一種用于沉默鐮刀菌內源基因的沉默載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于沉默鐮刀菌內源基因的沉默載體及其應用，所述沉默載體包括原始載體以及插入所述原始載體的正向沉默片段和反向沉默片段，所述原始載體為PFsilent-1，或潮霉素抗性基因替換為G418抗性基因的載體PFsilent-1；所述正向沉默片段插入所述原始載體中內含子上游的多克隆位點，所述反向沉默片段插入所述原始載體中內含子下游的多克隆位點。本發(fā)明還公開了所述沉默載體在沉默鐮刀菌內源基因中的應用。本發(fā)明構建了能用于適用于禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等鐮刀菌基因沉默的沉默載體及高效遺傳轉化體系；利用本發(fā)明建立的沉默載體和轉化體系，能使靶基因的表達量降低約80-90%。
【專利說明】—種用于沉默鐮刀菌內源基因的沉默載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學與基因工程領域，尤其涉及一種用于沉默鐮刀菌內源基因的沉默載體及其應用。
【背景技術】
[0002]RNA沉默是真核生物細胞對RNA的一種特異性的、高效的降解機制，該機制一旦被激活就能通過堿基互補的方式對胞質中同源的RNA進行降解。RNA沉默現(xiàn)象普遍存在于植物、動物和真菌等真核生物中，是生物體進化過程中抵抗外源遺傳因子(病毒、轉座子或轉基因)作用的一種防御機制，用以保持生物體自身基因組的完整和穩(wěn)定性。
[0003]利用RNA沉默技術防治病蟲害，顯示著巨大的應用潛力。最近研究發(fā)現(xiàn)，將病原菌或害蟲基因的dsRNA沉默載體轉入寄主植物中，植物中產生的雙鏈siRNA不僅能在植物微管組織進行系統(tǒng)輸導，而且能從植物細胞中移動到寄生植物的線蟲、病菌以及取食植物的昆蟲體內，對病菌和害蟲產生基因沉默效應，這也稱作為寄主誘導的RNA沉默(Host-1nduced RNA silencing)。利用寄主誘導的RNA沉默技術可有效地、特異性地抑制棉鈴蟲基因的表達，進而抑制棉鈴蟲的生長。該技術在害蟲防治方面已顯示出廣闊的應用前景，國內外已經利用該技術獲得對刺吸式和咀嚼式等多種害蟲有防治效果的轉基因作物材料。利用寄主誘導的RNA沉默技術在抗病品種培育方面也有成功先例，尤其在植物抗病毒方面，已培育出多種抗病毒的轉基因作物品種。例如:抗黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaicvirus, CMV)、西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)和西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)的轉基因南瓜。國際上剛剛開始利用寄主誘導的基因沉默技術創(chuàng)建抗真菌病害的作物材料，并已顯示出巨大的應用潛力。2010年Nowara等在《Plant Cell))上報道:在大麥植株中轉入針對白粉病菌效應因子AvralO或Avrkl基因的dsRNA沉默載體，大麥中產生的針對AvralO和Avrkl的siRNA能夠通過白粉菌的吸器進入菌體內，進而有效抑制白粉病菌的侵染行為，提高植株對白粉病的抗性。利用RNA沉默技術在小麥上成功的沉默了條銹病菌吸器特異性表達的致病相關基因，獲得的轉基因小麥材料對條銹病表現(xiàn)抗性。近來，Tinoco`等人將⑶S基因dsRNA沉默載體轉入煙草中，再用轉⑶S基因的輪枝鐮孢菌接種轉基因煙草，結果發(fā)現(xiàn):侵染煙草的輪枝鐮孢菌中GUS基因的表達被完全抑制，表明寄主誘導的基因沉默對腐生性較強的鐮孢菌同樣有效。與常規(guī)轉基因技術相比，利用RNA沉默技術僅需要在寄主植物中表達病原物基因特有的一部分序列，而不需要表達一個完整的基因，這可有效克服轉基植物可能存在的安全性問題，因此，該技術在高效廣譜抗真菌種質材料的創(chuàng)建中可發(fā)揮重要作用。
[0004]由鐮刀菌引起的農作物重要病害，如禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病，尖孢鐮刀菌引起的番茄枯萎病等，給農業(yè)生產帶來巨大的經濟損失。利用上述寄主誘導基因沉默技術獲得轉基因抗鐮刀菌品種具有廣闊的應用前景。建立寄主誘導基因沉默技術的關鍵是選擇針對病菌的靶基因，但目前還未見鐮刀菌沉默技術的報道。
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種用于沉默鐮刀菌內源基因的沉默載體，適用于鐮刀菌的基因沉默，且沉默效果好。
[0006]一種用于沉默鐮刀菌內源基因的沉默載體，包括原始載體以及插入所述原始載體的正向沉默片段和反向沉默片段，所述原始載體為pSilent-Ι或潮霉素抗性基因替換為G418抗性基因的載體pSilent-Ι ;所述正向沉默片段插入所述原始載體中內含子上游的多克隆位點，所述反向沉默片段插入所述原始載體中內含子下游的多克隆位點。
[0007]啟動子的啟動效率是影響基因沉默效果的關鍵因素，原始載體PFsilent-1中，用于啟動正向沉默片段和反向沉默片段轉錄的啟動子為來源于粗糙脈孢霉的trpC基因的啟動子，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，該啟動子能夠在鐮刀菌內正常啟動，且啟動效率高，能夠高效率的啟動正向沉默片段和反向沉默片段轉錄形成發(fā)卡結構，對Cyp51A基因、PKS12基因、Stel2基因、致死基因FGSG_06103、多基因tri6-Cyp51A_PKS12均能達到較好的沉默效果，基因的表達量最聞可降低80%以上。
[0008]沉默靶區(qū)域的選擇直接影響靶基因的沉默效果，對于沉默cyp51A基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0009]對于沉默PKS12基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0010]對于沉默Stel2基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0011]對于沉默同時沉默tri6-cyp51A-PKS12三基因，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示。
[0012]對于沉默致死基因FGSG_06103，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
[0013]選擇上述的沉默靶區(qū)域，可特異性的對各自相應的靶基因進行沉默，且沉默效果好，基因的表達量最聞可降低80%以上。
[0014]本發(fā)明還提供了所述的沉默載體的構建方法，包括:
[0015](I)以靶基因的cDNA為模板，PCR擴增正向沉默片段和反向沉默片段；
[0016](2)將所述的正向沉默片段連入所述原始載體中內含子上游的多克隆位點，將所述的反向沉默片段連入所述原始載體中內含子下游的多克隆位點，構建得到所述的沉默載體。
[0017]本發(fā)明還提供了所述的沉默載體在沉默鐮刀菌內源基因中的應用。
[0018]所述鐮刀菌具體可以為禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)或尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。
[0019]所述的應用具體包括:
[0020](I)將鐮刀菌的分生孢子接種于培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，獲得幼殖體；
[0021](2)以所述幼殖體為原料，制備得到原生質體；
[0022](3)將沉默載體轉化所述的原生質體，篩選獲得沉默轉化子。
[0023]步驟(1)中，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為23~28°C，時間為12~14小時，轉速為150~220rpm，優(yōu)選的，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為25°C，時間為12小時，轉速為160rpm。
[0024]所述原生質體的制備方法包括:將所述的幼殖體置于蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶的混合酶液中進行酶解，酶解結束后過濾、離心、清洗，得到所述的原生質體。
[0025]良好的原生質體是成功轉化及高轉化效率的前提，而酶液是影響原生質體質量的關鍵，優(yōu)選的，所述蝸牛酶的濃度為30g/L，纖維素酶的濃度為20g/L，溶菌酶的濃度為20g/L，混合酶液的溶劑為0.7M NaCl溶液。上述濃度的三種酶混合后，能夠有效降解鐮刀菌的細胞壁，制得原生質體。
[0026]酶解的溫度和時間也會影響原生質體的質量，優(yōu)選的，所述酶解的時間為2.5~3h，溫度為28~30°C。
[0027]所述轉化的方法包括:[0028](I)將所述的原生質體懸浮于STC溶液中，并滴加含40%PEG4000的STC溶液，得原生質體懸液；
[0029](2)將原生質體懸液、沉默質粒溶液和肝素鈉溶液混合，冰浴20~30min后，向混合液中逐滴加入1/3混合液體積的含40%PEG4000的STC溶液，得轉化液；
[0030](3)將所述的轉化液混勻后靜置20~30min，加入培養(yǎng)液進行再生培養(yǎng)；
[0031](4)再生培養(yǎng)結束后將所述的培養(yǎng)液與培養(yǎng)基混合后共培養(yǎng)。
[0032]采用上述PEG介導轉化的方法可將沉默質粒高效率的轉化到鐮刀菌的原生質體中。
[0033]STC溶液可維持原生質體的滲透壓，優(yōu)選的，STC溶液的配方為:山梨醇14.58g/100ml, CaCl20.555g/100ml, Tris0.692g/100ml,濃 HC10.42ml/100ml, ρΗ7.0。
[0034]步驟(2)中，原生質體懸液、沉默質粒溶液和肝素鈉溶液混合后，所述肝素鈉在混合液中的濃度為0.1~0.3mg/ml,優(yōu)選為0.2mg/ml。
[0035]步驟(3)中，所述的培養(yǎng)液優(yōu)選為RM培養(yǎng)液(酵母提取物lg/L，水解酪蛋白Ig/L,蔗糖 274g/L，ρΗ7.0)。
[0036]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0037]本發(fā)明根據(jù)RNAi (RNA介導的基因沉默)原理，構建了能用于適用于禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等鐮刀菌基因沉默的沉默載體，同時也建立了鐮刀菌高效遺傳轉化體系；利用本發(fā)明建立的沉默載體和轉化體系，能使靶基因的表達量降低約80-90%，達到基因功能研究的目的。另外，該技術不僅能完成單基因沉默，且能同時完成多基因沉默，尤其能用于鐮刀菌致死基因功能分析及寄主介導基因沉默技術的靶基因篩選，具有很強的理論研究及應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1.沉默載體PFsilent-Hgy圖譜；
[0039]圖2.沉默載體 PFsilent_G418 圖譜；
[0040]圖3A.cyp51A沉默載體構建示意圖；
[0041]圖3B.cyp5 IA沉默轉化子的表型檢測；其中，cyp51A_S7為該沉默轉化子在含戊唑醇藥劑平板上的生長表型，HN9-1為野生型禾谷鐮刀菌菌株，為陽性對照；cyp51A菌株為該cyp51A基因插入突變體，為陰性對照。[0042]圖3C.RT-PCR檢測轉化子cyp51A_S7中cyp51A基因的mRNA的相對表達量，野生型HN9-1的表達量設置為I。
[0043]圖4A.pksl2沉默載體構建示意圖；
[0044]圖4B.為pks 12沉默轉化子的表型檢測；其中，PKS-Sl為該沉默轉化子在PDA平板上的生長表型，HN9-1為野生型禾谷鐮刀菌菌株，為陽性對照。
[0045]圖4C.RT-PCR檢測轉化子PKS-Sl中該pksl2基因的mRNA的相對表達量，野生型HN9-1的表達量設置為I。
[0046]圖5A.F0Stel2沉默載體構建示意圖；
[0047]圖5B.F0Stel2沉默轉化子的致病力檢測；其中，F(xiàn)0Stel2_S12為該沉默轉化子在番爺果實上的致病能力，WT為野生型菌株F.0xysporum4287,為陽性對照。
[0048]圖5C.RT-PCR檢測轉化子F0Stel2_S12中該F0Stel2基因的mRNA的相對表達量，野生型F.0xysporum4287的表達量設置為I。
[0049]圖6A.tri6-cyp51A-PKS12三個基因同時沉默載體構建示意圖。
[0050]圖6B.三個基因同時沉默轉化子CPT-S2在含戊唑醇藥劑平板上的生長表型、色素
形成及DON毒素含量。
[0051]圖6C.三個基因同時沉默轉化子CPT-S2的DON毒素含量；
[0052]圖6D.RT-PCR檢測轉化子CPT-S2中三個靶標基因的mRNA的相對表達量，野生型HN9-1的表達量設置為I。
`[0053]圖7A.FGSG_06103基因沉默載體構建示意圖。
[0054]圖7B.FGSG_06103基因沉默轉化子FGSG_06103_S4在PDA上生長表型。
【具體實施方式】
[0055]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。
[0056]實施例1鐮刀菌的基因沉默技術體系的建立
[0057]本發(fā)明的目的是針對目前沒有適合鐮刀菌的基因沉默方法，提供一種適用于禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等鐮刀菌的基因沉默技術體系，涉及適用于鐮刀菌的沉默載體，含靶基因沉默載體構建方法及鐮刀菌遺傳轉化方法。具體
【發(fā)明內容】
如下:
[0058]1.適用于鐮刀菌基因沉默的載體PFsilent-Hyg和PFsilent_G418
[0059]沉默載體PSilent-1系贈送，即以下參考文獻中提及的pSilent-Ι載體:GenBank:AB303070.2, “Gene silencing vector pSilent-lDNA, complete sequence”，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/217272796。
[0060]適用于鐮刀菌的沉默載體PFsilent-Hyg (即沉默載體pSilent-1)的圖譜見圖1,PFsilent-Hyg質粒主要包括:Amp,氨節(jié)霉素編碼區(qū)(129_989bp),主要用于載體構建過程中，質粒在大腸桿菌中的篩選標記；PtrpC (2226-2592bp)，來源于粗糙脈孢霉的trpC基因的啟動子，用于啟動潮霉素編碼區(qū)；HygromyCin(2593-3618bp)，潮霉素抗性，用于在含潮霉素的平板上篩選沉默轉化子；TtrpC(3638-4123bp)，來源于粗糙脈孢霉的trpC基因的終止子，用于潮霉素基因翻譯的終止；PtrpC (4162-5447bp)來源于粗糙脈孢霉的trpC基因的啟動子，用于啟動加入的沉默片段正向轉錄；MCS (5451-5476bp)，多克隆位點，通過酶切的靶基因序列正向插入在該位點處；Intron(5491-5624bp)，來源于稻瘟病菌角質酶基因的內含子，便于形成發(fā)卡結構；MCS (5451-5476bp)，多克隆位點，通過酶切的能形成靶基因沉默 序列反義鏈的DNA序列插入在該位點處；TtrpC (5675_6404bp),來源于粗糙脈孢霉的trpC 基因的終止子，用于形成發(fā)卡結構的mRNA轉錄的終止。
[0061]對載體pSilent-1進行改造，將pSilent_l載體的篩選標記潮霉素基因通過SacI 和Spel雙酶切后，回收后連接上同樣黏性末端的G418抗性基因(序列如SEQ ID NO. 49)，構 建得到沉默載體PFsilent-G418。
[0062]適用于鐮刀菌的沉默載體PFsilent-G418的圖譜見圖2，可以用于在已含潮霉素 抗性的鐮刀菌菌株中進行基因沉默，與PFsilent-Hyg載體的主要區(qū)別在于G418抗性區(qū)域。 PFsilent-G418質粒主要包括：Amp，氨芐霉素編碼區(qū)（129_989bp)，主要用于載體構建過程 中，質粒在大腸桿菌中的篩選標記；PtrpC (2226-2546bp),來源于粗糙脈孢霉的trpC基因 的啟動子，用于啟動G418抗性編碼區(qū)；G418 (2547-3341bp)，G418抗性，用于在含G418抗 生素的平板上篩選沉默轉化子；TtrpC(3342-3827bp)，來源于粗糙脈孢霉的trpC基因的終 止子，用于潮霉素基因翻譯的終止；PtrpC(3866-5151bp)來源于粗糙脈孢霉的trpC基因的 啟動子，用于啟動加入的沉默片段正向轉錄；MCS (5155-5180bp)，多克隆位點，通過酶切的 靶基因序列正向插入在該位點處；Intron(5195-5328bp)，來源于稻瘟病菌角質酶基因的內 含子，便于形成發(fā)卡結構；MCS (5341-5377bp)，多克隆位點，通過酶切的能形成靶基因沉默 序列反義鏈的DNA序列插入在該位點處；TtrpC (5379_6108bp),來源于粗糙脈孢霉的trpC 基因的終止子，用于形成發(fā)卡結構的mRNA轉錄的終止。
[0063]2.靶基因沉默質粒的構建方法
[0064]在美國哈佛-麻省理工的博德研究所（Broad Institute)中查找到所需進行研究 的革巴基因(http://www. broadinstitute. org/annotation/genome/fusarium_group)獲取 對應的編碼區(qū)核酸序列（cDNA)。通過 SMART 軟件（http://smart, embl-heidelberg. de/)分 析靶基因的關鍵結構域作為沉默區(qū)域，再結合Vcctor NTIK軟件分析選擇沉默區(qū)域的酶切 位點，沉默區(qū)域應選擇不含有多克隆位點的酶切位點。沉默區(qū)域選擇大小一般為200-400bp 較合適。確定沉默區(qū)域后，設計引物擴增靶區(qū)域，酶切位點設計在引物的5’端。PCR產物使 用TAKARA公司的限制性內切酶進行酶切，酶切產物切膠回收后進行T4連接酶獲得重組質 粒。通過上述方法將正向和反向PCR產物插入至對應的多克隆位點上，獲得靶基因沉默質 粒。
[0065]3.沉默質粒轉化鐮刀菌方法
[0066]本發(fā)明采用PEG介導法將沉默質粒轉入目的鐮刀菌菌株中，具體步驟如下：
[0067]1)分生孢子制備
[0068]取PDA培養(yǎng)基(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉10g/L)上鐮刀菌菌落邊緣的 菌塊接種到1%綠豆湯（10g綠豆水煮20分鐘后三層紗布過濾，加ddH20至1000ml，121 °C高 壓滅菌20min)或CMC產孢培養(yǎng)液(羧甲基纖維素鈉15g/L，酵母提取物lg/L，NH4N03lg/L， KH2P04lg/L，MgS04 ?7H200. 5g/L)中，25°C，180rpm，24h 光照培養(yǎng) 4 天后用滅菌紗布過濾，濾 液8000rpm離心lOmin,棄上清,孢子沉淀再用無菌水懸浮混勻備用。
[0069]2)幼殖體制備
[0070]將分生孢子懸浮液接種到100ml的YEH)培養(yǎng)液(蛋白胨10g/L，酵母提取物3g/L， 葡萄糖20g/L，pH6. 7-7. 0)中，25°C，170rpm過夜培養(yǎng)，用三層擦鏡紙過濾幼殖體，0. 7M NaCl溶液沖洗多次，再用滅菌牙簽將沖洗好的幼殖體轉移到50ml玻璃三角瓶中待用。
[0071]3)原生質體制備
[0072]稱取三種細胞壁裂解酶(蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶)(上?？?各0.3g、0.2g、0.2g溶解在IOml的0.7M NaCl溶液中，用0.45 μ m的細菌濾器(Millpore)過濾酶液。將過濾好的酶液加入到裝有幼殖體的50ml玻璃三角瓶中，搖勻，使得幼殖體均勻分布在酶液中，30°C，IOOrpm搖培裂解2.5_3h。3層擦鏡紙過濾酶解混合液，用0.7M NaCl溶液沖洗原生質體，收集濾液，40C，5000rpm離心2min，棄上清液留原生質體沉淀，用2ml的0.7M NaCl溶液重懸浮原生質體沉淀，4°C,5000rpm,離心2min,棄上清液,再用Iml的STC (Sorbitol (山梨醇)14.58g/100ml, CaCl20.555g/100ml, Tris0.692g/100ml，濃 HC10.42ml/100ml，pH7.0)溶液重懸浮原生質體沉淀，4°C，5000rpm,離心2min，棄上清液，再用800 μ I的STC溶液重懸浮原生質體，逐滴加入200 μ I的SPTC溶液(含40%PEG4000的STC溶液)，冰上放置待用。4)原生質體轉化
[0073]將Iml的原生質體懸浮液、100 μ I的沉默質粒溶液(使用天根無內毒素質粒大提試劑盒提取(貨號DPl 17)，質粒濃度為450ng/y I)和5μ I的肝素鈉(5mg/ml)加入管中，輕輕混勻，冰上靜置30min ;逐滴加入1/3體積的SPTC溶液，輕輕混勻，在室溫靜置20min ；將轉化混合液加入50ml玻璃三角瓶中，加入20ml的RM培養(yǎng)液(酵母提取物lg/L，caseinhydrolysate (水解酪蛋白)lg/L,鹿糖 274g/L, ρΗ7.0),室溫靜置 2h 后 25°C, IOOrpm 過夜培養(yǎng)。次日將恢復好的菌絲混入溫度適中的PDA培養(yǎng)基中，加入篩選抗生素(潮霉素或者G418，終濃度均為100μ g/ml)，鋪平板，25°C培養(yǎng)2~3d后挑轉化子。
[0074]4.基因沉默效果評價方法
[0075]通過測定沉默轉化子的生長、對非生物脅迫等生物學特征，并通過RT-PCR技術定量檢測靶基因的表達量，與野生型菌株比較綜合評價沉默效果。
[0076]實施例2禾谷鐮刀菌cyp51A單基因的沉默
[0077]cyp51A基因在禾谷鐮刀菌抗三唑類殺菌劑過程中起重要作用，該基因的敲除突變體，不能在含三唑類藥劑平板上生長。試驗通過沉默cyp51A后，觀察其表型。
[0078]從 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到禾谷鐮刀菌的cyp51A基因(FGSG_04092)的⑶NA區(qū)域，通過分析，設計擴增正向沉默片段(Sense arm)的上下游引物為:
[0079]cvd51A-SL-F:5’ -ATctcgagTCTATCCCTTATGGGTCTTGG-3’ (XhoI)
[0080]cvp5IA-SL-R:5，-ATaagcttTTGCGTAAGGCCAAACTTGA~3，(HindIII)
[0081]擴增反向沉默片段(Antisense arm)的上下游引物為:
[0082]cvp5IA-SR-F: 5，-ATggtaccTCTATCCCTTATGGGTCTTGG-3，(KpnI)
[0083]cyp5IA-SR-R:5，-ATagatctTTGCGTAAGGCCAAACTTGA-3，(BglII)
[0084]RT-PCR鑒定沉默轉化子基因表達量引物如下，產物大小248bp:
[0085]cyp5 IA-RT-F: 5 ’ -CCAAGGCAATGGCTGAGATA-3 ’
[0086]cyp5 IA-RT-R: 5，-TGTTCGAATGCCCCCTTTT-3 ’
[0087]正向(正向沉默片段)或反向(反向沉默片段)PCR擴增產物為401bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，正反向產物分別酶切連接至PFsilent-G418的兩個多克隆位點，獲得重組后的沉默質粒，命名為PFsilent-G418-Cyp51A。按照實施例1中的PEG介導轉化體系轉化禾谷鐮刀菌，并在G418平板上篩選轉化子。
[0088]試驗得到23個沉默轉化子，表現(xiàn)出不同的沉默效果，以S7號(命名為cyp51A_S7)進行表型測定和RT-PCR分析。結果如圖3C所示，沉默轉化子cyp51A-S7的基因表達量明顯下降至野生型的15%左右,在含三唑酮(濃度為5 μ g/ml)的平板上表型與cyp51A基因的敲除突變體類似，生長極其緩慢(圖3B)。結果證明，該技術完成了靶基因cyp51A的沉默，降低其表達量。
[0089]實施例3禾谷鐮刀菌色素合成基因PKS單基因沉默
[0090]PKS基因簇是禾谷鐮刀菌色素合成的基因簇，該基因簇的基因突變將導致菌株不能產生深紅色色素。本實例將沉默PKS基因簇的關鍵基因PKS12來進行沉默效果評價。
[0091]從 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到禾谷鐮刀菌的PKS12基因(FGSG_02324)的⑶NA區(qū)域，通過分析設計引物如下:
[0092]擴增正向沉默片段的上下游引物為:
[0093]Pks12-SL-F: 5，-ATGCctcgag ACTTTGCCGACATTCAGGAA-3，(XhoI)
[0094]Pksl2-SL-R:5’ -ATGCaagcttAAGGAACTGACGATCGAGCAA_3’ (HindIII)
[0095]擴增反向沉默片段的上下游引物為:
[0096]PksI2-RL-F:`ATGCggtaccACTTTGCCGACATTCAGGAA~3， (KpnI)
[0097]Pksl2-RL-R:5’ -ATGCagatctAAGGAACTGACGATCGAGCAA-3’ (BglII)
[0098]RT-PCR鑒定引物如下，PCR產物大小為112bp:
[0099]NPKS-RTF: 5，-AAAGGTCGCGATGTTCATCG-3，
[0100]NPKS-RTR: 5，-TGAAGCAGCCATTCATGACC-3，
[0101]正向或反向PCR擴增產物為426bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，正反向產物分別酶切連接至PFsilent-Hgy的兩個多克隆位點，獲得重組后的沉默質粒，命名為PFs i Ient-Hgy-PKS12。按照實施例1中的PEG介導轉化體系轉化禾谷鐮刀菌，并在潮霉素平板上篩選轉化子。
[0102]試驗得到18個沉默轉化子，表現(xiàn)出不同的沉默效果，以SI號(命名為PKS-S1)進行表型測定和RT-PCR分析。結果如圖4B、圖4C所示，沉默轉化子PKS-Sl的基因表達量明顯下降至野生型的15%左右，在PDA平板上不能形成色素。結果證明，該技術完成了靶基因PKS12的沉默，降低其表達量。
[0103]實施例4尖孢鐮孢菌致病關鍵基因Stel2的沉默分析
[0104]尖孢鐮孢菌Stel2在其致病過程中起關鍵作用，已報道該基因的敲除突變體菌株不能引起番茄的病害，實例中對該基因進行沉默并觀察其致病能力。
[0105]從 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到尖孢鐮刀病菌F.0xysporum4287菌株Stel2 (F0XG_02103)的⑶NA區(qū)域,分析后設計沉默引物如下:
[0106]擴增正向沉默片段的上下游引物為:
[0107]PS-Fostel2-LF:5’ -ATGCctcgagGCAACCCGACCAGTACATTCGCCG_3’ (XhoI)
[0108]PS-Fostel2-LR:5，-ATGCaagcttCCAGTAAAAGACTTTTTGCTTC-3J (HindIII)擴增反向沉默片段的上下游引物為:[0109]PS-Fostel2-RF:5’ -ATGCggtaccGCAACCCGACCAGTACATTCGCCG_3’ (KpnI)
[0110]PS-Fostel2-RR:5，-ATGCagatctCCAGTAAAAGACTTTTTGCTTC-3J (BglII) RT-PCR 引物如下，擴增產物為217bp:
[0111]F0stel2-RT-F:5’ -GCCGTCCTGTCAAAAACTCCAA-3’
[0112]F0stel2-RT-R:5’ -TCGCGTTCCAGCGCGTCAAGAAAC-3’
[0113]正向或反向PCR擴增產物為361bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.5所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示，正反向產物分別酶切連接至PFsilent-Hgy的兩個多克隆位點，獲得重組后的沉默質粒，命名為PFsilent-Hgy-Ste12。按照實施例1中的PEG介導轉化體系轉化尖孢鐮孢菌，并在潮霉素平板上篩選轉化子。
[0114]試驗得到50個沉默轉化子，表現(xiàn)出不同的沉默效果，以S12號(命名為F0Stel2-S12)進行表型測定和RT-PCR分析。結果如圖5B、圖5C所示，沉默轉化子F0Stel2-S12的基因表達量明顯下降，番茄果實上接種試驗表明其致病力下降。
[0115]實施例5禾谷鐮刀菌tri6-cyp51A_PKS12多基因同時沉默效果評價
[0116]本實施案例通過同時沉默脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)合成關鍵基因、戊唑醇抗性相關基因cyp51A和色素合成基因PKS12，并檢測沉默轉化子沉默后，各基因對應表型，以證明本發(fā)明的技術可以用于同時進行多基因沉 默。
[0117]從 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到cyp51A、PKS12、tri6在禾谷鐮刀菌中的基因位置分別為FGSG_04092、FGSG_02324和FGSG_03536,首先設計引物將3個基因的沉默區(qū)域進行擴增，再通過融合PCR，進行融合。相關引物如下:
[0118]PsilentCom-Fl:5，-TACTCCGAAGAACCACTTGTT-3’
[0119]Psi IentCom-Rl: 5，-TGACAGCAAAGAGTGCTACCACATTGTTGTCCTTCCTTGTCTT-3，
[0120]PsilentCom-F2:5，-TGGTAGCACTCTTTGCTGTCA-3’
[0121]PsilentCom-R2:5’ -GCTTTTTGCGTAAGGCCAAACT-3’
[0122]NPsi lentCom-F3:5，-AGTTTGGCCTTACGCAAAAAGCCGTACCTTTCCTTCGGAGAAC-3，
[0123]NPsi lentCom-R3:5 ’ -AGGAACTGACGATCGAGCAAGTC-3 ’
[0124]PsilentCom-Fl/Rl 用于擴增 tri6 基因沉默區(qū)，PCR產物為 380bp;PsilentCom-F2/R2用于擴增cyp51A基因沉默區(qū)，PCR產物為438bp;NPsilentCom_F3/R3用于擴增PKS12基因沉默區(qū)，PCR產物為354bp。PCR產物用Primer Star進行擴增并回收產物。上述3個片段利用融合PCR進行融合后利用下列引物擴增正反向插入片段:
[0125]擴增正向沉默片段的上下游引物:
[0126]PsilentCom-HpF4:5’ -ATGCctcgagGCTTCGACTTTGACTTCGCGAAC_3’ (XhoI)
[0127]NPsilentCom-HpR4:5，-ATGCaagcttGAGAGCTCCAAGGACAAAGAAT_3’ (HindIII)擴增反向沉默片段的上下游引物:
[0128]NPsilentCom-NHpF5:5，-ATGCggtaccGCTTCGACTTTGACTTCGCGAAC_3’ (KpnI)
[0129]NPsilentCom-NHpR5:5’ -ATGCagatctGAGAGCTCCAAGGACAAAGAAT_3’ (BglII)
[0130]正向或反向PCR擴增產物為llOlbp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.7所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，正反向產物分別酶切連接至PFsi Ient-G418的兩個多克隆位點，獲得重組后的沉默質粒，命名為PFsi Ient-G418-CPT。按照實施例1中的PEG介導轉化體系轉化禾谷鐮刀菌，并在G418平板上篩選轉化子。
[0131]試驗得到30個沉默轉化子，表現(xiàn)出不同的沉默效果，以S2號(命名為CPT-S2)進行表型測定和RT-PCR分析。RT-PCR使用引物如下:
[0132]Tri6-PS-RTF: 5，-TTATCGCCCTTCCCACCTTCACAC-3，
[0133]Tri6-PS-RTR:5’ -GGTAATGCCGCCTAAAGTCCCGTC-3’
[0134]CYP5IA-PS-RTF: 5，-TTTTCCACTGGTTCCCTTTCTT-3，
[0135]CYP5IA-PS-RTR: 5，-ACTTCTTCTGCATTGGCATCCT-3，
[0136]PKS-PS-RTF: 5，-TGGTGTAGATGCTGTTCGTGTG-3，
[0137]PKS-PS-RTR: 5，-TGATGAATGAGTCAAGTCGGTC-3，
[0138]結果如圖6B、圖6C、圖6D所示，沉默轉化子CPT-S2的各基因表達量明顯下降，轉化子不能在含戊唑醇的平板上生長、菌落白色且DON產量降低。實例結果證明，該發(fā)明技術能進行多基因同時沉默。
[0139]實施例6禾谷鐮刀菌致死基因FGSG_06103沉默效果評價
[0140]禾谷鍵刀菌基因FGSG_06103 功能預測為 Serine/threonine-proteinph0SphataSe2B催化亞基。通過同源重組技術進行該基因敲除該基因，獲得150個異位轉化子，未獲得敲除突變體，因此推測為致死基因。本實例通過該發(fā)明技術進行沉默，觀察表型。
[0141]從 http://www.broadinstitute.0rg/annotation/genome/fusarium_group 中查找到FGSG_06103的CDNA序列，設計引物如下:
[0142]擴增正向沉默片段的上下游引物:
[0143]PS-Fg6103-LF:5’ _ATGCctcgagGGACGCTCCCATCACCGTCTGTG3’ (XhoI)
[0144]PS-Fg6103-LR:5’ -ATGCaagctt AAGGTGAAGTAGTCGGTCAAGT-3’(HindIII)擴增反向沉默片段的上下游引物:
[0145]PS-Fg6103-RF:5’ -ATGCggtaccGGACGCTCCCATCACCGTCTGTG-3’ (KpnI)
[0146]PS-Fg6103-RR:5’ -ATGCagatct AAGGTGAAGTAGTCGGTCAAGT-3? (BglII)
[0147]正向或反向PCR擴增產物為243bp，其中正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示，反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示，正反向產物分別酶切連接至PFsilent-Hgy的兩個多克隆位點，獲得重組后的沉默質粒，命名為PFsilent-Hgy-6103。按照實施例1中的PEG介導轉化體系轉化禾谷鐮刀菌，并在潮霉素平板上篩選轉化子。
[0148]試驗得到25個沉默轉化子，表現(xiàn)出不同的沉默效果，其中有5個轉化子表現(xiàn)出明顯的生長表型減慢。以S4號(命名為FGSG_06103-S4)進行表型測定，結果如圖7B所示，沉默轉化子FGSG_06103-S4在PDA培養(yǎng)基表面的生長速度明顯減弱。該結果證明，該技術完成了致死基因FGSG_06103的沉默。
【權利要求】
1.一種用于沉默鐮刀菌內源基因的沉默載體，包括原始載體以及插入所述原始載體的正向沉默片段和反向沉默片段，其特征在于，所述原始載體為PSilent-1或pSilent-Ι潮霉素抗性基因替換為G418抗性基因的載體pSilent-Ι ;所述正向沉默片段插入所述原始載體中內含子上游的多克隆位點，所述反向沉默片段插入所述原始載體中內含子下游的多克隆位點。
2.如權利要求1所述的沉默載體，其特征在于，所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQID N0.1所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示,所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示；或所述正向沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示，所述反向沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
3.如權利要求1或2所述的沉默載體的構建方法，其特征在于，包括: (1)以靶基因的cDNA為模板，PCR擴增正向沉默片段和反向沉默片段； (2)將所述的正向沉默片段連入所述原始載體中內含子上游的多克隆位點，將所述的反向沉默片段連入所述原始載體中內含子下游的多克隆位點，構建得到所述的沉默載體。
4.如權利要求1或2所述的沉默載體在沉默鐮刀菌內源基因中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述鐮刀菌為禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)或尖抱鍵刀菌(Fusarium xysporum)。
6.如權利要求4所述的應用，其特征在于，包括: (1)將鐮刀菌的分生孢子接種于培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，獲得幼殖體； (2)以所述幼殖體為原料，制備得到原生質體； (3)將沉默載體轉化所述的原生質體，篩選獲得沉默轉化子。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述原生質體的制備方法包括:將所述的幼殖體置于蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶的混合酶液中進行酶解，酶解結束后過濾、離心、清洗，得到所述的原生質體。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述蝸牛酶的濃度為30g/L，纖維素酶的濃度為20g/L，溶菌酶的濃度為20g/L。
9.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述轉化的方法包括: (1)將所述的原生質體懸浮于STC溶液中，并滴加含40%PEG4000的STC溶液，得原生質體懸液； (2)將原生質體懸液、沉默質粒溶液和肝素鈉溶液混合，冰浴20~30min后，向混合液中逐滴加入1/3混合液體積的含40%PEG4000的STC溶液，得轉化液； (3)將所述的轉化液混勻后靜置20~30min，加入培養(yǎng)液進行再生培養(yǎng)； (4)再生培養(yǎng)結束 后將所述的培養(yǎng)液與培養(yǎng)基混合后共培養(yǎng)。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，原生質體懸液、沉默質粒溶液和肝素鈉溶液混合后，所述肝素鈉在混合液中的濃度為0.1~0.3mg/ml。
【文檔編號】C12N15/63GK103820482SQ201410037594
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權日:2014年1月26日
【發(fā)明者】陳云, 高啟迅, 尹燕妮, 馬忠華 申請人:浙江大學