專利名稱：含F(xiàn)/2A序列的抗p185^erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及慢病毒表達(dá)載體，尤其是一種含F(xiàn)/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
背景技術(shù)：
c-erbB2/HER2/neu編碼產(chǎn)物pl85eAB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族成員。C-erbB2/HER-2/neu基因的擴(kuò)增和pl85ertB2蛋白的過度表達(dá)見于多種惡性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。pl85eAB2過度表達(dá)提示腫瘤預(yù)后差，如轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、易耐藥及存活期短等。pl85ertB2作為腫瘤抗原，是一個(gè)理想的腫瘤治療靶點(diǎn)。美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)已于1998年10月正式批準(zhǔn)將一株抗pl85ertB2人源化抗體Trastuzumab (商品名Herceptin)用于臨床治療pl85erbB2高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。但是，國(guó)外進(jìn)口抗體藥物價(jià)格昂貴，如何開發(fā)出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗pl85OTbB2基因工程抗體對(duì)于國(guó)內(nèi)患者具有十分重要的實(shí)際意義，其中，表達(dá)載體構(gòu)建尤為關(guān)鍵。目前構(gòu)建載體表達(dá)抗體分子的主要方式有三類一是將輕、重鏈基因分別連接至不同表達(dá)載體；二是輕、重鏈基因在同一載體上但處于不同的表達(dá)單元；三是以內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)連接輕、重鏈，使輕重鏈處于同一表達(dá)單元。但是，這些方式存在一些缺陷，如被表達(dá)的基因起始效率低，啟動(dòng)子之間相互干擾，上游基因與下游基因的表達(dá)不平衡等，造成輕、重鏈表達(dá)水平存在顯著差異，導(dǎo)致完整抗體分子表達(dá)水平較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種含F(xiàn)/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，為今后抗pl85MbB2嵌合抗體的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。含F(xiàn)/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體，該載體是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分別是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體重鏈基因(SEQ. ID. No. 2)和抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因(SEQ. ID. No. I), F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽(SEQ. ID. No. 15)。抗P 185eAB2人鼠嵌合抗體重鏈基因由鼠抗人P 185ertB2單抗重鏈可變區(qū)基因vH(SEQ. ID. No. 13)和人 IgGl 的重鏈恒定區(qū)基因 Y I (SEQ. ID. No. 14)連接而成 ^pl85ertB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因由鼠抗人pl85ertB2單抗輕鏈可變區(qū)基因vL(SEQ. ID. No. 16)和人IgGl的輕鏈恒定區(qū)基因K (SEQ. ID. No. 17)連接而成。上述含F(xiàn)/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個(gè)開放閱讀框0RF，插入慢病毒表達(dá)載體pWPI，即得。
上述含F(xiàn)/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括以下步驟<1>抗P185ertB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴(kuò)增 用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質(zhì)粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA Taq酶作用下分別用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B擴(kuò)增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L ;擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因； <2>全長(zhǎng)嵌合抗體H-F2A-L的構(gòu)建①接頭片段F2A的合成該片段由3部分構(gòu)成含NsiI酶切位點(diǎn)的嵌合重鏈H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含PvuII酶切位點(diǎn)的嵌合輕鏈L的5’端序列；②中間質(zhì)粒pUC57/F2A的構(gòu)建將接頭片段F2A插入到pUC57質(zhì)粒的BamH I和Xba I之間，獲得中間質(zhì)粒pUC57/F2A ；③含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒PUC57/F2A-L的構(gòu)建用BamH I和Xba I雙酶切質(zhì)粒PUC57/F2A，酶切產(chǎn)物經(jīng)I %的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒分別回收接頭片段F2A和載體片段PUC57 ;進(jìn)而用Pvu II酶切接頭片段F2A，獲得5’端為BamH I酶切位點(diǎn)和3’端為Pvu II酶切位點(diǎn)的接頭片段F2A ;用Pvu II和Xba I雙酶切嵌合輕鏈L，獲得5’端為Pvu II酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I位點(diǎn)的輕鏈片段L ;然后，將這兩個(gè)片段用T4DNA連接酶連接后克隆入載體PUC57，獲得含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒pUC57/F2A-L ；④片段H-F2A-L的拼接用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，獲得片段F2A-L ;進(jìn)而用Nsi I酶切片段F2A-L，獲得5’端為Nsi I酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I酶切位點(diǎn)的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I雙酶切嵌合重鏈H，獲得5’端為BamH I酶切位點(diǎn)和3’端為Nsi I位點(diǎn)的重鏈片段H ;通過T4DNA連接酶與片段F2A-L相連，獲得5’端為BamHI酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I位點(diǎn)的嵌合抗體全長(zhǎng)片段H-F2A-L(SEQ. ID. No. 3)；<3>慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pwpI/H-F2A_L的構(gòu)建將純化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平兩端；同時(shí)用PmeI酶切慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PWPI，經(jīng)SAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶與H-F2A-L連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5a感受態(tài)細(xì)菌，抽提質(zhì)粒后用載體測(cè)序引物EFl a和重鏈下游引物gammal-B作PCR，篩選正向插入陽性克隆PWPI/H-F2A-L，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，即得；上述各引物為H-A(SEQ. ID. No. 4) :5，-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，gammal-B (SEQ. ID. No. 5) :5，_ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG_3，L-A(SEQ. ID. No. 6) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 7) :5，_GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，:EFl a (SEQ. ID. No. 8) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，?？谔阋卟《?Foot-and-mouth disease virus, FMDV)的多妝 2A 基因編碼一種自剪切蛋白。兩個(gè)外源基因之間以2A序列連接形成一個(gè)完整的ORF，翻譯時(shí)融合蛋白可在編碼2A區(qū)域的C端被2A切開，將融合蛋白切割分離為兩個(gè)獨(dú)立的蛋白，F(xiàn)MDV 2A短基因序列和2A高效的自剪切效率使之成為構(gòu)建多順反子載體的有效工具。Jianmin F.等人在腺相關(guān)病毒表達(dá)載體中利用有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/ 口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)同時(shí)表達(dá)單克隆抗體DClOl的重鏈和輕鏈，從而實(shí)現(xiàn)了全長(zhǎng)抗體在體內(nèi)持續(xù)高效的表達(dá)，并取得了顯著的抗腫瘤效果。本發(fā)明在嵌合抗體輕、重鏈之間弓I入F/2A序列和慢病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)輕、重鏈進(jìn)行共表達(dá)，并與含IRES的嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行比較，結(jié)果表明由F/2A介導(dǎo)的嵌合抗體的表達(dá)水平要高于由IRES介導(dǎo)的嵌合抗體。本發(fā)明為獲得高表達(dá)水平的完整抗體展示了新的構(gòu)建策略，也為抗pl85OTbB2基因工程抗體的研究開辟了新的途徑。


圖I是本發(fā)明重組慢病毒表達(dá)載體PWPI/H-F2A-L的構(gòu)建策略圖。圖2是抗人pl85ertB2單抗嵌合輕、重鏈基因的PCR產(chǎn)物電泳圖，圖中M DNA markerDL2000,1 5嵌合輕鏈基因(L)，6 10嵌合重鏈基因(H)。圖3 是片段 H-F2A-L 電泳圖，圖中M DNA marker DL10000,1 片段 H-F2A-L。圖4是慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPI/H-F2A-L的PCR鑒定電泳圖，圖中M DNA markerDL10000,1 3pffPI/H-F2A-L質(zhì)粒，4pWPI質(zhì)粒，5和7載體引物EFla與重鏈下游引物gamma I -B對(duì)正向連接質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增條帶,6和8載體引物EFI a與重鏈下游弓丨物gamma I -B對(duì)反向連接質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增條帶。圖5是慢病毒三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)的顯微鏡觀察圖，圖中A、C、E分別為熒光下pWPI/H-F2A-L組、pWPI/H-IRES-L組、pWPI組，B、D、F分別為可見光下 pWPI/H-F2A-L 組、pWPI/H-IRES-L 組、pWPI 組。圖6是3種慢病毒的轉(zhuǎn)染效率流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖，圖中A、B、C分別是轉(zhuǎn)染pWPI/H-F2A-L、pWPI/H-IRES-L、pWPI 的 293T 細(xì)胞，D 是未轉(zhuǎn)染的 293T 細(xì)胞。圖7是RT-PCR鑒定嵌合抗體的輕、重鏈的表達(dá)電泳圖，圖中1嵌合抗體H_F2A_L的輕鏈基因，2嵌合抗體H-IRES-L的輕鏈基因，3嵌合抗體H-F2A-L的重鏈Fd片段，4嵌合抗體H-IRES-L的重鏈Fd片段。
具體實(shí)施例方式含F(xiàn)/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法研究I材料與方法I. I質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞三質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)由表達(dá)質(zhì)粒pWPI、結(jié)構(gòu)質(zhì)粒pCMV-dR 8. 74和封套質(zhì)粒pMD2G組成，為加拿大渥太華大學(xué)臨床腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。含F(xiàn)/2A序列的質(zhì)粒pUC57/F2A由上海生工公司構(gòu)建。轉(zhuǎn)化用大腸桿菌DH-5a、含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合輕、重鏈基因的質(zhì)粒pWPI/H-IRES-L、293T細(xì)胞均由為廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所保存。 I. 2工具酶和主要試劑限制酶BamH I, Pvu II, Nsi I, Xba I, Pme I、T4DNA連接酶等均購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)公司。Taq DNA聚合酶、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、DNA末端補(bǔ)平試劑盒均購(gòu)自Genstar公司。DNA marker、奸堿性磷酸酶(SAP)購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。Ε. Z. N. A.⑧無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；RIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。羊抗人K抗體、羊抗人IgG Fc-HRP、兔抗羊IgG-HRP購(gòu)自Sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MBI Fermentas公司。100mL/L胎牛血清購(gòu)自四季青生物公司。PCR引物合成及產(chǎn)物測(cè)序由Invitrogen公司合成。I. 3 引物擴(kuò)增嵌合抗體重鏈基因的引物為H-A(SEQ. ID. No. 4) :5，-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTCT-3’ (含 BamH I 酶切位點(diǎn) GGA TCC)，gammal-B (SEQ. ID. No. 5) :5，_ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG_3， ；擴(kuò)增嵌合抗體輕鏈基因的引物為L(zhǎng)-A(SEQ. ID. No. 6) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTCT-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 7) :5，-GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’(含Xba I 酶切位點(diǎn) TCT AGT)；pWPI質(zhì)?？寺∥稽c(diǎn)如的測(cè)序引物為EFl a (SEQ. ID. No. 8) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，；用于檢測(cè)抗人pl85ertB2嵌合抗體重鏈mRNA表達(dá)的引物為H-F(SEQ. ID. No. 9) :5’ -AAG TCC AAC TGC AGC AGT CTG G-3’H-R(SEQ. ID. No. 10) :5，-CTC GGG GCT GCC CTT TGG-3’ ；用于檢測(cè)抗人pl85ertB2嵌合抗體輕鏈mRNA表達(dá)的引物為L(zhǎng)-F(SEQ. ID. No. 11) :5，-GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA-3，，L-R(SEQ. ID. No. 12) :5，-CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，。I. 4抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴(kuò)增用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質(zhì)粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA Taq酶作用下分別用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B擴(kuò)增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L ;擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因。I. 5全長(zhǎng)嵌合抗體H-F2A-L的構(gòu)建I. 5. I接頭片段F2A的合成由上海生工公司合成接頭片段F2A，該片段由3部分構(gòu)成嵌合重鏈H的3’端序列(含Nsi I酶切位點(diǎn))、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及嵌合輕鏈L的5’端序列(含PvuII酶切位點(diǎn)的)；I. 5. 2中間質(zhì)粒pUC57/F2A的構(gòu)建將接頭片段F2A插入到pUC57質(zhì)粒的BamH I和Xba I之間，構(gòu)建中間質(zhì)粒pUC57/F2A ；I. 5. 3含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒PUC57/F2A-L的構(gòu)建
用BamH I和Xba I雙酶切質(zhì)粒pUC57/F2A，酶切產(chǎn)物經(jīng)I %的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒分別回收接頭片段F2A和載體片段pUC57 ;進(jìn)而用Pvu II酶切接頭片段F2A，獲得5’端為BamH I酶切位點(diǎn)和3’端為Pvu II酶切位點(diǎn)的接頭片段F2A ;用Pvu II和Xba I雙酶切嵌合輕鏈L，獲得5’端為Pvu II酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I位點(diǎn)的輕鏈片段L ;然后，將這兩個(gè)片段用T4DNA連接酶連接后克隆入載體pUC57，獲得含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒 pUC57/F2A-L ；
I. 5. 4 片段 H-F2A-L 的拼接用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，獲得片段F2A-L ;進(jìn)而用Nsi I酶切片段F2A-L，獲得5’端為Nsi I酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I酶切位點(diǎn)的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I雙酶切嵌合重鏈H，獲得5’端為BamH I酶切位點(diǎn)和3’端為Nsi I位點(diǎn)的重鏈片段H ;通過T4DNA連接酶與片段F2A-L相連，獲得5’端為BamH I酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I位點(diǎn)的嵌合抗體全長(zhǎng)片段H-F2A-L ；I. 6慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPI/H-F2A-L的構(gòu)建將純化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平兩端。同時(shí)用PmeI酶切慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PWPI，經(jīng)SAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶與H-F2A-L連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5a感受態(tài)細(xì)菌，抽提質(zhì)粒后用載體測(cè)序引物EFl a和重鏈下游引物gammal-B作PCR，篩選正向插入陽性克隆PWPI/H-F2A-L，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPI/H-F2A_L的構(gòu)建策略見圖I。I. 7慢病毒的包裝及病毒滴度測(cè)定用磷酸鈣沉淀法將慢病毒pWPI/H-F2A-L載體、pCMV_dR8. 74、pMD2. G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。72h收集轉(zhuǎn)染后的病毒上清，以O(shè). 45 μ m濾器過濾，獲得的培養(yǎng)液上清則含有攜帶H-F2A-L的重組病毒。同時(shí)分別轉(zhuǎn)染pWPI/H-IRES-L+pCMVdR8. 74+pMD2. G 和 pWPI+pCMVdR8. 74+pMD2. G (空載載體對(duì)照)進(jìn)入 293T 細(xì)胞作比較。在6孔板中分別接種2 X IO5的293T細(xì)胞，將所收集的上清按10'10'10'10'10_5、10_6倍稀釋，將Iml稀釋后的上清分別加入到相應(yīng)的孔中。48h后在熒光顯微鏡下觀察各濃度孔中GFP的表達(dá)情況并計(jì)數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞個(gè)數(shù)，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得到病
毒滴度。I. 8重組慢病毒感染293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測(cè)用重組慢病毒按Hanawa H的方法(Comparison of various envelope proteinsfor their ability to pseudotype lentiviral vectors and transduce primitivehematopoietic cells from human blood[J]. Mol Ther, 2002, 5 :242-251)分別感染 293T細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)一組(PWPI/H-F2A-L)、實(shí)驗(yàn)二組(pWPI/H-IRES-L)和對(duì)照組(pWPI)，重組病毒感染48h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)將I X IO6細(xì)胞離心沉淀，用PBS洗二次將細(xì)胞重新懸浮于Iml PBS中，盡可能吹打成單個(gè)細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上統(tǒng)計(jì)GFP陽性細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)慢病毒感染效率(轉(zhuǎn)基因效率)，以未感染重組慢病毒的293T細(xì)胞為陰性對(duì)照。I. 9嵌合抗體在293T細(xì)胞中的表達(dá)I. 9. IRT-PCR檢測(cè)嵌合抗體的表達(dá)
再次用3種慢病毒分別感染3組293T細(xì)胞，收集重復(fù)感染后的293T細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-PCR分別鑒定嵌合抗體H-F2A-L和H-IRES-L的穩(wěn)定表達(dá)。以H-F為5'端引物，以H-R為3'端引物擴(kuò)增人-鼠嵌合抗體重鏈Fd片段；以L-F為5'端引物，以L-R為3'端引物擴(kuò)增人-鼠嵌合抗體輕鏈。I. 9. 2ELISA法檢測(cè)嵌合抗體的表達(dá)以lmg/L羊抗人κ鏈抗體包被酶標(biāo)板，4°C過夜，50g/L BSA封閉液37°C封閉2h后，分別加入重組慢病毒(pWPI/H-F2A-L、pWPI/H-IRES -L和pWPI)感染后的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液，同時(shí)以未感染的293T細(xì)胞上清為陰性對(duì)照。37°C孵育2h，經(jīng)常規(guī)洗滌，加入羊抗人IgG Fe片段-HRP酶標(biāo)抗體孵育，OPD顯色，室溫避光反應(yīng)5min，酶聯(lián)免疫儀測(cè)定A490值，檢測(cè)細(xì)胞是否分泌人-鼠嵌合抗體。計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用DPS 7. 05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。2 結(jié)果2. I抗人pl85OTbB2單抗嵌合重鏈基因⑶和嵌合輕鏈基因(L)的擴(kuò)增用引物H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B，分別從質(zhì)粒pWPI/H-IRES-L中擴(kuò)增出pl85OTbB2單抗的嵌合重鏈基因(H)和嵌合輕鏈基因(L)。經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，H和L這兩條特異性條帶與理論值一致，大小分別為2100bp和810bp左右(如圖2)。2. 2全長(zhǎng)嵌合抗體H-F2A-L的構(gòu)建利用構(gòu)建的中間質(zhì)粒PUC57/F2A和擴(kuò)增出的嵌合重鏈基因H、嵌合輕鏈基因L，經(jīng)過多步酶切、連接，最終獲得嵌合抗體全長(zhǎng)片段H-F2A-L，純化回收、電泳后可見大約為3000bp的條帶(圖3)。2. 3慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPI/H-F2A-L的構(gòu)建用PmeI酶切慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPI，將片段H_F2A_L末端補(bǔ)平后插入克隆位點(diǎn)。為了確保H-F2A-L基因連接方向的正確，以pWPI載體上的引物EFla和重鏈下游引物gammal-B作PCR，若插入的基因是正向的，PCR應(yīng)擴(kuò)增出大小為2400bp的片段，若基因插入方向是反向的，則PCR擴(kuò)增不出條帶(圖4)。測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了含F(xiàn)/2A序列的抗pl85erbB2人鼠嵌合抗體全長(zhǎng)基因的慢病毒表達(dá)載體pWPI/H-F2A-L。2. 4慢病毒的包裝及病毒滴度測(cè)定用慢病毒系統(tǒng)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，48h后在熒光顯微鏡下觀察，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均可見大量的綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)(圖5)，說明構(gòu)建的包裝細(xì)胞系能夠有效地產(chǎn)生慢病毒。將轉(zhuǎn)染72h后的包裝細(xì)胞上清液再感染293T細(xì)胞(此時(shí)293T作為靶細(xì)胞)，48h后測(cè)定6孔板中慢病毒的滴度，結(jié)果對(duì)照空載體pWPI組的病毒滴度最高，為2. I X IO6TU/mL, pffPI/H-F2A-L組的病毒滴度次之，為4. 3X105TU/mL ;而pWPI/H-IRES-L組的病毒滴度最低，為 3. 5X105TU/mL。2. 5基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的檢測(cè)結(jié)果用3種重組慢病毒分別感染293T細(xì)胞，48h后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，PWPI/H-F2A-L組的陽性細(xì)胞率為87. 68%,pffPI/H-IRES-L組的陽性細(xì)胞率為79. 08%,而空載體pWPI組的陽性細(xì)胞率最高，為95. 51 %，未感染慢病毒的293T陰性細(xì)胞沒有熒光表達(dá)(圖6)。可見當(dāng)空載體pWPI中插入嵌合抗體基因后，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降，而轉(zhuǎn)導(dǎo)嵌合抗體H-F2A-L基因的效率要高于轉(zhuǎn)導(dǎo)嵌合抗體H-IRES-L基因的效率。2.6嵌合抗體輕、重鏈基因mRNA的表達(dá)經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)，轉(zhuǎn)染 pWPI/H-F2A-L 的 293T 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染 pWPI/H-IRES-L 的 293T細(xì)胞后均有嵌合輕鏈基因和嵌合重鏈基因的表達(dá)(圖7)。2. 7嵌合抗體的表達(dá)采用夾心ELISA法測(cè)定4組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染pWPI/H-F2A_L的293T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pWPI/H-IRES-L的293T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pWPI的293T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞)上清中嵌合抗體的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PWPI/H-F2A-L的細(xì)胞上清和轉(zhuǎn)染pWPI/H-IRES-L的細(xì)胞上清為陽性反應(yīng)，而轉(zhuǎn)染空載體pWPI的細(xì)胞上清為陰性反應(yīng)(表I)。這表明無論是F/2A元件還是IRES元件連接的重、輕鏈都能夠在293T細(xì)胞中表達(dá)，而且都能夠正確地組裝成有活性的抗體，很好地分泌到細(xì)胞外。其中，由F/2A介導(dǎo)的嵌合抗體的表達(dá)水平要高于由IRES介導(dǎo)的嵌合抗體。表I ELISA分析嵌合抗體的表達(dá)
GD490差異臟
_0.05 0.01
轉(zhuǎn)染 pWPI/H-F2A-L 的細(xì)胞上清 2.485 ±0.030 a A 轉(zhuǎn)染 pWPI/H-IRES-L 的細(xì)胞上清 2.007 ±0.096 b B 轉(zhuǎn)染pWPI的細(xì)胞上清 0.334±0.248 c C 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清_0.299±0.095_c_C3 討論erbB2作為腫瘤發(fā)生的癌基因，在20% 30%的乳腺癌中過表達(dá)，在25% 32%的卵巢癌中過表達(dá)，是與乳腺癌、卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)的基因之一。針對(duì)pl85OTbB2胞外區(qū)抗原的抗pl85OTbB2抗體，顯示了良好的抗腫瘤療效。為了克服鼠單克隆抗體在人體治療中出現(xiàn)的問題，經(jīng)典的基因工程抗體技術(shù)將人源抗體恒定區(qū)替代鼠抗體的恒定區(qū)，即構(gòu)建人鼠嵌合抗體。嵌合抗體不僅保留了親本抗體的特異性和親和力，大大降低了人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，而且其人源Fe段可激發(fā)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)作用和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒(CDC)效應(yīng)，從而增加其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。構(gòu)建嵌合抗體表達(dá)盒的策略，既有將輕、重鏈分別構(gòu)建于不同表達(dá)載體的，也有將輕、重鏈串聯(lián)于同一表達(dá)載體的。據(jù)報(bào)道，雙順反子載體不僅可以將輕、重鏈的表達(dá)進(jìn)行偶聯(lián)，而且還能夠提高抗體的表達(dá)水平。常用的表達(dá)雙順反子的元件為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或自剪切多肽2A，它們的作用機(jī)理分別為①IRES元件具有不依賴帽子結(jié)構(gòu)而獨(dú)立募集核糖體的功能，進(jìn)而可啟動(dòng)下游基因的翻譯2A元件則可在翻譯過程中形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心造成空間位阻，導(dǎo)致無法形成正常的肽鏈連接，但同時(shí)核糖體卻能繼續(xù)翻譯下游蛋白，從而形成一種類似蛋白水解酶的作用將前后兩個(gè)蛋白順式“切開”。由于兩者作用機(jī)理的差異，導(dǎo)致它們?cè)诙囗樂醋颖磉_(dá)中發(fā)揮的實(shí)際效果也存在明顯的特點(diǎn)，因此在實(shí)際應(yīng)用中通常需要構(gòu)建兩種或多種不同的表達(dá)載體來進(jìn)行比較，才能找到最合適的表達(dá)方案。2005年，Jianmin F等人通過利用弗林蛋白酶(Furin)酶切位點(diǎn)和2A自剪切多肽(F/2A)連接抗體的輕鏈和重鏈，構(gòu)建腺相關(guān)病毒表達(dá)載體。Furin是真核生物細(xì)胞中一種重要的內(nèi)切蛋白酶。Furin能識(shí)別特定的氨基酸序列，對(duì)分泌途徑中許多重要的多肽和蛋白的前體進(jìn)行剪切加工，使之具有生物活性。通過2A片段自剪切和Furin酶切位點(diǎn)的酶切，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)表達(dá)載體和一個(gè)開放閱讀框中同時(shí)均衡地表達(dá)一個(gè)全長(zhǎng)抗體的輕、重鏈，經(jīng)F/2A的自動(dòng)剪切，去除了連接輕、重鏈的所有外源序列，抗體表達(dá)水平達(dá)到了治療腫瘤的水平，克服了輕、重鏈構(gòu)建在兩個(gè)載體中所導(dǎo)致的抗體表達(dá)匹配不完全的缺點(diǎn)，為全長(zhǎng)抗體的表達(dá)提供了一個(gè)新的方法和技術(shù)。2011年，李蒙等利用F/2A構(gòu)建重組抗死亡受體5 (DR5)全長(zhǎng)人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體PWPXL-HF2AL，結(jié)果表明用F/2A多肽技術(shù)表達(dá)的人鼠嵌合抗體可在F/2A處自我剪切，人鼠嵌合抗體的輕、重鏈表達(dá)對(duì)稱并具有與其母本鼠源抗體相似的親和力和殺傷多種腫瘤細(xì)胞的活性。 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明利用F/2A構(gòu)建重組抗pl85ertB2全長(zhǎng)人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體pWPI/H-F2A-L，并且與已構(gòu)建的另一雙順反子表達(dá)載體pWPI/H-IRES-L進(jìn)行比較。結(jié)果表明，pffPI/H-F2A-L組的病毒滴度(4. 3X105TU/mL)高于pWPI/H-IRES-L組的病毒滴度(3. 5 X 105TU/mL)，而且前組病毒的感染效率(87. 68% )也高于后組的(79. 08% )。其原因可能是因?yàn)镮RES的結(jié)構(gòu)較大(約590bp)，而F/2A的結(jié)構(gòu)小(84bp)，故F/2A可以緩解慢病毒載體PWPI裝載量的壓力，更有利于病毒的包裝和感染；ELISA檢測(cè)顯示，由F2A介導(dǎo)的嵌合抗體表達(dá)水平要高于由IRES介導(dǎo)的。其原因可能是因?yàn)镮RES對(duì)位于其后的基因翻譯起始能力相對(duì)較弱，導(dǎo)致其下游基因的表達(dá)量?jī)H是上游的20 % 50 %，而F/2A在維持上下游基因表達(dá)平衡性方面優(yōu)于IRES元件，故由F/2A介導(dǎo)的嵌合抗體完整分子表達(dá)水平會(huì)較高。綜上所述，含F(xiàn)/2A的嵌合抗體表達(dá)盒,與含IRES的表達(dá)盒相比,更有利于慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和嵌合抗體的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種含F(xiàn)/2A序列的抗pl85MbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體，其特征在于該載體是PWPI/H-F2A-L,其中H和L分別是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體重鏈基因和抗pl85eAB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因，F(xiàn)2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含F(xiàn)/2A序列的抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體，其特征在于所述抗pl85eAB2人鼠嵌合抗體重鏈基因由鼠抗人pl85eAB2單抗重鏈可變區(qū)基因vH和人IgGl的重鏈恒定區(qū)基因Y I連接而成；所述抗pl85ertB2人鼠嵌合抗體輕鏈基因由鼠抗人pl85eAB2單抗輕鏈可變區(qū)基因vL和人IgGl的輕鏈恒定區(qū)基因K連接而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述含F(xiàn)/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個(gè)開放閱讀框ORF，插入慢病毒表達(dá)載體pWPI，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述含F(xiàn)/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟 〈1>抗pl85MbB2人鼠嵌合抗體重、輕鏈基因的擴(kuò)增 用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗體輕、重鏈基因的質(zhì)粒pWPI/H-IRES-L，并以此為模板，在DNA Taq酶作用下分別用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-Β擴(kuò)增出嵌合重鏈基因H和嵌合輕鏈基因L ;擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ;PGR產(chǎn)物經(jīng)I %的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收目的基因； <2>全長(zhǎng)嵌合抗體H-F2A-L的構(gòu)建 ①接頭片段F2A的合成該片段由3部分構(gòu)成含NsiI酶切位點(diǎn)的嵌合重鏈H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含Pvu II酶切位點(diǎn)的嵌合輕鏈L的5’端序列； ②中間質(zhì)粒PUC57/F2A的構(gòu)建將接頭片段F2A插入到pUC57質(zhì)粒的BamHI和Xba I之間，獲得中間質(zhì)粒PUC57/F2A ； ③含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒pUC57/F2A-L的構(gòu)建用BamHI和Xba I雙酶切質(zhì)粒pUC57/F2A，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒分別回收接頭片段F2A和載體片段PUC57 ;進(jìn)而用Pvu II酶切接頭片段F2A，獲得5I酶切位點(diǎn)和3’端為PvuII酶切位點(diǎn)的接頭片段F2A;用Pvu II和Xba I雙酶切嵌合輕鏈L，獲得5’端為Pvu II酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I位點(diǎn)的輕鏈片段L ;然后，將這兩個(gè)片段用T4DNA連接酶連接后克隆入載體PUC57，獲得含有嵌合輕鏈的質(zhì)粒pUC57/F2A-L ； ④片段H-F2A-L的拼接用BamHI酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，獲得片段F2A-L ;進(jìn)而用Nsi I酶切片段F2A-L，獲得5’端為Nsi I酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I酶切位點(diǎn)的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I雙酶切嵌合重鏈H，獲得5’端為BamH I酶切位點(diǎn)和3’端為Nsi I位點(diǎn)的重鏈片段H ;通過T4DNA連接酶與片段F2A-L相連，獲得5’端為BamH I酶切位點(diǎn)和3’端為Xba I位點(diǎn)的嵌合抗體全長(zhǎng)片段H-F2A-L ； <3>慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pwpI/H-F2A-L的構(gòu)建 將純化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平兩端；同時(shí)用PmeI酶切慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPI，經(jīng)SAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶與H-F2A-L連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化.DH-5a感受態(tài)細(xì)菌，抽提質(zhì)粒后用載體測(cè)序引物EFl a和重鏈下游引物gammal-B作PCR，篩選正向插入陽性克隆PWPI/H-F2A-L，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，即得； 所述各引物為H-A :5’ -CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，gammal-B :5’ -ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG-3’ ；L-A :5’ -TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，Kappa-B :5’ -GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3’ ；EFl α :5’ -TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含F(xiàn)/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)連接人鼠嵌合抗體的重鏈和輕鏈，形成一個(gè)開放閱讀框(ORF)，插入慢病毒表達(dá)載體pWPI，構(gòu)建重組抗p185erbB2全長(zhǎng)人鼠嵌合抗體表達(dá)載體pWPI/H-F2A-L。經(jīng)測(cè)序鑒定，pWPI/H-F2A-L與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。重組慢病毒的感染效率分別為87.68％，感染293T細(xì)胞后，有嵌合重鏈和嵌合輕鏈的表達(dá)。與含IRES的嵌合抗體慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行比較，由F/2A介導(dǎo)的嵌合抗體的表達(dá)水平要高于由IRES介導(dǎo)的嵌合抗體，為今后抗p185erbB2工程抗體的研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102618583SQ20121008091
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月24日
發(fā)明者劉芳, 張瑋, 李力 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所