專利名稱：調(diào)控的表達系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可調(diào)控表達系統(tǒng)領(lǐng)域，更具體地，屬于空間(在特定組織中)和時間(響應(yīng)誘導(dǎo)劑的添加)形式的可調(diào)控表達領(lǐng)域。本發(fā)明還涉及允許調(diào)控肝特異性表達的基因構(gòu)建體和病毒粒子，以及其在治療肝病中的用途。
背景技術(shù)：
肝功能包括，除其它外，糖類和脂類的代謝、細胞因子分泌、胰島素和其它激素的消解、膽汁的產(chǎn)生等。而且，在肝臟中產(chǎn)生影響許多遺傳疾病、心血管疾病、代謝疾病、出血性疾病和癌癥的因子。肝細胞的半衰期很長，并直接連接到血流，其有利于治療劑的到達。由于這些原因，肝臟被認為是基因治療的良好候選器官。然而，為了防止在非肝組織中與靶基因表達相關(guān)的次生效應(yīng)，產(chǎn)生允許肝臟中目的基因特異性表達的有效系統(tǒng)是有利的。 為此，使用這樣的構(gòu)建體，其中目的基因受肝特異性啟動子控制，所述啟動子諸如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶啟動子(PEPCK)、糖異生酶(Yang，Y. W.，J.等，GeneMed.，5:417' -424(2003))、α-I-抗胰蛋白酶、白蛋白、FVII、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer, M. G.,等，Mol. Ther.，7:375-385，2003)及甲狀腺素-結(jié)合球蛋白(ffang, L.,等，Proc. Natl. Acad. Sci, 96:3906-3910 (1999)。然而，這種類型系統(tǒng)的缺點是導(dǎo)致目的基因的恒定表達，其可能引起毒性及非預(yù)期的影響。為了防止目的基因的恒定表達所產(chǎn)生的影響，開發(fā)了在僅存在給定誘導(dǎo)劑時進行表達的可誘導(dǎo)系統(tǒng)。因此，可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)被視為時間和空間上是可控的，基于啟動子的使用，存在嵌合轉(zhuǎn)錄因子時啟動子可被激活，轉(zhuǎn)錄因子活性由米非司酮(RU-486)誘導(dǎo)(見Wang等，Nat. Biotechnol.，1997, 15:239-43)。使用組織特異性啟動子可將這種類型的調(diào)控應(yīng)用于任何細胞類型。這種系統(tǒng)是特定的、可逆的且無毒的。然而，其缺點是基礎(chǔ)條件下導(dǎo)致高表達水平，這使得其希望的體內(nèi)應(yīng)用不可接受。Zabala 等(Cancer Research 2004, 64:2799-2804)描述了包括不同四環(huán)素-可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)(tet-on)的實施方案的質(zhì)粒載體，這些質(zhì)粒載體都包括編碼轉(zhuǎn)基因(熒光素酶或IL-12)的序列，轉(zhuǎn)基因由操縱基因(operator)-啟動子序列控制的轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄，所述操縱基因-啟動子序列由7個四環(huán)素操縱基因(tet07)連接白蛋白啟動子(Palb)構(gòu)成；這個系統(tǒng)還包括編碼逆向反式激活因子rtTA (rtTA2s-M2)的序列，在肝特異性啟動子序列的控制下，根據(jù)不同的實施方案，啟動子序列不同，其選自EIIP a IAT (人α-I-抗胰蛋白酶基因的啟動子Pa IAT與增強乙型肝炎病毒核心抗原的區(qū)域EII相融合)、EalbPa IAT (人α-l-抗胰蛋白酶基因的啟動子Pa IAT與增強白蛋白基因的區(qū)域Ealb相融合)以及Phpx(人類血色素結(jié)合蛋白基因的啟動子)。在本文中，證明了轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)表達與用于控制rtTA表達的肝特異性啟動子的強度成正比；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達的能力與基礎(chǔ)表達成反比(使用最弱啟動子Phpx時，誘導(dǎo)率最大)；然而，誘導(dǎo)后的最大表達水平與啟動子的能力成正比，即，最強啟動子表達誘導(dǎo)后的最高水平。另一方面，當rtTA轉(zhuǎn)錄單位和轉(zhuǎn)基因依次放置時，轉(zhuǎn)基因的表達強于它們位于相反方向時。然而，在該研究中，指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達的Palb啟動子的使用伴隨著轉(zhuǎn)基因的較低表達，相比較于使用最小巨細胞病毒啟動子的系統(tǒng)。Kramer 等(Molecular Therapy, 2003，7:375-385)比較了不同啟動子構(gòu)建體的啟動子活性，包括肝特異性EIIPalAT、EalbPalAT和Phpx啟動子。他們證明了 PalAT啟動子自身或與VHB病毒的Ealb或EII增強子結(jié)合，指導(dǎo)肝細胞中基因穩(wěn)定表達的效能最高。Chtarto等(Gene Therapy, 2003, 10:84-94)描述了由四環(huán)素-可誘導(dǎo)的雙向轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)可誘導(dǎo)表達轉(zhuǎn)基因(eGFP報告基因，增強的GFP)的AAV載體。所述系統(tǒng)包括含有tet07操縱基因區(qū)域的序列，該操縱基因區(qū)域兩側(cè)是最小巨細胞病毒啟動子序列(pCMVm)，其在相反方向指導(dǎo)反式激活因子(rtTA)的轉(zhuǎn)錄，所述反式激活因子由四環(huán)素和轉(zhuǎn)基因激活，這樣，在存在強力霉素時，rtTA反式激活因子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因及其自身的轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)還包括雙向SV40聚腺苷酸化信號。這種自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)顯示出在腫瘤細胞系和腦內(nèi)體 內(nèi)表達中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達的能力。在最近的報告中(Chtarto等Experimental Neurology2007，204:387 - 399)，這一相同的組描述了改進版載體，其攜帶突變的rtTA反式激活因子，其可以在生物活性濃度下在紋狀體核中表達GDNF，該濃度抑制強力霉素處理的大鼠中的酪氨酸羥化酶，但在非誘導(dǎo)的對照鼠中不抑制酪氨酸羥化酶。然而，根據(jù)上述規(guī)定的要求，無相關(guān)數(shù)據(jù)表明這些載體是否適合獲得肝內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達。然而，目前技術(shù)水平需要開發(fā)用于目的基因的可誘導(dǎo)的肝特異性表達的可代替的系統(tǒng)，該系統(tǒng)不存在目前所述系統(tǒng)的缺點。發(fā)明簡述本發(fā)明的作者表明，基于使用四環(huán)素-敏感型反式激活因子和最小CMV啟動子的可誘導(dǎo)表達載體在肝臟中不表現(xiàn)出可控特異性表達的良好狀況，但是，正相反的是，包括人白蛋白啟動子(PAlb)替代最小pCMV啟動子的外源基因表達系統(tǒng)不僅能獲得較低的肝特異性基礎(chǔ)表達，而且更令人驚訝的是能在誘導(dǎo)后獲得強于那些最小CMV型的強啟動子獲得的表達水平。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種基因構(gòu)建，其允許目的多核苷酸響應(yīng)誘導(dǎo)劑的可誘導(dǎo)的肝特異性表達，該構(gòu)建體包含⑴可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動子，其包含至少一個所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，所述應(yīng)答元件兩側(cè)是第一肝特異性啟動子序列和第二肝特異性啟動子序列，其中兩個肝特異性啟動子序列以不同方式作用，(ii)第一核苷酸序列，其包含編碼可以由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的序列及位于相對于編碼反式激活因子區(qū)域的3’端的聚腺苷酸化信號，其中編碼反式激活因子的所述序列可操作地連接到第一肝特異性啟動子序列，以及(iii)第二核苷酸序列，其包含可操作地連接到第二肝特異性啟動子序列的多核苷酸及位于相對于目的多核苷酸的3’端的聚腺苷酸化信號，其中由于誘導(dǎo)劑存在時反式激活因子與操縱基因-啟動子的操縱基因區(qū)域結(jié)合而誘導(dǎo)了所述第一和第二肝特異性啟動子序列的啟動子活性。本發(fā)明的第二方面涉及包含本發(fā)明基因構(gòu)建體的載體、病毒基因組或病毒粒子。本發(fā)明的另一方面涉及通過在合適的包裝細胞中表達本發(fā)明的病毒基因組而獲得的病毒粒子。本發(fā)明的另一方面涉及在肝源性細胞中表達目的多核苷酸的體外方法，其包含以下步驟(i)將所述細胞與根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體、根據(jù)本發(fā)明的載體、根據(jù)本發(fā)明的病毒基因組或根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子在所述構(gòu)建體、所述載體或所述病毒粒子進入細胞的合適條件下相接觸，以及(ii)在必要的時間將所述細胞與誘導(dǎo)劑接觸以產(chǎn)生目的多核苷酸的表達。本發(fā)明的其它方面涉及根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體、根據(jù) 本發(fā)明的載體、根據(jù)本發(fā)明的病毒基因組或根據(jù)本發(fā)明的病毒粒子的藥物組合物，以及其作為藥物的用途或用于治療肝病。本發(fā)明的另一方面涉及可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動子，其適合誘導(dǎo)劑對兩個目的多核苷酸的可誘導(dǎo)的肝特異性表達，其包含(i)至少一個所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，(ii)第一肝特異性啟動子序列，以及(iii)第二肝特異性啟動子序列，其中第一和第二肝特異性啟動子序列相對于誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件以不同方式作用，且其中存在所述誘導(dǎo)劑和與應(yīng)答元件結(jié)合的反式激活因子時，第一和第二肝特異性啟動子序列的啟動子活性增加。本發(fā)明的其它方面涉及適合誘導(dǎo)劑對目的多核苷酸的可誘導(dǎo)肝特異性表達的基因構(gòu)建體，其包含(a)可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動子，其包含(i)至少一個所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，(ii)第一肝特異性啟動子序列，以及(iii)第二肝特異性啟動子序列，(b)編碼由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的核苷酸序列及位于相對于編碼反式激活因子區(qū)域3’端的聚腺苷酸化信號，所述核苷酸序列可操作地連接到第一肝特異性啟動子序列，其中第一和第二肝特異性啟動子序列相對于誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件以不同方式作用，且其中在可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動子中存在所述誘導(dǎo)劑和與應(yīng)答元件結(jié)合的反式激活因子時，第一和第二肝特異性啟動子序列的啟動子活性增加。


圖I.本發(fā)明的四環(huán)素-可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖。(I)雙向操縱基因-啟動子序列；(2)激活形式的反式激活因子的雙向應(yīng)答元件；(3)包含肝特異性啟動子(優(yōu)選為白蛋白啟動子(pAlb)或最小的白蛋白啟動子(pmAlb))的啟動子序列；(4)編碼由誘導(dǎo)劑激活的逆向反式激活因子的序列，優(yōu)選地由四環(huán)素(rtTA)激活；(5)編碼目的轉(zhuǎn)基因的序列；(6)聚腺苷酸化信號(polyA或pA)。雙向操縱基因-啟動子序列控制編碼反式激活因子(優(yōu)選為rtTA) (4)和目的轉(zhuǎn)基因(5)的序列的轉(zhuǎn)錄；反之，存在誘導(dǎo)劑(優(yōu)選為四環(huán)素或四環(huán)素的類似物，諸如強力霉素)時，反式激活蛋白(優(yōu)選為rtTA)誘導(dǎo)其啟動子活性。圖2.實施例中使用的不同重組腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)，其中已經(jīng)整合了四環(huán)素-可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)。A)rAAV-pTetbidi-pCMV_luc :該腺相關(guān)病毒的基因組具有整合的四環(huán)素-可誘導(dǎo)的雙向表達系統(tǒng)，其包括有7個42堿基的四環(huán)素操縱基因(tet07)的操縱基因區(qū)域，兩側(cè)是2個最小巨細胞病毒啟動子(PCMV);操縱基因-啟動子控制2個序列的表達，每側(cè)放置一個，其分別編碼逆向反式激活因子rtTA-M2和作為目的轉(zhuǎn)基因的熒光素酶(Iuc);將雙向SV40聚腺苷酸化信號整合作為聚腺苷酸化信號(PA) t;表達盒兩側(cè)包括2型腺相關(guān)病毒(AAV2)的5，-ITR(反向末端重復(fù)序列)和3，ITR0B)rAAV-pTetbidi-pAlb-luc :這種腺相關(guān)病毒的基因組具有整合的四環(huán)素-可誘導(dǎo)的雙向表達系統(tǒng)，其包括與rAAV-pTetbidi-pCMV-luC病毒相同的元件，唯一的區(qū)別是白蛋白基因啟動子(PAlb)序列取代了最小的pCMV啟動子。C)rAAV-pTetbidi-pAlb_mIL12 :該腺相關(guān)病毒的基因組具有整合的四環(huán)素-可誘導(dǎo) 的雙向表達系統(tǒng)，其包括與rAAV-pTetbidi-pCMV-luC病毒相同的元件，唯一的區(qū)別是鼠單鏈IL12 序列取代了突光素酶基因(Lieschke, G. J.,等 mNat Biotechnol, 1997. 15:35-40)。圖3.通過CXD相機獲得的生物發(fā)光圖像。圖像示出了選為測量熒光素酶活性水平的區(qū)域。A)上腹區(qū)(包括肝臟)，及B)整個動物發(fā)出的生物發(fā)光水平。圖4.在注射了含有重組rAAV-pTetbidi-pCMV-luc病毒(劑量為每只鼠1x10'3xl01(l及IxlO11病毒基因組(vg)，取決于組)的基因組的病毒粒子或病毒顆粒的雌性BALB/c小鼠中，測量熒光素酶活性(光子/S)。注射的病毒粒子為AAV2/8病毒粒子，其含有構(gòu)建于AAV2病毒ITRs上的基因組，但包裝于AAV8衣殼內(nèi)(由對應(yīng)于血清型8的腺相關(guān)病毒的衣殼蛋白組成)。為了誘導(dǎo)熒光素酶的表達，施用病毒載體21天后，對每個動物施用強力霉素(50mg/kg重量；腹腔內(nèi)注射途徑)，并且施用強力霉素(dox) 24小時后在飲用水(2mg/ml強力霉素；5%蔗糖)中維持誘導(dǎo)7天。線條表示根據(jù)時間測量的熒光素酶活性，從第一次通過腹腔內(nèi)注射途徑施用強力霉素(O天)以天數(shù)t(d)表示。肝區(qū)的活性水平用實線表示；整個動物的活性水平用虛線表示。圖5.在注射了含有rAAV-pTetbidi-pCMV-luC病毒(劑量為每只鼠IxIOiqJxIOiq及IxlO11vg)基因組的AAV2/8病毒粒子的小鼠中，測量熒光素酶活性(光子/S)。在用增加劑量的強力霉素(mg/kg;腹腔內(nèi)注射途徑)以15天為間隔重復(fù)誘導(dǎo)后進行測量。自腹腔內(nèi)注射施用強力霉素24小時后在上腹部或肝區(qū)測量熒光素酶活性。圖6.在通過靜脈途徑注射了含有重組rAAV-pTetbidi-pAlb_luc病毒(IXlO11Vg/小鼠)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性BALB/c小鼠中，測量熒光素酶活性(光子/s)。在強力霉素誘導(dǎo)前測量基礎(chǔ)狀態(tài)下(劑量O)的活性，且在腹腔內(nèi)注射施用50mg/kg重量24小時后測量誘導(dǎo)狀態(tài)下(劑量50)的活性；均在上腹部(肝臟)和整個動物(合計)中進行這
些測量。圖7.在注射了 含有 rAAV-pTetbidi-pCMV_luc 或rAAV-pTetbidi-pAlb-luc (I X IO1Vg/小鼠；靜脈注射途徑)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性BALB/c小鼠中，測量基礎(chǔ)狀態(tài)下(劑量O)和腹腔內(nèi)注射施用50mg/kg的強力霉素24小時后的誘導(dǎo)狀態(tài)下(劑量50)的熒光素酶活性(光子/s)的比較。在上腹部區(qū)域(肝臟)進行測量。圖8.在注射了 整合 rAAV-pTetbidi-pAlb-luC 病毒(劑量為 I X IO11 及 I X IO10Vg/小鼠，取決于組，靜脈注射途徑)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性BALB/c小鼠中的熒光素酶活性(光子/s)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下(誘導(dǎo)O)和50mg/kg的強力霉素誘導(dǎo)24小時后的4次重復(fù)誘導(dǎo)周期(分別為誘導(dǎo)1、2、3和4)測量活性。在誘導(dǎo)I和誘導(dǎo)2之間，及誘導(dǎo)2與誘導(dǎo)3之間，經(jīng)過15天；在誘導(dǎo)3和誘導(dǎo)4之間，經(jīng)過80天。圖9. A)對于注射了攜帶 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (I X IO11Vg/ 小鼠；靜脈注射途徑)基因組的AAV2/8病毒粒子的雌性和雄性C57BL/6鼠，測量其在基礎(chǔ)狀態(tài)下和不同劑量的強力霉素誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)狀態(tài)下的熒光素酶活性(光子/S)。對每組小鼠(N=5)施用不同劑量的強力霉素(劑量為mg/kg重量；靜脈注射途徑)。在注射相應(yīng)病毒后14天測量基礎(chǔ)活性；在注射病毒后22天及施用強力霉素劑量24小時后進行誘導(dǎo)狀態(tài)下的測量。B)A)中所示活性數(shù)據(jù)的對數(shù)轉(zhuǎn)換[Lo gltl(光子/s)]。圖10.在注射了攜帶 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (I X IO11Vg/ 小鼠；靜脈注射途徑)的AAV2/8病毒粒子的雌性和雄性C57BL/6鼠中，測量基礎(chǔ)狀態(tài)下(O天)和在飲用水(2mg/ml+5%蔗糖)中施用強力霉素期間不同天數(shù)的熒光素酶活性(光子/S)。圖11.體外熒光素酶活性的生物分布。雌性BALB/c (A)和C57BL/6 (B)品種(N=4 -8)注射了 攜帶 rAAV-pTetbidi-pCMV_luc 或 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (劑量為 IX IO11Vg/ 小鼠，靜脈注射途徑)的AAV2/8病毒粒子。注射病毒后21天，施用強力霉素(50mg/kg;腹腔內(nèi)注射途徑)誘導(dǎo)熒光素酶的表達；誘導(dǎo)后24小時，處死動物；提取器官并測量每個器官中的熒光素酶活性(RLU)，以總蛋白量進行標準化(RLU/mg蛋白質(zhì))。圖12.體外熒光素酶活性的生物分布。雄性BALB/c (A)和C57BL/6 (B)品種(N=4 -8)注射了 攜帶 rAAV-pTetbidi-pCMV_luc 或 rAAV-pTetbidi-pAlb_luc (劑量為 IX IO11Vg/ 小鼠，靜脈注射途徑)的AAV2/8病毒粒子。注射病毒后21天，施用強力霉素(50mg/kg;腹腔內(nèi)注射途徑)誘導(dǎo)熒光素酶的表達；誘導(dǎo)后24小時，處死動物；提取器官并測量每個器官中的熒光素酶活性(RLU)，以總蛋白量進行標準化(RLU/mg蛋白質(zhì))。圖13.移植來自MC28同源腫瘤系的細胞后，施用于雌性C57BL/6小鼠的抗腫瘤治療方案圖。在第O天，施用了 3種不同劑量的攜帶rAAV-pTetbidipAlb-mIL12 (3 X 101、I X 101°和3X109vg/小鼠)的AAV2/8病毒粒子，且留下一組不施用載體的小鼠(N=5)。30天后，肝內(nèi)植入5X105MC38細胞。植入后10天(該方案的第40天)，通過腹腔內(nèi)注射施用強力霉素(50mg/kg)開始對系統(tǒng)的誘導(dǎo)。接下來的一天，在飲用水中(2mg/ml強力霉素+5%蔗糖)繼續(xù)誘導(dǎo)，且維持后6天(直到該方案的第47天)。在第90天，皮下再次給藥I X 106MC38細胞/小鼠，2組接受最高劑量的載體，且5只天然鼠作為對照。再次給藥后第13、23與42天(該方案的103、113與132天)測量腫瘤大小。在第113天，給小鼠抽血并提取PBLs。最后，在第132天，處死動物并從未完全保護的小鼠中提取皮下腫瘤。紅色垂直線表示用于測量血清指標而進行的抽血的天數(shù)。藍色垂直線表示測量再次給藥后腫瘤大小的天數(shù)。圖14.在注射了攜帶 rAAV-pTetbidi-pAlb-mIL12 (3 個不同劑量3 X 101CI、I X 101°和3X IO9Vg/小鼠)的AAV2/8病毒粒子的雌性C57BL/6動物的血清中，轉(zhuǎn)氨酶、ALT(A)和AST(B)的水平。所示水平為基礎(chǔ)狀態(tài)下(誘導(dǎo)的第O天)，開始腹腔內(nèi)注射施用50mg/kg的強力霉素后的第1、4和7天，在誘導(dǎo)的第O天進行，然后在飲用水中(2mg/ml強力霉素+5%蔗糖)施用強力霉素。圖15.應(yīng)用圖13中描述的方案，C57BL/6小鼠的及時存活率。說明文字示出了每組在方案開始通過靜脈途徑接受的病毒劑量(以Vg/小鼠表示)。對照組不接受任何載體。使用時序檢驗(GraphPad Prism軟件)進行統(tǒng)計評價(***ρ〈0· 001)。圖16.比較未處理小鼠的對照組⑷與經(jīng)過I X 106MC38細胞/小鼠皮下再次給藥處理的小鼠的腫瘤大小。括號內(nèi)(在B中)，示出了每只小鼠根據(jù)圖13描述的方案接受的病毒劑量，該劑量以vg表示。(C)示出了試驗結(jié)束時(方案的第132天)通過不同組得到的腫瘤大小。括號內(nèi)，示出了每只小鼠根據(jù)圖13描述的方案接受的病毒劑量，該劑量以vg表不。圖17. CD8+/Tet+PBLs (MC38)的百分比。再次給藥后23天(圖13中所述方案的第113天)給小鼠抽血，獲得PBLs并用抗-CD8+抗體和加載MC38細胞特異性肽的四聚物標記。使用FlowJo計算機程序分析Q)8+-MC38Tet+PBLs的百分比。用Student t_檢驗進行統(tǒng)計評價(*P〈0. 05)。
圖18. MC38四聚物特異性及活化標記物⑶44陽性的腫瘤內(nèi)⑶8+淋巴細胞的百分t匕。已處理小鼠的組組合在一起，因為它們之間沒有顯著性差異(A)、B)和C)分別示出了關(guān)于對照組和已處理組的代表小鼠的點圖。用Student t_檢驗進行統(tǒng)計評價O**p〈0. 001)。圖19.施用于雌性C57BL/6小鼠的治療性抗腫瘤處理的方案圖。在第O天，植入同源腫瘤系MC38細胞。7天后，向其中注射單劑量lX101QrAAV-pTetbidipAlb-mIL12病毒基因組(vg)，且留下一組沒有施用載體的小鼠(N=5)。15天后，腹腔內(nèi)注射施用強力霉素(50mg/Kg)起始對系統(tǒng)的誘導(dǎo)。接下來的一天，在飲用水中(2mg/ml強力霉素+5%鹿糖)繼續(xù)誘導(dǎo)，且維持隨后6天，之后分析兩組的存活。圖20.應(yīng)用圖19中描述的方案，C57BL/6小鼠隨時間的存活百分比。圖例示出了通過已處理動物接受的病毒劑量(以vg/小鼠表示)。對照組不接受載體。使用時序檢驗(GraphPad Prism 軟件)進行統(tǒng)計評價(***ρ〈0· 001)。發(fā)明詳述本發(fā)明的基因構(gòu)津體本發(fā)明作者已開發(fā)出用于目的多核苷酸的表達系統(tǒng)，其允許在肝臟中所述多核苷酸時間及空間上的精確表達。為此，發(fā)明人使用與控制反式激活因子表達的第一肝特異性啟動子和控制目的基因表達的第二肝特異性啟動子相關(guān)的可激活的雙向操縱基因-啟動子，存在誘導(dǎo)劑時所述反式激活因子激活所述雙向啟動子的表達。在基礎(chǔ)狀態(tài)下(未誘導(dǎo))，肝特異性啟動子指導(dǎo)反式激活因子和轉(zhuǎn)基因的少量表達，引起所謂的系統(tǒng)殘余表達。缺乏誘導(dǎo)劑時，反式激活因子不能與雙向啟動子的操縱基因位點構(gòu)象地結(jié)合，因此，不能激活雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄。存在誘導(dǎo)劑時，后者與細胞中存在的殘余反式激活因子分子結(jié)合，產(chǎn)生構(gòu)象變化，以允許其與可誘導(dǎo)的雙向啟動子-操縱基因結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄。如此，誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因和反式激活因子的表達。這些新合成的反式激活因子分子能與細胞游離的誘導(dǎo)劑結(jié)合并產(chǎn)生正反饋環(huán)，直到達到一種狀態(tài)，其中可能出現(xiàn)以下兩種情況(a)所有的操縱基因位點都被誘導(dǎo)劑-反式激活因子復(fù)合物分子占據(jù)；或(b)細胞的游離誘導(dǎo)劑耗盡，如果其沒有被過量施用，且合成的反式激活因子分子不能繼續(xù)與操縱基因位點結(jié)合。因此，施用誘導(dǎo)劑后，將開始誘導(dǎo)步驟或誘導(dǎo)狀態(tài)。反式激活因子和轉(zhuǎn)基因的表達水平都取決于施用的誘導(dǎo)劑劑量。一旦移除誘導(dǎo)劑，反式激活因子恢復(fù)到其無活性構(gòu)象狀態(tài)，且不能有效地結(jié)合到操縱基因位點，其使轉(zhuǎn)基因表達降低直到恢復(fù)到起始或基礎(chǔ)狀態(tài)。當誘導(dǎo)劑-反式激活因子復(fù)合物分子占據(jù)所有操縱基因位點時獲得最高表達。出乎預(yù)料地，本發(fā)明的作者已示出研發(fā)的載體允許誘導(dǎo)后的肝特異性表達，其達到比使用帶有更高基礎(chǔ)表達的啟動子的載體獲得的更高水平表達。因此，盡管所描述誘導(dǎo)系統(tǒng)的最高表達迄今與基礎(chǔ)狀態(tài)下啟動子的效能直接相關(guān)，但在本發(fā)明的系統(tǒng)中，其使用通常弱于普通CMV型啟動子的組織特異性啟動子，誘導(dǎo)后獲得與使用CMV相比較高的基礎(chǔ)表達。具體地，在本發(fā)明實施例2中，可觀察到，施用誘導(dǎo)劑后使用本發(fā)明的肝特異性系統(tǒng)獲得的報告基因的誘導(dǎo)率比使用基于普通CMV啟動子的系統(tǒng)的誘導(dǎo)率高約85倍(見圖7)，其與 Zabala 等(Zabala, Μ.,等，Cancer Res. 2004; 64:2799-2804)獲得的結(jié)果不同，其中使用Palb啟動子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達與使用巨細胞病毒最小的啟動子的系統(tǒng)獲得的表達相t匕，引起了較低的轉(zhuǎn)基因表達。而且，在誘導(dǎo)狀態(tài)下用于兩個系統(tǒng)的強力霉素劑量的差異、非常顯著。另一方面，由本發(fā)明的可誘導(dǎo)的肝特異性表達系統(tǒng)控制的報告基因肝內(nèi)表達與基于普通CMV啟動子的系統(tǒng)控制的表達相比，其達到更高的熒光素酶活性誘導(dǎo)水平(見圖11)。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種基因構(gòu)建體，其允許目的多核苷酸響應(yīng)誘導(dǎo)劑的可誘導(dǎo)的肝特異性表達，該構(gòu)建體包含(i)可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動子，其包含所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件，所述應(yīng)答元件兩側(cè)是第一肝特異性啟動子序列和第二肝特異性啟動子序列，其中兩個肝特異性啟動子序列以不同方式定向，(ii)第一核苷酸序列，其包含編碼可以由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的序列及位于相對于編碼反式激活因子區(qū)域3’端的聚腺苷酸化信號，其中編碼反式激活因子的序列可操作地連接到第一肝特異性啟動子序列，以及(iii)第二核苷酸序列，其包含可操作地連接到第二肝特異性啟動子序列的多核苷酸及位于相對于目的多核苷酸3’端的聚腺苷酸化信號，其中所述第一和第二肝特異性啟動子序列的啟動子活性由于誘導(dǎo)劑存在時反式激活因子與操縱基因-啟動子的操縱基因區(qū)域結(jié)合而誘導(dǎo)。本發(fā)明使用的術(shù)語“基因構(gòu)建體”，是指單鏈或雙鏈核酸，其包含能夠被表達的區(qū)域，及可選地，在所述核酸之前(非編碼5’ -序列)或所述核酸之后(非編碼3’ -序列)的調(diào)控序列。在本發(fā)明中，術(shù)語“基因構(gòu)建體”和“核酸構(gòu)建體”交換使用。術(shù)語“表達”是指基因或基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)RNA (rRNA.tRNA)或mRNA，隨后將所述RNA翻譯為蛋白質(zhì)或不翻譯。本發(fā)明使用的術(shù)語“可誘導(dǎo)的表達”，是指響應(yīng)激活劑/誘導(dǎo)劑表達可能增加。本發(fā)明使用的術(shù)語“目的多核苷酸”，是指與細胞或被導(dǎo)入細胞的受試者部分或完全異源的核酸序列，且由于存在相對于所述目的多核苷酸的5’或3’端的表達調(diào)控區(qū)域，核酸序列可被轉(zhuǎn)錄，且最終被翻譯以產(chǎn)生具有所需生物活性的多肽。術(shù)語“目的多核苷酸”不應(yīng)該僅被理解為能夠編碼多肽的多核苷酸，還可被用來指與細胞或被導(dǎo)入細胞的受試者的內(nèi)源多核苷酸部分或完全互補的核酸序列，這樣，在其轉(zhuǎn)錄后，它會產(chǎn)生能夠雜合(hibridisin)或抑制內(nèi)源多核苷酸表達的RNA分子(microRNA、shRNA或siRNA)。目的多核苷酸可以是DNA或cDNA。本發(fā)明使用的術(shù)語“誘導(dǎo)劑”是指能夠引起基因轉(zhuǎn)錄增加的任何分子。通常，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的有效控制下，響應(yīng)所述誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，反之，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合位點，存在所述誘導(dǎo)劑時轉(zhuǎn)錄激活因子的活性增加。因此，在本發(fā)明的文本中，因為其指目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，使用的術(shù)語“誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件”是指轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合位點，該轉(zhuǎn)錄激活因子通過與誘導(dǎo)劑結(jié)合其活性增加。優(yōu)選地，誘導(dǎo)劑是在體內(nèi)容易施用并分散的化合物，且激活系統(tǒng)的劑量是無害的。而且，誘導(dǎo)劑必需能夠滲入到所需組織或器官，且其半衰期為幾小時(不是分鐘或天)?？烧{(diào)控的雙向操縱基因-啟動子本發(fā)明的基因構(gòu)建體的元件(a)包含可誘導(dǎo)的雙向操縱基因-啟動子，其包含活性形式的反式激活因子的應(yīng)答元件，該應(yīng)答元件兩側(cè)是第一肝特異性啟動子序列和第二肝特異性啟動子序列，其中兩個肝特異性啟動子序列以不同方式定向。
本發(fā)明使用的術(shù)語“可調(diào)控的雙向操縱基因-啟動子”，是指存在給定信號時能夠從所述“操縱基因-啟動子”的相反方向激活特定多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的啟動子。術(shù)語“誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件”是指一個或多個順式作用的DNA元件且使啟動子能夠激活響應(yīng)所述元件與轉(zhuǎn)錄因子或反式激活因子的DNA結(jié)合域相互作用的轉(zhuǎn)錄，存在誘導(dǎo)劑時誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄活性，通常的原因是結(jié)合誘導(dǎo)劑引起反式激活因子的構(gòu)象改變。因此，術(shù)語“誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件”必需理解為存在誘導(dǎo)劑時轉(zhuǎn)錄激活因子的應(yīng)答元件。轉(zhuǎn)錄因子或反式激活因子的DNA結(jié)合域，在存在或不存在誘導(dǎo)劑的情況下，都能與應(yīng)答元件的DNA序列結(jié)合，以啟動或抑制位于相對于啟動子3’端的基因的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“應(yīng)答元件”、“轉(zhuǎn)錄應(yīng)答元件”或TRE可互換地使用。在優(yōu)選的實施方案中，可調(diào)控的雙向啟動子-操縱基因包含至少一個可由抗生素激活的反式激活因子的應(yīng)答元件，優(yōu)選為四環(huán)素-應(yīng)答元件，且更優(yōu)選為包含可變拷貝數(shù)的42堿基對操縱基因序列(稱為TetO)的四環(huán)素-應(yīng)答元件，如最初由Baron等所述(Nucleic Acids Res.，1995，17:3605-3606)。TetO 的拷貝數(shù)可至少為 2、至少為5或優(yōu)選地，不超過7。這種類型的四環(huán)素-應(yīng)答元件可在存在反向四環(huán)素-激活的反式激活因子(或類似物強力霉素)的情況下激活雙向轉(zhuǎn)錄，如最初由Gossen等所述(Science, 1995，278:1766-1769)。在優(yōu)選的實施方案中，反式激活因子+四環(huán)素的應(yīng)答元件包含7份操縱基因序列，這種情況下其被稱為Tet07。在更優(yōu)選的方案中，操縱基因-啟動子包含序列SEQ ID NO : I或由其組成?；驑?gòu)建體的元件(a)還包含第一肝特異性啟動子序列。本發(fā)明使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄啟動子序列”，是指由宿主細胞識別的核酸序列并使激活位于所述啟動子區(qū)域3’端的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。通常，啟動子序列含有允許目的多核苷酸表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。本發(fā)明使用的術(shù)語“肝特異性”，是指轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域，其指所述區(qū)域能夠選擇性地激活肝細胞中或源于肝細胞的細胞系中的轉(zhuǎn)錄。適合本發(fā)明的肝特異性啟動子包括，但不限制于，α -I-抗胰蛋白酶(AAT)啟動子、甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動子、α -甲胎蛋白啟動子、醇脫氫酶啟動子、IGF-II啟動子、因子VIII (FVIII)啟動子、HBV基礎(chǔ)核心蛋白啟動子或BCP及PreS2啟動子、甲狀腺素-結(jié)合球蛋白(TBG)啟動子、肝臟控制區(qū)域(HCR)-Ap0CII的雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、與小鼠白蛋白基因的增強子元件(Ealb)結(jié)合的AAT啟動子、載脂蛋白E啟動子、低密度脂蛋白啟動子、丙酮酸激酶啟動子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶啟動子、卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)啟動子、載脂蛋白H(ApoH)啟動子、鐵傳遞蛋白啟動子、甲狀腺素運載蛋白啟動子、α-纖維蛋白原及β_纖維蛋白原的啟動子、α-I-抗糜蛋白酶啟動子、α-2-HS糖蛋白啟動子、觸珠蛋白啟動子、血漿銅藍蛋白啟動子、血纖維蛋白溶酶原啟動子、補體蛋白(CIq、CIr、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C9、補體的因子I及因子H)啟動子、補體C3激活子的啟動子、血液結(jié)合素啟動子及α-I-酸性糖蛋白啟動子?？稍诮M織特異性啟動子數(shù)據(jù)庫TiProD中找到另外的組織特異性啟動子(Nucleic AcidsResearch, J4:D104-D107 (2006))?？商娲兀墒褂冒翁禺愋栽鰪娮雍透翁禺愋詥幼拥碾s合啟動子。這種類型的啟動子包括肝臟控制區(qū)域(HCR)-Ap0CII的雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、與小鼠白蛋白基因的增強子元件(Ealb)結(jié)合的AAT啟動子及載脂蛋白E啟動子、由小鼠白蛋白基因增強子(Ealb)和小鼠α-l-抗胰蛋白酶(AAT)的啟動子(Ealb-AATp)形成的雜合啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，第一表達盒的一部分的肝特異性啟動子是鼠源或人源的白 蛋白基因啟動子。特別地，本發(fā)明考慮使用完整的白蛋白基因啟動子(SEQ ID NO 2)或?qū)?yīng)于SEQ ID NO 2中限定的完整啟動子的核苷酸113至196的所述啟動子(SEQ ID NO 3)的最小區(qū)域。本發(fā)明考慮使用啟動子的任何片段，其包括至少最小的啟動子(SEQ ID Ν02的殘基113-196)。在本發(fā)明中，肝特異性啟動子是那些在肝臟中的活性比在其它任何身體組織中活性都高的啟動子。通常，肝特異性啟動子在肝臟中的活性比在其它組織中高很多。例如，這種啟動子在肝臟中的活性比在其它類型細胞中可以高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。所述啟動子在肝源細胞與參照細胞中的活性對比可通過其指導(dǎo)在特定組織中的表達同時阻止在其它細胞或組織中的表達的能力測定。因此，肝特異性啟動子允許基因在肝臟中的活性表達并阻止基因在其它細胞或組織中的表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會注意到第一和第二肝特異性轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域可以是相同的或不同的。在優(yōu)選的實施方案中，兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域是相同的。在更優(yōu)選的實施方案中，第一轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域和第二轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域都包含白蛋白基因啟動子。在更優(yōu)選的實施方案中，形成第一和/或第二轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域的白蛋白基因啟動子包含選自SEQ ID NO :2與SEQID NO 3的序列。在優(yōu)選的實施方案中，可調(diào)控的雙向啟動子-操縱基因包含由7個反式激活因子的結(jié)合位點組成的四環(huán)素-應(yīng)答元件，反式激活因子可由誘導(dǎo)劑激活，誘導(dǎo)劑優(yōu)選為四環(huán)素，應(yīng)答元件兩側(cè)為以不同方式定向的兩個白蛋白基因啟動子。在更優(yōu)選的實施方案中，包含Tet07操縱基因和兩個白蛋白啟動子的所述操縱基因-啟動子包含SEQ ID N0:4序列。具有肝特異性啟動子活性的序列與操縱基因區(qū)域以不同方式定向排列。本發(fā)明使用的術(shù)語“不同方向”，是指肝特異性啟動子，指啟動子對，其中由啟動子對的第一啟動子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)生在一條DNA分子鏈上，從而允許RNA聚合酶以5’-3’方向作用，而第二啟動子在相反鏈上作用，導(dǎo)致RNA聚合酶在相反方向的置換，其中其與第一啟動子共同作用。組成本發(fā)明基因構(gòu)建體的雙向操縱基因-啟動子的元件以這種方式構(gòu)成，S卩，存在誘導(dǎo)劑時，反式激活因子與操縱基因-啟動子的操縱基因區(qū)域結(jié)合，因此誘導(dǎo)第一和第二肝特異性啟動子序列的啟動子活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會注意到所述轉(zhuǎn)錄啟動子活性的誘導(dǎo)，除其它因素，將取決于操縱基因元件和肝特異性啟動子序列的距離。優(yōu)選地，操縱基因和第一或第二啟動子序列的距離可在O至30個核苷酸之間變化，更優(yōu)選地在O至20個核苷酸之間變化，甚至更優(yōu)選，在O至15個核苷酸之間變化。本發(fā)明基因構(gòu)建體的第一核苷酸序列本發(fā)明基因構(gòu)建體的元件(b)是核苷酸序列，其包含編碼可以由所述誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子的序列，該序列可操作地連接到第一肝特異性啟動子序列，及位于相對于編碼反式激活因子的區(qū)域3’端的聚腺苷酸化信號。本發(fā)明中互換使用的術(shù)語“核苷酸序列”、“核酸”及“多核苷酸”是指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯的聚合物形式，或其任何類似的磷酸酯，諸如單鏈或雙鏈形式的硫代磷酸酯及硫酯。因此，由DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA組成的螺旋是可能的。術(shù)語“核酸序列”，特別是DNA或RNA分子，僅指分子的一級或二級結(jié)構(gòu)，且不限制任何特定類型的三級結(jié)構(gòu)。因此，這個術(shù)語包括雙鏈DNA，如以線狀或環(huán)狀DNA分子、超螺旋DNA質(zhì)粒及染色體呈現(xiàn)。本發(fā)明使用的術(shù)語“可以被誘導(dǎo)劑激活的反式激活因子”是指多肽，S卩，當其與所述誘導(dǎo)劑結(jié)合時，通過在所述基因的非編碼區(qū)與所述多肽的特定識別區(qū)域相結(jié)合能夠促進給定基因的轉(zhuǎn)錄，即其活性可通過其它因子調(diào)節(jié)，根據(jù)促進包含所述調(diào)節(jié)子的特異性結(jié)合位點的基因轉(zhuǎn)錄的需要，提供或除去所述因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會注意到由本發(fā)明第一核苷酸序列編碼的反式激活因子能夠與包含所述誘導(dǎo)劑的應(yīng)答元件的操縱基因-啟動子的區(qū)域結(jié)合，以致存在誘導(dǎo)劑時，反式激活因子與操縱基因-啟動子的操縱基因區(qū)域結(jié)合后，反式激活因子激活所述第一和第二肝特異性啟動子序列的轉(zhuǎn)錄。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會注意到本發(fā)明考慮到調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達的任何方法，只要其允許最低基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達。特別地，本發(fā)明考慮到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的用途，不通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子表達水平的增加產(chǎn)生誘導(dǎo)，而通過響應(yīng)誘導(dǎo)劑結(jié)合的構(gòu)象變化，其可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子易位至細胞核，在細胞核中發(fā)揮作用或增加轉(zhuǎn)錄活性。這種類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子通常由DNA結(jié)合域或DBD,配體結(jié)合域或LBD及轉(zhuǎn)錄激活域或AD組成。DNA結(jié)合域可以是任何具有已知特定結(jié)合元件的結(jié)合域，包括合成的、嵌合的或類似的DNA結(jié)合域。適合本發(fā)明的DNA結(jié)合域包括(i)同源異型域(Scott等，1989, Biochim. Biophys. Acta 989:25-48; Rosenfeld 等，1991，Genes Dev. 5:897-907)，其通常由大約 61 個氨基酸的鏈組成，呈現(xiàn)由3個α -螺旋組成的二級結(jié)構(gòu)，(ii)由24至36個DNA指結(jié)構(gòu)及通式Cys2His2串聯(lián)排列組成的鋅指結(jié)構(gòu)(例如，TFIIIA、Zif268、Gli及SRE-ZBP)，其中每個組件包含能與3至5個堿基對的DNA區(qū)域接觸的α -螺旋，至少3個鋅指對于產(chǎn)生高親和性DNA結(jié)合位點是必須的，及至少2個鋅指對于產(chǎn)生低親和性DNA結(jié)合位點是必須的，
(iii)稱為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋或HLH的DNA結(jié)合域，諸如TetR、ΜΑΤΙ、ΜΑΤ2、MATal、觸足蛋白、超級雙胸基因(Ultrabithorax)、波紋(Engrailed)、Paired、Fushi tarazu、H0X、Unc86、 OctU 0ct2 及 Pit-1, (iv)亮氨酸拉鏈類型的 DNA 結(jié)合域,諸如 GCN4、C/EBP、c-Fos/c-Jun 與JunB。適合本發(fā)明的DNA結(jié)合域的實例包括GAL4、LexA、轉(zhuǎn)錄因子、H組核受體、類固醇 /甲狀腺激素超 家族核受體的DNA結(jié)合域。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會注意到本發(fā)明考慮到由幾個DNA結(jié)合基序組成的雜合DNA結(jié)合域的用途，所述基序可識別不同于組成自身的元件的 DNA結(jié)合位點。因此，可能使用由鋅指與同源異型框結(jié)合形成的DNA結(jié)合域。在優(yōu)選的實施方案中，DNA結(jié)合域是由大腸桿菌的Tet轉(zhuǎn)錄阻遏物中獲得的。適合本發(fā)明使用的能夠促進轉(zhuǎn)錄激活子的核定位的配體結(jié)合序列包括存在15-脫氧-δ-前列腺素J2時移位至細胞核的PPAR-衍生的定位序列(受體由過氧化物酶激活子激活)，存在9-順式維甲酸的a、β或Y異構(gòu)體時移位至細胞核的維甲酸受體，可由維甲酸和TTNPB激活的類法尼醇X受體，可由24-羥基膽固醇激活的肝X受體，可由4-氨基-苯甲酸丁酯激活的苯甲酸鹽X受體，組成型雄烷受體，可由孕烯醇酮-16-腈誘導(dǎo)的孕甾(pregnan)受體，可由甲哌力復(fù)霉素誘導(dǎo)的類固醇和異生物素的受體，可由甲羥孕酮激活的孕酮受體，以及米非司酮的激動劑和拮抗劑與 19-去甲睪酮的衍生物，可由糖皮質(zhì)激素激活的糖皮質(zhì)激素受體，可由T3和/或T4激活的甲狀腺激素受體，及可由雌激素及其衍生物，諸如17-β-雌二醇和雌二醇激活的雌激素受體，可由“tet-off”四環(huán)素/強力霉素激活的tTA反式激活因子(Gossen和 Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551),可由 “tet-on” 四環(huán)素激活的rtTA反式激活因子(Gossen等,1995, Science, 268:1766-1769),可由米樂留酮A或類似蛻皮激素受體的配體誘導(dǎo)的反式激活因子(No等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，93:3346-3351)，可由RSLl配體激活的反式激活因子，諸如Palli等最初描述的 RheoSwitch 系統(tǒng)(2003, Eur. J. Biochem. , 270:1308-1315),可由雷帕霉素或雷帕霉素類似物激活的反式激活因子(Ho 等，1996, Nature, 382:822-826; Amara 等，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10618-10623)，及可由香豆霉素/新生霉素激活的反式激活因子， 其中香豆霉素與新生霉素分別競爭性地作為誘導(dǎo)劑和阻遏物(Zhao等，2003, Hum. Gene Ther.，14:1619-1629)。最后，轉(zhuǎn)錄激活域可以是酸性激活域、富含·脯氨酸的激活域、富含絲氨酸/蘇氨酸的激活域及富含谷氨酰胺的激活域。酸性激活域的實例包括由氨基酸753-881組成的VP16 區(qū)域和GAL4區(qū)域。富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄激活域的實例包括CTF/NF1的氨基酸399-499及AP2 的氨基酸31-76。富含絲氨酸/蘇氨酸的激活域的實例包括ITFl的氨基酸1-427及ITF2 的氨基酸2-452。富含谷氨酰胺的激活域的實例包括Octl的氨基酸175-269及Spl的氨基酸132-243。每個所述區(qū)域的序列，以及其它轉(zhuǎn)錄激活域，已由Seipel，K.等描述(ΕΜΒ0 J. (1992) 13:4961-4968)。此外，可使用本領(lǐng)域已知的方法從上面提到的激活域中獲得其它轉(zhuǎn)錄激活域。此外，激活域可以是H組核受體、甲狀腺或類固醇激素的核受體的激活域， VP16、GAL4、NF- κ B、Β42、ΒΡ64 或 ρ65 的激活域。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)錄激活域是單純性皰疹病毒粒子(以下稱為 VP16)的蛋白質(zhì)16,其氨基酸序列已經(jīng)由Triezenberg, S. J.，等所描述(Genes Dev.，1988, 2:718-729) ο這種結(jié)構(gòu)域可以由VP16的C-末端的約127個氨基酸組成。 可替代地，轉(zhuǎn)錄激活域可以由VP16的C-末端區(qū)域的11氨基酸組成，其仍然具有激活轉(zhuǎn)錄的能力。適合用作轉(zhuǎn)錄激活域的VP16的C-末端區(qū)域如Seipel, K.等所述(ΕΜΒ0 J. (1992) 13:4961-4968)。在更優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)錄激活子包含由13個氨基酸和序列 PADALDDFDLDML(SEQ ID NO 5)組成的所述蛋白質(zhì)的最小區(qū)域，如Baron等所述(Nucleics Acids. Res.，1997，25:2723-2729)。
在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)錄激活子是可以由四環(huán)素或其類似物激活的轉(zhuǎn)錄激活子。本發(fā)明使用的術(shù)語“四環(huán)素類似物”，是指與四環(huán)素結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物，其能夠在至少約IO-6M-1的Ka與四環(huán)素阻遏物結(jié)合。優(yōu)選地，四環(huán)素類似物對至少 IO-9M-1的TetR有親和性。適合本發(fā)明的四環(huán)素類似物的實例包括，但不限于，無水四環(huán)素、強力霉素(Dox)、金霉素、土霉素、差向土霉素、氰基四環(huán)素、地美環(huán)素、甲氯環(huán)素、甲烯土霉素及其它如Hlavka和Boothe所述，在“Handbook of Experimental Pharmacology” 78 中的"The Tetracyclines " , R. K. Blackwood 等(eds. )，Spr inger-Verlag, Berlin-New York, 1985;L. A. Mitscher, " The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics " , Medicinal Research 9,Dekker,N. Y. , 1978;Noyee Development Corporation, " Tetracycline Manufacturing Processes " , Chemical Process Reviews, Park Ridge, N. J. , 2volumes, 1969;R.C.Evans, " The Technology of the Tetracyclines " , Biochemical Reference Series I,Quadrangle Press,New York, 1968;和 H. F. Dowling, " Tetracycline" , Antibiotic Monographs, no. 3, Medical Encyclopedia, New York, 1955。
在優(yōu)選的實施方案中，可由四環(huán)素激活的反式激活因子可以是所謂的反向四環(huán)素阻遏蛋白、或反向tetR，是指多肽，其⑴顯示了對于誘導(dǎo)劑的特異性親和力，(ii)當與誘導(dǎo)劑結(jié)合時，顯示了對于tet-型應(yīng)答元件的特異性親和力，及(iii)不與誘導(dǎo)劑結(jié)合時，從 tet元件分離。這種激活子包括其自然形式及功能衍生物。在優(yōu)選的實施方案中，可由四環(huán)素調(diào)控的激活子可以是所謂的反向四環(huán)素-依賴型反式激活因子(rtTA)，其特征在于，存在四環(huán)素或其類似物時，發(fā)生構(gòu)象變化使其變成轉(zhuǎn)錄激活子，而在不存在四環(huán)素時其失活。 如此，防止了與源于大腸桿菌的tetR阻遏物的反式激活因子相關(guān)的問題，不存在四環(huán)素時反式激活因子能夠激活具有四環(huán)素-應(yīng)答元件的基因的轉(zhuǎn)錄，且存在四環(huán)素時反式激活因子停止激活轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，反向四環(huán)素-依賴型反式激活因子(rtTA)包括rtTA反式激活因子或任何Urlinger, S.,等所述的rtTA變體(Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2000; 97:7963 -7968)。在優(yōu)選的實施方案中，rtTA變體是已知變體rtTA-M2，其特征在于，使其激活所需的強力霉素濃度比所需的原始rtTA濃度低10倍。rtTA-M2反式激活因子是由多核苷酸和序列SEQ ID NO :6編碼的多肽。本發(fā)明基因構(gòu)建體的第一核苷酸序列的元件(b)還包含位于相對于編碼反式激活因子的多核苷酸3’端的聚腺苷酸化序列。本發(fā)明使用的術(shù)語“聚腺苷酸序列”或“聚腺苷酸化信號”，是指含有轉(zhuǎn)錄終止信號的核酸，且當其出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄物時，在存在具有聚腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶活性的酶時使所述轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化。如本文所使用的“聚腺苷酸化”，是指在mRNA的3’末端添加聚腺嘌呤尾巴。適合本發(fā)明使用的聚腺苷酸化信號包括，但不限于， SV40早期-后期聚腺苷酸化信號、HSV胸苷激酶的聚腺苷酸化信號、魚精蛋白基因的聚腺苷酸化信號、腺病毒5EIb的聚腺苷酸化信號、牛生長激素的聚腺苷酸化信號、人生長激素變體及相似物的聚腺苷酸化信號。在優(yōu)選的實施方案中，聚腺苷酸化信號是雙向聚腺苷酸化信號。當使用病毒載體表達本發(fā)明基因構(gòu)建體時使用雙向聚腺苷酸化信號是特別有利的，其中終止序列具有特的的轉(zhuǎn)錄啟動子活性(特別是AAVs、慢病毒)。如此，防止其被可誘導(dǎo)的系統(tǒng)干擾，從而降低基礎(chǔ)活性。在更優(yōu)選的實施方案中，雙向聚腺苷酸化信號對應(yīng)于SV40聚腺苷酸化信號。在更優(yōu)選的實施方案中，SV40聚腺苷酸化信號包含序列SEQ ID NO :7。
_4] 本發(fā)明基因構(gòu)建體的第二核苷酸序列本發(fā)明基因構(gòu)建體還包含操作地連接到第二肝特異性啟動子序列的多核苷酸及位于相對于目的多核苷酸3’端的聚腺苷酸化信號。術(shù)語“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“肝特異性啟動子序列”、“可操作的控制”及“聚腺苷酸化信號”如上定義且以和第一核苷酸表達序列中相同的方式用于第二核苷酸序列。 本發(fā)明使用的術(shù)語“目的多核苷酸”，是指出于不同目的進行操縱的DNA序列，且其包括 DNA、cDNA、基因組DNA、RNA或核酸類似物，以及能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)或RNA分子的相應(yīng)的反義分子，諸如，例如，以非限制的方式，小干擾RNA(siRNA)、短環(huán)RNA(shRNA)或核酶。在優(yōu)選的實施方案中，目的多核苷酸編碼多肽。這種多肽可以是熒光素酶報告基因型的基因編碼的多肽、綠色熒光蛋白(GFP)、GFP(EGFP、YFP或BFP)變體、堿性磷酸酶、 β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酸酶、鄰苯二酚脫氫酶?？商娲兀康亩嗪塑账峋幋a多肽，其在肝臟或肝細胞中的表達對肝病的修復(fù)是有益的，將從所述多肽的表達獲益。因此，適合用于治療肝變化的多肽包括，但不限于干擾素α及，具體地，選自由IFN-α 2a、IFN-a 2b、IFN-α 4、IFN-α 5、IFN-α 8組成的組中的 IFN-α、制瘤素、心肌營養(yǎng)素、IL-6、IGF-I及其變體、雙調(diào)蛋白、IL_15、IL_12、CD134、CD137、 PB⑶、抗體、TGF-β I抑制劑，諸如國際專利申請W00031135、W0200519244和W00393293中描述的肽Ρ17和Ρ144，通過引用將上述申請納入本文，IL-10抑制劑、FoxP3抑制劑、TNFa 抑制劑、VEGF抑制劑、PD-I抑制劑和CD 152抑制劑。在優(yōu)選的實施方案中，目的多核苷酸編碼IL-12或其同功能變體。白細胞介素-12(IL-12)是主要由巨噬細胞和樹突狀細胞分泌的I型細胞因子，包括天然IL-12和以重組方式制備的IL-12，且白細胞介素-12能夠通過多種機制增強抗腫瘤免疫力，所述機制包括(1)增加細胞毒性T淋巴細胞的應(yīng)答，(2)激活溶細胞性自然殺傷細胞(NK，自然殺傷)，(3)強化溶細胞性自然殺傷細胞和T淋巴細胞的增殖，(4)誘導(dǎo)I型輔助性T細胞 (Thl，輔助性Tl)子系列的極化(5)誘導(dǎo)抗血管生成作用。多數(shù)這些作用是通過溶細胞性自然殺傷細胞和活化的T淋巴細胞產(chǎn)生和分泌干擾素-Y (INF-y)介導(dǎo)的。細胞因子IL-12是由重鏈(p40)和輕鏈(p35)組成的異源二聚體。人源重鏈和輕鏈的序列如 Gubler 等所述(Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1991，88:4143)。如果輕鏈是外源提供的，目的多核苷酸可以編碼重鏈，如果重鏈是外源提供的，目的多核苷酸可以編碼輕鏈，或其可以編碼兩種鏈。編碼IL-12的多核苷酸生成單一 RNA，其包含兩個由內(nèi)部核糖體進入位點隔開的開放閱讀框，內(nèi)部核糖體進入位點使來自每個開放閱讀框的每條鏈表達。優(yōu)選地，編碼IL-12的多核苷酸包含編碼融合蛋白的單一開放閱讀框，融合蛋白包含通過連接子相互結(jié)合的輕鏈和重鏈，如W09624676 中和Lieschke G. J.等所述(Nat Biotechnol. 1997，15:35-40)。在優(yōu)選實施方案中，編碼單鏈IL-12的多核苷酸包含序列SEQ ID NO :8。
本發(fā)明使用的術(shù)語“同功能變體”是指與IL-12序列相差一個或多個插入、缺失或取代的多肽，但其實質(zhì)上保持IL-12的生物活性。適合用于本發(fā)明的IL-12的同功能變體與所述細胞因子的序列同一性為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的計算機算法和方法測定變體和免疫刺激細胞因子的同源度。優(yōu)選地使用BLASTP算法測定兩個氨基酸序列的同一性[BLASTManual，Altschul, S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S.,等，J Mol Biol, 215:403-410 (1990)]?？杀O(jiān)測IL-12的功能以確定給定多肽是否是IL-12的變體，所述功能包括，但不限于，Thl細胞中分化未成熟T細胞，刺激T細胞的生長和功能，通過NK (自然殺傷)細胞合成IFN-Y和 TNF-α，減少IL-4-介導(dǎo)的IFN-Y抑制作用，增加NK細胞和⑶8+淋巴細胞的細胞毒活性， 刺激IL-12受體的β I和β 2鏈的表達及抗血管生成活性。優(yōu)選地,通過測量增加抗腫瘤免疫力的能力以測定變體的IL-12活性，例如，通過如Zabala，M.等，2007所述的試驗[J Hepatology, vol. 47(6):807-815]。本發(fā)明的載體、病毒基因組及病毒粒子
本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以分離的形式呈現(xiàn)。然而，為了促進其操縱和增殖，有利的是將構(gòu)建體納入載體中。因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明基因構(gòu)建體的載體。本發(fā)明使用的術(shù)語“載體”是指多核苷酸或DNA分子被操縱或?qū)爰毎鶓{借的媒介。載體可以是線狀或環(huán)狀多核苷酸，或其可以是較大尺寸的多核苷酸或任何其它類型結(jié)構(gòu)，諸如來自病毒基因組、病毒粒子或任何其它可以操縱DNA或?qū)⑵鋵?dǎo)入細胞的生物構(gòu)建體的DNA或RNA。據(jù)了解，術(shù)語“重組載體”和“重組系統(tǒng)”可以與術(shù)語“載體”互換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會注意到對于可使用的載體類型沒有限制，因此所述載體可以是適于增殖的克隆載體并獲得足夠的多核苷酸或在不同異源生物體中適于共軛物純化的基因構(gòu)建體或表達載體。因此，根據(jù)本發(fā)明的合適載體包括原核生物中的表達載體，諸如pUC18、pUC19、 Bluescript 及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4、噬菌體及“穿梭”載體，諸如PSA3和pAT28，酵母中的表達載體，諸如2 μ m質(zhì)粒型載體、整合質(zhì)粒、YEP載體、著絲粒質(zhì)粒及其相似物，昆蟲細胞中的表達載體，諸如PAC和pVL系列中的載體，植物中的載體，諸如來自 pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE 系列及其相似物的載體，及基于病毒載體(腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒及逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和慢病毒載體)與非病毒載體的真核細胞中的表達載體，所述非病毒載體諸如pSilencer 4. I-CMV(Ambion)、 pcDNA3、pcDNA3. 1/hyg、pHCMV/Zeo、pCR3. I、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、 pTRACER-HCMV、pUB6/V5_His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL 和 pKSV-10、pBPV-1、pML2d 和 pTDTl。本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染易于被所述載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細胞。 所述細胞可以是原核細胞或真核細胞。舉例來說，將DNA序列導(dǎo)入其中的載體可以是質(zhì)?；蜉d體，當其導(dǎo)入宿主細胞中，其被整合到所述細胞基因組并與整合為一體的染色體共同復(fù)制。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得所述載體(Sambrook等，2001，如上所述)。因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、基因構(gòu)建體或載體的細胞； 為此，所述細胞由本發(fā)明提供的構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細胞(Sambrook等，2001，如上所述)。在特定實施方案中，所述宿主細胞是由合適的載體轉(zhuǎn)染或感染的動物細胞。 適用于本發(fā)明的共軛物表達的宿主細胞包括，但不限于，哺乳動物、植物、昆蟲、真菌和細菌的細胞。細菌細胞包括，但不限于，革蘭氏陽性菌細胞，諸如芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的菌種，革蘭氏陰性菌細胞，諸如埃希氏菌屬和假單胞菌屬的細胞。真菌細胞優(yōu)選地包括酵母菌細胞，諸如酵母屬、畢赤酵母和漢遜酵母。昆蟲細胞包括但不限于，果蠅細胞和Sf9細胞。植物細胞包括，其中包括，栽培植物細胞，諸如谷物，藥用植物，觀賞植物或鱗莖。適用于本發(fā)明的哺乳動物細胞包括上皮細胞系(豬的，等等)、骨肉瘤細胞系(人的，等等)、神經(jīng)母細胞瘤細胞系(人的，等等)、上皮細胞癌(人的，等等)、膠質(zhì)細胞(鼠的， 等等)、肝細胞系(猴子的，等等)、CHO(中國倉鼠卵巢)細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa, 911、AT1080、A549、293 或 PER. C6 細胞、人 NTERA-2ECC 細胞、mESC 系的 D3 細胞、人類胚胎干細胞，諸如 HS293 和 BGVOU SHEFU SHEF2 和 HS181、NIH3T3、 293T、REH 和 MCF-7 細胞，及 hMSC細胞?？商娲?，本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以是重組病毒基因組的一部分。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的基因構(gòu)建體的重組病毒基因組。本發(fā)明使用的術(shù)語“病毒基因組”，是指病毒的遺傳補體，無論是否完整或以這樣的方式操縱，去除非必要元件且保留必要元件，從而保持將目的核苷酸序列感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)及導(dǎo)入靶細胞的足夠功能性。在優(yōu)選的實施方案中，包含本發(fā)明構(gòu)建體的病毒基因組是重組腺相關(guān)病毒的基因組。如本文所使用的術(shù)語“腺相關(guān)病毒”(AVV)包括AAV的任何血清型。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上顯著同源性的基因組序列，提供了相同系列的遺傳功能， 產(chǎn)生物理和功能上本質(zhì)上相同的病毒粒子，且通過幾乎相同的機制復(fù)制并組裝。特別地， 可使用 AAV 血清型 I (AAVl)、AAV2、AAV3 (包括 3A 型和 3B 型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAVlO、AAV11、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、羊AAV，及任何其它目前已知或可能在未來發(fā)現(xiàn)的AAV進行本發(fā)明。參見，例如，F(xiàn)ields等，Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed.，Lippincott-Raven Publishers)。近期，已確定許多由AAV克隆的公認的新血清型(參見例如，Gao 等，(2004) J. Virology 78:6381-6388;Moris 等，(2004) Virology 33:375-383)。幾種AAV血清型和自主性細小病毒的基因組序列，以及反向末端重復(fù)序列(ITR)、Rep蛋白與衣殼亞基序列在本領(lǐng)域是已知的。可在文獻或公共數(shù)據(jù)庫諸如 GenBank 中找到這些序列。參見例如，GenBank 登錄號 NC_002077、NC_001401、NC_001729、 NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、 NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、 X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、 AF513852、AY530579 ;這些信息通過引用納入本文中以用于研究細小病毒和AAV的核酸序列和氨基酸序列。還參見，例如，Srivistava 等(1983), J. Virology 45:555; Chiorini 等 (1998).J. Virology 71:6823 ;Chiorini 等(1999), J. Virology 73:1309;Bantel-Schaal 等(1999)，J. Virology 73:939 ;Xiao 等(1999)，J. Virology 73:3994 ；Muramatsu 等 (1996),Virology 221:208 ; Shade 等(1986)，J. Virol. 58:921 ;Gao 等(2002). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854 ;Moris 等(2004), Virology 33: 375-383 ;國際專利
發(fā)明者格洛麗亞·岡薩雷斯阿塞古伊諾拉薩, 赫蘇斯瑪麗亞·普列托巴爾圖埃納, 露西婭瑪麗亞·班雷利馬霍 申請人:西馬生物醫(yī)學(xué)計劃公司