專利名稱：缺氧調(diào)節(jié)的條件沉默性aav表達(dá)血管生成誘導(dǎo)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方式包括治療組織缺氧和相關(guān)情況。具體地，通過表達(dá)所需因子的條件沉默載體表達(dá)在患者中誘導(dǎo)定向治療性血管生成。
背景技術(shù)：
治療血管生成是開發(fā)用于治療缺血的方法，其中在缺血組織中響應(yīng)由基因或者細(xì)胞遞送的外源血管生成因子而誘導(dǎo)新血管生長。主要的臨床目標(biāo)是由冠狀和外周動(dòng)脈疾病分別造成的心肌和重癥下肢缺血?；蚝颓绑w干細(xì)胞的有說服力的臨床結(jié)果產(chǎn)生一系列的ΙΙ/ΙΠ期臨床試驗(yàn)。這些只是適度成功，顯示了程序的安全性，但療效最小。

發(fā)明內(nèi)容
此總結(jié)提供本發(fā)明的概要以簡要說明發(fā)明的性質(zhì)和物質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解的是，它不會(huì)用于解釋或限制所附權(quán)利要求的范圍或意義。優(yōu)選實(shí)施方式包括促進(jìn)選擇性定向動(dòng)脈發(fā)生的載體，其在一些實(shí)施方式中由缺氧調(diào)節(jié)的條件沉默性AAV載體來專門驅(qū)動(dòng)。這些組合物由強(qiáng)烈組織缺氧調(diào)控的NRSE和TOAD/FROG沉默元件組合的生長因子表達(dá)來提供更快、更高效血管重生和組織恢復(fù)。提供了方法，其中，生長因子基因表達(dá)的條件沉默提供以條件沉默程度決定的定向動(dòng)脈發(fā)生。這產(chǎn)生缺 血組織的高效血管重生，其也由條件沉默的程度來決定。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，包含F(xiàn)R0G/T0AD和NRSE沉默子的載體賦予組織缺氧的強(qiáng)烈調(diào)控和由三個(gè)沉默元件(NRSE/FR0G/T0AD)組合影響的最大反應(yīng)的更迅速血管重生。這三個(gè)異源沉默元件的意外屬性可能歸因于相較單獨(dú)NRSE相的多種不同細(xì)胞基因表達(dá)的沉默，其中沉默限于非神經(jīng)細(xì)胞，并且在干細(xì)胞中功能弱或者沒有。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，使用基因調(diào)控元件組合在包含永久遞送基因治療載體的骨骼肌和心肌缺血組織中選擇性表達(dá)促血管生成基因，從而基因的調(diào)控表達(dá)促進(jìn)引起肌肉再灌注的穩(wěn)定成熟血管的生長。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)控系統(tǒng)遞送基因到靶細(xì)胞，包括骨骼和心臟肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、干細(xì)胞等。其他方面在下文描述。附圖簡要說明

圖1A-1E :組織缺氧調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。圖IA的示意圖顯示基因表達(dá)的條件沉默由NRSE組蛋白去乙?；富钚院虷IF-I組蛋白乙酰化酶活性間的相互作用操作。圖1B-1D顯示條件沉默的基因調(diào)控。圖1B-1C :心肌細(xì)胞，HeLa細(xì)胞或者C2-C12骨骼肌細(xì)胞用所示AAV穿梭載體和內(nèi)部對照Renilla熒光素酶共同轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，培養(yǎng)物在有氧或缺氧(0.5% -1%氧氣)空氣下再孵育24小時(shí)，并收集以檢測熒光素酶表達(dá)。圖ID C2C12肌細(xì)胞用PGK或CS-PGK引導(dǎo)的AAV-GFP轉(zhuǎn)染，并如所示暴露于空氣或缺氧情況下。圖IE C2C12肌細(xì)胞用PGK或CS-PGK引導(dǎo)的AAV-VEGF轉(zhuǎn)染，并暴露于空氣或缺氧情況下，分泌的VEGF通過ELISA在24小時(shí)的培養(yǎng)基中檢測。圖2A的示意圖顯示如圖2C所示的FR0G，T0AD，和FR0G+T0AD元件的序列。IRE是炎癥反應(yīng)元件(NF K -B) 。構(gòu)建體的其他成分與圖1A-1E中描述的NRSE構(gòu)建體相同。圖2B C2C12細(xì)胞用由包含F(xiàn)R0G/T0AD元件+HRE的PGK啟動(dòng)子引導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。如圖1A-1E所述，細(xì)胞暴露于有氧或缺氧情況下孵育48小時(shí)。圖3A-3C顯示CS-AAV對比腺病毒的后肢缺血再灌注。圖3A :在小鼠后肢中誘導(dǎo)局部缺血并且在手術(shù)后由肌肉注射遞送指定載體。對所述每組12只小鼠肢體進(jìn)行多至12周的每周多普勒(Doppler)掃描，然后每月掃描。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)殺死小鼠，肌肉用RT-PCR來定量hVEGF或固定和石蠟包埋以用于免疫染色。正方形(上部曲線)AAV-CS-VEGF :圓和三角形(下部曲線)腺病毒(Ad)低和高劑量。Ad-VEGF自動(dòng)切除的所有肢體；黃色箭頭指示6月康復(fù)的AAV肢體的流。圖3B :在指定次數(shù)(η = 3)肢體肌肉中用RT-PCR定量VEGF表達(dá)。圖3C :對比AAV-CS-VEGF (綠色)，AAV-PGK-VEGF (紅色)和PBS (低曲線)的后肢再灌注。方法如圖3Α所示；兩個(gè)AAV載體都恢復(fù)流，但是流在CS-VEGF上恢復(fù)更快。圖4顯示使用平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體對石蠟包埋組織部分的免疫染色，揭示12周后，AAV9-CS-VEGF處理相較AAV9-PGK-VEGF載體在后肢有顯著更大的血管(AAV9-PGK-VEGF通過組織缺氧經(jīng)內(nèi)源HRE調(diào)控，但是沒有條件沉默，調(diào)控降低)。圖5A-5D顯示體內(nèi)條件沉默的基因調(diào)控。一日齡小鼠(圖5Α)兩眼間注射AAV9-PGK-VEGF或AAV9-CS-VEGF(圖5B)。在圖5A，4周齡小鼠的一個(gè)后肢由結(jié)扎和解剖股動(dòng)脈造成缺血，組織從缺血的和非缺血對側(cè)肢體收集，并且用RT-PCR測量VEGF。圖中，大鼠足墊用表達(dá)PGK-VEGF或者CS-PGK-VEGF的質(zhì)粒載體注射，4周后檢查新血管的生長。黑色箭頭指示遞送DNA時(shí)標(biāo)記感興趣區(qū)域的縫合位置。白色箭頭指示響應(yīng)PGK而不是CS載體反應(yīng)生成的新血管。圖6顯示早期血管發(fā)生中的VEGF HEY2比例的圖。缺血后肢用低調(diào)控(PGK)或者條件沉默(CS)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的AAV9-VEGF處理。人體VEGF和小鼠HEY2表達(dá)用指定時(shí)間點(diǎn)(η = 2)收集的肌肉的RT-PCR測量。此階段內(nèi)PGK處理的肌肉的平均VEGF表達(dá)比CS載體高6. 2倍，指示基礎(chǔ)的和誘導(dǎo)表達(dá)在CS載體中更低。圖7A-7C顯示在Ad或者AAV9-CS-VEGF處理中血管的定位和密度。圖7Α顯示后肢肌肉部分的DiI染色和雙光子共焦熒光顯微鏡圖片。有X的紅色圓圈指示用來結(jié)扎股骨動(dòng)脈和標(biāo)記缺血區(qū)域的縫合位置。在12周Ad處理組中，毛細(xì)管優(yōu)選向股骨動(dòng)脈平面垂直生長，如綠色雙箭頭指示。黃色雙箭頭描述AAV-CS-VEGF組中缺血區(qū)域的大動(dòng)脈。圖7Β顯示SMA抗體和Dapi染色的動(dòng)脈區(qū)域。血管面積用Area Trace軟件對每個(gè)情況下> 50SMA陽性血管來定量。圖7C :毛細(xì)管密度用Volocity Image軟件對DiI染色血管共焦部分定量。圖8A-8C顯示股骨束的定向動(dòng)脈發(fā)生。圖8A顯示用指定處理缺血后在指定時(shí)間取得的代表性DiI染色肌肉部分。每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)代表每組至少3個(gè)小鼠。白十字指示裝入股骨切除區(qū)域的股骨縫合位置；黃色箭頭指示股骨束的位置(切除股骨動(dòng)脈但是保留股骨神經(jīng))。在 I 年 AAV-CS-VEGF 處理但不是 Ad-CMV-VEGF，AAV-PGK-VEGF 或者 AAV-CMV 處理(AAV-CMV未顯示)的股骨束內(nèi)可見與正常股骨動(dòng)脈尺寸相似的大動(dòng)脈。圖8B和8C顯示血流，局部缺血和后肢血管生長(圖8B)和皮瓣(圖SC)模型的關(guān)系。圖SB :左圖顯示再灌注后肢的多普勒掃描，相連的黑色叉號標(biāo)記切除股骨位置，右圖顯示位于股骨束的重生的動(dòng)脈。圖8C :左圖顯示在缺血恢復(fù)中有基因治療載體遞送到缺血區(qū)域的皮瓣多普勒掃描；右圖顯示沿著該模型中最大缺血區(qū)域的組織缺氧梯度向下生長的平行DiI染色血管。圖9A-9D顯示條件沉默VEGF的治療性動(dòng)脈發(fā)生。圖9A和9D:小鼠后肢用Io8AAV-CS-VEGF或AAV-unreg/PGK_VEGF基因組注射，并且16周后收集肌肉。肌肉部分用抗平滑肌肌動(dòng)蛋白(以確定細(xì)動(dòng)脈和動(dòng)脈)和Dapi (圖9A)染色，定量平均血管體積(圖9B)。簡單說，每4個(gè)玻片的10個(gè)最大血管面積各用追蹤工具Axiovision軟件來測量。每一個(gè)肢體的血管面積用至少3個(gè)大腿區(qū)域橫截面不同部分來計(jì)數(shù)，以得到每個(gè)動(dòng)物的平均值(P < O. 01)。圖9C和9D :使用Volocity軟件在共焦圖像上定量血管密度。血管體積數(shù)據(jù)用每個(gè)視場的均一感興趣區(qū)域獲得。采用3只不同小鼠的10個(gè)視場評價(jià)各處理的平均 血管密度(總DiI染色血管的體積)(圖9B :p < O. 05)。血管密度通過計(jì)數(shù)⑶31+染色部分確定。圖10A-10C顯示用FR0G/T0AD/NRSE組合調(diào)控的條件沉默的最佳組織康復(fù)和血管再生。圖IOA是一個(gè)最優(yōu)載體的實(shí)施方式的不意圖。圖IOB顯不局部缺血和基因治療后第14天用AAV載體的腳趾康復(fù)的對比。AAV-NRSE-VEGF處理肢體，12個(gè)中有3個(gè)壞死的腳趾；AAV-CMV-VEGF處理肢體在2周內(nèi)失去所有腳趾，并顯示高級自身斷離；FR0G/T0AD/NRSE-VEGF處理的肢體沒有壞死，和100%腳趾和肢體康復(fù)。圖IOC :7天多普勒分析顯示在AAV-NRSE-VEGF處理的缺血肢體中的最小血流，AAV-CMV-VEGF處理的肢體中沒有流動(dòng)且開始自身斷離，但是AAV-FR0G/T0AD/NRSE-VEGF處理的肢體上有明顯恢復(fù)的流動(dòng)(P < O. 05 ；η = 3)。方法在小鼠后肢中誘導(dǎo)局部缺血并且手術(shù)后i. m.遞送指定載體。每天對腳趾進(jìn)行檢查和拍照；每周兩次執(zhí)行多普勒掃描。AAV-CMV-VEGF處理的所有肢體在I月內(nèi)自身斷離；其他AAV組中沒有觀察到自身斷離。圖IOC的箭頭指示缺血的肢體。發(fā)明詳述本發(fā)明的幾個(gè)方面在下面根據(jù)實(shí)施例應(yīng)用描述以說明。應(yīng)理解，提出大量的具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方式來提供對本發(fā)明的充分理解。然而，相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易認(rèn)識至IJ，本發(fā)明能在沒有一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)或有其他方法時(shí)實(shí)施。本發(fā)明不受所述行為或事件順序的限制，因?yàn)橐恍┬袨榭赡芤圆煌捻樞蚝?或同時(shí)與其他行為或事件發(fā)生。另外，不是所有說明的行為或事件對執(zhí)行本發(fā)明所述方法都是必須的。相似的，本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物旨在對應(yīng)于本文公開的組合物和方法可應(yīng)用的任何物種的同源物。因此，術(shù)語包括但不限于人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)理解，當(dāng)公開一個(gè)具體物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，該公開僅用于示例而不應(yīng)解釋為限制，除非上下文明確指出。因此，例如，對于本文公開的基因，在一些實(shí)施方式中涉及哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列，旨在包括其他動(dòng)物的同源的和/或垂直同源基因和基因產(chǎn)物，所述動(dòng)物包括但不限于其他哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲類、爬行類和鳥類。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述基因或核酸序列是人類的。
定義本文所用的術(shù)語僅僅用來描述具體的實(shí)施方式，而不是用于限制本發(fā)明。如本文所用，單數(shù)形式的“一個(gè)”，“一種”和“該”也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確說明。而且，在發(fā)明詳述和/或權(quán)利要求中使用術(shù)語“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“帶有”或它們的變體時(shí)，這些術(shù)語旨在以類似術(shù)語“包含”的方式具有包括性。術(shù)語“約”或“大約”表示本領(lǐng)域普遍技術(shù)人員所測定的特定數(shù)值的可接受誤差范圍內(nèi)，這部分取決于該數(shù)值的測量或測定方式，即測量體系的界限。例如，“約”能表示該領(lǐng)域?qū)嵺`中在I之內(nèi)或大于I的標(biāo)準(zhǔn)偏差。或者，“約”能表示多至20%的范圍，優(yōu)選多至10 %，更優(yōu)選多至5 %，并在給定值中更優(yōu)選多至I %。或者，在特定生物系統(tǒng)或過程中，術(shù)語能表示數(shù)量級內(nèi)，優(yōu)選數(shù)值的5倍內(nèi)，更優(yōu)選2倍內(nèi)。特定值在應(yīng)用和權(quán)利要求中描述時(shí)，除非另有說明，假定術(shù)語“約”表示特定值的可接受誤差范圍內(nèi)。局部缺血定義為對特定器官和組織的供血不足。持續(xù)組織缺氧可以造成受影響器官或者組織的損傷。供血減少的后果是器官或組織的氧供應(yīng)不充足(組織缺氧)?！叭毖?癥”指器官或組織中幾乎完全沒有氧，其若延長會(huì)導(dǎo)致器官或組織死亡?！叭毖跚闆r”定義為特定器官或組織接受不充足氧供給的情況?！皡捬跚闆r”指特定器官或組織的供氧被切斷的情況?！霸俟嘧ⅰ敝附M織中局部缺血期后血流的恢復(fù)?！熬植咳毖獡p傷”指局部缺血和/或局部缺血然后再灌注階段對器官或組織造成的細(xì)胞和/或分子損傷。本文使用的術(shù)語“損傷”廣義理解為包括對細(xì)胞、組織或者器官的任何影響，所述影響造成對該細(xì)胞，組織或者器官不需要的結(jié)果。一些實(shí)施方式中，損傷來自可觀察或另外可定義的損害，但是鑒定損傷來源的能力不受限制。因此，在一些實(shí)施方式中，損傷包括局部缺血損傷。然而，在一些實(shí)施方式中，損傷包括之后細(xì)胞、組織和/或器官顯示受損功能的任何損傷，其次于一個(gè)或者多個(gè)原因，能否鑒定，不同于局部缺血損傷?！按傺苌伞敝复碳ぶ睆叫∮?00 μ M的微脈管、或更大和更多的肌肉血管的新血管生長。本文使用的術(shù)語“異常血管形成”或者“異常血管發(fā)生”或者“無序生長”將理解為包括異常的新血管形成，包含新血管、更大血管，更多分支血管(腸套疊)的形成，以及任何和所有導(dǎo)致患病組織或者位點(diǎn)的血液攜帶容量不適當(dāng)或者增加的的機(jī)理。如本文所用，“定向生長”指血管的生長采用從一個(gè)需要點(diǎn)到一個(gè)需要點(diǎn)的受控方向。例如，組織缺氧通過產(chǎn)生提供EPC歸巢和推測內(nèi)皮細(xì)胞向梯度生長的生長因子(VEGF，SDF-1)的梯度，確定軟組織局部缺血模型中的血管定向生長。本文數(shù)據(jù)也顯示定向血管生長和可能涉及產(chǎn)生的切應(yīng)力，因?yàn)檠芫W(wǎng)可連接切除的股骨動(dòng)脈上游和下游區(qū)域并且血液恢復(fù)從臀部流向踝部。本文所用術(shù)語“安全和有效量”或者“治療量”指足以產(chǎn)生所需的治療反應(yīng)而不產(chǎn)生過度不良副作用(如毒性、刺激或變態(tài)反應(yīng))的某組分用量，用于本發(fā)明方時(shí)該用量應(yīng)與合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱?！爸委熡行Я俊敝傅氖怯行Мa(chǎn)生期望治療反應(yīng)的本發(fā)明組合物的含量。具體的安全和有效量或治療有效量取決于多種因素而變化，例如所治療的具體病癥、患者身體狀況、治療的哺乳動(dòng)物或動(dòng)物類型、治療持續(xù)時(shí)間、同時(shí)進(jìn)行的治療(如果有)的性質(zhì)和采用的具體制劑和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。本文所用術(shù)語“動(dòng)物”或“患者”旨在包括，例如，人、綿羊、麇鹿、鹿、長耳鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動(dòng)物、魚、昆蟲和蛛形綱動(dòng)物?！安溉閯?dòng)物”涵蓋通常在醫(yī)療護(hù)理下的恒溫哺乳動(dòng)物(例如，人和馴養(yǎng)動(dòng)物)。示例包括貓科，犬科，馬科，?？苿?dòng)物和人類，以及僅僅是人?！爸委煛被颉疤幚怼焙w哺乳動(dòng)物疾病狀態(tài)的治療，包括(a)預(yù)防哺乳動(dòng)物發(fā)生疾病狀態(tài)，具體是當(dāng)所述哺乳動(dòng)物易患該疾病狀態(tài)但尚未診斷患有該疾病時(shí)；(b)抑制疾病狀態(tài)，即阻滯其發(fā)展；和/或(C)緩解疾病狀態(tài)，即引起該疾病狀態(tài)消退直到達(dá)到所需終點(diǎn)。治療也包括疾病癥狀的改善(即減輕疼痛或不適)，其中，這種改善可直接或不直接影響疾病(例如，原因，轉(zhuǎn)移，表達(dá)，體內(nèi)量等)。本文所用術(shù)語“細(xì)胞滲透性DNA或RNA載體”是使用或者不使用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入細(xì)胞的載體。例如，很多病毒序列編碼細(xì)胞結(jié)合糖蛋白，或者具有用于胞內(nèi)靶標(biāo)的區(qū)域。其他示例包括可使載體細(xì)胞間有效轉(zhuǎn)化的核酸序列。疾病或紊亂的治療潛伏期的基因和細(xì)胞治療模型專門關(guān)注血管發(fā)生，因此有術(shù)語“治療性血管發(fā)生”。這些研究有兩個(gè)主要缺陷(I)不充分運(yùn)輸載體過早結(jié)束基因表達(dá)，(2)遞送未調(diào)控的、組成型活性基因不能提供新血管生長的定向信號。這些缺陷被過短的治療時(shí)程和局限在毛細(xì)管密度單向定量的血管生長分析所大量掩蓋。在優(yōu)選實(shí)施方式中，提高體內(nèi)定向血管發(fā)生的方法包括給予患者含有腺相關(guān)病毒(AAV)載體的組合物，其中促血管生成基因表達(dá)由啟動(dòng)子例如磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子，與組織缺氧反應(yīng)元件(HRE)和沉默元件的組合盒聯(lián)合調(diào)控，所述盒使得在有氧情況下 基因表達(dá)沉默而缺血下表達(dá)激活。該載體在美國專利號5，834，306中描述，其通過引用全文納入本文。在優(yōu)選實(shí)施方式中，給予在由組織缺氧調(diào)控啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的半滲透、組織特異性(例如，肌肉趨向性)AAV9載體中的促血管生成因子基因(例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF))，可誘導(dǎo)或提高定向血管發(fā)生，繼而動(dòng)脈形成并用穩(wěn)定組織重灌注再建功能性毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)。促血管發(fā)生因子示例包括以下至少一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，肝細(xì)胞生長因子，多育曲菌素，血管營養(yǎng)素，促血管生成素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)，或紅細(xì)胞生成素(EPO)。其他能從條件沉默載體表達(dá)的因子示例包括例如c-kit配體/干細(xì)胞因子，胰島素，胰島素樣生長因子I (IGF-I)，神經(jīng)生長因子(NGF)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，白血病抑制因子(LIF)配體，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，白細(xì)胞介素，例如但不限于白細(xì)胞介素3 (IL-3)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素7 (IL-7)和白細(xì)胞介素13 (IL-13)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)，干細(xì)胞因子(SCF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑。如本文所用，“條件沉默”指“基因沉默元件”的使用，包括但不限于NRSE、FROG、TOAD和條件誘導(dǎo)型元件,所述元件包括但不限于缺氧反應(yīng)元件(HRE)、炎癥反應(yīng)元件(IRE)和切應(yīng)力激活元件(SSAE)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，條件沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG, TOAD, FROG/TOAD, NRSE/FROG/TOAD, FROG/TOAD或其組合。示例包括TOAD/PGK (正義)5，-CCGGCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGAC-3’ (SEQ ID NO :1)(反義)3，-GAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGGAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGGAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGGGCC-5’ (SEQ ID NO :2)FROG/PGK (正義) 5，-CCGGGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGAC-3’ (SEQID NO 3).(反義)3，-CCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGGGCC-5’ (SEQID NO 4).FROG-TOAD/PGK (正義)5，-CCGGCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGACCTCTTCCAGAGCAAGGCAACCACAGGAGACCCTGTCACGTCCTGCACGACGGTGTGCATTTAGCTAAATTCCCCACTGTCACGTCCTGCACGAC-3’ (SEQ ID NO :5).(反義)3， -GAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGGAGAAGGTCTCGTTCCGTTGGTGTCCTCTGGGACAGTGCAGGACGTGCTGCCACACGTAAATCGATTTAAGGGGTGACAGTGCAGGACGTGCTGGGCC-5’ (SEQ ID NO :6).在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，條件沉默子包括至少一個(gè)SEQ ID NO :1_6所不核苷酸序列,其衍生物、變體、突變體或者同源體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，條件沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG, TOAD, FR0G/T0AD,或其組
口 ο已發(fā)現(xiàn)用于實(shí)施方式所述多種載體的條件沉默子優(yōu)于任何現(xiàn)有載體。例如，(I)AAV9-PGK-VEGF不提高定向血管生長，盡管受缺氧調(diào)控-由于較高(未沉默)基本常氧表達(dá)-效果在AAV9-CMV-VEGF中更差；(2) AAV9-CMV-VEGF造成血管隨機(jī)生長并且沒有保肢，100%自身斷離-比沒有治療還差；(3)FR0G/T0AD的插入產(chǎn)生更緊的調(diào)控，提供更快血管發(fā)生和100%保腳趾率的最佳治療，盡管基因表達(dá)相較AAV9-CS (NRSE)-VEGF更低(見例如，圖10A-10C)。不希望受理論約束，這可能是由于更好的VEGF Notch比例。FR0G/T0AD包含物和條件沉默的等級反應(yīng)是意料之外的和令人驚訝的。例如，所得結(jié)果涉及腳趾康復(fù)，用FR0G/T0AD不能預(yù)測更快的多普勒恢復(fù)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，條件誘導(dǎo)型元件包括缺氧反應(yīng)元件(HRE),炎癥反應(yīng)元件(IRE),切應(yīng)力激活元件(SSAE),金屬反應(yīng)元件(MRE)或其組合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，條件沉默載體有條件表達(dá)含有以下至少一個(gè)的因子內(nèi)皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，肝細(xì)胞生長因子，多育曲菌素，血管營養(yǎng)素，促血管生成素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)，胰島素樣生長因子I (IGF-I)，神經(jīng)生長因子(NGF)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)，干細(xì)胞因子(SCF)，或紅細(xì)胞生成素(EPO)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，條件沉默載體包括腺相關(guān)病毒(AAV)載體,促血管發(fā)生因子和/或生長因子和/或細(xì)胞遷移因子，啟動(dòng)子，缺氧反應(yīng)原件(HRE)和沉默元件的組
么合
口 jm ο
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，載體基因表達(dá)在有氧條件下被抑制(條件沉默)并且在局部缺血條件下被激活。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，治療缺氧相關(guān)的疾病或紊亂的方法包括促血管生長因子的轉(zhuǎn)移，例如，VEGF基因，使用半滲透基因遞送載體，例如腺相關(guān)病毒(AAV)載體或者慢病毒載體，其中VEGF表達(dá)由啟動(dòng)子如磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子，與組織缺氧反應(yīng)元件(HRE)和沉默元件的結(jié)合盒聯(lián)合調(diào)控，所述盒使得在有氧情況下基因表達(dá)沉默而缺血下表達(dá)激活(“條件沉默”)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，將表達(dá)促血管發(fā)生因子和/或其他因子的條件沉默載體給予有發(fā)展以下疾病風(fēng)險(xiǎn)或患有疾病的患者肌肉缺血，包括外周和心肌缺血，后肢缺血，視網(wǎng)膜缺血,癌癥,心臟病，中風(fēng),黃斑變性,糖尿病視網(wǎng)膜病,關(guān)節(jié)炎,移植中增加頭發(fā)移植的禿頂7等等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，產(chǎn)生新血管受控定向生長的方法包括給予所需患者表達(dá)促血管生成和/或其他因子的條件沉默載體，其中，所述載體在靶組織生成治療有效控制量的促血管生成生長因子。生成的受控量促血管生成因子防止血管無序生長到受傷組織中。本發(fā)明的條件沉默載體有益地用于在多種不同醫(yī)療條件下治療受損細(xì)胞或組織。無限制損傷列表包括結(jié)構(gòu)組織損傷，例如軟骨和半月板損傷，包括與中風(fēng)相關(guān)的缺血損傷，心肌梗塞，心臟病發(fā)作，脊髓損傷，供體器官損傷，器官移植接受者，重灌注，血管支架植入，短暫性腦缺血，慢性和急性腸系膜缺血，跛行，重癥下肢缺血，癌癥，骨髓損傷和腎臟損傷。使用本發(fā)明組合物治療或預(yù)防的疾病包括糖尿病，癌癥，心血管疾病或紊亂，自身免疫，神經(jīng)疾病或紊亂，炎癥等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的條件沉默載體可以在損傷和缺血損傷之前、之中或之后給予對象。缺血損傷一般由向組織供血的血管閉塞事件導(dǎo)致。當(dāng)血管開放或者由于治療干涉重新開放時(shí)，由于傷疤形成細(xì)胞和釋放破壞性酶(重灌注損傷)的炎性細(xì)胞的流入，常造成對組織的進(jìn)一步損傷。表達(dá)促血管生成因子和/或其他因子的條件沉默載體可以給予中風(fēng)、心臟病發(fā)作或者脊髓損傷患者，以利于降低缺血事件期后細(xì)胞和組織損失的嚴(yán)重性。該組合物可以在任何醫(yī)療過程之前、之中或之后給藥，該過程在血管再生過程中，例如心肌缺血后放入支架，冠狀動(dòng)脈旁路移植，和心臟、肝臟、肺、胰腺和腎臟的器官移植，有重灌注的風(fēng)險(xiǎn)。在各病例中，組合物優(yōu)選在血管再生位置的遠(yuǎn)端或者近端靜脈內(nèi)給藥，并且引起血管定向生長。缺血和重灌注的反復(fù)發(fā)作被認(rèn)為是造成長期傷口的形成和治愈失敗的因素，例如壓瘡和糖尿病足潰瘍。因此，長期傷口可通過給予本發(fā)明組合物來治療。接受腸內(nèi)手術(shù)的患者可以用本發(fā)明組合物在腸內(nèi)恢復(fù)血流之前/同時(shí)和/或后進(jìn)行治療，以排除或降低重灌注損傷。本發(fā)明組合物也用于進(jìn)行移植準(zhǔn)備的調(diào)節(jié)器官和組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，可將供體與本發(fā)明組織修復(fù)組合物在移植之前、之中和/或之后接觸，從而損傷在移植后的階段降低，所述損傷包括但不限于重灌注損傷。移植接受者也可以用該組合物在移植之前、之中和/或之后治療。本發(fā)明的方法也用于防止由于多種組織中缺血和/或隨后重灌注造成的組織損傷和/或死亡。一個(gè)示例性應(yīng)用是心臟病發(fā)作后的復(fù)發(fā)性心肌缺血造成的損傷降低。心臟病發(fā)作患者心臟組織的治療基因表達(dá)可以降低任何后續(xù)缺血發(fā)作中組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)。相似的，診斷有短暫大腦缺血、血凝塊或其他中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)因素的對象可受益于缺血誘導(dǎo)型腦特異性構(gòu)建的應(yīng)用。診斷為急性或慢性腎臟衰竭的患者的腎臟進(jìn)一步缺血損傷的風(fēng)險(xiǎn)加大。這些對象可受益于腎臟特異性啟動(dòng)子控制下的治療基因，其表達(dá)由缺血條件增強(qiáng)。診斷為有缺血“風(fēng)險(xiǎn)”的多種其他組織可以類似地加以保護(hù)，如同本領(lǐng)域技術(shù)人員從本說明書益處中所理解的。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)促血管生成和/或其他因子的條件沉默載體可以單獨(dú)或者作為治療方案的一部分聯(lián)合使用。這些特別適用于在急性心肌梗塞或其他缺血損傷后降低缺血損傷的藥物包括但不限于血管擴(kuò)張劑，例如腺苷酸，潘生丁和西洛他唑；一氧化氮供體；前列腺素和其衍生物；抗氧化劑，包括羥基黃酮和二羥基；膜穩(wěn)定劑；抗TNF組合物；抗感染藥，包括地塞米松、阿司匹林、吡非尼酮、甲氯滅酸和曲尼司特；高血壓藥，包括β阻斷劑；ACE抑制劑和鈣離子通道阻斷劑；抗代謝藥，例如2-CdA，血管活性物質(zhì)，包括腸血管活性肽(VIP);胰島素；蛋白質(zhì)激酶；反義寡核苷酸，包括resten-NG ;免疫抑制劑，包括西羅莫司、依維莫司、他克莫司、依托泊苷、環(huán)孢菌素例如環(huán)孢菌素A和米托蒽醌；抗凝血酶；抗血小板劑，包括替羅非班、埃替非巴肽和阿昔單抗；心臟保護(hù)劑，包括垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP), apoA-I milano,氨氯地平,尼可地爾，cilostaxone和噻吩并卩比唳；抗白血球劑；環(huán)氧酶抑制劑，包括C0X-1和C0X-2抑制劑；增加酵解代謝的肽酶(p^tidose)抑制劑，包括omnipatrilat ;|丐增敏劑,包括左西孟旦，semidan和匹莫苯丹。蛋白質(zhì)或肽藥物可以是人、非人、重組或者合成的，可以是全長天然形式或其活性片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合于治療缺血損傷的條件沉默載體在心肌梗塞或其他急性缺血綜合病癥后遞送到重新開放的閉塞位點(diǎn)或其附近。在前面閉塞位點(diǎn)或其附近遞送載體組合物使得藥物可通過血流下游遞送到重灌注組織。載體組合物可以通過在上述支架開口處含有藥物的支架遞送。載體組合物也可以通過藥物包埋支架、灌輸、微球、導(dǎo)管、線圈或者其他局部遞送方式傳遞。例如，微球、線圈、脂質(zhì)體或其他小藥物運(yùn)載體可以用導(dǎo)管或藥物遞送支架局部遞送到上述閉塞位點(diǎn)或其附近。這些小藥物運(yùn)載體釋放出來，通過下游進(jìn)入心肌，在該處它們可以自身植入以直接遞送藥物到缺血組織。組合物遞送支架可以置于另一前面放置的支架內(nèi)或其附近。支架移植位點(diǎn)可以在 閉塞位點(diǎn)或其附近。植入位點(diǎn)也可以選擇在斑塊破裂位點(diǎn)或血管收縮位點(diǎn)或其附近。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，定向控制血管生長載體的局部遞送與另一治療試劑例如抗缺血?jiǎng)┑娜磉f送聯(lián)用?；蛘?，局部遞送載體和試劑。在另一些實(shí)施方式中，全身性遞送載體和試劑。細(xì)胞組合物在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，將表達(dá)促血管生長因子的條件沉默載體給予細(xì)胞，例如成肌細(xì)胞，肌細(xì)胞，衛(wèi)星成肌細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞，心臟干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，造血干細(xì)胞，內(nèi)皮祖干細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，干細(xì)胞(骨髓，外周血液，脂肪細(xì)胞，多種組織)。細(xì)胞可獲自患者或供體，純化和離體培養(yǎng)。一旦擴(kuò)大，細(xì)胞可以轉(zhuǎn)染、感染有表達(dá)促血管生成因子和/或其他因子(例如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子)的條件沉默載體[如病毒載體或質(zhì)粒DNA]或與之混合，并且給予患者。例如，如果患者出現(xiàn)心肌缺血，細(xì)胞通過例如心臟內(nèi)注射來給予患者。因此，缺血損傷提供能整合和/或分化成心肌細(xì)胞、血管等的細(xì)胞，促血管生成因子誘導(dǎo)或提高損傷組織的血管形成。
如本文所用，當(dāng)細(xì)胞從其天然環(huán)境存在的所有其他細(xì)胞中分離出來時(shí)，以及當(dāng)混合細(xì)胞中該細(xì)胞比例高于其天然環(huán)境時(shí)，細(xì)胞以“純化形式”存在。另一種方面，當(dāng)討論的細(xì)胞群代表富集的感興趣細(xì)胞群時(shí)，甚至如果其他細(xì)胞和細(xì)胞類型也存在于所述富集群體時(shí)，認(rèn)為細(xì)胞是“純化形式”。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)細(xì)胞包括至少約10%的混合細(xì)胞群時(shí)，認(rèn)為細(xì)胞是純化形式，在一些實(shí)施方式中，為至少約20 %的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約25%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約30%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約40%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約50%的混合細(xì)胞總體群，在一些實(shí)施方式中，為至少約60%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約70%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約75%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約80%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約90%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為至少約95%的混合細(xì)胞群，在一些實(shí)施方式中，為約100%的混合細(xì)胞群，前提是所述細(xì)胞在純化前群體中，包括更大百分比的“純化”群中的總細(xì)胞群。在這個(gè)方面，術(shù)語“純化”和“富集”可以被認(rèn)為是同義詞。如本文所用，短語“骨髓衍生粘附干細(xì)胞亞群”，“Sea-Γ/⑶457ckit7⑶90+/CD105_ 干細(xì)胞”，“CD347CD457ckit7CD90+/CD105-干細(xì)胞”，“Sca-l+/CD457ckit7CD907CD105-細(xì)胞(BMMSC) ”，“Sca-l7CD457c-kit7Thyl+/CD105-和間充質(zhì)干細(xì)胞亞群”可以互換使用，并且指用本文所述方法從混合骨髓衍生粘附干細(xì)胞分離的骨髓細(xì)胞亞群。在一些實(shí)施方式中，骨髓衍生粘附干細(xì)胞亞群通過從骨髓衍生粘附干細(xì)胞混合群中分離得到，所述細(xì)胞亞群是Sca-?；颌?4+以及⑶457c-kit7Thyl+/⑶105_，取決于骨髓衍生粘附干細(xì)胞來源。例如，如果骨髓衍生粘附干細(xì)胞來源是小鼠，所述細(xì)胞亞群包括SaC-l+/CD457C-kit7Thyl7⑶105_細(xì)胞。如果骨髓衍生粘附干細(xì)胞來源是人體，所述細(xì)胞分組包括CD34+/CD457c-kit7Thyl7CD105-細(xì)胞。所述亞群分離可以用任何方法進(jìn)行，包括附于塑料培養(yǎng)皿，然后在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)或者，和/，能基于表達(dá)或者不表達(dá)一個(gè)或多個(gè)0)133、0)45、0)34、0)31、50&-1、(3-1^七、Thyl和⑶105標(biāo)記來分離細(xì)胞的方法，包括但不限于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。根據(jù)本發(fā)明使用的干細(xì)胞以優(yōu)選順序是自體同源，同種異體或異種異體，并且選擇可以很大程度取決于治療需要的緊迫性。呈現(xiàn)立即危及生命病況的患者可以用心肺機(jī)維持，同時(shí)培養(yǎng)充足量的自體同源干細(xì)胞或最初治療可以用自體同源以外的干細(xì)胞提供。本發(fā)明的細(xì)胞治療可通過數(shù)種給藥途徑提供，包括下文所述。首先，當(dāng)干細(xì)胞采用可注射的液體懸浮液制品形式或者以可注射液體形式并在損傷心肌位點(diǎn)形成半固體的生物相容性培養(yǎng)基時(shí)，可以使用避免開腔手術(shù)過程的心臟內(nèi)肌肉注射。只要針腔或口徑有足夠的直徑(即30標(biāo)準(zhǔn)尺寸或更大)，切應(yīng)力不會(huì)損傷干細(xì)胞，則可以使用常規(guī)心臟內(nèi)注射器或者可控制的關(guān)節(jié)鏡遞送設(shè)備?？勺⑸涞囊后w懸浮干細(xì)胞制品也可以靜脈內(nèi)給予，通過持續(xù)滴注或者大丸藥。期間，開腔手術(shù)過程包括對心臟直接物理進(jìn)入，上述所有形式的干細(xì)胞遞送制品皆可選。劑量范圍的代表性示例是包括約10-40 X IO6細(xì)胞/ml的約 20_50 μ I可注射懸浮液。無論載體培養(yǎng)基是液體還是固體，每單位體積細(xì)胞的濃度基本保持在同一范圍內(nèi)。當(dāng)在開腔過程中使用固體、“貼片”類型應(yīng)用時(shí)，遞送的干細(xì)胞量往往更大，但是后續(xù)注射治療方式如上所述。然而，治療的頻率和持續(xù)時(shí)間取決于組織受累的程度(百分比)而變化，如已有描述(例如5-40%左心室質(zhì)量)。如果有5-10%范圍的組織受累，有可能只用一次給予含一百萬個(gè)細(xì)胞的20-50 μ I注射制品來治療。注射培養(yǎng)基可以是任何藥物學(xué)可接受的等滲液體。示例包括磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，培養(yǎng)基例如DMEM(優(yōu)選不含血清)，生理鹽水，或含5%葡萄糖的水。如果更多為約20 %組織受累嚴(yán)重水平范圍，可考慮多次20-50 μ I注射(10-40 X IO6細(xì)胞/ml)。后續(xù)治療可以使用其他劑量。在很嚴(yán)重的病例中，即約40%組織受累嚴(yán)重水平范圍，明確延長持續(xù)時(shí)間的多個(gè)相等劑量，用長期的(多至數(shù)個(gè)月)恢復(fù)期維持劑量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離的和培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞能用于植入多種假體裝置。例如，使用填有經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增人細(xì)胞的多孔性陶瓷結(jié)構(gòu)并移植此結(jié)構(gòu)到廣泛組織損傷區(qū)域。在其他實(shí)施方式中，不同干細(xì)胞可與間充質(zhì)干細(xì)胞一起用于治療心臟和周圍疾病和紊亂。優(yōu)選干細(xì)胞是全能或者多能干細(xì)胞。體內(nèi)有很多未分化細(xì)胞。干細(xì)胞是未分化、未成熟細(xì)胞，能夠自我更新(無限制分裂)和分化(特異化)。這些早期細(xì)胞在發(fā)育中的胚胎內(nèi)豐富，但是，隨著發(fā)育進(jìn)展而數(shù)量下降。相反，成年生物體包括限于某些體室的有限干細(xì)胞數(shù)量。通常認(rèn)為干細(xì)胞是單潛能，雙潛能或者多潛能。單潛能和雙潛能干細(xì)胞在發(fā)育中更受限，并分別產(chǎn)生一種或者兩種專門細(xì)胞。相反，多潛能干細(xì)胞(PSC)能分化成多種不同類型的細(xì)胞，產(chǎn)生組織(其形成器官)或在全能干細(xì)胞情況下產(chǎn)生整個(gè)生物體。多潛能干細(xì)胞不同于單潛能或雙潛能，能多向分化，產(chǎn)生由不同類型或譜系的細(xì)胞集合組成的組織。根據(jù)現(xiàn)有理解，干細(xì)胞例如多能干細(xì)胞，具有以下四個(gè)特性(i)它是未分化細(xì)胞，即沒有最終分化；(ii)有不受限制分裂的能力；(iii)有產(chǎn)生分化后裔的能力；和(iv)當(dāng)它分裂時(shí)，每一個(gè)子細(xì)胞有選擇余地可以保持為干細(xì)胞，如同親代一樣，或者能開始導(dǎo)向分化的過程。造血干細(xì)胞是多能干細(xì)胞的一個(gè)示例，其在骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，并能產(chǎn)生所有各種血細(xì)胞(包括白血球和紅血球)。造血干細(xì)胞可以從(i)骨髓，(ii)生長因子動(dòng)員外周血或(iii)臍帶血(胎盤)中分離提取。近來，造血干細(xì)胞從胚胎干細(xì)胞(ES)中準(zhǔn)備，使用體外無菌技術(shù)從胚胎中提取。這些未分化細(xì)胞能多向分化和重建所有身體組織，即全能。
存在很多未分化的造血譜系干細(xì)胞。這些包括多能干細(xì)胞(PSC)，淋巴干細(xì)胞(LSC)和髓系干細(xì)胞，已知統(tǒng)稱為淋巴造血祖細(xì)胞(LPC)。LSC和髓系干細(xì)胞都由PSC分化形成。因此，LSC和髓系干細(xì)胞比PSC更加定向。造血譜系分化細(xì)胞的示例包括T細(xì)胞，B細(xì)胞，嗜伊紅血球，嗜堿性細(xì)胞，嗜中性細(xì)胞，巨核細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。其他干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞，多能干細(xì)胞，能產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞(atrocyte)、少突細(xì)胞(Nakafuku 和 Nakamura, 1995, J. Neurosci Res.，卷 41 (2) 153-68 ；Anderson,1994, FASEB J.,卷 8(10) :707-13 ；Morshead 等，1994, Neuron,卷 13(5)1071-82)。骨骼肌肉衛(wèi)星細(xì)胞是另一類型的干細(xì)胞，更具體來說，在成年人中維持為靜止干細(xì)胞和需要時(shí)能產(chǎn)生新肌肉細(xì)胞的一種不同肌生細(xì)胞類型(Bischoff，1986，Dev Biol.，卷115(1) :129-39)。其他干細(xì)胞類型是上皮干細(xì)胞，基底細(xì)胞的子集，和 間充質(zhì)干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞(ES)通常在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中使用。胚胎干細(xì)胞已顯示在體外分化為幾種細(xì)胞類型，包括淋巴樣前體細(xì)胞(Potocnik等，1994，EMBO J.，卷13(22) =5274-83)和神經(jīng)細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞表征為有很多階段特異性標(biāo)記，例如階段特異性胚胎標(biāo)記3和4 (SSEA-3和SSEA-4)、高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81以及堿性磷酸酶(Andrews等，1984，Hybridoma，卷 3 :347-361 ；Kannagi 等·，1983，EMBO J.，卷 2 :2355-2361 ；Fox 等，1984, Dev. Biol.，卷 103 :263-266 ;0zawa 等，1985，Cell. Differ.，卷 16 :169-173)。多種抗原與未分化和分化細(xì)胞結(jié)合。此處術(shù)語“結(jié)合”指細(xì)胞表達(dá)或能表達(dá)，或出現(xiàn)或能誘導(dǎo)出現(xiàn)，或包括，各抗原。大部分未分化和已分化細(xì)胞包括主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I型抗原和/或II型抗原。如果這些抗原與細(xì)胞結(jié)合，那么被稱為I+型和/或II+型細(xì)胞。每一個(gè)與未分化細(xì)胞或者已分化細(xì)胞結(jié)合的特異性抗原能作為標(biāo)記。因此，不同類型細(xì)胞可以基于其結(jié)合的具體抗原或基于具體結(jié)合抗原組合而彼此區(qū)分。這些標(biāo)記抗原示例包括抗原⑶34，⑶19和⑶3。如果這些抗原出現(xiàn)，則這些特定細(xì)胞分別稱為⑶34+，⑶19+和⑶3+。如果這些抗原不出現(xiàn)，則這些特定細(xì)胞分別稱為⑶34_，⑶19_和⑶3_。一些髓系干細(xì)胞上鑒定的標(biāo)記包括CD34+DR+，CD13+，CD33+，CD7+和TdT+細(xì)胞。PSC是CD34+DITTdr細(xì)胞(其他有用標(biāo)記為CD3K和CD36+)。LSC是DR+，CD34+和TdT+細(xì)胞(以及CD38+)。胚胎干細(xì)胞表達(dá)SSEA-3和SSEA-4，高分子糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81和堿性磷酸酶。它們也不表達(dá)SSEA-1，其出現(xiàn)是分化的標(biāo)記。已知其他干細(xì)胞類型的其他標(biāo)記，例如神經(jīng)干細(xì)胞的Nestein (J. Neurosci，1985，卷5 :3310)。間充質(zhì)干細(xì)胞對SH2，SH3，CD29，⑶44，⑶71，⑶90，⑶106，CD 120a和CD 124也為陽性，例如，對CD34，CD45和CD14為陰性。干細(xì)胞可用已知方法進(jìn)一步分離用于轉(zhuǎn)化和分化。例如，通過殺死小鼠和用剪刀切下腿骨來分離小鼠骨髓細(xì)胞。干細(xì)胞也可通過骨髓細(xì)胞用結(jié)合不需要細(xì)胞的抗體篩選而從骨髓細(xì)胞中分離，所述細(xì)胞例如⑶4+和⑶8+(T細(xì)胞)、⑶45+(panB細(xì)胞)、GR-I (粒細(xì)胞)和Iad (分化抗原呈遞細(xì)胞)ο所述操作方案的示例見Inaba等.，J. Exp. Med. 176 1693-1702(1992)。人體中，⑶34+造血干細(xì)胞可獲自多種來源，包括臍帶血、骨髓和動(dòng)員外周血。通過抗體親和過程完成CD34+細(xì)胞的純化。分離CD34+細(xì)胞的親和柱分離過程描述于Ho等.，Stem Cells 13(增刊·3) : 100-105 (1995)。還參見 Brenner, Journal of Hematotherapy
2:7-17(1993)。已知分離，純化和培養(yǎng)擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
或者，或另外，很多細(xì)胞可由形態(tài)特性來鑒定。使用顯微鏡鑒定(可任選用染色技術(shù))是充分發(fā)展的學(xué)科，術(shù)語組織學(xué)和其相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域廣泛使用。多種技術(shù)可用來從最初去除專門譜系細(xì)胞來分離細(xì)胞。單克隆抗體對鑒定與特定細(xì)胞譜系和/或分化階段相關(guān)的標(biāo)記特別有用。如果需要，大部分最終分化細(xì)胞可通過最初使用“相對粗”分離而除去。例如，磁性珠分離可最初用于移除大量定向細(xì)胞。理想地，至少約80%，通常至少70%的總體造血細(xì)胞被移除。分離過程可以包括但不限于磁性分離，使用抗體包被的磁珠，親和層析，與單克隆抗體結(jié)合或與單克隆抗體聯(lián)用的細(xì)胞毒性劑，包括但不限于補(bǔ)體和細(xì)胞毒素，和用結(jié)合固體基質(zhì)如平板的抗體“篩選”，淘選或其他任何簡便技術(shù)。 提供準(zhǔn)確分離的技術(shù)包括但不限于，流式細(xì)胞儀，它可具有不同的復(fù)雜程度，例如多個(gè)顏色通道、低角度和鈍角光散射檢測通道、阻抗通道等。分離步驟可以逐步方式和/或同時(shí)操作。例如，每一個(gè)標(biāo)記的存在與否可以單獨(dú)評價(jià)，基于個(gè)體標(biāo)記是否出現(xiàn)在每一步產(chǎn)生兩個(gè)亞群。其后，選擇感興趣亞群并根據(jù)下一個(gè)標(biāo)記存在與否而進(jìn)一步分開。也應(yīng)理解，不同分離技術(shù)(例如親和純化和FACS)可在純化過程的一個(gè)或多個(gè)步驟上共同使用。給藥給予本發(fā)明組合物的合適方法，例如，條件沉默載體，含有載體的細(xì)胞等，包括但不限于靜脈內(nèi)給予和向靶組織或器官的直接遞送。在一些實(shí)施方式中，給藥方法包括組合物在需要治療位點(diǎn)的局部遞送或積累的特性。在一些實(shí)施方式中，組合物直接地送到需要治療的組織或器官。在一些實(shí)施方式中，例如，細(xì)胞的選擇性遞送通過靜脈注射細(xì)胞完成，其定位到靶組織或器官并在其中灌輸。在一些實(shí)施方式中，本公開的細(xì)胞通過靶組織或器官產(chǎn)生的SDF-I梯度定位到靶組織或器官，所述梯度作為細(xì)胞趨化現(xiàn)象的引誘劑。所述方法可以在需要治療的任何動(dòng)物上操作。優(yōu)選動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選靈長類動(dòng)物，更加優(yōu)選人類。因此，雖然本文提供的藥物組合物描述主要涉及在倫理上適合給予人的藥物組合物，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這類組合物通常也適合給予所有種類的動(dòng)物。改變適合給予人的藥物組合物以使該組合物適合給予各種動(dòng)物已眾所周知，獸醫(yī)藥理學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可僅通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)(如果需要)設(shè)計(jì)和進(jìn)行這種改變。預(yù)期本發(fā)明藥物組合物的給予對象包括但不限于人類和其他靈長類，哺乳動(dòng)物包括商業(yè)相關(guān)哺乳動(dòng)物，例如牛、豬、馬、綿羊、貓和狗，禽類包括商業(yè)相關(guān)禽類，例如雞、鴨、鵝和火雞。劑量將本公開主題的有效劑量組合物給予需要的對象?！爸委熡行Я俊被颉爸委熈俊笔亲阋援a(chǎn)生可測量反應(yīng)(例如治療對象中的生物或臨床相關(guān)反應(yīng))的治療組合物量。本公開主題的組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以不同，以使給予的活性化合物量就特定對象有效獲得所需治療反應(yīng)。所選劑量水平取決于治療組合物的活性，給藥方式，與其他藥物或治療的組合，治療病癥的嚴(yán)重性，和治療對象的病癥及先前病史。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，化合物的起始劑量水平低于獲得理想治療效果所需的劑量并逐步增加劑量直到獲得理想效果。組合物的效力可以不同，并且因此“治療有效量”可以不同。然而，使用本文所述分析方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易評估本公開主題的候選化合物的潛能和功效，并且相應(yīng)調(diào)整治療方案。本文提供所公開主題的綜述后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能對個(gè)體對象調(diào)整劑量，考慮到特定制劑、組合物使用的給藥方法和特定治療疾病。進(jìn)一步計(jì)算劑量要考慮對象身高和體重，癥狀嚴(yán)重性和階段，其他有害物理?xiàng)l件的出現(xiàn)。這些調(diào)整或改變，和何時(shí)和如何作出這些調(diào)整或改變，為醫(yī)學(xué)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。除了上面討論的效用，本發(fā)明的組合物(例如包含本發(fā)明嵌合基因的表達(dá)載體)和方法在動(dòng)物醫(yī)學(xué)中也有很多應(yīng)用。盡管動(dòng)物并不經(jīng)常發(fā)生典型的動(dòng)脈硬化癥，但是心肌癥很常見。很多物種發(fā)生局部缺血相關(guān)綜合癥，包括動(dòng)脈炎、脈管炎和相關(guān)血管病變，導(dǎo)致細(xì)胞和組織的直接氧化還原作用損傷，特別是血管壁和心肌組織。這些病癥可以通過給予本發(fā)明嵌合基因來緩解。馬和小馬的常見和嚴(yán)重病癥包括結(jié)腸局部缺血的上升，一般由腸梗阻造成。狗的相關(guān)疾病稱為胃擴(kuò)張-扭結(jié)。這些疾病的治療通常包括手術(shù)去除阻塞。這類手術(shù)后的重灌注會(huì)造成重灌注組織的嚴(yán)重?fù)p傷，并通常引發(fā)伴有累進(jìn)組織壞死的炎癥反應(yīng)。重灌注也可 以造成動(dòng)物因心臟休克死亡。本發(fā)明的組合物和方法可治療性用于治療這些病癥，并在上述病癥治療中對脆弱組織提供保護(hù)，所述組織包括心臟和血管內(nèi)皮。本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用是貓和狗心臟病的治療。貓和狗中都發(fā)現(xiàn)了心血管疾病的多種形式，包括擴(kuò)張型心肌病，左心室肥厚和甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)。Beagles描述了系統(tǒng)壞死脈管炎，可以與人體動(dòng)脈硬化癥相似的病癥(就色斑形成和內(nèi)膜增生而言)。每一個(gè)病癥可以包括對心臟和脈管組織的局部缺血和氧化還原損傷的重新灌注，可以使用本發(fā)明的方法和組合物治療。雖然上面描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方式，但應(yīng)理解它們只是舉例，不是為了限制?？筛鶕?jù)本文公開內(nèi)容對所述實(shí)施方式進(jìn)行許多改變，而不背離所述發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)受任何上述實(shí)施方式的限制。本文提及的所有文獻(xiàn)都通過引用納入本文。該應(yīng)用所引用的所有出版物和專利文獻(xiàn)都通過引用納入本文，以用于所有相同程度的目的，就好像每個(gè)單獨(dú)出版物或?qū)＠墨I(xiàn)都單獨(dú)表示。在該文獻(xiàn)中引用多種參考文獻(xiàn)，應(yīng)用并不承認(rèn)任何特定文獻(xiàn)對其發(fā)明為“優(yōu)先技術(shù)”。發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方式在下面實(shí)施例中闡述。
實(shí)施例下述非限制性的實(shí)施例描述了本發(fā)明的選定實(shí)施方式。應(yīng)該認(rèn)識到，組分的比例變化和元件替代為該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并且在本發(fā)明實(shí)施方式范圍內(nèi)。實(shí)施例I :用表達(dá)人VEGF的條件沉默AAV9基因治療載體治療缺血骨骼肌的血管生成,血管發(fā)生和動(dòng)脈發(fā)生。假設(shè)缺血調(diào)控啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的半滲透、肌肉趨向性AAV9載體遞送VEGF基因會(huì)支持定向血管生成，然后動(dòng)脈生成和重建立有穩(wěn)定組織重灌注的功能脈管網(wǎng)絡(luò)。材料和方法將含HIF-Ia和NSF (沉默子)結(jié)合位點(diǎn)的串聯(lián)陣列的PGK啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人(h)VEGF基因克隆入AAV9載體。基因表達(dá)和調(diào)控在正常和有動(dòng)脈硬化傾向的小鼠的缺氧骨骼肌細(xì)胞和缺血后肢中定量。動(dòng)脈發(fā)生和血管發(fā)生治療在小鼠后肢缺血模型通過肌肉內(nèi)遞送AAV9-CS-VEGF載體來評價(jià)。
結(jié)果此處顯示結(jié)果第一次指出通過缺氧調(diào)控載體啟動(dòng)子持續(xù)遞送VEGF提高缺血組織的穩(wěn)定重灌注。該方法包括使用腺相關(guān)病毒(AAV)載體轉(zhuǎn)移VEGF基因，其中，VEGF表達(dá)由含有缺血反應(yīng)元件(HRE)和沉默子元件組合盒的磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子調(diào)控，該組合盒在有氧條件下使基因表達(dá)沉默，在缺血時(shí)激活表達(dá)。載體命名為AAV9-CS-VEGF。制造由PGK啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)VEGF而不含有沉默子調(diào)控元件的對照AAV9載體；對照命名為AAV9-PGK-VEGF。通過使用所述方法，證明血管發(fā)生之后是動(dòng)脈發(fā)生，伴有當(dāng)使用AAV9-CS-VEGF治療時(shí)，穩(wěn)定血管和重灌注組織的生成。制造并且檢測穩(wěn)定血管生成和由缺血轉(zhuǎn)基因調(diào)控的AAV9-CS-VEGF和AAV9-PGK-VEGF載體。Balb/C小鼠中，通過結(jié)扎和切除股骨動(dòng)脈完成后肢缺血。101Qpfu的AAV9-CS-VEGF或AAV9-PGK-VEGF注入肢體，并且腺病毒載體表達(dá)的VEGF或磷酸鹽緩沖鹽水與注入對照。激光多普勒技術(shù)對肢體血液灌注進(jìn)行每兩周掃描，并且在殺死小鼠后用Dil熒光和共焦顯微鏡或者熒光抗體染色成像血管。結(jié)果第一次顯示，頭2-4周過后，AAV9-CS-VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生，接著16周連續(xù)VEGF生成，有與最初切除股骨動(dòng)脈相似大小的血管動(dòng)脈生成，AAV9-CS-VEGF也產(chǎn)生從臀向腳縱向生長的血管，這個(gè)結(jié)果在腺病毒或AAV9-PGK-VEGF中沒有觀察到，盡管后一載體有缺氧調(diào)控?？v向方式生長新血管的能力可能是由于分級缺氧調(diào)節(jié)和肌肉正常含氧區(qū)域沉默結(jié)合產(chǎn)生的定向信號。該特征可能是定向血流的切向力引起動(dòng)脈生成轉(zhuǎn)化的原因。也顯示動(dòng)脈可以使用AAV2-CS-VEGF構(gòu)建體產(chǎn)生，轉(zhuǎn)入間充質(zhì)干細(xì)胞和注入兔缺血后肢。使用載體AAV9-CS-VEGF或AAV2-CS-VEGF和其他促血管生長因子治療肌肉缺血，包括周邊和心肌缺血。小結(jié)持續(xù)缺血調(diào)控VEGF表達(dá)支持早期血管生成，發(fā)展為有穩(wěn)定血管生成，肌肉 灌注和肢體康復(fù)的動(dòng)脈生成。與治療相符的轉(zhuǎn)基因下調(diào)提供安全轉(zhuǎn)換，使得所述策略的臨床轉(zhuǎn)化為治療患者后肢缺血。實(shí)施例2 :治療血管生成的模型條件沉默基因治療載體的表達(dá)分布條件沉默是該實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的新技術(shù)來提供更嚴(yán)格的缺血基因調(diào)控。HIF-Ια結(jié)合元件(HRE)與沉默元件(神經(jīng)元反應(yīng)沉默元件(NRSE)和鼠Ig3啟動(dòng)子的非組織特異性沉默子)，在組織特異性和組成型啟動(dòng)子上游的串聯(lián)陣列中結(jié)合。排列元件從而在生理學(xué)氧張力(常)情況下，沉默元件具有活性并且抑制基因表達(dá)。組織缺氧(或局部缺血)情況下，HRE位點(diǎn)被激活，造成HIF-I增強(qiáng)子的雙重誘導(dǎo)和沉默元件的抑制。凈作用是組織缺氧強(qiáng)烈誘導(dǎo)(> 100倍)的非常低的常氧基因表達(dá)。高度誘導(dǎo)性很大程度是由于基礎(chǔ)基因表達(dá)的沉默，并且不包括活性過強(qiáng)的啟動(dòng)子。圖1A，1B和IC描述組織特性啟動(dòng)子的條件沉默和缺血轉(zhuǎn)錄激活的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。心臟特異性α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)啟動(dòng)子不是缺血誘導(dǎo)的。所示_86bp處的3X HRE元件插入和-164處含串聯(lián)HRE和沉默元件的條件沉默轉(zhuǎn)換元件(CSE)可逆地使表達(dá)沉默和賦予心肌細(xì)胞142±36倍缺血誘導(dǎo)。a-MHC啟動(dòng)子在非心肌細(xì)胞中不明顯表達(dá)。磷酸甘油酸激酶(PDG)基因啟動(dòng)子有內(nèi)源性HRE，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-280和-365，并且在骨骼肌細(xì)胞缺血下誘導(dǎo)表達(dá)7. 1±0. 3倍。CSE在-495位點(diǎn)的插入造成由缺血逆轉(zhuǎn)的有氧表達(dá)的> 90%沉默。CS-PGK啟動(dòng)子誘導(dǎo)倍數(shù)是116±26。圖ID顯示在C2C12骨骼肌細(xì)胞基因遞送和缺氧下CS-PGK-GFP的表達(dá)示例。條件沉默機(jī)制包括沉默子結(jié)合蛋白HDAC活性和誘導(dǎo)型增強(qiáng)子HAT活性的對抗作用，和結(jié)合鄰近DNA元件因子的別構(gòu)干擾。兩種活性都通過凝膠移位分析，沉默子蛋白的過量表達(dá)和顯性負(fù)沉默子表達(dá)，以及曲古抑菌素A抑制HDAC來證明。不期望受理論的束縛，衰老和疾病可以降低HIF-I活性。生成第二系列CS缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子，其中HIF-I結(jié)合元件由來自金屬硫蛋白(MT2)基因啟動(dòng)子的缺氧反應(yīng)金屬反應(yīng)元件(MRE)-共有序列TGCRCNC (R指A或G，N指四個(gè)堿基中的任何一個(gè))取代。當(dāng)與沉默子元件結(jié)合時(shí),這些啟動(dòng)子保持與HIF-I盒相同的調(diào)控。體內(nèi)局部缺血的調(diào)節(jié)將PGK-VEGF和CS-PGK-VEGF構(gòu)建體克隆到AAV9，以用于體內(nèi)表達(dá)和抗缺血治療。當(dāng)系統(tǒng)性遞送時(shí)，AAV9有骨骼和心肌的趨向性。AAV9載體由I日齡小鼠眼睛內(nèi)注射和8周小鼠尾靜脈注射遞送。圖5A顯示注射有AAV9和臺盼藍(lán)染色追蹤劑的I日齡小鼠以確定遞送成功。圖5B顯示注射后4周組織中的VEGF表達(dá)，AAV9遞送的PGK-VEGF優(yōu)選在骨骼心臟肌肉中表達(dá)。圖5C顯示股骨動(dòng)脈切除I周以后，相較對側(cè)不缺血的肢體，4周齡小鼠的后肢踝肌肉中條件沉默的CS-PGK-VEGF構(gòu)建體表達(dá)。缺血誘導(dǎo)的表達(dá)是78±6倍(n = 3)。圖5D，大鼠脂肪墊模型用來檢測由非缺血組織中未調(diào)控和CS-AAV9-VEGF載體誘導(dǎo)的血管生成。中間圖顯示相較沒有血管響應(yīng)條件沉默載體，組織注射未調(diào)控PGK載體時(shí)有陽性血管生長。這些結(jié)果證明CS構(gòu)建體的基因表達(dá)在非缺血組織中沉默。動(dòng)脈生成的小鼠后肢模型在小鼠缺血后肢模型中對響應(yīng)AAV9和腺病毒載體的治療性血管生成定量。第一組AAV9-CS-PGK-VEGF遞送效果實(shí)驗(yàn)與低和高劑量Ad-CMV-VEGF作比較。這些結(jié)果見圖3Α。所有治療改善多普勒評分多至8-10周，但是之后，兩個(gè)腺病毒治療組中流動(dòng)急劇下降，而AAV-CS-VEGF組流動(dòng)維持超過6個(gè)月。如右圖所示，有CS-VEGF的AAV治療使得肢體康復(fù),而所有用腺病毒治療的肢體(6個(gè)中的6個(gè))在6個(gè)月內(nèi)自身斷離。這些結(jié)果顯示在兔后肢模型中，VEGF的腺病毒遞送不支持血管持久生成。相反，AAV-CS-VEGF產(chǎn)生持久血管。圖3Β顯示實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)測定的VEGF表達(dá)；第一周中，腺病毒表達(dá)強(qiáng)烈而隨后8周內(nèi)下降到接近基線。CS-AAV9驅(qū)動(dòng)的VEGF表達(dá)在16周后仍然維持高于基線。圖3C中CS-VEGF后肢重灌注與未調(diào)控(PGK)-VEGF作比較。箭頭指示基因遞送后2周的時(shí)間點(diǎn)，其中CS-VEGF治療的肢體多普勒評分明顯高于AAV9-PGK-VEGF治療。這些結(jié)果證明更多VEGF調(diào)控表達(dá)產(chǎn)生更快重灌注，盡管CS載體介導(dǎo)VEGF的低表達(dá)。有序血管生成需要VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化和Notch介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞形成側(cè)抑制之間的平衡。VEGF表達(dá)與 Notch Dl 14 靶標(biāo) HEY2 作比較。圖 6 所示結(jié)果比較 AAV9-PGK-VEGF 和 AAV9-CS-PGK-VEGF驅(qū)動(dòng)的血管生成。結(jié)果顯示在VEGF由缺氧和條件沉默調(diào)控時(shí)，VEGF HEY2水平更加平衡。注意到，包括CS載體的后肢VEGF表達(dá)比表達(dá)未沉默載體的肌肉小> 6倍。圖3A-3C和6所述實(shí)驗(yàn)中，更低VEGF表達(dá)更好支持組織重灌注。也發(fā)現(xiàn)，14-28天SDF-I表達(dá)峰值(3. I倍)只在CS-AAV-VEGF處理肢體中出現(xiàn)。CS-AAV-VEGF的定向血管生長治療后10_16周，每2周通過DiI染色組織切片 來顯影血管。圖7A顯示由腺病毒或AAV-CS-VEGF遞送VEGF后12周和AAV9-CS-VEGF后16周，肌肉中的血管示例。底部圖顯示切除前股骨靜脈和動(dòng)脈。Ad治療切片的血管定向與股骨動(dòng)脈方向呈對角線，而CS-VEGF治療肌肉的較大血管(細(xì)動(dòng)脈和動(dòng)脈)定向與股骨動(dòng)脈和靜脈的臀向膝蓋方向相同。AAV9-CS-VEGF治療16周后，與股骨動(dòng)脈相似大小的血管在縫合位置間可見，如箭頭所示，該縫合部位描述股骨動(dòng)脈切割區(qū)域的開始處。圖7B顯示平滑肌肌動(dòng)蛋白(紅色)和dappi (藍(lán)色)染色的細(xì)動(dòng)脈。16周時(shí)用NIH圖像軟件定量AAV9-CS-VEGFAAV9-PGK-VEGF治療的后肢切片的血管面積；數(shù)據(jù)顯示每一個(gè)情況至少50個(gè)血管。AAV9-CS-VEGF治療組的血管明顯大于AAV9-PGK-VEGF組(p < O. 02)。毛細(xì)管密度使用Volocity軟件通過⑶31和VWF染色切片來定量，如圖7C所示。該過程中，通過雙光子共焦顯微鏡以約200 μ m總垂直距離中的10 μ m步得到Z堆棧。二十個(gè)圖片棧需要6分鐘時(shí)間間隔。然后用Volocity觀察以3D呈現(xiàn)Z堆棧。每一個(gè)圖像單獨(dú)用感興趣區(qū)域(ROI)內(nèi)的總血管網(wǎng)絡(luò)體積分析。采用等于90%總場的ROI評價(jià)總血管網(wǎng)絡(luò)體積。通過該方法，16周CS-AAV-VEGF治療中的血管密度相較PGK-AAV-VEGF組高I. 6倍(p < O. 05)。石蠟切片的⑶31和VWF染色支持這些結(jié)果。小鼠AMI模型為確定AAV9載體表達(dá)的VEGF是否影響缺血-重灌注損傷和梗塞后重建，AAV9-VEGF載體如圖5A- 所述進(jìn)行系統(tǒng)性遞送，并且10周后完成AMI。梗塞大小在重灌注后24小時(shí)測定。AMI之前和AMI之后2周，用超聲波心動(dòng)描記術(shù)和MRI測定收縮性。這些結(jié)果示于表I。表I :計(jì)算自Echo的心肌收縮性參數(shù)(η = 3)。
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)或者促進(jìn)患者中定向血管發(fā)生的方法，所述方法包括 給予患者含條件沉默載體的組合物，所述載體編碼以下至少ー種促血管發(fā)生因子，生長因子，細(xì)胞保護(hù)/細(xì)胞存活、細(xì)胞遷移因子和/或抗炎癥因子，其中，所述因子誘導(dǎo)組織或者器官在所需方向上形成血管；和， 誘導(dǎo)或者促進(jìn)定向血管發(fā)生。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述載體包含腺相關(guān)病毒(AAV)載體，促血管發(fā)生因子和/或生長因子和/或細(xì)胞遷移因子，啟動(dòng)子，缺氧反應(yīng)元件(HRE)和沉默元件的組合盒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在干，所述載體的基因表達(dá)在有氧條件下被抑制(條件沉默)并且在局部缺血時(shí)被激活。
4.如權(quán)利要求2所的方法，其特征在于，所述條件沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG,TOAD, FROG/TOAD, NRSE/FROG/TOAD 或其組合。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述條件沉默子包括至少ー個(gè)SEQID NO1-6所示核苷序列，衍生物，變體，突變體或者其同源物。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述條件誘導(dǎo)型元件包括缺氧反應(yīng)元件(HRE)，炎癥反應(yīng)元件(IRE)，切應(yīng)カ激活元件(SSAE)，金屬反應(yīng)元件(MRE)或其組合。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述載體條件性表達(dá)含以下至少ー種的因子內(nèi)皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，肝細(xì)胞生長因子，多育曲菌素，血管營養(yǎng)素，促血管生成素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)，胰島素樣生長因子I (IGF-I)，神經(jīng)生長因子(NGF)，基質(zhì)衍生因子(SDF)，干細(xì)胞因子(SCF)，或紅細(xì)胞生成素(EPO)。
8.一種治療患者組織缺氧和/或炎癥相關(guān)疾病和/或紊亂的方法，所述方法包括 給予患者含條件沉默載體的組合物，所述載體編碼以下至少ー種促血管發(fā)生因子，生長因子，或細(xì)胞遷移因子，其中，所述因子誘導(dǎo)組織或者器官在所需方向上形成血管； 誘導(dǎo)或者促進(jìn)定向血管發(fā)生；和治療患者組織缺氧相關(guān)疾病和/或紊亂。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體包括腺相關(guān)病毒 (AAV)載體或其他細(xì)胞透過性DNA或RNA載體，促血管發(fā)生因子和/或生長因子和/或細(xì)胞遷移因子，啟動(dòng)子，缺氧反應(yīng)元件(HRE)和沉默元件的組合盒。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因表達(dá)在有氧條件下被抑制(條件沉默)并且在局部缺血條件下被激活。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體條件性表達(dá)以下至少ー種內(nèi)皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，肝細(xì)胞生長因子，多育曲菌素，血管營養(yǎng)素，促血管生成素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)，胰島素樣生長因子I (IGF-I)，神經(jīng)生長因子(NGF)，基質(zhì)衍生因子(SDF)，干細(xì)胞因子(SCF)，或紅細(xì)胞生成素(EPO)。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述條件沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG,TOAD,FR0G/T0AD，或其組合。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述條件沉默子包括至少ー個(gè)SEQID NO.1-6所示核苷序列，衍生物，變體，突變體或其同源物。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在干，所述條件誘導(dǎo)型元件包括缺氧反應(yīng)元件(HRE)，炎癥反應(yīng)元件(IRE)，切應(yīng)カ激活元件(SSAE)，金屬反應(yīng)元件(MRE)或其組合。
15.—種含載體的分離細(xì)胞,其中,所述載體包括腺相關(guān)病毒(AAV)載體,促血管發(fā)生因子和/或生長因子和/或細(xì)胞遷移因子，啟動(dòng)子，缺氧反應(yīng)元件(HRE)和沉默元件的組合盒。
16.如權(quán)利要求15所述的分離細(xì)胞，其特征在于，所述基因表達(dá)在有氧條件下被抑制(條件沉默)并且在局部缺血時(shí)被激活。
17.如權(quán)利要求15所述的分離細(xì)胞，其特征在于，所述載體條件性表達(dá)以下至少ー種內(nèi)皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，肝細(xì)胞生長因子，多育曲菌素，血管營養(yǎng)素，促血管生成素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)，胰島素樣生長因子I (IGF-I)，神經(jīng)生長因子(NGF)，基質(zhì)衍生因子(SDF)，干細(xì)胞因子(SCF)，或紅細(xì)胞生成素(EPO)。
18.如權(quán)利要求15所述的分離細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是肌肉細(xì)胞，成纖維細(xì)胞或干細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18所述的分離細(xì)胞，其特征在于，所述干細(xì)胞是自體同源，供體衍生，同系，同種異體或異種異體。
20.如權(quán)利要求15所述的分離細(xì)胞，其特征在于，所述條件沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG,TOAD, FR0G/T0AD，或其組合。
21.如權(quán)利要求15所述的分離細(xì)胞，其特征在干，所述條件沉默子包括至少ー個(gè)SEQID NO :1-6所示核苷序列，衍生物，變體，突變體或其同源物。
22.如權(quán)利要求15所述的分離細(xì)胞，其特征在于，所述條件誘導(dǎo)型元件包括缺氧反應(yīng)元件(HRE)，炎癥反應(yīng)元件(IRE)，切應(yīng)カ激活元件(SSAE)，金屬反應(yīng)元件(MRE)或其組合。
23.ー種條件沉默子，所述沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG, TOAD, FROG/TOAD, NRSE/FROG/TOAD或其組合。
24.如權(quán)利要求23所述的條件沉默子，其特征在于，所述條件沉寂子包括至少ー個(gè)SEQID NO :1-6所示核苷序列，衍生物，變體，突變體或其同源物。
25.如權(quán)利要求23所述的條件沉默子，其特征在于，所述條件誘導(dǎo)型元件包括缺氧反應(yīng)元件(HRE)，炎癥反應(yīng)元件(IRE)，切應(yīng)カ激活元件(SSAE)，金屬反應(yīng)元件(MRE)或其組合。
26.—種載體,所述載體包含啟動(dòng)子,缺氧反應(yīng)元件(HRE)和沉默元件的組合盒。
27.如權(quán)利要求26所述的載體，其特征在于，所述基因表達(dá)在有氧條件下被抑制(條件沉默)并且在局部缺血時(shí)被激活。
28.如權(quán)利要求26所述的載體，其特征在于，所述載體條件性表達(dá)以下至少ー種內(nèi)皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，肝細(xì)胞生長因子，多育曲菌素，血管營養(yǎng)素，促血管生成素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)，胰島素樣生長因子I (IGF-I)，神經(jīng)生長因子(NGF)，基質(zhì)衍生因子(SDF)，干細(xì)胞因子(SCF)，或紅細(xì)胞生成素(EPO)。
29.如權(quán)利要求26所述的載體，其特征在于，所述條件沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG,TOAD,FR0G/T0AD，或其組合。
30.如權(quán)利要求26所述的載體，其特征在于，所述條件沉默子包括至少ー個(gè)SEQIDNO :1-6所示核苷序列，衍生物，變體，突變體或其同源物。
31.如權(quán)利要求15所述的載體，其特征在于，所述條件誘導(dǎo)型元件包括缺氧反應(yīng)元件(HRE)，炎癥反應(yīng)元件(IRE)，切應(yīng)カ激活元件(SSAE)，金屬反應(yīng)元件(MRE)或其組合。
32.ー種條件沉默子，所述沉默子包括NRSE，F(xiàn)ROG, TOAD, FR0G/T0AD，或其組合。
33.如權(quán)利要求32所述的條件沉默子，其特征在于，所述條件沉默子包括至少ー個(gè)SEQID NO :1_6所示核酸序列，衍生物，變體，突變體或其同源物。
34.如權(quán)利要求32所述的條件沉默子，其特征在于，所述條件誘導(dǎo)型元件包括缺氧反應(yīng)元件(HRE)，炎癥反應(yīng)元件(IRE)，切應(yīng)カ激活元件(SSAE)，金屬反應(yīng)元件(MRE)或其組
全文摘要
由定向血管發(fā)生/動(dòng)脈發(fā)生治療缺氧相關(guān)疾病的方法和組合物。在缺氧條件下表達(dá)治療分子的條件沉默載體避免了混亂的血管形成，并且使得新血管向受傷組織有序生長。
文檔編號C12N15/00GK102712920SQ201080060561
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者K·A·韋伯斯特 申請人:邁阿密大學(xué)