專利名稱：一種氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域。具體地講，本發(fā)明涉及一種β-內(nèi)酰胺酶泄漏減少的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1973年，美國科學(xué)家發(fā)明了重組DNA技術(shù)，標志著人類認識生命本質(zhì)并能按照自己意愿改造生命的新時期開始。在這之后的三十多年里，以重組DNA技術(shù)為基礎(chǔ)的基因工程得到了蓬勃發(fā)展?；蚬こ碳夹g(shù)通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，實現(xiàn)基因改造和重新組合，然后導(dǎo)入宿主細胞進行無性繁殖，并誘導(dǎo)重組基因的表達，產(chǎn)生出所需要的基因產(chǎn)物?；蚬こ碳夹g(shù)不僅在基礎(chǔ)研究中有著廣泛的應(yīng)用，也在數(shù)以千億美元計的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著重要作用。載體是用來協(xié)助將目的基因引入宿主細胞進行增殖或表達的DNA片段?；蚬こ讨谐Ｓ玫妮d體主要包括質(zhì)粒、噬菌體和病毒三大類，其中以質(zhì)粒的使用最為廣泛。質(zhì)粒是獨立于細胞染色體外具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA。最早使用的質(zhì)粒載體是PBR322， 它是一人工構(gòu)建的DNA片段，分子大小為4. 3kb，帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因以利于篩選的標志基因，并含有EcoRI、BamHLHindIII等單一的限制酶切點以方便目的基因的克隆。現(xiàn)今使用的質(zhì)粒大多來自pBR322的改造，它們的一個共同特點是使用抗氨芐青霉素基因作為篩選標志。氨芐青霉素是現(xiàn)今使用最廣泛的抗生素，它的抑菌機理是使細菌細胞膜的內(nèi)層轉(zhuǎn)肽酶失活從而抑制細胞壁的合成，細菌因無法合成完整的細胞壁而導(dǎo)致無法生長。抗氨芐青霉素基因(bla)編碼β -內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)，β -內(nèi)酰胺酶在胞質(zhì)內(nèi)合成后經(jīng)自身信號肽引導(dǎo)進入周質(zhì)空間(細胞內(nèi)、外膜之間一狹窄區(qū)域)?？缒ず螅盘栯谋恍盘栯拿盖谐?，產(chǎn)生成熟的β "內(nèi)酰胺酶。β "內(nèi)酰胺酶水解氨芐青霉素的β "內(nèi)酰胺環(huán)使其失效，轉(zhuǎn)化菌因而也得以在氨芐青霉素存在的環(huán)境下生長。可以看出，β -內(nèi)酰胺酶分泌至周質(zhì)空間是轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)生氨芐青霉素抗性的先決條件。有研究表明，大腸桿菌外膜蛋白的信號肽引導(dǎo)內(nèi)酰胺酶至周質(zhì)空間的效率相比內(nèi)酰胺酶的自身信號肽要高出 100倍以上。然而，因為尚未知的原因，分泌至周質(zhì)空間的β -內(nèi)酰胺酶可進一步泄漏至胞外， 將胞外環(huán)境中的氨芐青霉素破壞掉。當(dāng)轉(zhuǎn)化菌在瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，泄漏至胞外的
內(nèi)酰胺酶在轉(zhuǎn)化菌周圍形成一個無氨芐青霉素選擇壓力的區(qū)域，在那個區(qū)域非轉(zhuǎn)化菌也能夠生長，形成大家所熟知的“衛(wèi)星菌落”，這會干擾對轉(zhuǎn)化菌的挑選。當(dāng)轉(zhuǎn)化菌被應(yīng)用于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，內(nèi)酰胺酶的泄漏會造成更嚴重的問題。由于內(nèi)酰胺酶的迅速擴散，液體培養(yǎng)基中的氨芐青霉素會被全部破壞掉，使得整個環(huán)境的選擇壓力消失。轉(zhuǎn)化菌細胞中的質(zhì)粒存在分離不穩(wěn)定性，質(zhì)粒在細胞分裂過程中不是平均分配，在細胞分裂時會產(chǎn)生不含有質(zhì)粒的細胞。在選擇壓力消失的環(huán)境中，不含有質(zhì)粒的細胞會迅速生長。因為不含有質(zhì)粒的細胞代謝負擔(dān)比含有質(zhì)粒的細胞要輕，不含有質(zhì)粒的細胞生長速度比含有質(zhì)粒的細胞要快。由于存在競爭優(yōu)勢，培養(yǎng)物最終將被不含有質(zhì)粒的細胞所主導(dǎo)，含有質(zhì)粒的細胞在培養(yǎng)物中只占很小的比例，這對相關(guān)的應(yīng)用如質(zhì)粒的抽提、蛋白質(zhì)的表達等會造成嚴重的負面影響。培養(yǎng)基中氨芐青霉素的選擇壓力也會因為受培養(yǎng)基酸化影響而被破壞。隨著培養(yǎng)時間的延長，細菌的代謝活動促使培養(yǎng)基的PH降低，而氨芐青霉素在酸性環(huán)境下易發(fā)生水解，這個問題可以通過調(diào)控培養(yǎng)基的PH或者采用羧芐青霉素來避免，因為羧芐青霉素在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性相比氨芐青霉素要高很多。但是，羧芐青霉素的價格是是氨芐青霉素的數(shù)倍；而且，跟氨芐青霉素一樣，羧芐青霉素不能抵抗β -內(nèi)酰胺酶的水解作用。因此，減少甚至消除內(nèi)酰胺酶的泄漏對于保持培養(yǎng)環(huán)境中的選擇壓力是至關(guān)重要的。對于以重組蛋白質(zhì)表達為目的的培養(yǎng)而言，保持培養(yǎng)環(huán)境的選擇壓力非常重要。 如果選擇壓力消失，導(dǎo)致最終培養(yǎng)物中無質(zhì)粒的細胞占主導(dǎo)，則由于目的基因的丟失，目標蛋白質(zhì)的表達水平將很低。一些方法已經(jīng)被報道用來減少內(nèi)酰胺酶泄漏造成的負面影響，包括在培養(yǎng)物中加入β “內(nèi)酰胺酶的抑制劑甲氧苯青霉素；洗滌細胞以去除β “內(nèi)酰胺酶；使用高度稀釋的培養(yǎng)物用于接種等。但是，這些方法并不解決內(nèi)酰胺酶的泄漏問題，只是β-內(nèi)酰胺酶的泄漏后的補救措施。因為每批次的培養(yǎng)都需要進行這些操作，這些方法費事、也不經(jīng)濟。同時，由于內(nèi)酰胺酶的不斷合成和泄漏，這些方法的效果是有限的。

發(fā)明內(nèi)容
如背景技術(shù)中所述，為了減少培養(yǎng)過程中內(nèi)酰胺酶泄漏造成的不利影響，已經(jīng)提出了一些方法。但這些方法要求在每批次培養(yǎng)中都進行相關(guān)操作，既費事、又不經(jīng)濟。 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的局限性，將減少內(nèi)酰胺酶泄漏作為目標，而不是去想辦法補救內(nèi)酰胺酶泄漏造成的負面影響。在此基礎(chǔ)上，提供一種減少攜帶有氨芐青霉素抗性質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)過程中內(nèi)酰胺酶泄漏的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明主要通過對現(xiàn)有質(zhì)粒載體質(zhì)粒骨架上氨芐青霉素抗性基因的改造，來解決 β-內(nèi)酰胺酶泄漏的問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先公開了一種氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體，所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體的質(zhì)粒骨架上含有抗氨芐青霉素基因，所述抗氨芐青霉素基因為 β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因(bla)與β-半乳糖苷酶α肽編碼基因(IacZa)的融合基因。所述融合基因中，β-半乳糖苷酶α肽編碼基因連接于β -內(nèi)酰胺酶編碼基因的 3’端。半乳糖苷酶α肽編碼基因與內(nèi)酰胺酶編碼基因直接相連，或者兩者之間經(jīng)連接肽編碼基因連接，連接肽編碼基因編碼的連接肽應(yīng)不影響融合蛋白功能。常用的不影響融合蛋白功能的連接肽序列可以是=GlyGlySer, (GlyGlySer)2, (GlyGlySer)3, (GlyGlySer)4, SerProGlySer, GlySerGlySerGly, (GlySerGlySerGly)2, (GlySerGlySerGly)3 GlyGlySerGlyGly, (GlyGlySerGlyGly)2, (GlyGlySerGlyGly)3 GlyGlyGlyGlySer, (GlyGlyGlyGlySer)2, (GlyGlyGlyGlySer)3, (His)6, (His)8, GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly 或 GlySerAlaGlySerAlaAlaGlySerGlyGluPhe。本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體質(zhì)粒骨架上的其他構(gòu)架均為常規(guī)。進一步的，所述融合基因編碼序列為SEQ ID NO 14的融合蛋白，或者所述融合基因編碼的蛋白質(zhì)其氨基酸序列與SEQ ID NO :14具有高度同源性。進一步的，所述融合基因的序列為SEQ ID NO :1，或者所述融合基因的序列與SEQ ID NO :1具有高度同源性。本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體可用將現(xiàn)有氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體中的 β-內(nèi)酰胺酶編碼基因采用所述融合基因替換的方法獲得。所述現(xiàn)有氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體可以是任一具有氨芐青霉素抗性并以β _內(nèi)酰胺酶編碼基因作為其抗氨芐青霉素基因的載體?，F(xiàn)有氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體可以是如 PET系統(tǒng)、pMAL系統(tǒng)、pTrc系統(tǒng)或pGEX系統(tǒng)中的載體。本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體可用于構(gòu)建重組載體。轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒的菌株，相比轉(zhuǎn)化有未改造的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體的菌株，轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)過程中內(nèi)酰胺酶泄漏顯著減少，從而避免內(nèi)酰胺酶泄漏對于轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)所造成的不利影響。本發(fā)明還提供了一種減少攜帶有氨芐青霉素抗性重組載體的菌株在培養(yǎng)過程中 β -內(nèi)酰胺酶泄漏的方法，選自以下任一1)采用本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體構(gòu)建重組載體，而后轉(zhuǎn)化并用于培養(yǎng)；2)將所述菌株攜帶的氨芐青霉素抗性重組載體進行基因改造，將該氨芐青霉素抗性重組載體質(zhì)粒骨架中的內(nèi)酰胺酶編碼基因改造為內(nèi)酰胺酶的編碼基因與半乳糖苷酶α肽編碼基因的融合基因，而后轉(zhuǎn)化并用于培養(yǎng)。所述菌株為大腸桿菌菌株，菌株可以是BL21，BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS，DH5α， DH10B, JM109, MachlTl，Origami, Origami (DE3)，Origami (DE3)pLysS, Origami B, Origami B (DE3), Origami B(DE3)pLysS, Rosetta, Rosetta (DE3), Rosetta (DE3) pLysS, TGl， TOPlO 或 XLl-Blue。本發(fā)明將編碼β -內(nèi)酰胺酶的DNA片段與編碼β -半乳糖苷酶α肽的DNA片段融合得到融合基因，再用融合基因替換原質(zhì)粒上內(nèi)酰胺酶編碼基因，或者將原質(zhì)粒上 β-內(nèi)酰胺酶編碼基因改造為融合基因。融合基因編碼的融合蛋白保留內(nèi)酰胺酶的活性，轉(zhuǎn)化菌能夠在含有氨芐青霉素的環(huán)境中正常生長；但在另一方面，融合蛋白的分泌水平大大降低，泄漏至胞外的量也極大地減少，導(dǎo)致胞外的內(nèi)酰胺酶活力極低，從而達到了減少β-內(nèi)酰胺酶泄露的目標。此方法從基因改造的角度來達到減少β-內(nèi)酰胺酶泄露的目標，質(zhì)粒載體改造好后，具有一勞永逸的特點，不需像其它方法那樣，為避免內(nèi)酰胺酶泄露造成的負面影響在每批次培養(yǎng)都需要進行相關(guān)操作，因而更簡便和經(jīng)濟。


圖1 β -內(nèi)酰胺酶與改造后的β -內(nèi)酰胺酶與β -半乳糖苷酶α肽的融合蛋白在過表達條件下的泄漏情況M 標準分子量蛋白質(zhì)；1 :BL21 (DE3)/pOmpAssbla(表達β -內(nèi)酰胺酶)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)；IIB :BL21 (DE3)/pOmpAssbla 胞內(nèi)包涵體；2 :BL21(DE3)/pXYZ3(表達β -內(nèi)酰胺酶與β _半乳糖苷酶α肽的融合蛋白)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)；
2IB :BL21 (DE3)/pXYZ3 胞內(nèi)包涵體；1，BL21(DE3)/p0mpAssbla 胞外蛋白質(zhì)；2，:BL21(DE3)/pXYZ3 胞外蛋白質(zhì)；(箭頭表示目標蛋白質(zhì)的包涵體及胞外蛋白質(zhì)條帶)。圖2以pGEX-4T-l質(zhì)粒骨架上β -內(nèi)酰胺酶編碼基因的改造為例說明在質(zhì)粒上實現(xiàn)該基因改造的方法
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的適用范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南 (第三版)》(J.薩姆布魯克等著，2003)中所述的條件進行。實施例1 β -內(nèi)酰胺酶與改造后的β -內(nèi)酰胺酶與β “半乳糖苷酶α肽的融合蛋白在過表達條件下的泄漏情況對比1. 1表達載體的構(gòu)建1. 1. 1 大腸桿菌外膜蛋白 A (outer membrane protein A, ompA)基因擴增以大腸桿菌基因組為模板，ompA-F (5，-ggaattccatatgAAAAAGACAGCTATCGCGATTG-3'SEQ ID NO 2)和 ompA-R(5，-cggggtaccGAACTGGTAAACGATACCC_3，SEQ ID NO 3)為上、下游引物，PCR反應(yīng)擴增包含信號肽的全長基因，產(chǎn)物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用生工生物工程(上海)有限公司提供的“SanPrep柱式膠回收試劑盒”回收目的片段，得到ompA 基因擴增產(chǎn)物。1. 1. 2 β -內(nèi)酰胺酶的過表達載體構(gòu)建文獻報道，大腸桿菌外膜蛋白A信號肽(ompAss)引導(dǎo)β -內(nèi)酰胺酶的分泌相比其自身信號肽效率要高出100倍以上，構(gòu)建融合基因并置于Τ7強啟動子下表達，具體方式如下以 ompA-F 為上游引物，Lactam-R(5，-cccaagcttatcaCCAATGCTTAATCAGTGAG-3，SEQ ID NO 4)為下游引物，IP0M(5，-GTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCCACCCAGAAACGCTGGTGAAAG-3，SEQ ID NO 5)為中間搭橋引物，以ompA基因擴增產(chǎn)物(ompA信號肽模板)和pGEX_4T_l質(zhì)粒 (β-內(nèi)酰胺酶編碼基因模板)為模板，通過重疊PCR擴增編碼ompA信號肽和β-內(nèi)酰胺酶成熟蛋白質(zhì)的雜合基因。產(chǎn)物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產(chǎn)物經(jīng)NdeI和HindIII雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的pET24a載體，測序后獲得正確的克隆， 質(zhì)粒命名為pOmpAssbla。1. 1. 3 β -內(nèi)酰胺酶(β -lactamase)與 β -半乳糖苷酶 α 肽(β -galactosidase α peptide)的融合蛋白質(zhì)的過表達載體構(gòu)建以質(zhì)粒 pMALp2x 為模板，IacZ α -F(5' -gtcggtaccGCACTGGCCGTCGTTTTAC_3，SEQ ID NO 6)禾口 IacZ α-R(5，-cccaagctttcaTCCGCCAAAACAGCCA-3，SEQ ID NO 7)為上、下游引物，PCR反應(yīng)擴增β-半乳糖苷酶α肽的編碼基因IacZa，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產(chǎn)物經(jīng)KpnI和HindIII雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的 pET32a載體，測序后獲得正確的克隆，質(zhì)粒命名為pXYZl。以質(zhì)粒 pOmpAssbla 為模板，ompA-F 和 bla_R(5，-ggggtaccCAACCAATGCTTAATCAGTGAG-3'SEQ ID NO 8)為上、下游引物，PCR反應(yīng)擴增編碼ompA信號肽與β -內(nèi)酰胺酶成熟蛋白質(zhì)(不含終止子)的雜合基因，產(chǎn)物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產(chǎn)物經(jīng)NdeI和KpnI雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的pXYZl載體，測序后獲得正確的克隆，質(zhì)粒命名為PXYZ2。用NdeI和HindIII對質(zhì)粒pXYZ2進行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收小片段(ompAss-bla-lacZa雜合基因)，純化后連入經(jīng)同樣酶切的 pET24a載體，測序后獲得正確的克隆，質(zhì)粒命名為pXYZ3。1.2蛋白質(zhì)表達與檢測構(gòu)建好的質(zhì)粒pOmpAssbla和pXYZ3分別轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli BL21 (DE3)，得到的工程菌命名為 BL21 (DE3)/p0mpAssbla 和 BL21 (DE3)/pXYZ3。分別挑取BL21 (DE3) /pOmpAssbla 和 BL21 (DE3) /pXYZ3 單菌落接入含有 50mg/L 卡那霉素的MR培養(yǎng)基中，30 0C，200rpm,過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的BL21 (DE3)/pOmpAssbla 和 BL21 (DE3)/pXYZ3 按 5% 的接種量接入含有50mg/L卡那霉素的MR培養(yǎng)基中，30°C，200rpm,培養(yǎng)至OD6tltl 3. 0時，加入終濃度為 0. 5mM的誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)3. 5小時。將菌液于12000rpm離心5分鐘后，取發(fā)酵液上清制備樣品用于目標蛋白質(zhì)泄漏的檢測。菌體用20mM pH 8. 0的磷酸緩沖液重懸，超聲破碎，將破碎液于12000rpm離心10 分鐘后，分別取上清和沉淀制備樣品用于胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)和包涵體的檢測。MR培養(yǎng)基是以甘油為碳源的合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組分明確。BL21(DE3)在MR培養(yǎng)基中生長時，細胞外膜的通透性提高，分泌至周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)大部分泄漏至發(fā)酵液中。 用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析制備的蛋白質(zhì)樣品后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)酰胺酶過表達后大部分泄漏至發(fā)酵液中，而β-內(nèi)酰胺酶與β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白過表達后，絕大部分以包涵體的形式存在，發(fā)酵液中檢測不到融合蛋白(圖1)。這表明，將半乳糖苷酶α肽與 β“內(nèi)酰胺酶融合是阻止β“內(nèi)酰胺酶泄漏至胞外環(huán)境的好方法。另一方面，BL21 (DE3)/pXYZ3可以在含有50mg/L卡那霉素和100mg/L氨芐青霉素的雙抗平板上生長，這表明，內(nèi)酰胺酶與半乳糖苷酶α肽融合后仍然保留內(nèi)酰胺酶的活性。因此，將編碼β-內(nèi)酰胺酶的DNA片段與編碼β-半乳糖苷酶α肽的DNA 片段融合得到的融合基因作為抗性基因是可行的。實施例2質(zhì)粒上β -內(nèi)酰胺酶編碼基因的改造下面以商品化質(zhì)粒pGEX-4T-l為例，將質(zhì)粒骨架上β -內(nèi)酰胺酶編碼基因改造為編碼內(nèi)酰胺酶與半乳糖苷酶α肽的融合蛋白的融合基因。2. 1載體的改造以引物對 MutNheI-F (5，-GAACTACTTACTCTAGCTAGCCGGCAACAATTAATAG-3，SEQ ID NO :9)、MutNheI-R(5，-CTATTAATTGTTGCCGGCTAGCTAGAGTAAGTAGTTC-3，SEQ ID NO 10)和 Mu tHindm-F(5，-GTAACTGTCAGACCAAGCTTACTCATATATACTTT-3，SEQ ID NO 11) ,MutHindIH-R (5 ‘-AMGTATATATGAGTAAGCTTGGTCTGACAGTTAC-3‘ SEQ ID NO 12)為引物，以質(zhì)粒pGEX_4T_l 為模板，PCR反應(yīng)擴增整個質(zhì)粒，擴增產(chǎn)物為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶DpnI (DpnI 的識別序列為甲基化的GATC，GATC幾乎在各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)且不止一次)切割PCR產(chǎn)物，原來的模板質(zhì)粒PGEX-4T-1來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對Dpn I敏感而被切碎，而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開。Dpn I酶消化模板質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落培養(yǎng)、抽提質(zhì)粒并送交測序。經(jīng)篩選，得到產(chǎn)生目標突變的質(zhì)粒，新的質(zhì)粒命名為pGEXM。相比較pGEX-4T-l，pGEXM質(zhì)粒骨架上產(chǎn)生了一個Nhe I和一個HindIII酶切位點。其中，HindHI酶切位點由引物對MutHindHI-F、 MutHindm-R引入，其位點位于β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的終止密碼子之后，對β-內(nèi)酰胺酶編碼基因無任何影響。NheI酶切位點由引物對MutNhel-F、MutNheI-R引入，其位點位于 β -內(nèi)酰胺酶編碼基因3’端，此位點突變采用的是同義突變，即改造只限于堿基突變，編碼的氨基酸序列完全未變。這樣，就保證了 PGEXM質(zhì)粒上抗性基因所編碼的內(nèi)酰胺酶跟質(zhì)粒PGEX-4T-1完全一致。以質(zhì)粒 ρΧΥΖ3 為模板，Mbla-F (5，-gctagctagcCGGCAACAATTAATAGACTG-3，SEQ ID NO 13)和IacZ α -R為上、下游引物，PCR反應(yīng)擴增β -內(nèi)酰胺酶編碼基因3’端部分序列及β-半乳糖苷酶α肽的編碼DNA，產(chǎn)物用的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并割膠回收目的片段。純化產(chǎn)物經(jīng)Nhe I和Hindm雙酶切后，連入經(jīng)同樣酶切的pGEXM載體，改造后的質(zhì)粒命名為pGEXMZ。pGEXMZ質(zhì)粒上氨芐青霉素抗性基因的序列符合SEQ ID NO :1，該抗性基因編碼的是β-內(nèi)酰胺酶與β-半乳糖苷酶α肽的融合蛋白，融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 14，全長349個氨基酸。其中，第1-23位氨基酸為β -內(nèi)酰胺酶信號肽序列，第24-286 位氨基酸為β-內(nèi)酰胺酶成熟蛋白質(zhì)序列，第291-349位氨基酸為β-半乳糖苷酶α肽序列，信號肽在跨膜后會被切除。2. 2 β -內(nèi)酰胺酶泄漏的對比構(gòu)建好的質(zhì)粒pGEXM和pGEXMZ分別轉(zhuǎn)化宿主菌Ε. coli BL21 (DE3)，得到的工程菌命名為 BL21 (DE3) /pGEXM 和 BL21 (DE3) /pGEXMZ。分別挑取BL21 (DE3) /pGEXM 和 BL21 (DE3) /pGEXMZ 單菌落接入含有 100mg/L 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 0C，200rpm,過夜培養(yǎng)。將菌液稀釋10倍，用分光光度計檢測600nm下的吸光度以測定菌濃。另取菌液于 12000rpm離心5分鐘后，取發(fā)酵液上清檢測β -內(nèi)酰胺酶的活力。β -內(nèi)酰胺酶的活力測定是以青霉素G鉀鹽為底物，β -內(nèi)酰胺酶能夠水解青霉素 G鉀鹽使其在240nm的特定吸收峰消失。取50 μ L發(fā)酵液上清跟950 μ L含有200 μ g/mL青霉素G鉀鹽的磷酸緩沖液(50mM，pH 7. 0)混合，37°C下反應(yīng)30分鐘，測定240nm下的吸光度。β-內(nèi)酰胺酶的活力以反應(yīng)時間內(nèi)青霉素G鉀鹽被水解的百分比表示。表1 β -內(nèi)酰胺酶編碼基因的改造對菌體生長和β -內(nèi)酰胺酶泄漏的影響
權(quán)利要求
1.一種氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體，所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體的質(zhì)粒骨架上含有抗氨芐青霉素基因，所述抗氨芐青霉素基因為β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因與β-半乳糖苷酶α 肽編碼基因的融合基因。
2.如權(quán)利要求1所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體，其特征在于，所述融合基因中，半乳糖苷酶α肽編碼基因連接于內(nèi)酰胺酶編碼基因的3’端。
3.如權(quán)利要求1所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體，其特征在于，所述融合基因中，半乳糖苷酶α肽編碼基因與內(nèi)酰胺酶編碼基因直接相連，或者兩者之間經(jīng)連接肽編碼基因連接。
4.如權(quán)利要求1所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體，其特征在于，所述融合基因編碼序列為SEQ ID NO :14的融合蛋白，或者所述融合基因編碼的蛋白質(zhì)其氨基酸序列與SEQ ID NO: 14具有高度同源性。
5.如權(quán)利要求1所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體，其特征在于，所述融合基因的序列為 SEQ ID NO :1，或者所述融合基因的序列與SEQ ID NO :1具有高度同源性。
6.權(quán)利要求1-5任一所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體的制備方法，為將現(xiàn)有氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體中的內(nèi)酰胺酶編碼基因采用內(nèi)酰胺酶的編碼基因與半乳糖苷酶 α肽編碼基因的融合基因替換的方法獲得。
7.權(quán)利要求1-5任一所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體用于構(gòu)建重組載體的用途。
8.一種減少攜帶有氨芐青霉素抗性重組載體的菌株在培養(yǎng)過程中內(nèi)酰胺酶泄漏的方法，選自以下任一1)采用權(quán)利要求1-5任一所述氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體構(gòu)建重組載體，而后轉(zhuǎn)化并用于培養(yǎng)；2)將所述菌株攜帶的氨芐青霉素抗性重組載體進行基因改造，將該氨芐青霉素抗性重組載體質(zhì)粒骨架中的內(nèi)酰胺酶編碼基因改造為內(nèi)酰胺酶的編碼基因與半乳糖苷酶α肽編碼基因的融合基因，而后轉(zhuǎn)化并用于培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌菌株，菌株可以是但不限于:BL21, BL21(DE3), BL21 (DE3)plysS, DH5α，DH10B, JM109, MachlTl, Origami, Origami(DE3), Origami(DE3)pLysS, Origami B, Origami B(DE3), Origami B (DE3)pLysS, Rosetta, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS, TGI,TOPlO 或XLl-Blue。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體及其制備與應(yīng)用。本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體的質(zhì)粒骨架上含有抗氨芐青霉素基因，所述抗氨芐青霉素基因為β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因與β-半乳糖苷酶α肽編碼基因的融合基因。本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體可用于構(gòu)建重組載體。相比未改造的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒的菌株在培養(yǎng)過程中β-內(nèi)酰胺酶泄漏顯著減少，從而避免了β-內(nèi)酰胺酶泄漏對于轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)所造成的不利影響。
文檔編號C12R1/19GK102329811SQ20111027390
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者傅向陽, 李威 申請人:生工生物工程(上海)有限公司