用于檢測(cè)煙草對(duì)tmv抗性的n基因特異性引物對(duì)、檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)煙草對(duì)TMV抗性的N基因特異性引物對(duì)、檢測(cè)方法及試劑盒，特異性引物對(duì)包括上游引物和下游引物；上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。檢測(cè)方法為：在煙草N基因序列特異區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物；以待測(cè)煙草品種的DNA為模板，使用N基因特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；采用電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有865bp的特征條帶，如果含有，則對(duì)TMV具有抗性；反之，則不具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性。具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠極大地加速抗TMV育種材料的選育過(guò)程，縮短育種周期，提高育種效率。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)煙草對(duì)TMV抗性的N基因特異性引物對(duì)、檢測(cè)方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)煙草對(duì)TMV抗性的N基因特異性引物對(duì)、檢測(cè)方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草普通花葉病(TMV, tobacco mosaic virus)是全世界煙草栽培區(qū)發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的一大病害。發(fā)病后，煙葉產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣，對(duì)煙葉生產(chǎn)帶來(lái)極大危害。目前，對(duì)于TMV的防治沒(méi)有效果較好的藥劑，只能采取提前預(yù)防、綜合防治等措施，由于受耕地資源緊張、連作的影響，培育抗TMV的煙草品種在生產(chǎn)中顯得尤為迫切和重要。
[0003]N基因起源于野生種黏煙草(Nicotiana glutinosa),是目前已經(jīng)明確的煙草抗TMV基因，是煙草抗TMV育種的主要抗源。1938年，F(xiàn).Q.Holmes等研究表明，黏煙草對(duì)TMV的抗性是由顯性單基因N基因控制的；1994年，S.Whitham等通過(guò)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆得到N基因，并證明其介導(dǎo)的TMV抗性可以產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)。N基因全長(zhǎng)為6656bp，包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼NS和NL兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，屬于TIR-NBS-LRR類抗病基因。國(guó)外已經(jīng)利用N基因介導(dǎo)的TMV抗性育成了一批高抗TMV的煙草品種，包括Ky56、By21、NC75、VA770、TN86、Colerl76、Coker86等。我國(guó)也利用該抗源培育了一系列抗TMV品種(系)，如:利用Ky56作為親本育成了遼煙8號(hào)、遼煙10號(hào)等抗TMV品種；利用Coker86的抗病性，育成了遼煙13、遼煙14等抗TMV品種。這些品種在我國(guó)的煙草生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。
[0004]在傳統(tǒng)的抗TMV育種中，為鑒定所培育的品種是否具有TMV抗性，通常采取田間鑒定方法，即:需要對(duì)育種材料進(jìn)行單株接種并創(chuàng)造合適的發(fā)病條件，因此，如果接種不成功或條件不合適，均會(huì)影響品種抗性判斷結(jié)論，具有品種抗性判斷效率低的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)煙草對(duì)TMV抗性的N基因特異性引物對(duì)、檢測(cè)方法及試劑盒，利用N基因特異引物序列檢測(cè)不同育種材料TMV抗性，為煙草抗TMV育種提供一條快捷有效的方法，不受生長(zhǎng)條件和發(fā)育時(shí)期的影響，可以快速高效的檢測(cè)N基因控制的TMV抗性，加快抗TMV種質(zhì)資源和優(yōu)良品種篩選，還具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠極大地加速材料的選育過(guò)程，縮短育種周期，提高育種效率。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明第一目的為提供一種用于檢測(cè)煙草對(duì)TMV抗性的N基因特異性引物對(duì)，包括上游引物NPF和下游引物NPR ；
[0008]所述上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0009]所述下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0010]本發(fā)明第二目的為提供一種煙草是否具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0011]SI,利用Genbank提供的煙草基因組序列進(jìn)行Blast比對(duì)，查找被檢測(cè)煙草的N基因序列特異區(qū)域，并在該特異區(qū)域設(shè)計(jì)N基因特異性引物對(duì)；其中，所述N基因特異性引物對(duì)包括:上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示；
[0012]N基因序列特異區(qū)域的序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)煙草對(duì)TMV抗性的N基因特異性引物對(duì)，其特征在于，包括上游引物NPF和下游引物NPR ； 所述上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 所述下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一種煙草是否具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，利用Genbank提供的煙草基因組序列進(jìn)行Blast比對(duì)，查找被檢測(cè)煙草的N基因序列特異區(qū)域，并在該特異區(qū)域設(shè)計(jì)N基因特異性引物對(duì)；其中，所述N基因特異性引物對(duì)包括:上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示； S2，提取被檢測(cè)煙草品種的DNA ； S3，以所述被檢測(cè)煙草品種的DNA為模板，使用所述N基因特異性引物對(duì)對(duì)所述被檢測(cè)煙草品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； S4,采用電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有865bp的特征條帶，如果含有，則所述被檢測(cè)煙草品種具有N基因序列，對(duì)TMV具有抗性；反之，則所述被檢測(cè)煙草品種不具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的煙草是否具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為:2 X Dr eamt aq MIX I Ou I，模板DNA Iu I，上游引物Iu I，下游引物Iul，最后用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至20ul。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述 的煙草是否具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94~95°C預(yù)變性3~5min ；94~95°C變性30s ;退火溫度 53-570C，30s ;72°C延伸 Imin ;30_35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C，IOmin 停止反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的煙草是否具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s ;退火溫度56°C，30s ；72°C延伸Imin ;共35個(gè)循環(huán)，最后72°C IOmin停止反應(yīng)。
6.一種檢測(cè)煙草是否具有N基因介導(dǎo)的TMV抗性的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括:PCR反應(yīng)試劑和引物；所述引物包括: 上游引物NPF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； 下游引物NPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103866038SQ201410135454
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】張玉, 羅成剛, 楊愛(ài)國(guó), 張偉, 蔣彩虹, 常愛(ài)霞, 馮全福, 錢玉梅, 程立銳, 耿銳梅, 任民 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所