草莓生長素合成限速酶FaYUC11基因及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術，公開了一種草莓生長素合成限速酶基因FaYUC11及用于調(diào)節(jié)果實大小的應用，提供了這個基因的核酸序列以及蛋白序列。FaYUC11用于調(diào)節(jié)果實大小的方法包括：構建FaYUC11基因的病毒誘導沉默載體；將沉默載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并用微注射方法感染草莓幼綠果，建立病毒誘導FaYUC11基因沉默的轉(zhuǎn)基因草莓株系。該基因沉默可以導致果實瘦果(種子)中游離生長素含量下降，果實縱橫徑增長率降低，同時，影響了果實硬度和可溶性固形物含量。此基因在草莓果實大小調(diào)控方面具有很好的應用前景，對于功能性SNP分子標記的開發(fā)和優(yōu)質(zhì)大果草莓的選育具有重要意義。
【專利說明】草莓生長素合成限速酶FaYUC11基因及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物【技術領域】，具體涉及八倍體草莓生長素限速酶FaYUCll基因 及應用，以及用上述基因調(diào)控草莓果實大小的方法。

【背景技術】
[0002] 草莓（FragariaXananassa)屬薔薇科草莓屬植物，是重要的鮮食水果作物之一， 也是薔薇科植物重要的功能基因研究的模式物種，其果實發(fā)育相關的遺傳和分子生物學研 究越來越受到關注。其中，植物激素的調(diào)控對于果實發(fā)育和品質(zhì)形成至為關鍵。
[0003] 草莓果實屬"假果"，由花托發(fā)育而來，植物學意義的果實是點綴其表面的種子，后 者又稱為瘦果。早在上個世紀中期，Nitsch就研究發(fā)現(xiàn)草莓花托的生長發(fā)育受激素的調(diào)控， 主要是瘦果中合成的生長素起著重要作用（Nitschl955)。授粉后若去掉草莓花托上的全部 瘦果，花托就會停止生長；而去掉花托上的部分種子，則僅含有瘦果的那部分花托發(fā)育，最 后會長成畸形的果實。但是，如果去掉花托上所有的種子，再用人工合成生長素 NAA涂在花 托上，最后能生長發(fā)育成正常的果實。
[0004] 生長素是植物中最早發(fā)現(xiàn)的一類激素，至今已有近80年（Thimann and Koepfli 等1935)。目前知道生長素幾乎參與了植物生命的每一個方面的調(diào)控，包括多種組織器官的 發(fā)育和形態(tài)建成以及對環(huán)境的響應。吲哚乙酸IAA是植物中的主要生長素，其合成途徑可 能因物種、器官類型、發(fā)育階段或環(huán)境條件而有差異。近來研究表明，依賴于色氨酸的吲哚 丙酮酸途徑（IPyA pathway of IAA biosynthesis)是多種植物中的主要生長素合成途徑。 草莓中的研究也表明，IPyA途徑生長素合成對草莓生長發(fā)育至關重要（Liu等2014)。
[0005] 僅包括兩步反應的IPyA途徑又稱為TAA/YUC途徑：色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶TAA/TAR催 化下由色氨酸產(chǎn)生卩引哚丙酮酸（indole-3-pyruvic acid，IPyA),之后YUC家族黃素單加氧 酶將 IPyA 轉(zhuǎn)變?yōu)?IAA (Mashiguchi 等 2011 ;Abu_Zaitoon 等 2012 ;Stepanova 等 2011)。趙 云德等2001最早報道了從擬南芥中鑒定出YUC，為色氨酸依賴生長素合成限速步驟的關鍵 酶。近年來，在包括擬南芥、水稻、玉米、矮牽牛、番茄和草莓等多種植物中發(fā)現(xiàn)來自TAA/YUC 途徑的生長素對植物生長發(fā)育很重要。這些研究支持一個論點，YUC在植物中廣泛存在、高 度保守，經(jīng)由YUC催化合成生長素可能是植物中生長素的主要來源。
[0006] 病毒誘導基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS)是一種操作簡單、快 速便捷的基因功能鑒定方法。將帶有目的基因片段的病毒載體侵染植物，植物細胞會自發(fā) 識別入侵病毒的威脅，然后利用自身的防衛(wèi)機制來抵御并且摧毀病毒和病毒載體上的目的 基因，從而引起目的基因在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生降解甚至是消除（Lange等2013 Jurkayastha 和Dasgupta2009)。多種植物中都有VIGS基因沉默體系用于研究相應基因功能的成功報 道，特別是有針對性的研究植物繁殖器官中的特異基因，從而理解植物果實的發(fā)育與品質(zhì) 形成機理。廣為運用的VIGS沉默載體是雙鏈RNA病毒-煙草脆裂病毒（TRV) (Liu等2002)， 草莓中已成功應用（Jia等2011)。
[0007] 果樹作物的傳統(tǒng)雜交育種周期漫長。分子標記輔助選擇技術可顯著縮短育種周 期，提高育種效率。當前，分子標記輔助育種對于加速果樹傳統(tǒng)雜交育種選育進程的重要性 越來越突顯。新型分子標記中的功能性分子標記（functional markers，F(xiàn)Ms)，以與表型相 關的功能基因基序中的功能性單核苷酸多態(tài)性位點（SNP)為基礎而開發(fā)出，其優(yōu)勢在于來 自控制表型的序列模體，與目標基因緊密連鎖，可以在多種不同遺傳背景下直接應用，能更 有效準確地篩選和追蹤已知基因。積極鑒定農(nóng)藝性狀相關基因功能，可為功能標記的開發(fā) 和分子育種工作提供重要材料和手段。
[0008] 我國的草莓生產(chǎn)在總面積和總產(chǎn)量上稱得上"草莓大國"，但與"世界草莓強國"美 國、西班牙等相比仍存在一定差距，自育優(yōu)質(zhì)大果草莓品種占世界草莓良種的比例很低，且 平均單產(chǎn)顯著較低。揭示草莓果實大小調(diào)控分子機制，對于果實大小、重量等相關功能標記 開發(fā)和輔助選育適合我國栽培環(huán)境和消費習慣的大果草莓新種質(zhì)，具有重要意義。
[0009] 參考文獻：
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【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0020] 本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)節(jié)草莓果實膨大的生長素合成限速酶FaYUCll基 因及其應用。
[0021] 技術方案為，一種草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因，含有如SEQ ID No. 1所示 的核苷酸序列。優(yōu)選的，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0022] 這種基因來源于八倍體草莓，編碼生長素的吲哚丙酮酸合成途徑（IPyA pathway of IAA biosynthesis)中的限速酶-YUCCA類黃素單加氧酶（FMO)，含有如SEQ ID No. 2所 示的氨基酸序列。優(yōu)選的，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0023] 上述的基因可用于調(diào)控草莓果實中的吲哚乙酸（IAA)含量和果實大小，該基因的 沉默不但可以導致草莓果實中游離IAA含量下降，還使草莓果實膨大受到抑制。
[0024] 本發(fā)明利用RT_PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)和病毒誘導基因沉默VIGS (Virus-induced gene silencing)技術從八倍體草莓中克隆并鑒定了一種新的草莓果實大小調(diào)控基因 FaYUCll， 該基因編碼生長素的B引哚丙酮酸合成途徑（IPyA pathway of IAA biosynthesis)中的限 速酶-YUCCA類黃素單加氧酶（FMO)。該基因的沉默不但可以導致草莓果實中游離IAA含量 下降，還使草莓果實膨大受到抑制。本發(fā)明提供這個基因的核酸序列以及蛋白序列，同時還 涉及該基因在草莓果實大小調(diào)控中的用途。
[0025] 根據(jù)前述的應用，將草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因的非保守區(qū)域構建到 PTRV2載體的2X35S啟動子的下游，形成內(nèi)含子（Intron)隔開的雙向發(fā)夾結構，通過微注 射法轉(zhuǎn)化草莓，并鑒定轉(zhuǎn)基因草莓。FaYUCll基因沉默后，草莓果實膨大被抑制并且草莓果 實中游離IAA含量下降。
[0026] 使草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因沉默的方法，是構建沉默表達載體，并與 農(nóng)桿菌混合后侵染草莓。具體步驟為：根據(jù)草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因的CDS序 列設計PCR擴增引物對，如SEQ ID No. 3和No. 4所示。
[0027] 其全長正向引物 OF 為：5 ' -AAAATGGAGAACAATGTGTTTGGGA-3 ' ；
[0028] 反向引物 OR : 5，-GGACTAGACCTCTCTTGCAGCAT-3，。
[0029] 以八倍體"久香"草莓瘦果cDNA為模版，利用上述引物，通過PCR擴增獲得FaYUCll 基因全序列；將PCR產(chǎn)物克隆至pUCm-T載體上，經(jīng)測序正確。
[0030] 根據(jù)草莓YUC全家族序列比對結果，選擇FaYUCll基因特異區(qū)域，設計擴增出 253bp的基因特異引物對，如SEQ ID No. 5和No. 6所示。
[0031] 正向引物 RiF: 5 ' -TTCTGCTCTCTGCCGATGAT-3 ' ；
[0032] 反向引物 RiR :5，-CTCCAGTCGCAATTACCAAG-3，。
[0033] 以前面所獲得全長基因的T質(zhì)粒為模版，利用RiF和RiR引物對，通過PCR擴增 獲得FaYUCll基因的253bp片段，利用體外重組方法分兩步克隆進pBSK-in載體（Duan等 2008)的Intron兩端，形成了帶有2個FaYUCll基因片段的重組質(zhì)粒pBSK-in-dYUCll，其 中2個YUCll基因片段方向相反，且中間為一個內(nèi)含子Intron隔開。具體為：該基因片段 首先克隆到PUCm-T載體上，再將含有該FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒經(jīng)PstI和BamHI 雙酶切，通過體外重組將基因片段轉(zhuǎn)移進入用相同組合酶切的PUCm-T質(zhì)粒上；再次用PstI 和Sail酶切含有FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒，將切下的基因片段通過體外重組轉(zhuǎn)移 進入用NsiI和Sail線性化的已含有一個FaYUCll基因片段的pBSK-in載體。
[0034] 進一步用KpnI酶和SacI酶雙酶切pBSK-in-dYUCll重組質(zhì)粒，將FaYUCll基因片 段的雙向發(fā)夾結構克隆至煙草脆裂病毒PTRV2 (Liu等2002)的2 X 35S啟動子后病毒CP蛋 白的下游，獲得pTRV2-dYUCl 1重組載體即沉默載體。混合含有煙草脆裂病毒的RNAl和RNA2 的農(nóng)桿菌，采用農(nóng)桿菌微注射法處理草莓小綠果，經(jīng)過連續(xù)拍照觀察，結合TRV病毒RNA1/2 特異引物和FaYUCll的RT-PCR檢測篩選，最終獲得病毒誘導FaYUCll沉默的草莓果實。
[0035] 本發(fā)明首次利用病毒誘導基因沉默方法，構建FaYUCll的煙草脆裂病毒沉默載 體，并利用微注射方法轉(zhuǎn)化到草莓，改變果實生長發(fā)育，從而影響草莓產(chǎn)量和品質(zhì)。對于詳 細闡明草莓果實膨大的激素調(diào)控機理具有重要的理論價值，并且可以通過對該基因及其等 位基因的單核苷酸多態(tài)性研究為基礎，開發(fā)出果實大小相關的功能性分子標記，在草莓分 子育種和大果優(yōu)質(zhì)草莓選育中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為本發(fā)明實施例1中所構建目標基因的病毒誘導沉默載體（pTRV2_dYUCll載 體）圖譜。
[0037] 圖2為本發(fā)明實施例3中病毒陽性株系的RT-PCR鑒定結果。采用TRV2特異引物 對進行PCR擴增后電泳檢測，其中泳道1為八倍體草莓"久香"的果實，泳道2為CKl不含 目標基因片段的TRV農(nóng)桿菌注射的久香果實，泳道3為RiYUCll目標基因沉默載體農(nóng)桿菌 注射的久香果實。
[0038] 圖3為本發(fā)明實施例3中FaYUCll基因沉默的qRT-PCR鑒定結果，為草莓生長素 合成基因 FaYUCll在對照（CKl)久香草莓及2個病毒誘導基因沉默株系中的表達。縱坐標 為real-time PCR(實時熒光定量PCR)檢測該基因在對照CKl或病毒誘導基因沉默株系中 的相對表達量（相對于未注射病毒沉默載體的野生型）。
[0039] 圖4為本發(fā)明實施例4中病毒誘導基因沉默后果實表型分析，為對照（CK1，不含目 標基因插入的病毒空載體轉(zhuǎn)化）和2個病毒誘導基因沉默株系（RiYUCl 1-2和RiYUCl 1-3) 果實處理34天后的形態(tài)。與對照相比，病毒誘導基因沉默果實膨大明顯受抑制，而對照果 實膨大正常。
[0040] 圖5為本發(fā)明實施例4中病毒誘導基因沉默株系與對照草莓瘦果中自由IAA的含 量差異?？v坐標顯示通過GC-MS方法所測定的草莓瘦果中的IAA含量。
[0041] 圖6為本發(fā)明實施例4中病毒誘導沉默株系和對照的果實縱、橫徑增長比例的差 異?？v坐標顯示微注射前后縱、橫徑變化相比于注射前的比值。

【具體實施方式】
[0042] 以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的應用范圍。
[0043] 實施例IFaYUCll基因的分離和病毒誘導基因沉默載體構建
[0044] 根據(jù)二倍體森林草莓YUC全家族基因序列信息（Liu等2014)，在八倍體栽培草莓 果實（分花托和瘦果）中解析全家族基因基因的動態(tài)表達模式。結果發(fā)現(xiàn)FaYUCll是該家 族唯一在瘦果中高表達成員，且其動態(tài)表達模式和瘦果中生長素積累動態(tài)模式一致。
[0045] 根據(jù)森林草莓同源基因的序列設計PCR擴增引物，正向引物OF :
[0046] 5，-AAAATGGAGAACAATGTGITTGGGA-3，；反向引物 OR :
[0047] 5' -GGACTAGACCTCTCTTGCAGCAT-3'，分別如 SEQ ID No. 3 和 4 所示。
[0048] 以野生型久香草莓果實cDNA為模版，采用全式金高保真酶（來自北京TransGene 公司）用上述擴增引物進行PCR擴增，獲得FaYUCll全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，其所編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0049] 按照TranStart聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR反應。將PCR產(chǎn)物連接克隆 到pUCm-Τ載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列，如SEQ ID No. 1。
[0050] 之后，再根據(jù)久香草莓YUC全家族成員的序列比對結果，選取靠5'端的基因 特異區(qū)域，設計了干涉引物對，正向引物：5' -TTCTGCTCTCTGCCGATGAT-3'和反向引物： 5' -CTCCAGTCGCAATTACCAAG-3'，分別如 SEQ ID No. 5 和 6 所示。
[0051] 以所獲得全長基因質(zhì)粒為模版，利用上述所設計干涉引物對，PCR擴增獲得了 253bp的基因片段。該基因片段首先克隆到pUCm-T載體上，然后再經(jīng)過兩次體外重組轉(zhuǎn)移 到pBSK-in載體的intron序列兩端，最后經(jīng)KpnI和SacI雙酶切點整合進病毒RNA2質(zhì)粒 PTRV2中，得到pTRV2-dYUCll病毒誘導基因沉默載體。載體圖譜見圖1。
[0052] 其中，中間載體pBSK-in-dYUCll的構建過程為：首先將含有FaYUCll基因片段 (253bp)的pUCm-T質(zhì)粒經(jīng)PstI和BamHI雙酶切，通過體外重組將基因片段轉(zhuǎn)移進入用相同 組合酶切的pUCm-Τ質(zhì)粒（上海生工生物工程有限公司）上。之后，再次用PstI和Sail酶 切含有FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒，將切下的基因片段通過體外重組轉(zhuǎn)移進入用NsiI 和Sail線性化的已含有一個目標基因片段的pBSK-in載體，就得到了含有2個FaYUCll基 因片段的重組質(zhì)粒pBSK-in-dYUCll，其中2個YUCll基因片段方向相反，且中間被一個內(nèi)含 子（Intron)隔開。
[0053] 實施例2病毒誘導基因沉默草莓的獲得
[0054] 進一步用KpnI酶和SacI酶雙酶切pBSK-in-dYUCll重組質(zhì)粒，將FaYUCll基因片 段的雙向發(fā)夾結構克隆至煙草脆裂病毒PTRV2 (Liu等2002)的2 X 35S啟動子后病毒CP蛋 白的下游，獲得pTRV2-dYUCll重組載體。混合含有煙草脆裂病毒的RNAl和RNA2的農(nóng)桿菌。
[0055] 將含有目標基因病毒誘導沉默表達載體以及空pTRVl和pTRV2載體的GV3101農(nóng) 桿菌接種于含50yg/mL Kan、10yg/mL Rif和50yg/mL Gen的5mL YEP培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng) 過夜，次日按照1 :50的比例接種于誘導培養(yǎng)基（YEP，含有10mM/L MES、20yM/L AS、50yg/ 11^1^11、1(^8/11^1^€和5(^8/11^6611)中，281：搖菌至對數(shù)期（00值0.6-0.8)，50001·/!^!! 離心IOmin收集菌體，再用侵染緩沖液（含有10mM/L MES、100yM/L AS、10mM/L MgCl2)重 懸菌體，并調(diào)節(jié)菌液濃度至〇D值為I. 2-1. 5間，28°C放置3h后用于接種草莓果實（以智 能人工溫室中的"久香"草莓小綠果為材料）。然后將含有PTRVl的GV3101菌液與含有 pTRV2-dYUCll的GV3101菌液按1:1體積混勻，使用微注射方法將混合的菌液，從果實頂部 注入，控制環(huán)境溫度在25-28°C，保證病毒有效侵染。
[0056] 實施例3病毒誘導基因沉默草莓的鑒定
[0057] 為了檢測煙草脆裂病毒是否成功侵染草莓，分別提取野生型和注射病毒原始載體 以及重組的FaYUCll的病毒誘導沉默載體的草莓果實總RNA，利用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄合 成 cDNA。
[0058] 按照Jia等2011文獻提供煙草脆裂病毒RNA2的特異引物進行RT-PCR反應，來鑒 定病毒侵染的草莓果實。對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，結果發(fā)現(xiàn)，病毒原始載體和FaYUCll的 重組病毒載體侵染的草莓果實能擴增出病毒特異條帶（如圖2)，而野生型草莓中無此目的 條帶。初步確定，煙草脆裂病毒已通過微注射方法侵染了草莓果實。
[0059] 進一步地，在所選構建病毒沉默載體的片段下游，設計FaYUCll新的特異引物對。 正向引物：5' -GGAAAGGTGAAAAGGGCGT-3' ；反向引物：
[0060] 5' -GACCTCTCTTGCAGCATTAC-3，。
[0061] 通過RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平鑒定病毒誘導基因沉默的效果。取兩個用重組病毒誘導 的FaYUCll基因沉默株系進行驗證，分別用RiYUCl 1-2和RiYUCl 1-3表示。
[0062] 結果表明，相比于注射含原始病毒質(zhì)粒農(nóng)桿菌的果實，部分微注射含F(xiàn)aYUCll重 組的病毒誘導沉默質(zhì)粒農(nóng)桿菌的果實中發(fā)生了 FaYUCll的不同程度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累水平下 降，如圖3。
[0063] 實施例4病毒誘導基因沉默草莓表型分析
[0064] 將原始病毒侵染草莓果實和野生型同發(fā)育時期的草莓果實相比較，發(fā)現(xiàn)含原始 TRV病毒的農(nóng)桿菌注射后果實頂部有輕微凹陷，此外果實膨大和基本形態(tài)未受到明顯影響。 進一步的表型分析發(fā)現(xiàn)，注射重組病毒載體農(nóng)桿菌的草莓果實膨大受到抑制，部分果實經(jīng) 過一個月的生長幾乎沒有變大，仍然處于小綠果階段，另外有部分果實膨大所受的抑制要 輕微些，如圖4。
[0065] 通過GC-MS方法測定草莓果實種子（瘦果）中的IAA，可以明顯看出病毒誘導 FaYUCll沉默的草莓果實不僅膨大受到抑制，生長素含量也明顯下降，如圖5。進一步通過 果實縱橫徑測定，與微注射含病毒農(nóng)桿菌之前的果實大小數(shù)據(jù)相比較，可以明顯看出重組 FaYUCll的病毒誘導沉默載體注射的草莓果實比原始病毒載體注射果實的縱橫徑增長比例 小，如圖6。
[0066] 結果證明，該基因沉默可以導致果實瘦果（種子）中游離生長素含量下降，果實縱 橫徑增長率降低，同時，影響了果實硬度和可溶性固形物含量。此基因在草莓果實大小調(diào)控 方面具有很好的應用前景，對于功能性SNP分子標記的開發(fā)和優(yōu)質(zhì)大果草莓的選育具有重 要意義。
[0067] 雖然，以上已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本 發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此， 在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所作的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權利要求】
1. 草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因，其特征在于，含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸 序列。
2. 草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 /_J、i 〇
3. 權利要求1或2所述草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因在調(diào)控果實大小方面的應 用。
4. 權利要求1或2所述草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因用于調(diào)控果實中吲哚乙酸 的含量。
5. -種草莓生植物合成限速酶，其特征在于，含有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
6. 權利要求5所述草莓生植物合成限速酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所 /_J、i 〇
7. 權利要求5所述草莓生植物合成限速酶，其特征在于，由權利要求1或2所述基因編 碼。
8. 權利要求1或所述草莓生長素合成限速酶FaYUCll基因沉默的方法，其特征在于，構 建沉默表達載體，并與農(nóng)桿菌混合后侵染草莓。
9. 權利要求8所述草莓生長素合成限速酶FaYUCl 1基因沉默的方法，其特征在于，所述 沉默表達載體的構建方法為： 以SEQ ID No. 5和No. 6的序列為引物，F(xiàn)aYUCll基因全長序列為模板，獲得253bp的 FaYUCll基因片段； 該基因片段首先克隆到pUCm-T載體上，再將含有該FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒 經(jīng)PstI和BamHI雙酶切，通過體外重組將基因片段轉(zhuǎn)移進入用相同組合酶切的pUCm-T質(zhì) 粒上； 再次用PstI和Sail酶切含有FaYUCll基因片段的pUCm-T質(zhì)粒，將切下的基因片段通 過體外重組轉(zhuǎn)移進入用Nsil和Sail線性化的已含有一個FaYUCll基因片段的pBSK-in載 體，得到含有2個FaYUC 11基因片段的重組質(zhì)粒pBSK-in-dYUC 11，其中2個YUC11基因片段 方向相反，且中間為一個內(nèi)含子隔開； 進一步用Kpnl酶和SacI酶雙酶切pBSK-in-dYUCll重組質(zhì)粒，將FaYUCll基因片段 的雙向發(fā)夾結構克隆至煙草脆裂病毒PTRV2的2X35S啟動子后病毒CP蛋白的下游，獲得 pTRV2-dYUCll重組載體，即為沉默表達載體。
【文檔編號】C12N15/66GK104388443SQ201410663152
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權日:2014年11月19日
【發(fā)明者】段可, 謝為發(fā), 高清華, 張玲 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院