專利名稱：一種克服靶細(xì)菌限制修飾障礙導(dǎo)入外源dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種克服靶細(xì)菌限制修飾障礙導(dǎo)入外源DNA的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)由限制性內(nèi)切酶(限制酶)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶組成，前者能夠特異性識別并切割DNA，后者能夠向DNA的堿基添加一個甲基修飾，從而防止限制酶對DNA的切割。限制修飾系統(tǒng)能夠選擇性的降解侵入細(xì)菌內(nèi)部的外源DNA，實現(xiàn)細(xì)菌自我保護(hù)的目的。根據(jù)限制修飾系統(tǒng)的亞基組成、切割位點、序列特異性與輔因子特征，將其劃分為四大類型。I型、II型和III型限制修飾系統(tǒng)的限制酶亞基能夠識別并切割未甲基化的DNA，但如果DNA首先被甲基轉(zhuǎn)移酶亞基識別并修飾后，限制酶即不能完成切割。IV型限制修飾 系統(tǒng)只有限制酶組成，不含甲基轉(zhuǎn)移酶，它識別并切割具有外源甲基化模式的DNA，因此，是一種甲基化依賴的限制酶。另外，最近研究表明DNA骨架的磷硫酰修飾酶及其對應(yīng)的限制酶是一類新型的限制修飾系統(tǒng)(Nucleic Acids Research, 38, 7133-7141)。這種復(fù)雜的修飾-切割模式，極大的保護(hù)了細(xì)菌自身DNA的安全性，是細(xì)菌作為有效防止噬菌體、環(huán)境中死細(xì)菌釋放的DNA等外源DNA入侵的主要手段。同時，這也成為現(xiàn)今利用分子生物學(xué)手段將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌、實現(xiàn)遺傳操作的主要障礙。含有多套限制修飾系統(tǒng)細(xì)菌的遺傳操作尤為困難。迄今為止研究人員發(fā)明了兩類技術(shù)克服限制修飾障礙。第一類策略即修飾外源DNA的策略，包括體外修飾和大腸桿菌體內(nèi)修飾。如利用靶細(xì)菌粗蛋白抽提物(含有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)體外修飾外源DNA，能夠?qū)崿F(xiàn)對幽門螺桿菌、蠟樣芽胞桿菌和韋氏芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化(MolecularMicrobiology,37,1066-1074,Applied and Environmental Microbiology,74,7817-7820);或在大腸桿菌中克隆表達(dá)靶細(xì)菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，體內(nèi)修飾外源質(zhì)粒DNA，如在大腸桿菌TOPlO中克隆表達(dá)青春棒桿菌的兩個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)行穿梭質(zhì)粒的體內(nèi)修飾，實現(xiàn)了青春棒桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化(Nucleic Acids Research, 37, e3)。第二類方法即滅活限制修飾系統(tǒng)的方法，包括利用物理手段滅活和基因敲除。利用轉(zhuǎn)化后加熱的方法暫時性滅活靶細(xì)菌限制酶，外源質(zhì)粒對谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)化率提高至IO8CFUz^g DNA (MicrobialBiotechnology, 52, 541-545);敲除丙酮丁醇梭菌CAC1502基因后可以使其接受非甲基化質(zhì)粒DNA(PLoS 0NE,5,e9038);但也有報道表明敲除SauI限制性內(nèi)切酶不足以使金黃色葡萄球菌接受外源 DNA (Applied and Environmental Microbiology, 75, 3034-3038)。雖然上述技術(shù)可以在一定程度上提高外源DNA對靶細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率，但是還存在以下問題和不足之處部分方案雖然能夠利用靶細(xì)菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在體外修飾外源DNA分子，但利用粗蛋白抽提物的體外修飾效率較低，且在修飾的同時限制酶也會降解部分質(zhì)粒；體內(nèi)修飾方案未解除大腸桿菌自身DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對外源DNA分子的甲基化，這種帶有大腸桿菌甲基化模式的DNA易激活靶細(xì)菌的III型限制系統(tǒng)；許多細(xì)菌的限制酶為非熱敏感性，不能利用加熱手段暫時滅活；如果細(xì)菌含有多套限制修飾系統(tǒng)時，逐個敲除限制酶基因費時費力，同時敲除限制酶還造成靶細(xì)菌易受噬菌體感染，對工業(yè)微生物發(fā)酵菌種的構(gòu)建極為不利；技術(shù)的通用性不強(qiáng)，可能僅適用于一種或少數(shù)幾種細(xì)菌

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種將外源DNA分子導(dǎo)入靶細(xì)菌的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)將靶細(xì)菌基因組中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因在自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌中共表達(dá)，得到重組菌A ；2)將外源DNA分子導(dǎo)入所述重組菌A進(jìn)行體內(nèi)修飾，得到甲基化修飾的外源DNA分子;
3)將所述甲基化修飾的外源DNA分子導(dǎo)入所述靶細(xì)菌中。上述方法中，步驟I)中，所述將靶細(xì)菌基因組中所有的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因在自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌中共表達(dá)為將所述靶細(xì)菌基因組中所有的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因通過重組載體導(dǎo)入所述自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌內(nèi)；步驟2)包括如下步驟A)將所述外源DNA分子導(dǎo)入所述重組菌A中，得到重組菌B ;B)誘導(dǎo)培養(yǎng)所述重組菌B，得到誘導(dǎo)后重組菌B ；C)提取所述誘導(dǎo)后重組菌B的DNA，即得到甲基化修飾的外源DNA分子。上述方法中，步驟I)中，所述重組載體為將所述所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因均插入pWYE724質(zhì)粒中，得到共表達(dá)所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的重組載體；上述重組載體中的每個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因可以使用各自的啟動子或共用一個啟動子(構(gòu)成操縱子的結(jié)構(gòu))。步驟2)的B)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的誘導(dǎo)劑為阿拉伯糖。上述方法中，步驟2)的B)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為將所述重組菌B在含有終濃度為0.2% (質(zhì)量百分含量)的阿拉伯糖的液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為25°C _37°C，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為3-24小時；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度具體為30°C，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間具體為12小時。上述方法中，所述靶細(xì)菌為含有限制修飾系統(tǒng)的真細(xì)菌或古生菌，所述含有限制修飾系統(tǒng)的真細(xì)菌或古生菌具體為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208、臘樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987 或漢氏硝化細(xì)菌(Nitrobacterhamburgensis)X14 ；所述自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌具體為大腸桿菌(Escherichiacoli)EC135CGMCCN0. 5925 ;其限制修飾系統(tǒng)基因型為 mcrAA (mrr-hsdRMS-mcrBC)Δdcm::FRTΔdam::FRT。上述方法中，所述外源DNA 分子為 pAD123、pAD43_25、pMK3、pMK4、pHCMC02、PHCMC04、pDG148StuI、pWYE748 或 pBBRl-MCSS-P^^ 345Q-GFP。上述方法中，所述解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208中所有 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因為 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835和 BAMTA208_16660 ；所述 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和BAMTA208_16660的核苷酸序列依次為序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5 ；所述蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因為 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365 和 BCE_0392 ;所述 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392的核苷酸序列依次為序列表中的序列6、序列7、序列8、序列9、序列10和序列11 ；所述漢氏硝化細(xì)菌(Nitrobacter hamburgensis)X14中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因為 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803 和 Nham_3225 ;所述 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803和Nham_3225的核苷酸序列依次為序列表中的序列12、序列13、序列14和序列15。
在上述方法前還包括確定靶細(xì)菌基因組中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的步驟(a)通過同源序列比對等方法，預(yù)測靶細(xì)菌中編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因；(b)將預(yù)測的所有編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因分別連入可誘導(dǎo)的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌中，然后分別誘導(dǎo)培養(yǎng)。(C)分別制備上述轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的大腸桿菌的基因組DNA (包括染色體DNA與表達(dá)載體)，檢測DNA是否含已被甲基化修飾，如果確定DNA已被甲基化修飾，即證明預(yù)測的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶確實具有DNA甲基化修飾功能，并且其蛋白在大腸桿菌中具有活性。檢測方法包括高效液相色譜法和DNA點雜交方法。上述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，包括I型、II型與III型甲基轉(zhuǎn)移酶，I型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)包括甲基轉(zhuǎn)移亞基與DNA識別亞基。其中所述可誘導(dǎo)的表達(dá)載體，可以是低拷貝，也可以是高拷貝載體，但應(yīng)與轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌的穿梭/整合質(zhì)粒能夠相容。甲基轉(zhuǎn)移酶的啟動子可以是其自身的啟動子，也可以是在大腸桿菌中可誘導(dǎo)型的啟動子，包括但不局限于阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子、IPTG誘導(dǎo)型啟動子和鼠李糖誘導(dǎo)啟動子。甲基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)溫度為8°C -43°C。其中所述自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌為已知的限制酶、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶完全缺失的大腸桿菌，這些酶包括但不局限于Dam、Dcm、EcoKI> Mrr> McrA和Mrr。本發(fā)明的另一個目的是提供一株大腸桿菌(Escherichia coli)EC135。本發(fā)明提供的大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC NO. 5925。菌株EC135于2012年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5925，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。其中所述轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌的方法，因選擇的靶細(xì)菌不同而異，包括但不局限于化學(xué)轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)化法及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明與現(xiàn)有的克服細(xì)菌限制修飾障礙，實現(xiàn)遺傳操作的方法相比，優(yōu)點在于I.使用一株自身限制修飾系統(tǒng)完全缺失的大腸桿菌作為宿主，一方面克服了大腸桿菌修飾模式(Dam、Dcm和EcoKI)對靶細(xì)菌IV型限制修飾系統(tǒng)的激活作用，另一方面，大腸桿菌Mrr、McrA和McrBC的缺失有利于靶細(xì)菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的克隆表達(dá)；2.對靶細(xì)菌所有的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行共表達(dá)，真正實現(xiàn)靶細(xì)菌DNA甲基化模式的精確模擬；
3.使用的是在大腸桿菌體內(nèi)DNA甲基化修飾的方式，在培養(yǎng)細(xì)菌的過程中同時完成，無需額外的體外反應(yīng)，無需添加甲基化反應(yīng)底物，方便快捷；4.在本發(fā)明中可使用釀酒酵母組裝多個甲基轉(zhuǎn)移酶基因，共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建可在一周內(nèi)完成，加速了靶細(xì)菌限制修飾障礙克服的過程；5.利用本方法得到的靶細(xì)菌轉(zhuǎn)化子，其限制修飾系統(tǒng)與出發(fā)菌株一致。本方法不會對靶細(xì)菌原有的限制修飾系統(tǒng)造成損傷；6.本發(fā)明具有很強(qiáng)的通用性，已成功應(yīng)用于兩株芽胞桿菌，一株革蘭氏陰性、化能自養(yǎng)細(xì)菌的遺傳操作，并有望擴(kuò)展至更多的細(xì)菌種屬。本發(fā)明對于含有多套限制修飾系統(tǒng)的頑固型細(xì)菌遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建具有重要意義。


圖I為TOPlOdcm基因敲除PCR檢測結(jié)果圖2為EC135dam基因敲除PCR檢測結(jié)果圖3為解淀粉芽胞桿菌TA208DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖4為點雜交檢測解淀粉芽胞桿菌TA208DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性圖5為pWYE724質(zhì)粒圖譜圖6為EcoRV單切檢測pM. Bam電泳7為pM. Bam質(zhì)粒圖譜圖8為不同宿主制備的穿梭質(zhì)粒對解淀粉芽胞桿菌ΤΑ208的轉(zhuǎn)化效率(*未檢測到)圖9為解淀粉芽胞桿菌TA208upp基因敲除PCR驗證結(jié)果圖10為解淀粉芽胞桿菌ΤΑ208和BS043在MM、MM+5-FU培養(yǎng)基生長情況圖11為點雜交檢測蠟樣芽胞桿菌ATCC 10987DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性圖12為HindIII單切檢測pM. Bce電泳圖
圖13為pM. Bce質(zhì)粒圖譜圖14為不同宿主制備的穿梭質(zhì)粒對蠟樣芽胞桿菌ATCC 10987的轉(zhuǎn)化效率(*未檢測到)圖15為點雜交檢測漢氏硝化細(xì)菌X14DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性圖16為BamHI單切檢測pM. Nham電泳17為pM. Nham質(zhì)粒圖譜圖18為綠色熒光蛋白在漢氏硝化細(xì)菌Χ14中的表達(dá)
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例I、限制修飾系統(tǒng)完全缺失的大腸桿菌EC135的構(gòu)建
以大腸桿菌T0P10 (北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號為⑶101)為出發(fā)菌株，依次敲除dcm基因(Dcm甲基化酶編碼基因)，將染色體recA基因突變?yōu)橐吧?，敲除dam基因(Dam甲基化酶編碼基因)得到大腸桿菌EC135，具體如下制備T0P10菌株的感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒pKD46(購自美國Coli Genetic StockCenter,以下簡寫為CGSC，編號7739)轉(zhuǎn)化入T0P10菌株，30°C篩選氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子，得到 T0P10/pKD46o利用引物WB089與WB090，以pKD3質(zhì)粒(購自美國CGSC，編號7631)為模板擴(kuò)增氯霉素抗性基因，切膠回收1166bp，得到氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物。將T0P10/pKD46菌株在LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)，在OD6tltl為O. 2時加入終濃度IOOmM的阿拉伯糖誘導(dǎo)I小時，制備感受態(tài)后利用5μ L回收的氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 40 μ L感受態(tài)細(xì)胞，30°C復(fù)蘇I小時后將復(fù)蘇產(chǎn)物涂布于含有34 μ g/mL氯霉素的LB平板，37 °C培養(yǎng)過夜。挑選重組子，利用引物WB064和WB065進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性重組子PCR產(chǎn)物大小應(yīng)為1816bp，而原始基因大小為1980bp。挑取陽性重組子，在LB液體培養(yǎng)基中42°C連續(xù)培養(yǎng)三代，以消除pKD46質(zhì)粒，得到TOPlOdcm: :CmR菌株。稀釋涂布平板后挑取單菌落TOPlOdcm: : CmR菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)，將pCP20 (購自美國CGSC，編號7629)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入TOPlOdcm: : CmR菌株，篩選氨芐青霉素抗性重組子后挑單菌落在不含抗生素的LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至0D_為O. 2，然后提高溫度至42°C培養(yǎng)過夜。稀釋菌液后涂布無抗性的LB平板，挑取單菌落利用引物WB064和WB065進(jìn)行菌落PCR鑒定。氯霉素抗性基因消除的陽性重組子擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為大小應(yīng)為886bp (圖I)，將陽性重組子命名為 TOPlOAdcm: :FRT。由于dam與recA雙突變是致死基因型，因此在敲除dam基因之前要先回復(fù)突變recAl基因。利用引物WB253和WB254，以大腸桿菌W3110 (購自美國CGSC，編號4474)染色體DNA為模板擴(kuò)增野生型recA基因(1236bp),連接至載體pKOV (購自美國Addgene,貨號#25769)的 NotI 與 BamHI 位點，得到 pKOV-recA。將 pKOV-recA 轉(zhuǎn)化入 T0P10 Δ dcm: :FRT菌株，30°C篩選氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子，挑取轉(zhuǎn)化子后在42°C液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并涂布含有氯霉素的LB平板，使pKOV-recA整合至染色體recAl位點。得到單菌落后利用引物WB255和WB256進(jìn)行菌落PCR，如果有大于7Kb的PCR條帶，即說明pKOV-recA已整合至染色體。挑取正確的重組子，42°C培養(yǎng)后涂布于含有10%蔗糖的LB平板，將單菌落在含有氯霉素和不含氯霉素的LB平板上劃線同時傳代，挑選氯霉素敏感的菌落。利用引物WB255和WB256擴(kuò)增recA基因后測序，recA+重組子recA基因第482位堿基應(yīng)為G，而T0P10菌株為A。dam基因的敲除與dcm敲除步驟相同，所用的氯霉素抗性基因擴(kuò)增引物為WB087和WB088，外側(cè)檢測引物為WB062和WB063?；蚯贸髷U(kuò)增產(chǎn)物大小為740bp，原始基因大小為 1356bp(圖 2)。經(jīng)過上述三步遺傳操作，所得到的dcm dam缺失、recA回復(fù)突變的菌株即為EC135。上述提到的菌株EC135于2012年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCjia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5925，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)。
所用到的PCR弓丨物序列見表I。表I、本發(fā)明所使用的PCR弓丨物

...................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
引物名稱引物序列(5’ -3’ )
WB089CTAAATGGCTGTAATTATGTTAACCTGTCGGCCATCTCAGATGGCCGGTGAAATCTTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG
WB090ACCGGAATACGGAATTTCGCTTCTCCCGGCGCTTCAAAACCCATTAAGCGCGCGCATAACGGCTGACATGGGAATTAGC
WB064TGCTGAAGCTACCGCAAACCATG
WB065GCACTCCCAGACAATCAATACGC
WB253ATAAGAATGCGGCCGCCACTTGATACTGTATGAGCATACAG
WB254CGCGGATCCCGGGATGTTGATTCTGTCATGGCAT
WB255ATTACCCGGCGGGAATGCTTCAG
WB256TTTACGTCGCAGTTCTTGCTCAC
WB087CTGGATGCTGTCGGAGCTTTCTCCACAGCCGGAGAAGGTGTAATTAGTTAGTCAGCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG
WB088ACTTTGACGACATGCAATTTTGCGCGCTGATACCACTCACGCGTTAACATCGTATCTAACGGCTGACATGGGAATTAGC
WB062GGCCGATCTGAAGTAATCAAGGT
WB063TCCAGATAGCTCAGAGGTGTCGC
WB325ATGCCATAGCATTTTTATCC
WR475CGTAGTTTATTCATGAATTCCTCCTTCAACTATGTACTTGAGGTAATCGA
WB476TCGATTACCTCAAGTACATAGTTGAAGGAGGAATTCATGAATAAACTACG
WB477TTATTGCTGTTCATGAATTCCTCCTTTATTCAGATTCTTTATTATCGTAT
WB478ATACGATAATAAAGAATCTGAATAAAGGAGGAATTCATGAACAGCAATAA
WB479GAAAAAAAACGCATGAATTCCTCCTTTATTCTAAATCTAATAATTCATTT
WB480AAATGAATTATTAGATTTAGAATAAAGGAGGAATTCATGCGTTTTTTTTC
WB326GATTTAATCTGTATCAGGWB325
WB575ATACAGTTCATATGTCTTACCTCCTTTAATCGGCGGTATTTTGTGTAGAT
WB576ATCTACACAAAATACCGCCGATTAAAGGAGGTAAGACATATGAACTGTAT
WB577TTTAAACATATAACACTTTCCTCCTTTACGCTTCTAATGTCTCTCGAATG
WB578CATTCGAGAGACATTAGAAGCGTAAAGGAGGAAAGTGTTATATGTTTAAA

權(quán)利要求
1.一種將外源DNA分子導(dǎo)入靶細(xì)菌的方法，包括如下步驟 .1)將靶細(xì)菌基因組中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因在自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌中共表達(dá)，得到重組菌A ; .2)將外源DNA分子導(dǎo)入所述重組菌A進(jìn)行體內(nèi)修飾，得到甲基化修飾的外源DNA分子； .3)將所述甲基化修飾的外源DNA分子導(dǎo)入所述靶細(xì)菌中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述將靶細(xì)菌基因組中所有的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因在自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌中共表達(dá)為將所述靶細(xì)菌基因組中所有的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因通過重組載體導(dǎo)入所述自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌內(nèi)； 步驟2)包括如下步驟 A)將所述外源DNA分子導(dǎo)入所述重組菌A中，得到重組菌B； B)誘導(dǎo)培養(yǎng)所述重組菌B，得到誘導(dǎo)后重組菌B; C)提取所述誘導(dǎo)后重組菌B的DNA，即得到甲基化修飾的外源DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述重組載體為將所述所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因均插入PWYE724質(zhì)粒中，得到共表達(dá)所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的重組載體； 步驟2)的B)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的誘導(dǎo)劑為阿拉伯糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步驟2)的B)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為將所述重組菌B在含有終濃度為O. 2% (質(zhì)量百分含量)的阿拉伯糖的液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為25V _37°C，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為3-24小時； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度具體為30°C，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間具體為12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述靶細(xì)菌為含有限制修飾系統(tǒng)的真細(xì)菌或古生菌，所述含有限制修飾系統(tǒng)的真細(xì)菌或古生菌具體為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208、臘樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987 或漢氏硝化細(xì)菌(Nitrobacter hamburgensis)X14 ； 所述自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌具體為大腸桿菌(Escherichia coli)EC135CGMCCNo. 5925。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述外源DNA分子為pAD123、pMK3、pMK4、pHCMC02、pHCMC 04、pDG148StuI、pWYE748 或 pBBRl-MCS5_PNham 345Q-GFP。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于 所述解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因為 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和 BAMTA208_16660 ;所述BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和 BAMTA208_16660 的核苷酸序列依次為序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5 ； 所述蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因為 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365 和 BCE_0392 ；所述 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392的核苷酸序列依次為序列表中的序列6、序列7、序列8、序列9、序列10和序列11 ；所述漢氏硝化細(xì)菌(Nitrobacter hamburgensis)X14中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因為 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803 和 Nham_3225 ;所述 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803和Nham_3225的核苷酸序列依次為序列表中的序列12、序列13、序列14和序列15。
8.大腸桿菌(Escherichia coli)EC135，其保藏編號為 CGMCC No. 5925。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克服靶細(xì)菌限制修飾障礙導(dǎo)入外源DNA的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)將靶細(xì)菌基因組中所有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因在自身限制修飾系統(tǒng)缺失的大腸桿菌中共表達(dá)，得到重組菌A；2)將外源DNA分子導(dǎo)入所述重組菌A進(jìn)行體內(nèi)修飾，得到甲基化修飾的外源DNA分子；3)將所述甲基化修飾的外源DNA分子導(dǎo)入所述靶細(xì)菌中。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明與現(xiàn)有的克服細(xì)菌限制修飾障礙，實現(xiàn)遺傳操作的方法相比轉(zhuǎn)化率高。
文檔編號C12R1/085GK102618476SQ20121008012
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者張國強(qiáng), 溫廷益 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所