病感染的防御反應(yīng)中該結(jié)構(gòu)域的功能是未知的。
本發(fā)明由下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例并不是限制性的。
實(shí)施例材料和方法水稻植物和稻瘟病接種在本實(shí)驗(yàn)中使用攜帶Pi-2基因的抗性等基因品系C1O1A51和易感性栽培品種CO39。用M.grisea的菲律賓分離株P(guān)O6-6接種3周齡的水稻植物。接種后，植物在濕箱中在黑暗中26℃下保持24小時。然后，將接種的植物移進(jìn)生長室中以10小時光照和14小時黑暗在25-26℃培養(yǎng)7天。在接種后的0，4，8，12，24，48，72小時從兩種栽培品種中收獲葉組織。
RNA分離，cDNA合成和RT-PCRRNeasy微型試劑盒(Qiagen，德國)用于從150-200mg水稻葉組織分離總RNA。使用Qiagen Oligotex Spin柱從總RNA分離的Poly(A)+RNA用作逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中的模板。根據(jù)克隆的基因Cf-9，一種針對葉霉菌暗黃枝孢(Cladosporiumfulvum)的西紅柿抗性基因(Jones等，1994)的DNA序列設(shè)計(jì)了兩個引物CF9-RT和CF9-Rev。CF9-RT的引物序列是5＇-AAAAGCACAAGTTGCTGC-3＇(SEQ ID NO3)，它是起始密碼子后從217到235bp的DNA序列。CF9-Rev的序列是5′TAACGTCTATCGACTTCT-3′(SEQ ID NO4)，它是起始密碼子后從1408至1426bp的Cf-9的逆向鏈序列。按廠商(GIBCO-BRL，Life-Technology，USA)提供的如下方法進(jìn)行RT-PCR。然后在1.2％的瓊脂糖凝膠中分離擴(kuò)增的cDNA。
克隆和DNA測序?qū)⑻禺愋詶l帶克隆進(jìn)pGEM-T載體(Promega，USA)中。使用ABI PRISM 377 DNA測序儀(PerKin-Elmer，CA，USA)測序克隆。用軟件DNAstar和Sequencher3.0分析序列。
BAC文庫篩選和亞克隆用于BAC濾膜制備和篩選的方法按Wang等(1995)所述。雜交和洗滌條件與Hoheisel等(1993)所述相同。
Southern雜交按Dellporta等(1984)所述分離水稻基因組DNA。用限制性酶消化DNA并在0.8％瓊脂糖凝膠中分離，然后轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜(Amersham，UK)上。使用大引物標(biāo)記試劑盒(Amersham，UK)標(biāo)記探針。使用迅速雜交溶液(Clonetech，USA)。
Northem雜交使用Trizol總RNA分離試劑(GIBCO-BRL，Life-Technology，USA)分離用于Northem印跡分析的總RNA。每泳道50微克的總RNA在1.0％瓊脂糖凝膠中分離并使用NorthemMax試劑盒(Ambion，USA)按廠商說明書轉(zhuǎn)移到Hybond-N+膜(Amersham，UK)上。按上文對Southern雜交所述同樣地進(jìn)行Northem雜交。
實(shí)施例1分離稻瘟病感染后誘導(dǎo)的cDNA片段用分離株P(guān)O6-6接種8小時后從葉組織分離總RNA。純化的mRNA用作第一鏈cDNA合成的模板。當(dāng)引物CF9-RT和CF9-Rev用于RT-PCR時，在接種后的C1O1A51(相容的)和CO39(不相容的)中擴(kuò)增出4條帶(資料未顯示)。然后將這些cDNA片段克隆進(jìn)pGEM-T載體。測序具有不同插入片段大小的克隆。數(shù)據(jù)庫檢索揭示了具有350bp插入片段的克隆與哺乳動物和酵母MAP激酶具有高度同源性。
實(shí)施例2從水稻BAC文庫分離基因組克隆為了克隆該基因的全長基因組片段，使用實(shí)施例1所述的350bpcDNA片段作探針篩選栽培品種IR64(Yang等，1997)的水稻BAC文庫。從完整的BAC文庫鑒定了4個陽性BAC克隆(3-07，17-H21，43-H15和43-F5)。用3種不同的酶消化3個BAC克隆的微量制備的DNA以檢查它們是否是在染色體區(qū)域中重疊的克隆。根據(jù)限制性圖譜，發(fā)現(xiàn)這3個克隆是重疊的克隆。因此，選擇一個BAC克隆(3-07)并亞克隆進(jìn)pBluescript-SK(Strategene，USA)。鑒定與350bpcDNA片段雜交的重組克隆(M1，4.5Kb)并用于測序。根據(jù)與已知的MAP激酶基因比較，發(fā)現(xiàn)它含有包括推斷的啟動子和部分編碼區(qū)(大約400bp)的該基因的5′區(qū)。
實(shí)施例3使用RT-PCR分離全長cDNA為了從水稻中分離全長的cDNA，根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)含有覆蓋起始密碼ATG序列的引物(5＇-AACACAGTGGAAATGGAGTTCTTCA-3＇)SEQ ID NO5。使用該引物和寡聚-dT引物(Life-Technologies，USA)進(jìn)行RT-PCR。從C1O1A51感染的葉片制備的cDNA(接種8小時后)獲得了2.0Kb的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-T載體并測序。該序列在SEQ ID NO1中顯示。它含有1557bp的開放閱讀框，相應(yīng)于519個氨基酸(SEQ IDNO2)。該基因命名為BIMK1，表示稻瘟病誘導(dǎo)的MAP激酶。將該氨基酸序列與從各種生物分離的幾個MAP激酶序列進(jìn)行了比較。如表1所示，這些序列具有明顯的同源性。在表的A部分中，顯示了BIMK1推斷的氨基酸序列(N-端)與來自其它生物的MAP激酶的其它成員的多重序列對比。比較了BIMK1與來自紫苜蓿的MsERK(Duerr等，1993)，來自煙草的WIPK(Seo等，1995)，來自擬南芥屬的ATMPK(Mizuguchi等，1994)，來自人的ERK2(Owaki等，1992)，來自歐芹的ERM(Ligterink等，1997)的氨基酸序列。黑體字代表與BIMK1匹配的氨基酸殘基。導(dǎo)入缺口以最大化對比序列。星號表示MAP激酶保守的TXY(在BIMK1中，“X”是天冬氨酸，而在大多數(shù)MAP激酶中，它是谷氨酸)磷酸化基序。以羅馬字標(biāo)記11個MAP激酶的亞域(Hanks等，1988)。M.grisea BIMK1基因含有在哺乳動物和植物的所有已知MAP激酶中存在的全部11個高度保守的亞域。令人感興趣的是，BIKM1還含有在其C端與哺乳動物乙醇脫氫酶(ADH)同源的50個氨基酸。表B部分顯示了BIMK1推斷的氨基酸序列(C末端)與動物和植物中其它ADH基因的多重序列對比。ADH在許多生物包括人類中存在，它以NAD+/NADH作必需輔酶在氧化還原反應(yīng)中代謝乙醇。
實(shí)施例4BIMK1在水稻基因組中保守且被定位到聚集稻瘟病抗性基因的區(qū)域用限制性酶BamHⅠ，EcoRⅡ和HindⅢ消化C1O1A51和CO39的DNA。使用BIMK1 cDNA片段作探針按材料和方法部分所述進(jìn)行Southem雜交。對于這3種酶在抗性和易感性品系之間沒有檢測到多態(tài)性(圖1)。使用4個其它栽培品種的DNA已獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明BIMK1在水稻栽培品種中是保守的。BIMK1被定位在水稻染色體12的RG341和RG574標(biāo)記之間，該區(qū)域聚集了稻瘟病抗性基因Pi-4(t)和Pi-6(t)。
實(shí)施例5以稻瘟病真菌誘導(dǎo)BIMK1從在接種后的不同時間點(diǎn)收集的水稻葉組織分離總RNA。使用BIMK1 cDNA片段作為32p標(biāo)記的探針雜交印跡。發(fā)現(xiàn)早到在接種后4小時時高度誘導(dǎo)BIMK1。接種24小時后基因BIMK1的表達(dá)減少(圖2)。在抗性(C1O1A51)和易感性(C039)品系中BIMK1的誘導(dǎo)水平非常相似(圖2)。由于除了C1O1A51攜帶稻瘟病抗性基因Pi-2外，C1O1A51和Co39具有相同的遺傳背景，因此表明BIMK1獨(dú)立于Pi-2被誘導(dǎo)且參與稻瘟病的一般防御途徑。
表1(A)I IIBIMK1 ------------------------------------------MEFFT EYGEASQ-YQIQ-EV IGKGSYGVVAAAVDT RTGERVAIkKINDVF 48MsERK1 MEGGGAPPADTVMSD AAPAPPQMGIENIPA VLSHGGRFIQYNIFG NIFEVTAKYKPPIMP IGKGAYGIVCSAHNS ETNEHVAVKKIANAF 90WIPK ------------MAD ANMGAGGGQFPDFPS VLTHGGQYVQFDIFG NFFEITTKYRPPIMP IGRGAYGIVCSVLNT ELNEMVAVKKIANAF 78ATMPK1 ----------------------MATLVDPPN GIRNEGK-HYFSMWQ TLFEIDTKYMP-IKP IGRGAYGVVCSSVNS DTNEKVAIKKIHNVY 67ERK2 -----------------------------MA AAAAAGP---EMVRG QVFDVGPRYTN-LSY IGEGAYGMVCSAYDN LNKVRVAIKKIS-PF 57ERM--------------- -MANPGDGQYTDFPA IQTHGGQFIQYNIFG NLFQVTKKYRPPIMP IGRGAYGIVCSIMNT ETNEMVAVKKIANAF 74Ⅲ Ⅳ Ⅴ ⅥBIMK1 EHVSDATRILREIKL LRLLRHPDIAEIKHI MLPPSRREFQDIYVV FELMESDLHQVIRAN DDLTPEHYQFFLYQL LRALKYIHAANVFHR 138MsERK1 DNKIKAKRTLREIKL LRHMDHENVVAIRDI VPPPQREVFNDVYIA YELMDTDLHQIIRSN QALSEEHCQYFLYQI LRGLKYTHSANVLHR 180WIPK DIYMDAKRTLREIKL LRHLDHENVIGLRDV IPPPLRREFSDVYIA TELMDTDLHQIIRSN QGLSEDHCQYFMYQL LRGLKYIHSANVLHR 168ATMPK1 ENRIDALRTLRELKL LRHLRHENVIALKDV MMPIHKMSFKDVYLV YELMDTDLHQIIKSS QRLSNDHCQYFLFQL LRGLKYIHSANILHR 157ERK2 EHQTYCQRTLREIKI LLRFRHENIIGINDI IRAPTIEQMKDVYIV QDLMETDLYKLLKT- QHLSNDHICYFLYQI LRGLKYIHSANVLHR 146ERMDNYMDAKRTLREIKI LRHLDHENVIAITDV IPPPLRREFTDVYIA TELMDTDLHQIIRSN QGLSEEHCQYFLYQL LRGLKYIHSANIIHR 164Ⅶ* * Ⅷ ⅨBIMK1 DLKPKNILANSDCKL KICDFGLARASFNDA PSAIFWTDYVATRWY RAFEIMWLIFSKYTP AIDIWSIGCIFAELL TGRPLFRGKNVVHQL 228MSERK1 DLKPSNLLLNANCDL KICDFGLARVTSET- ---DFMTEYVVTRWY RARELL-LNSSDYTA AIDVWSVGCIFMELM DRKPLFPGRDHVHQL 265NIPK DLKPSNLLVNANCDL KICDFGLARPNIEN- ---ENMTEYVVTRWY RAPELL-LNSSDYTA AIDVWSVGCIFMELM NRKPLFGGKDHVHQI 253ATMPK1 DLKPGNLLVNANCDL KICDFGLARASNTKG ---QFMTEYVVTRWY RAPELL-LCCDNYGT SIDVWSVGCIFAELL GRKPIFQGTECLNQL 243ERK2 DLKPSNLLLNTTCDL KICDFGLARVADPDH DHTGFLTEYVATRWY RAPEIM-LNSKGYTK SIDIWSVGCILAEML SNRPIFPGKHYLDQL 235ERMDLKPSNILLNANCDL KICDFGLARHNTDDE ---FMTEYVVTRWY RAPELL-LNSSDYTV AIDIWSVGCIYMELM NRKPLFPGKDHVHQM 249ⅩⅪBIMK1 DIITDLLGTPSSETL SRIRNEKARRYLSTM RKKHAVFFSQKFRNT DPLALRLLERLLAFD PKDRPSAEEALADPY FASLANVEREPSRHP 318MsERK1 RLLMELIGTPSEDDL GFL-NENAKRYIRQL PPYRRQSFQEKFPHV HPEAIDLVEKMLTFD PRKRITVEDALAHPY LTSLHDISDEP--VC 352WIPK RLLTELLGTPTEADL GFLQNEDAKRYIRQL PQHPRQQLAEVFPHV NPLAIDLVDKMLTFD PTRRITVEEALDHPY LAKLHDAGDEP--IC 341ATMPK1 KLIVNIIGSQREEDL EFIVNPKAKRYIRSL PYSPGMSLSRLYPCA HVLAIDLLQKMLVFD PSKRISASEALQHPY MAPLYDPNANP--PA 331ERK2 NHILGILGSPSQEDL NCIINLKARNYLLSL PHKNKVPWNRLFPNA DSKALDLLDKMLTFN PHKRIEVEQALAHPY LEQYYDPSDEP--IA 323ERMRLLTELLGSPTEADL GFVRNEDAKRFILQL PRHPRQPLRQLYPQV HPLAIDLIDKMLTFD PSKRITVEEALAHPY LARLHDIADEP--IC 237BIMK1 ISKLEFEFERRKLTK DDVRELIYREILEYH PQMLQEYMKG 358(519)MsERK1 MTPFSFDFEQHALTE EQMKELIYREALAFN PEYQQ 387WIPK PVPFSFDFEQQGIGE EQIKDMIYQEALSLN PEYA 375ATMPK1 QVPIDLDVDED-LRE EMIREMIWNEMLHYH PQASTLNTEL 370ERK2 EAPFKFDMELDDLPK EKLKELIFEETARFQ PGYRS 358ERMTKPFSFEFETAHLGE EQIKDMIYQEALAFN PDCA 371
表1(續(xù))(B)BIMK1-rice 445 SAGQNGVTSTDLSSRSYLKSAS-ISASKCVAVKDNKEPEDDYISEEM-EGSVDGLEEQVF-RMQFLV 509ADH-rabbit 214 AAGASRIIAVDINKDKFPK-AKEVGATECINPQDYKKPIQEVIQE-ISDGGVDFSFE-VIGRLDTVV 277ADH-horse 212 AAGAARIIGVDINKDKFAK-AKEVGATECVNPQDYKKPIQEVLTE-MSNGGVDFSFE-VIGRLDTMV 275ADH-human 161 AAGAARIIAVDINKDKFAK-AKELGATECINPQDYKKPIQEVLKE-MTDGGVDFSFE-VIGRLDTMM 224
文獻(xiàn)目錄Bogre，L.，Meskiene，I.，Barker，P.，Heberle-Bors，E.，HuskissonNS，Hirt，H.，(1997)。創(chuàng)傷誘導(dǎo)特定激酶途徑的迅速和瞬時激活。植物細(xì)胞，9，75-83。
Caboche(1990)，植物生理學(xué)79173-176。
Christou et al.(1991)生物/技術(shù)9957-962。
Cohen P.(1997)。哺乳動物細(xì)胞中MAP和SAP激酶生理學(xué)底物的研究。細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)展.7353-361.
Datta等.(1990)生物/技術(shù).8736-740。
Decroocq-Ferrant，V.D.S.，Van Went，J.，Schmidt，E.，Kreis，M.(1995).在矮牽牛屬雜交品種的營養(yǎng)和雌性生殖器官中表達(dá)MAP/ERK蛋白激酶基因家族的同源物。植物分子生物學(xué)27(2)339-350.
Dellaporta，S.L.，W.J.，and Hicks J.B.(1984).Maizeminiprep，pp.36-37植物分子生物學(xué)，實(shí)驗(yàn)室教程手冊。Russell M.編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室。
Duerr，B.G.M.，Ropp，T.，Jacobs，T.(1993).MsERKl來自開花植物的促細(xì)胞分裂原激活蛋白激酶。植物細(xì)胞，5(1)87-96。
Fukuda，M.G.Y.，Nishida，E.(1997).MAP激酶與MAP激酶的相互作用，其在MAP激酶細(xì)胞核—細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸控制中的可能作用。EMBOJ.16(8)1901-1908。
Gabay L.S.R.，Shilo，B.Z.(1997).果蠅胚胎發(fā)生期間MAP激酶原位激活寰椎。發(fā)育.124(18)3535-3541。
Gad等，79177-183(1990)Hanks，S.K.，Hunter，T.(1998).蛋白激酶家族催化域的保守特征和推斷的種系發(fā)生。科學(xué)，241(4861)42-52。
Hirt，H.(1997).MAP激酶在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的多種作用。植物科學(xué)動態(tài)2(1)11-15。
Jonak，C，P.A.，Bogre L，Hirt H，Heberle-Bors E.(1993).以細(xì)胞周期依賴性和器官特異性方式表達(dá)MAP激酶的植物同源物。植物雜志，3(4)611C17。
Jonak，C，K.S.，Lloyd C，Chan J，Hirt H.(1995).MMK2，一種新的苜蓿MAP激酶，特異性地互補(bǔ)酵母MPK1功能。普通分子遺傳學(xué)，248(6)686-694。
Jonak，C，K.S.，Ligterink W， Barker PJ，Huskisson NS，Hirt H.(1996)．植物應(yīng)激信號促細(xì)胞分裂原激活蛋白激酶途徑被寒冷和干旱激活。美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，93(20)11274-11279。
Jones DA，T.C.，Hammond-Kosack KE，Ballint-Kurti PJ，Jones JD.經(jīng)轉(zhuǎn)座子標(biāo)記分離對暗黃枝孢抗性的西紅柿Cf-9基因。科學(xué)，266(51 86)789-793。
Ledoux等，(1974)自然24917-21。
Ligterink W，K.T.，zur Nieden U，Hirt H，Scheel D.(1997).在植物的病原體防御中受體介導(dǎo)的MAP激酶激活?？茖W(xué)，2762054-2057。
Luo等(1998)植物分子生物學(xué)報(bào)道6(3)165煙草中的MAP激酶。植物細(xì)胞，9(5)809-824。
Marshall CJ.(1994).MAP激酶激酶激酶，MAP激酶激酶和MAP激酶。Curr.Opin.Genet.Dev.，4(1)82-89。
Mizoguchi T.G.Y.，Nishida E，Yamaguchi-Shinozaki K，Hayashida N，Iwasaki T Kamada H，and S.K.(1994).在擬南芥中鑒定了編碼MAP激酶同源物的2個cDNA并分析了生長素在培養(yǎng)的細(xì)胞中激活該激酶活性的可能作用。植物雜志，5(1)111-122。
Moffat AS.(1994).定位疾病抗性序列?？茖W(xué)，2651804-1805.
Ou SH.(1985).水稻疾病。第二版。PP.109-201，The Cambrian NewsLtd.，(Great Britain)。
Rhodes等，(1988)科學(xué)240204-207。
Ruis H，S.C.(1995).酵母應(yīng)激信號傳導(dǎo)。Bioessays，17(11)959-965。
Samejima I，M.S.，F(xiàn)antes PA.(1997).在裂殖酵母中激活應(yīng)激反應(yīng)MAP激酶途徑的多種方式。EMBOJ.，16(20)6162-6170。
Seo S，O.M.，Seto H，Ishizuka K，Sano H，Ohashi Y.(1995).煙草MAP激酶在傷口信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中可能的介導(dǎo)物。科學(xué)2701988-1992.Shyy JY，C.S.(1997).整合素在機(jī)械應(yīng)激和附著的細(xì)胞反應(yīng)中的作用。Curr.Opin.Cell Bi0l.，9(5)707-713。
Shimamoto等，(1989)Nature 338274-277。
Stafstrom JP，A.M.，Anderson DH.(1993).豌豆MAP激酶同源物的分子克隆和表達(dá)。植物分子生物學(xué)，22(1)83-90。
Topfer R.等，(1989)植物細(xì)胞1133-139。
Toriyama等，(1988)生物/技術(shù)61072-1074。
Usami S，B.H.，Ito Y，Nishihama R和Machida Y.(1995).剪切激活植物中46千道爾頓的蛋白質(zhì)激酶。美國科學(xué)院學(xué)報(bào)，928660-8664。
Wang GL，H.T.，Song WY，Wang HP，Eonald PC，.(1995).水稻細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建和與疾病抗性基因連鎖的克隆的鑒定。植物雜志，7(3)525-533。
Wilson C，E.N.，Garmer A，Vicente O，Heberle-Bors E.(1993).分離和鑒定編碼推斷的MAP激酶的煙草cDNA克隆。植物分子生物學(xué)，23(3)543-551。
Xu JP，H.J.(1996).MAP激酶和cAMP信號調(diào)節(jié)稻瘟病真菌Magnaporthe grisea中感染結(jié)構(gòu)的形成和病原體的生長。GenesDev.，10(21)2696-2706。
Yang D，P.A.，Nandi S，Subudhi P，Zhu Y，Wang G，Huang N，.(1997).細(xì)菌枯萎病人工染色體(BAC)文庫的構(gòu)建及鑒定水稻中與染色體4-特異性RFLP標(biāo)記重疊的BAC克隆。Theor.Appl.Genet.出版中。
Zhang S，K.D.(1997).水楊酸激活煙草中的48-KD激酶。植物細(xì)胞9(5)809-824。
Zhang W.等，(1988)Theor.Appl.Genet.76835-840。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院(除美國外)何朝族(對美國)王國梁(對美國)(ⅱ)發(fā)明名稱與植物疾病抗性相關(guān)的基因(ⅲ)序列數(shù)6(2) SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1957堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物體Oryza sativa(B)株系C1O1A51(ⅶ)直接來源(B)克隆BlMK1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1AACACAGTGG AAATGGAGTT CTTCACTGAGTATGGAGAAGCAAGCCAGTA CCAGATCCAG 60GAAGTCATTG GCAAAGGAAG TTATGGAGTAGTTGCTGCTGCAGTAGATAC CCGCACGGGT 120GAGCGGGTTG CGATCAAGAA GATCAATGATGTGTTTGAGCATGTATCAGA CGCTACGCGC 180ATATTGCGTG AGATCAAGCT CCTTCGTCTGCTCCGTCACCCAGACATAGC TGAGATCAAA 240CACATTATGC TTCCCCCTTC TCGAAGGGAGTTCCAAGATATTTATGTTGT TTTTGAGCTC 300ATGGAATCAG ATCTCCATCA AGTCATCAGAGCGAACGATGACCTCACCCC GGAGCACTAC 360CAGTTTTTCC TGTACCAACT TCTTCGTGCTCTCAAGTACATCCATGCAGC TAATGTATTT 420CATCGCGATC TAAAGCCCAA GAATATACTGGCAAACTCAGACTGCAAATT GAAAATATGT 480GATTTCGGAC TTGCCCGAGC ATCATTCAATGATGCCCCTTCAGCAATATT TTGGACGGAT 540TATGTTGCAA CGAGGTGGTA CCGAGCACCTGAATTATGTGGCTCATTTTT CTCCAAATAC 600ACTCCTGCAA TTGATATTTG GAGTATTGGGTGCATATTTGCTGAACTTCT CACTGGGAGA 660CCACTATTTC CTGGGAAGAA TGTTGTGCACCAATTAGATATTATAACAGA TCTTCTTGGA 720ACTCCATCAT CAGAAACCTT ATCCAGGATTCGAAATGAGAAGGCCAGGAG ATACTTGAGC 780ACCATGCGGA AAAAACATGC TGTCCCCTTCTCTCAGAAGTTCCGCAATAC TGACCCCTTG 840GCTCTTCGTC TGCTAGAGCG TTTACTGGCATTTGATCCTAAAGATCGGCC TTCAGCTGAA 900GAAGCTTTGG CTGATCCGTA CTTCGCAAGTCTTGCTAATGTGGAACGTGA GCCCTCAAGA 960CATCCAATCT CAAAACTTGA GTTTGAATTCGAGAGACGGAAGCTGACAAA AGATGATGTT1020AGAGAATTAA TTTATCGAGA GATTTTGGAG TATCACCCAC AGATGCTGCA AGAGTATATG 1080AAAGGTGGAG AGCAGATTAG CTTCCTCTAT CCAAGTGGGG TTGATCGCTT CAAACGACAG 1140TTTGCACACC TTGAGGAGAA CTACAGCAAA GGAGAAAGAG GTTCTCCACT GCAGAGGAAG 1200CATGCTTCTT TACCGAGGGA GAGAGTAGGT GTATCAAAGG ATGGTTATAA CCAACAAAAC 1260ACCAATGACC AAGAGAGGAG TGCAGATTCC GTTGCCCGCA CTACAGTAAG CCCTCCAATG 1320TCACAAGATG CACAACAACA TGGATCTGCT GGCCAAAATG GTGTGACATC CACAGACTTG 1380AGTTCGAGGA GCTATCTGAA GAGTGCAAGC ATTAGTGCTT CCAAGTGTGT CGCTGTCAAG 1440GACAATAAAG AACCAGAGGA TGATTACATC TCTGAAGAAA TGGAAGGGTC GGTCGATGGA 1500TTGTTTGAAC AAGTTTTCAG GATGCAATTC CTAGTGCACA ACGATGACGA TGATCAGTGC 1560AAGATTTTGT GAGGCGCACC AAATGCTGAT AATTTCCAAG CAGGATGCTG CACTGCAAGT 1620TTGGACTTTG GACAATGCAA GTATGCAACA GCCAGCCCGA GATGATTGGC ATCTTCTTAT 1660GCTCATCCAT GTTCACATAT TCTTCTTGCC ATTGTGCTGT CTGTCACTAC AGGACCCCTG 1740CATGGATTAA TGTATTATCC CTCTGATGTA ACACTAGATT AGTTCATCTG TCCATGGAGG 1800AATGAATAGC AAGCAGCCAG CTTGTGCATC ATGTGGGCAT GTTCATTTTC CAGTGAGATC 1860TAGTCATATC CATGCTTTTT TTGTAATGGT ATATGAAACA GTTTATCAGT GAGACTGTGG 1920TCCATTCCTC TTTGAAGAAC TCCATTTCCA CTGTGTT1957(2)INFORMATION FOR SEQ I0 NO2(ⅰ)序列特征(A)長度519個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)是(ⅳ) 反義否(ⅵ) 原始來源(A)生物體Oryza sativa(B)株系 ClolA51(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO2Met Glu Phe Phe Thr Glu Tyr Gly Glu Ala Ser Gln Tyr Gln Ile Gln1 5 10 15Glu Val Ile Gly Lys Gly Ser Tyr Gly Val Val Ala Ala Ala Val As920 25 30Thr Arg Thr Gly Glu Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn Asp Val Phe35 40 45Glu His Val Ser Asp Ala Thr Arg Ile Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu50 55 60Arg Leu Leu Arg His Pro Asp Ile Ala Glu Ile Lys His Ile Met Leu65 70 75 80Pro Pro Ser Arg Arg Glu Phe Gln Asp Ile Tyr Val Val Phe Glu Leu85 90 95Met Glu Ser Asp Leu His Gln Val Ile Arg Ala Asn Asp Asp Leu Thr100 105 110Pro Glu His Tyr Gln Phe Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Ala Leu Lys115 120 125Tyr Ile His Ala Ala Asn Val Phe His Arg As9 leu Lys Pro Lys Asn130 135 140Ile Leu Ala Asn Ser Asp Cys Lys Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu145 150 155 160Ala Arg Ala Ser Phe AsnAsp Ala Pro Ser Ala Ile Phe Trp Thr Asp165170 175Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Lau Cys Gly Ser Phe180 185 190Phe Ser Lys Tyr Thr Pro Ala Ile Asp Ile Trp Ser Ile GlyCys Ile195 200 205Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val210 215 220Val His Gln Leu Asp Ile Ile Thr Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Ser225 230 235 240Glu Thr Leu Ser Arg Ile Arg Asn Glu Lys Ala Arg Arg Tyr Leu Ser245 250255Thr Met Arg Lys Lys His Ala Val Pro Phe Ser Gln Lys Phe Arg Asn260 265 270Thr Asp Pro Leu Ala Leu Arg Leu Leu Glu Arg Leu Leu Ala Phe Asp275 280 285Pro Lys Asp Arg Pro Ser Ala Glu Glu Ala Leu Ala Asp Pro Tyr Phe290 295 300Ala Ser Leu Ala Asn Val Glu Arg Glu Pro Ser Arg His Pro Ile Ser305 310 315 320Lys Leu Glu Phe Glu Phe Glu Arg Arg Lys Leu Thr Lys Asp Asp Val325 330 335Arg Glu Leu Ile Tyr Arg Glu Ile Leu Glu Tyr His Pro Gln Met Leu340 345 350Gln Glu Tyr Met Lys Gly Gly Glu Gln Ile Ser Phe Leu Tyr Pro Ser355 360 365Gly Val Asp Arg Phe Lys Arg Gln Phe Ala His Leu Glu Glu Asn Tyr370 375 380Ser Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro Leu Gln Arg Lys His Ala Ser Leu385 390 395 400Pro Arg Glu Arg Val Gly Val Ser Lys Asp Gly Tyr Asn Gln Gln Asn405 410 415Thr Asn Asp Gln Glu Arg Ser Ala Asp Ser Val Ala Arg Thr Thr Val420 425 430Ser Pro Pro Met Ser Gln Asp Ala Gln Gln His Gly Ser Ala Gly Gln435 440 445Asn Gly Val Thr Ser Thr Asp Leu Ser Ser Arg Ser Tyr Leu Lys Ser450 455 460Ala Ser Ile Ser Ala Ser Lys Cys Val Ala Val Lys Asp Asn Lys Glu465 470 475 480Pro Glu Asp Asp Tyr IIe Ser Glu Glu Met Glu Gly Ser Val Asp Gly485 490 495Leu Phe Glu Gln Val Phe Arg Met Gln Phe Leu Val Ris Asn Asp Asp500 505 510Asp Asp GLn Cys Lys Ile Leu515(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=＂合成DNA＂(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ) 反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3AAAAGCACAA GTTGCTGC(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=＂合成DNA＂(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ) 反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4TAACGTCTAT CGACTTCT(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=＂合成DNA＂(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ) 反義否(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO5AACACAGTGG AAATGGAGTT CTTCA 25(2) SEQ ID NO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1678堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來源(A)生物體Oryza sativa(B)株系C101A51(ⅶ)直接來源(B)克隆B1MK1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6GTAATTTTTT CCCCATCACC ACCACCACCA CCATCGCTTT CTTCATCTTC GCCTTCTGGT 60CTGCATCCAT CCATCCATCC ATTACTCGCC GAAGACTTCG CGCGGGGAGA GAGGAGGCAA 120GCTTTGTCGC GGGAACGCGG GAAGAAAGGT CCGAGCTTGG AAGGAGAAGA AGAAGTAGCC 180AAGAACGCGA GAGCTTGGAA GGCGAGCTGC GGTGGTGTAG CTAGCCAATG CCGGCGGGGA 240ACTGGTAGGG AGGGGGATGG GGGGAGGGGG CACGCTCGTC GACGGATTCC GCCGCATCTT 300CCACCGCCGC ACGGCGTCCG GCTCCAACCA GTCGTCCAAC GCCGGCGAGG AGGCCGCCTC 360CTCCGACCTC GAGGTCGCCG ACGACCCGGA TCTCGTCGCC CTCCGCTCCA TCCGCATCCG 420CGTGCCCAAG CGCAAGATGC CCTCTCCCCG TCGAGAGCCA CAAGAAGGTG AGGAGGTGCC 480TAGTGTGAAG TGTGCTTTGC TTTGCTTCGT TTTCTTTTCA GTTTGGGGGT GAAATGAAAG 540TTTCAGGCTT TCTCGTGATC CCTTGATTCG TGGCCACGAG GGGTTCTTAG ACAAGATCAG 600ATCTTCGTGG CACCTGAATT ACTTGCATAC TGTACAATAT CATTATTTCT TTTTTTCTAT 660GATCTGTGCA AAGTGCAATA CAGCTCAAGT GCAGGTAAAG CTTGCGTGTT CTATCCAATC 720TTTCTTCTTT CGATGGTTGC TTGTAGAGCG ATAGTTGCTT GTAAACTGCC ATCCGATTCG 780TCATCCTGGC TGTTGACCTG GTTATTCCAG TGATCTATGA AACGATCGAT CTCGTAAAAC 840TTAAGTTTCT TTCTTTCTTT CTCTGTTTGC TTAGTTCTGA AATTACTTGC TCCTGCATGC 900TCCATTTCTT AGAGGAGTGC AATTGCAGCA CTACTATGCA AAAAGCTTGT GCCCTCTTTT 960GGAGCTGTTC TCAACAATTG GTCCCATCAT CCTGTCATAC TGATCCTTAG GAGCTCATAC 1020CAAGTTGTCC ACTTGTGGTT TTGGATGATC TCATCAGAAT CGGCTACTAA TTAGTACTCC 1080AGGTTTGACT TGGTCTGGCC TATGTATATC TCTGGTACGG ACTGTTTCTA TTGGGAACAA 1140GTCGCGTCTT GCACATGGTA TGGAGCAGGT GTCCTTTCAT TTGCGAATAA ACCTACATGT 1200CTATGTACTG AAAATGTCAA TTTTTGTTAG GTTGGTCATG ATATTCCCAG GGAAAAGATC 1260ATGGTTTTGT TTATAGGGCT ATTCTACTAC TGAAGAAGTT TTATAACCAG CCACTCTGTA 1320TTTTTAGTTA GCTTAATATT TTCTTGCAAA ATTGTGATCT TGTAGAACAC AGTGGAAATG 1380GAGTTCTTCA CTGAGTATGG AGAAGCAAGC CAGTACAGCC AGTACCAGAT CCAGGAAGTC1440ATTGGCAAAG GAAGTTATGG AGTAGTTGCT GCTGCAGTAG ATACCCGCAC GGGTGAGCGG1500GTTGCGATCA AGAAATCAAT GATGTGTTTG AGCATGTATC AGACGCTACG CGCATATTGC1560GTGAGATCAA GCTCCTTCGT CTGCTCCGTC ACCCAGACAT AGCTGAGATC AAACACATTA1620TGCTTCCCCC TTCTCGAAGG GAGTTCCAAG ATATTTATGT TGTTTTTGAG CTCATGGAA 1679
權(quán)利要求
1.一種分離的脫氧核糖核酸，包括編碼基本上由SEQ ID NO1從大約位置13到大約位置1569的序列所編碼的蛋白質(zhì)的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的脫氧核糖核酸，它與植物活性啟動子可操作地相連。
3.一種能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的表達(dá)載體，它含有與在所述植物中有活性的啟動子可操作相連的權(quán)利要求1的脫氧核糖核酸。
4.用權(quán)利要求3的載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
5.含有權(quán)利要求4的植物細(xì)胞的植物。
6.權(quán)利要求5的植物的種子。
7.權(quán)利要求3的表達(dá)載體，其中該植物是單子葉植物。
8.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中該植物是單子葉植物。
9.權(quán)利要求5的植物，其中該植物是單子葉植物。
10.權(quán)利要求6的種子，其中該植物是單子葉植物。
11.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中該植物是水稻，小麥，玉米，大麥或蘆筍。
12.權(quán)利要求5的植物，其中該植物是水稻，小麥，玉米，大麥或蘆筍。
13.權(quán)利要求5的植物，其中該植物是水稻。
14.權(quán)利要求12或13的植物的種子。
15.一種脫氧核糖核酸，包括SEQ ID NO1從大約位置13到大約位置1569的序列。
16.與權(quán)利要求1或15的脫氧核糖核酸互補(bǔ)的分離的信使RNA。
17.一種脫氧核糖核酸分子或核糖核酸分子，它與權(quán)利要求1或15的脫氧核糖核酸或其互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。
18.一種分離的蛋白質(zhì)，基本上包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
19.一種賦予植物疾病抗性的方法，包括遺傳修飾植物以導(dǎo)致或調(diào)節(jié)權(quán)利要求1或15的脫氧核糖核酸表達(dá)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中該植物是單子葉植物。
21.權(quán)利要求19的方法，其中該植物是水稻，小麥，玉米，大麥或蘆筍。
22.權(quán)利要求21的方法，其中該植物是水稻。
23.一種植物啟動子，它具有基本上包含在SEQ ID NO6中的核苷酸序列。
全文摘要
在水稻中鑒定,分離和克隆了編碼新的促細(xì)胞分裂原活化蛋白(“MAP”)激酶的基因。通過應(yīng)答稻瘟病病原體M.grisea感染而誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。該基因可用于賦予植物,特別是單子葉植物,如水稻,小麥,玉米,大麥和蘆筍疾病抗性。還公開了含有該新基因的載體,轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞,植物和種子。
文檔編號C12N9/12GK1285872SQ9881315
公開日2001年2月28日 申請日期1998年1月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月16日
發(fā)明者何朝族, 王國梁 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院