專利名稱：利用抗體庫陣列(ara)發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)特異性抗體的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及對靶標(biāo)抗原有特異性的抗體序列。確切的說，本發(fā)明涉及到包括自然人類抗體，含有該抗體的抗體陣列和表達(dá)該抗體的人類B細(xì)胞在內(nèi)的發(fā)現(xiàn)方法及其化合物。本發(fā)明亦涉及到潛在治療性抗體的高通量和平行篩選方法。本發(fā)明還涉及到指向功能性抗原決定簇的抗體，這些抗原決定簇對應(yīng)于靶標(biāo)，疫苗和源于所述的抗體的治療方法。
背景技術(shù)：
可以識別細(xì)胞表面受體胞外域的單克隆抗體可以作為該受體的激動劑或者拮抗劑。單克隆抗體(MAb) 263是一種廣泛使用的單克隆抗體，它可以識別生長激素(GH)受體的胞外域(ECD)，它也可以在生物體內(nèi)或者體外作為生長激素(GH)的激動劑。(Wan Y.，等人，Molecular Endocrinology 17(11) :2240-2250(2003))。然而，并不是所有的結(jié)合有受體的抗體都會顯示出與激動劑或者拮抗劑配對的活性。有些需要額外的構(gòu)象變化引發(fā)信號。甚至并不是所有指向激素結(jié)合位點和作為激素結(jié)合競爭者得Mab都能夠充當(dāng)激動劑并引發(fā)信號。(Rowlinson SW，等人，1998JBiol Chem 273 :5307-5314).有報道，將激動作用限制在一個很小的Mab范圍內(nèi)作用于促紅細(xì)胞生成素受體，大量研究顯示該受體的96種Mab，僅有4種有激動劑活性(Elliott S，等人， 1996JBiol Chem 271 :24691-24697)。在需要延長半衰期的情形下或者可以期望減少頻繁治療的情形下，抗體刺激細(xì)胞表面受體的激動劑活性，使它成為非常有吸引力的治療選擇。為了觀察了解單克隆抗體怎樣激活受體，利用已知的抑制激動劑Mab定位抗原決定基的工作已經(jīng)開始實行。進(jìn)一步來講，在定位激動劑的細(xì)胞表面受體結(jié)合位點時，單克隆抗體可以加深我們對于受體的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的理解。一種用人類巨核細(xì)胞培養(yǎng)的鼠類單克隆抗體，術(shù)語為BAH-I，可以專一性識別細(xì)胞表面促血小板生成素(TPO)的受體(C-Mpl)，顯示出激動劑活性。(Deng B.，等人， Blood,92(6) :1981-1988(1998)).目前特異性蛋白質(zhì)檢測和定量測量的方法有基于抗原/抗體結(jié)合的免疫測定法， 包括經(jīng)典的直接免疫測定，比如免疫擴(kuò)散，免疫電泳，血液凝集和免疫沉淀反應(yīng)實驗，還包括最近發(fā)展的一些方法，比如熒光免疫檢驗法，放射性免疫測定法(RIA)，酶免疫測定法(EIA)和蛋白質(zhì)印跡法。這些方法利用的是抗原抗體間的專一性反應(yīng)。但是這些方法每次只能分析一個試劑，限制了單次實驗中可以被分析的分子數(shù)量。為了優(yōu)化人類抗體工程，研究者開發(fā)出了一系列的顯示方法。噬菌體顯示法具有能夠與分子庫內(nèi)分子專一性結(jié)合的特點，是一種廣泛用于多肽和蛋白質(zhì)分離的方法?？贵w庫的噬菌體顯示法可以作為尋找靶標(biāo)抗體片段的一種替代方法。在功能性基因和蛋白質(zhì)方面，在篩選新型高親和力基和其受體時，噬菌體顯示法的使用在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面有至關(guān)重要的作用。顯示法使得許多疾病下確定主要化合物和路徑成為可能，這些疾病主要包括癌癥，艾滋病(AIDQ，心血管疾病和自身免疫混亂。噬菌體顯示法具有能夠與分子庫內(nèi)分子專一性結(jié)合的特點，是一種廣泛用于多肽和蛋白質(zhì)分離的方法?？贵w庫的噬菌體顯示法可以作為尋找靶標(biāo)抗體片段的一種替代方法。在篩選新型高親和力基和其受體時，噬菌體顯示法的使用在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面有至關(guān)重要的作用。顯示法使得許多疾病下確定主要化合物和路徑成為可能，這些疾病主要包括癌癥，艾滋病(AIDQ，心血管疾病和自身免疫混亂。一般的噬菌粒/輔助噬菌體體系的缺點是噬菌體的高傳染性背景，其不顯示目的蛋白質(zhì)，但是與選擇靶標(biāo)的非特異性結(jié)合會促使噬菌體繁殖。所述的問題和已提高的細(xì)菌的生長速率為不表達(dá)重組蛋白的異常噬菌體提供了有利條件，以上的兩個特點使得選擇效率大大降低。施用于抗體時，這一方法的主要缺點是會丟失輕鏈和重鏈的自然組合，并會產(chǎn)生很多假陽性組合。因此尋找輕鏈和重鏈(從自然免疫系統(tǒng)中發(fā)展起來的)的最優(yōu)組合的可能性非常小。由人類后胚胎中心(POSt-GC)B細(xì)胞表達(dá)出的親和成熟的抗體預(yù)示著對傳染病和生化暴露治療的極大希望(Casadeval 1，A.，Pirofski，L. A. ,2005. Expert Opin. Biol. Ther. 5，1359)。這些抗體的最好來源可能是特定的傳染病恢復(fù)者或者疫苗接種者，并產(chǎn)生特定保護(hù)性抗體響應(yīng)的人。人類抗體是由健全的人類免疫系統(tǒng)由于自身功能自然產(chǎn)生的抗體。自然抗體對人類病毒類疾病治療的效用已經(jīng)被人超免疫球蛋白的治療實踐證實。三階段療法能夠利用人類外周血液B細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的雜合細(xì)胞群，這些雜合細(xì)胞可以很大程度上提高對抗肉毒桿菌神經(jīng)毒素的親和成熟的人類IgG抗體的作用。在這個方法中，外周單核血液細(xì)胞(PBMC) (a)被選中來表達(dá)CD27，后胚中心B細(xì)胞的標(biāo)記物，(b)通過體外培養(yǎng)來改進(jìn)B細(xì)胞的增殖能力和等級轉(zhuǎn)換能力，(c)與已經(jīng)基因改造的骨髓瘤細(xì)胞系融合。(Adekar等人，J Immunol Methods. 2008 Apr 20 ；333 (1-2) :156-66.)。自然抗體，作為一類，在一些方面與通過重組庫內(nèi)細(xì)胞(噬菌體和基因改造的小鼠細(xì)胞)得到的抗體不同，它所特有的性質(zhì)使其成為治療人類疾病的理想治療手段。 (參見 Dessain 等人，Exploring the Native Human Antibody Repertoire to Create Antiviral Therapeutics in Current Topics in Microbiology and Immunology 317 155-183 (2008)， Springer-Verlag New York)。更明確的表述是，通過人類B細(xì)胞表達(dá)得到的抗體相對于通過噬菌體得到的抗體有一個獨(dú)特的優(yōu)點由于噬菌體法在產(chǎn)生所有原始或者自然輕鏈重鏈的配對物方面的限制，會阻止重要的抗體結(jié)構(gòu)嵌入基于噬菌體的抗體庫中。因此，人們期望能夠得到高質(zhì)量的由人類B細(xì)胞表達(dá)出的人類抗體，并利用高通量法進(jìn)行病原體的檢測，診斷，治療。
進(jìn)一步來說，并不是每一個源于病原體染色體組的潛在抗原決定基的免疫識別都是必須的。抗原集合和傳染性病原體的抗原決定簇的響應(yīng)對于保護(hù)作用已經(jīng)足夠。所以 “免疫性抗病毒藥物”基于這樣一個概念，即對抗原集合和與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的抗原決定基的響應(yīng)就可以滿足保護(hù)的需要，并不需要對整個有機(jī)體響應(yīng)。對癌癥的有效免疫響應(yīng)也經(jīng)常限制到被腫瘤影響的免疫系統(tǒng)范圍。因此，人們希望能夠獲得與任何傳染或者腫瘤相關(guān)的人類免疫系統(tǒng)的抗體庫。目前此篩選抗體庫方法的另一個缺點是我們得到的信息本質(zhì)上是基于抗體結(jié)合目標(biāo)的能力，在結(jié)合到目標(biāo)物時，只能提供很少或者不能提供基于抗體功能性影響篩選作用。九十年代見證了基因技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)的快速發(fā)展，使開發(fā)一整套新目標(biāo)物變得非常有希望。對正常組織和腫瘤組織的核苷鏈和蛋白質(zhì)鏈的高通量篩選和計算機(jī)輔助分析揭示了在蛋白質(zhì)水平下的細(xì)微差別，在理論上可以瞄準(zhǔn)癌癥治療。然而，沒有獲得任何一種臨床上可以應(yīng)用的或者被證實的靶標(biāo)。在表達(dá)模式上的細(xì)微差別可能并不是那么重要，而腫瘤選擇性功能可能更加相關(guān)。新的抗原決定基水平上的靶標(biāo)物的調(diào)查是為了確定哪些可以給腫瘤細(xì)胞帶來功能性區(qū)別，因為與一個抗原決定基的結(jié)合可以帶來信號傳播的變化，而與另一個抗原決定基的結(jié)合可能會產(chǎn)生不同的性質(zhì)。這樣在單一治療失去效力的情況下，允許使用聯(lián)合治療法或者利用阻礙不同功能和互相影響的抗體的二階治療法。舉例來說，TRASTUZUMAB (HERCEPTIN ⑧；Genentech，San Francisco, CA)是一種重組人類單克隆抗體，目標(biāo)為HER-2(人類表皮生長因子受體2;erb-B2 ；neu)酪氨酸激酶受體的胞外域。臨床研究證實TRASTUZUMAB 有抗轉(zhuǎn)HER-2過量表達(dá)移性乳腺癌的活性，美國食品藥品監(jiān)督局于1998年批準(zhǔn)其上市(Carter P，Presta L，Gorman CM, ^A Humanization of an anti-pl85her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA(1992)89 :4285-4289.) 另外一種以HER-2為靶標(biāo)物的單克隆抗體， PERTUZUMAB (0ΜΝΙΤ ARG ，2C4 ;Genentech)最近正在患有不同類型實體瘤的癌癥病人中進(jìn)行第一階段的臨床試驗。為了和TRASTUZUMAB 對照，PERTUZUMAB 通過空間上阻礙HER-2和其他的HER受體的二聚作用來發(fā)揮效力，它阻礙了 HER-2/EGFR和HER-2/HER-3 異二聚體(Agus DB，等人Cancer Cell (2002) 2 :127-137.)發(fā)出的配基活性信號。由于大部分初始就對TRASTUZUMAB 有反應(yīng)的乳腺癌患者一年內(nèi)就會復(fù)發(fā)(Cobleigh MA,等人J ClinOncol 1999 ；17 :26394648)，研究發(fā)現(xiàn)用 TRASTUZUMAB 和PERTUZUMAB 聯(lián)合治療可以協(xié)同阻礙HER-2過量表達(dá)BT474乳腺癌細(xì)胞的存活。(Nahta R.，等人Cancer Res. 64， 2343-2346(2004))。因此，人們希望能夠得到下述抗體庫，其中的抗體可以用快速檢測或者高通量檢測的方式按照功能或者抗原決定基特異性分類。erbB2致癌基因編碼增長因子受體。經(jīng)證實erbB2基因的過量表達(dá)與越來越多的侵略性腫瘤和低水平預(yù)后相關(guān)。針對這個分子的抗體在體內(nèi)有抗癌作用，但是有些沒有此作用。(Wang等人MoI Immunol. 2004 Feb ；40 (13) :963-969)。顯然，有些抗原決定基與 erbB2腫瘤生長功能相關(guān)，有些則不相關(guān)。因此，需要在給定目標(biāo)下，對抗原決定基進(jìn)行全面的空間性能研究。

發(fā)明內(nèi)容
以下針對不同實施方案方法、組合物和試劑盒的實施方案的描述將不在任何方面作為對附上的權(quán)利要求的限制的解釋。本發(fā)明涉及一種人類抗體發(fā)現(xiàn)方法，該方法有利于促進(jìn)基于人類抗體的新型、有效的治療方法，診斷方法和預(yù)測方法的開發(fā)。本項發(fā)明提供了一種建立包含有與人體內(nèi)構(gòu)象相同的抗體庫的方法。本發(fā)明將進(jìn)一步提供一個新型的包含人類抗體庫中抗體的抗體庫陣列(ARA)，來發(fā)現(xiàn)瞄準(zhǔn)特定抗原的人類自然抗體。通過應(yīng)用本發(fā)明的ARA，本發(fā)明可提供包含有瞄準(zhǔn)特定抗原的人類自然抗體的新型組合物和試劑盒。本發(fā)明涉及一種快速鑒別有特異性功能的單克隆抗體的方法，該單克隆抗體來自于一系列指向特異性靶細(xì)胞表面分子單克隆抗體，比如受體。本發(fā)明可以提供新型組合物和試劑盒，所述的組合物和試劑盒包括瞄準(zhǔn)特定抗原的人類自然抗體，并具有通過利用本發(fā)明中的靶標(biāo)特異性抗體庫陣列(ARA)發(fā)現(xiàn)的特異性功能。本發(fā)明涉及一種篩選有生物學(xué)功能的單克隆抗體的方法，該方法包括提供一個含有眾多指向細(xì)胞表面特異性靶標(biāo)分子的單克隆抗體的抗體庫陣列(ARA)，還包括將此ARA 與細(xì)胞表面存在特異性靶標(biāo)分子的細(xì)胞聯(lián)系起來，并確定哪些單克隆抗體對細(xì)胞表面的特異性靶標(biāo)分子有抑制作用或者促進(jìn)作用。此方法進(jìn)一步包括使ARA與通信細(xì)胞接觸，其中的通信細(xì)胞被改造為當(dāng)其與通信細(xì)胞表面靶標(biāo)分子的激動劑或拮抗劑接觸時會表達(dá)可檢測性信號；在生成可檢測性信號必須底物存在的情況下，用單克隆抗體培養(yǎng)通信細(xì)胞，其中可檢測性信號水平上的變化就可以顯示出單克隆抗體細(xì)胞表面靶標(biāo)分子激動劑或者拮抗劑的功能的存在。在一些情況下，存在于細(xì)胞表面的特異性靶標(biāo)分子就是受體分子。在一些情況下，受體從以下這組物質(zhì)中選擇，這些物質(zhì)包括外周膜蛋白受體，跨膜受體，代謝性受體，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，酪氨酸激酶受體，鳥苷酸環(huán)化酶受體，對胞外配基響應(yīng)的離子型受體，酪氨酸激酶受體，細(xì)胞因子受體，鳥苷酸環(huán)化酶受體，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體，胰島素受體，胰島素樣生長因子受體，人類生長激素受體，葡萄糖輸運(yùn)， 鐵轉(zhuǎn)蛋白受體，表皮生長因子受體，低密度脂蛋白受體，瘦素受體，白細(xì)胞介素受體，IL-I受體，IL-2受體，GPCRs，毒蕈堿乙酰膽堿受體，腺苷受體，腎上腺素受體，伽馬氨基丁酸受體， 血管緊張素受體，大麻酯受體，膽囊收縮素受體，多巴胺受體，胰高血糖素受體，代謝型谷氨酸受體，組胺受體，嗅覺受體，阿片受體，視紫紅質(zhì)，分泌素受體，血清素受體，生長激素抑制素受體，鈣感受受體，生長因子受體，共刺激因子受體，蛋白激酶受體，T細(xì)胞受體，B細(xì)胞受體，ITIM含受體，ITAM含受體，TNFR總科組分，TNF受體總科，離子通道，和趨化因子受體。在一些方面，抗體起著受體蛋白全激動劑，部分激動劑，拮抗劑或者反拮抗劑的作用。一些實施方案中，可檢測信號有熒光劑，化學(xué)染料，放射性結(jié)合試劑，化學(xué)發(fā)光結(jié)合試劑，電化學(xué)發(fā)光試劑，磁性結(jié)合試劑，順磁性結(jié)合試劑，可生成有色物質(zhì)的酶，可生成化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的酶，可生成磁性物質(zhì)的酶或者釕。本發(fā)明與篩選方法相關(guān)，其中細(xì)胞表面分子的激活作用與作用于底物的酶的活力相關(guān)的胞內(nèi)信號途徑相耦合。在一些實施方案中，酶從以下這些酶組成的本組物質(zhì)中進(jìn)行選擇，這些酶包括 β-內(nèi)酰胺酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，β -甘露糖苷酶，酸性磷酸酶，堿性磷酸酶，磷酸二酯酶II。
在一些實施方案中，底物從以下底物中進(jìn)行選擇，這些底物包括對氨基苯-β -D-吡喃半乳糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃半乳糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃葡萄糖苷， 對氨基苯-β -D-吡喃葡萄糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯-β -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯磷酸鹽和對氨基苯磷酸膽堿或其衍生物。在一些實施方案中，酶對底物的作用可以與化學(xué)反應(yīng)，發(fā)光反應(yīng)，顯色反應(yīng)或者熒光反應(yīng)相耦合。本發(fā)明涉及一種篩選方法，進(jìn)一步包括在抗體功能檢測前利用流體剪切力從 ARA表面除去未結(jié)合的通信細(xì)胞。在一些方面，ARA試驗在96或者384孔板中進(jìn)行。每個孔中都有從單個B細(xì)胞克隆中得到的單克隆抗體，其中單克隆抗體的濃度足夠從細(xì)胞表面靶標(biāo)分子中得到反應(yīng)信號。每個孔中都可以與IO3以上通信細(xì)胞進(jìn)行接觸。在一些實施方案中，每孔都可以與少于 IO3通信細(xì)胞接觸，允許細(xì)胞在適宜的條件下生長直至每個孔中都達(dá)到或超過IO3個信號細(xì)胞，能夠產(chǎn)生可檢測信號。一些情況下，可檢測性物質(zhì)可能是或者不是通信細(xì)胞分泌的，信號檢測在各個孔中，也即物質(zhì)生成的地方進(jìn)行。一些情況下，每個孔中都可以與通信細(xì)胞接觸，通信細(xì)胞在適合細(xì)胞生長的條件下增殖，直至達(dá)到103，IO4, IO5或者更多。細(xì)胞生長條件同樣適合于可檢測物質(zhì)的表達(dá)。一些情況下，本篩選法為高通量篩選。一些情況下，本篩選法為高含量篩選。一些情況下，可檢測性物質(zhì)是細(xì)胞表面靶標(biāo)分子激活過程中間接產(chǎn)生的?！┣闆r下，細(xì)胞表面靶標(biāo)分子信號路徑的激活可以和β -內(nèi)酰胺酶表達(dá)關(guān)聯(lián)起來，內(nèi)酰胺酶的表達(dá)可以用熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)反應(yīng)的底物來量化。本發(fā)明提供了一種可以生產(chǎn)抗體庫的方法，該方法包括從每一個有效數(shù)目的人類供體內(nèi)得到至少10 細(xì)胞，形成一個B細(xì)胞群，所述的細(xì)胞群包含至少105，優(yōu)選至少106， 更加優(yōu)選至少IO7不同種類自然生成的抗體。其中的每一個抗體都有自然配對的重鏈和輕鏈，以充分表現(xiàn)整體人類免疫系統(tǒng)；將所述的B細(xì)胞群劃分成不同B細(xì)胞亞群，每個亞細(xì)胞群平均都可以產(chǎn)生1，5，10，20，50或者100種不同種類抗體；將每個B細(xì)胞亞群擴(kuò)增為B細(xì)胞系；在擴(kuò)增前或者擴(kuò)增后，將所述的任一個B細(xì)胞永生化以產(chǎn)生永生化的B細(xì)胞；在B細(xì)胞可以將抗體分泌到培養(yǎng)基的合適條件下培養(yǎng)所述的B細(xì)胞培養(yǎng)；將所述的抗體附著或者分配到固體表面的特定位置，從而產(chǎn)生抗體陣列。進(jìn)一步，本方法包括確定對所述的靶標(biāo)有特異性的抗體。本方法可以進(jìn)一步包括確定哪個永生化或者非永生化B細(xì)胞系能夠生產(chǎn)所述的靶標(biāo)抗體和從B細(xì)胞培養(yǎng)中分離產(chǎn)生所述的靶標(biāo)抗體的B細(xì)胞的步驟。本發(fā)明提供從一個或者多個單個供體中生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括從所述的一個或者多個單一供體中利用自然表達(dá)出的抗體獲得至少IO4個B細(xì)胞；將所述的B細(xì)胞分成可生產(chǎn)至少一個抗體以上的亞細(xì)胞群，優(yōu)選的亞細(xì)胞群可以產(chǎn)生約1-100個抗體；將每個B細(xì)胞的亞細(xì)胞群增殖以得到一個擴(kuò)增的B細(xì)胞系；任選地在擴(kuò)增前或擴(kuò)增后固定每一個所述的B細(xì)胞系的每個細(xì)胞以生產(chǎn)固定化B細(xì)胞系；在所述的B細(xì)胞可以分泌抗體到所述的培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)所述的B細(xì)胞系中的每一個細(xì)胞；將所述的抗體固定到固體表面的特定位置。本方法可以進(jìn)一步包括以下步驟篩選針對一靶標(biāo)的所述的抗體。
本發(fā)明提供的方法中所述人類供體數(shù)至少10，50，100或者500。本發(fā)明提供的方法中所述B細(xì)胞群被分成至少10，20，50，100，1000，104，直至IO7 個亞細(xì)胞群。本發(fā)明包含一個含有至少105，優(yōu)選至少106，更加優(yōu)選至少IO7個自然產(chǎn)生、有自然配對的Vh區(qū)和\區(qū)的抗體庫，所述的抗體由人類B細(xì)胞，優(yōu)選由永生化的人類B細(xì)胞表達(dá)得到，其中B細(xì)胞從一個足夠多樣的人類群體中獲得，以至于所述的抗體庫中的這些抗體具有與全部人類免疫實質(zhì)上類似的結(jié)合活性的多樣性。本發(fā)明提供了一個陣列和一個抗體庫，它們包括至少105，優(yōu)選至少106，更加優(yōu)選至少IO7或者更多自然表達(dá)的人類抗體，所述的抗體有自然配對的與Vh和\區(qū)，是由人類 B細(xì)胞表達(dá)的。在一些實施方案中，該抗體庫或者ARA可以識別至少IO5不同的特異性抗原或者靶標(biāo)，優(yōu)選至少可以識別106，更加優(yōu)選至少IO7或者更多不同的特異性抗原或者靶標(biāo)。 參見US 6319690，通過在此引證全部全部并入本申請。本發(fā)明提供了一個由人類B細(xì)胞群組成的庫，B細(xì)胞可以產(chǎn)生至少105，優(yōu)選至少 106，更加優(yōu)選至少IO7或者更多的不同種類的自然生成的抗體，所述的抗體有自然配對的與Vh和\區(qū)。所述的人類B細(xì)胞群被分為多個B細(xì)胞亞群，每個亞群平均可以產(chǎn)生1-100 不同種類的抗體，所述的人類B細(xì)胞可以從足夠多樣的病人獲得，以至于由所述的庫內(nèi)B細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體具有與完整的人類免疫實質(zhì)上相似的結(jié)合活性的多樣性。本發(fā)明提供了一種建立非永生化B細(xì)胞庫的方法，該方法包括從每個有效數(shù)量的人類供體中獲得至少IO4記憶B細(xì)胞；制備人類B細(xì)胞群，所述的B細(xì)胞群包含至少IO5 個不同種類的自然產(chǎn)生的抗體，優(yōu)選至少106，更加優(yōu)選至少IO7或者更多個不同種類的自然產(chǎn)生的抗體，其中所述的每個抗體都有自然配對的與重區(qū)和輕區(qū)；將所述的B細(xì)胞群分為多個B細(xì)胞亞群，每個亞細(xì)胞群平均可以產(chǎn)生1-100個不同種類的抗體；任選地，擴(kuò)增B 細(xì)胞亞群生產(chǎn)擴(kuò)大的B細(xì)胞系；在適合保存亞細(xì)胞群RNA的條件下存儲每一個細(xì)胞亞群，這樣能夠產(chǎn)生平均每個B細(xì)胞群可以表達(dá)1-100個不同種類的抗體的非永生化B細(xì)胞群庫。 該方法進(jìn)一步包含下述步驟制備與所存儲的B細(xì)胞亞群相應(yīng)的RNA樣本；在RNA樣本上， 實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；分離對應(yīng)于可以自然配對的Vh區(qū)和Vl區(qū)的DNA ；在適合表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)的宿主上克隆所述的DNA ；并在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白(Ig)。本發(fā)明提供了一種分離靶標(biāo)特異性抗體的方法，該方法包括從曾被靶標(biāo)影響的人類供體中獲得B細(xì)胞，其中所述的B細(xì)胞群包含至少IO5不同種類的自然產(chǎn)生的與重鏈和輕鏈自然配對的抗體；將所述的B細(xì)胞群分為多個B細(xì)胞亞群，每個亞群平均可以產(chǎn)生 1-100種不同種類的抗體；在所述的B細(xì)胞分泌抗體到培養(yǎng)基的情況下，擴(kuò)增B細(xì)胞亞群以得到擴(kuò)增的B細(xì)胞培養(yǎng)；將所述的分泌到培養(yǎng)基中的抗體分配到固體表面特定位置，建立抗體庫陣列(ARA)；用天然靶標(biāo)分子探測該抗體庫陣列來確定一個或者更多對所述的靶標(biāo)有特異性的抗體群；利用對應(yīng)于對所述的靶標(biāo)有特異性的抗體群的B細(xì)胞培養(yǎng)制備RNA樣品；在眾多RNA樣品上實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；分離Vh區(qū)和Vl區(qū)對應(yīng)的可以自然配對的DNA ；在適合表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)的宿主內(nèi)，克隆所述的對應(yīng)于Vh區(qū)和\區(qū)的DNA ；在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白。一些實施方案中，靶標(biāo)為病毒，細(xì)菌，酵母，寄生蟲，真菌或者其他病菌。一些實施方案中，靶標(biāo)分子為病毒粒子，病毒樣粒子，被病毒感染的細(xì)胞或者病毒蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，靶標(biāo)為人類免疫缺陷病毒(HIV)。在一方面，本方法進(jìn)一步包括，提供了一系列靶標(biāo)物，這些化合物包括多種類型靶標(biāo)物和相同靶標(biāo)的不同血清類型；并且可以確定可交叉反應(yīng)的抗體。本發(fā)明包括用以下任一方法制備的抗體庫陣列(ARA)。本發(fā)明提夠了一種基于成簇的抗原決定基篩選抗體的方法，本方法包括從對應(yīng)某靶標(biāo)蛋白的基因片段中得到基因片段抗菌素顯示法(GFPD)庫，其中GFPD庫中的成員依照與一個或者多個抗原決定基團(tuán)的關(guān)系歸類成組；提供完整的靶標(biāo)蛋白；提供從預(yù)先暴露在足量靶標(biāo)下能引起免疫反應(yīng)的實驗者血樣中取得的抗體庫陣列(ARA)。用完整靶標(biāo)分子和來自于靶標(biāo)的有抗原決定基特異性的成簇的GFPD庫成員探測該ARA ；確定一個或者多個對所述的靶標(biāo)有特異性的抗體群和至少一個抗原決定簇；利用對應(yīng)于對所述的抗原決定簇有特異性的抗體群的B細(xì)胞培養(yǎng)制備RNA樣品；在眾多RNA樣品上實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；分離對應(yīng)與可以自然配對得Vh區(qū)和\區(qū)的DNA ；在適合表達(dá)所述的Vh區(qū)和 Vl區(qū)的宿主內(nèi)，克隆所述的對應(yīng)于Vh區(qū)和\區(qū)的DNA ；在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白。在一方面，本方法進(jìn)一步包括利用完整的靶標(biāo)和GFPD庫成員基于ARA的識別模式確定新的抗原決定基。該方法包括下述附加步驟利用對應(yīng)于對所述的抗原決定簇有特異性的抗體群的B細(xì)胞培養(yǎng)制備RNA樣品；在眾多RNA樣品上實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)；分離對應(yīng)與可以自然配對得Vh區(qū)和Vl區(qū)的DNA ；在適合表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)的宿主內(nèi)，克隆所述的對應(yīng)于Vh區(qū)和\區(qū)的DNA ；在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白。依據(jù)所述的方法，本發(fā)明涉及一種通過表達(dá)特定和克隆區(qū)和\區(qū)鏈制備的治療性抗體。本發(fā)明涉及一種制備基因片段噬菌體顯示(GFPD)庫的方法，其中該GFPD成員依照與一個或者多個抗原決定基關(guān)系是成簇存在的，通過以下方法實現(xiàn)提供可以編碼靶標(biāo)蛋白的基因；將所述的基因分為基因片段；制備由GFPD庫成員組成的噬菌體顯示庫；根據(jù)有靶標(biāo)特異性的人類抗體淘選GFPD庫；依據(jù)其與一個或者多個抗原決定簇的關(guān)系對GFPD 進(jìn)行分組。本方法進(jìn)一步包括對GFPD庫成員分組；將GFPD庫成員覆蓋到靶標(biāo)物已知的三維結(jié)構(gòu)表面，其中靶標(biāo)物的功能是與部分已知的靶標(biāo)物三維結(jié)構(gòu)相關(guān)的。本發(fā)明涉及一種檢測兩個或多個其中本申請描述的方法所確定的抗原決定簇之間協(xié)同作用的方法，該方法包括制備表達(dá)Vh區(qū)和\區(qū)第一自然配對的免疫球蛋白，其中Vh 區(qū)和\區(qū)序列得自于對不同抗原決定簇有特異性的抗體群；制備表達(dá)Vh區(qū)和\區(qū)第二自然配對的免疫球蛋白，Vh區(qū)和\區(qū)序列得自于對不同抗原決定簇有特異性的抗體群；在檢測系統(tǒng)中分別和組合執(zhí)行第一自然配對和第二自然配對的免疫球蛋白來測量完整靶標(biāo)的活性；檢測新的與已知功能相關(guān)的抗原決定基的活性或者協(xié)同作用活性。本發(fā)明提供小分子和治療性抗體制備，該抗體可以有效調(diào)整已結(jié)合有一個或多個以上所述的抗原決定簇的靶標(biāo)的功能。本發(fā)明提供一種疫苗制備方法，包括對本申請所述方法決定的功能性抗原決定簇有效的抗體。
本發(fā)明提供一種由可轉(zhuǎn)變細(xì)胞表面受體功能的治療性抗體組成的試劑盒。本發(fā)明提供一種可篩選具有特定功能的單克隆抗體的試劑盒，該試劑盒包括由指向細(xì)胞表面特定靶標(biāo)分子的抗體組成的抗體庫陣列(ARA)；和任選地，通信細(xì)胞，其中通信細(xì)胞被改造成當(dāng)與通信細(xì)胞表面激動劑或者拮抗劑接觸時能夠表達(dá)可檢測性信號。本發(fā)明和本發(fā)明的其他研究對象，特點和優(yōu)點在以下具體實施方式
、附附圖和實施例中進(jìn)一步說明。


附圖1是利用抗體庫陣列來發(fā)現(xiàn)抗體過程的示意附圖。附圖2是利用ARA平臺技術(shù)發(fā)現(xiàn)抗HIV單克隆抗體過程的示意附圖。附圖3是開發(fā)對應(yīng)于人類基因的抗原決定基庫的噬菌體顯示法過程的示意附圖。附圖4是利用全蛋白質(zhì)或者病原體作為靶標(biāo)和利用單個抗原決定級作為靶標(biāo)篩選ARA過程的示意附圖。附圖5是指向靶標(biāo)上單個功能性抗原決定基的特異抗體群分離過程的示意附圖。
具體實施例方式沒有進(jìn)一步細(xì)節(jié)描述的情況下，根據(jù)以下描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)⒈景l(fā)明進(jìn)行充分?jǐn)U展。以下描述僅為說明性描述，任何條件下不作為對本發(fā)明公開的其余部分的限制。將被動抗體治療應(yīng)用于傳染病治療的功效和必要性已經(jīng)被公眾認(rèn)胃。(Keller and Stiehm. Clin. Microbiol. Rev. 13 :602-614(2000) ；Oral HB.等人 MoI. Biotechnol. 21 :225-239 (2002) ；Casadevall 等人 Nat. Rev. Microbiol. 2 695-703(2004).)從病毒性傳染病中康復(fù)的人和接種含有抗體群的治療性疫苗的人可以獲得對病毒的終身免疫。這些“天然抗體”有與人類免疫系統(tǒng)活動時產(chǎn)生的構(gòu)想完全一致的成對的重鏈和輕鏈。它們與用重組細(xì)胞系統(tǒng)或者基因改造的小鼠系統(tǒng)產(chǎn)生的人類或者人類化抗體不同，它們不會復(fù)制由人類系統(tǒng)自然產(chǎn)生的抗體全長的“野生型”結(jié)構(gòu)。天然人類抗體庫擁有發(fā)展新型單克隆治療法的未開發(fā)潛力。天然人類抗體庫有對人類疾病明確的免疫學(xué)解決辦法，而且它很可能是臨床應(yīng)用上最安全的方法。盡管以前人們采用靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG;利用血漿中的自然IgG)的多克隆抗體療法，本發(fā)明涉及一種更有效的新方法的開拓，涉及到克隆天然人類抗體的治療潛力。目前已經(jīng)構(gòu)建出抗體庫或者抗體陣列(參見US4^9010和4591570，均通過在此引證全部并入本申請)；然而正如本申請所描述和聲明的，目前沒有任何人類自然抗體庫或者ARA能夠?qū)嵸|(zhì)上包括所有人類天然免疫。本發(fā)明提供一個用來發(fā)現(xiàn)抗體的抗體庫陣列(ARA)。一方面，高通量、多元和可升級的平臺可用于對給定供體或者供體庫的抗體庫做全面的探測。另一方面本發(fā)明提供了一個大型候選庫，以提高檢定有獨(dú)特功能特點的高質(zhì)量抗體的幾率。本發(fā)明涉及一種從抗體庫陣列(ARA)的眾多單克隆抗體中快速識別有特定功能抗體的方法。。一方面，高通量、多元和可升級的平臺可用于對給定供體或者供體庫的抗體庫做全面的探測。另一方面本發(fā)明提供了一個大型候選庫，以提高檢定有獨(dú)特功能特點的高質(zhì)量抗體的幾率。受體是嵌入在細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中，移動信號分子可能接觸的蛋白分子。與受體結(jié)合的分子叫做配基，有可能是肽(比如神經(jīng)傳遞素)、激素、藥物分子、毒素或者抗體，當(dāng)其與激動劑成鍵是，受體會發(fā)生能夠引起細(xì)胞響應(yīng)的構(gòu)象變化。有些配基(比如拮抗劑) 很少在不引起任何反應(yīng)的情況下阻礙受體。配基誘導(dǎo)的受體變化會導(dǎo)致生理學(xué)上的變化， 即配基的生理活性。依據(jù)本發(fā)明受體包括外周膜蛋白受體，跨膜受體，代謝性受體，G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR)，酪氨酸激酶受體，鳥苷酸環(huán)化酶受體，對胞外配基響應(yīng)的離子型受體等等?？缒さ鞍卓赡馨ㄒ粋€或多個跨膜域。例如酪氨酸激酶受體，一些細(xì)胞因子受體，鳥苷酸環(huán)化酶受體和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體包含一個單個的跨膜域。然而，包括離子通道和腺嘌呤環(huán)化酶的各種其他的蛋白質(zhì)包含多個跨膜域。由于它們包含7個跨膜區(qū)，所以很多重要的細(xì)胞表面受體被歸類為“七跨膜域(7TM)”蛋白，重要的跨膜蛋白受體包括但不限于胰島素受體，胰島素樣生長因子受體，人類生長激素受體，葡萄糖輸運(yùn)，鐵轉(zhuǎn)蛋白受體，表皮生長因子受體，低密度脂蛋白受體，瘦素受體，白細(xì)胞介素受體，比如IL-I受體，IL-2受體等等。GPCR包括毒蕈堿乙酰膽堿受體，腺苷受體，腎上腺素受體，GABA受體，血管緊張素受體， 大麻酯受體，膽囊收縮素受體，多巴胺受體，胰高血糖素受體，代謝型谷氨酸受體，組胺受體，嗅覺受體，阿片受體，視紫紅質(zhì)，分泌素受體，血清素受體，生長激素抑制素受體，鈣感受受體，趨化因子受體，細(xì)胞因子受體，諸如此類。信號轉(zhuǎn)換中會涉及到某些受體。跨膜域的特征包括大約20個連續(xù)的被帶電氨基酸跟隨的疏水氨基酸。因此，基于特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列的分析，可以預(yù)測蛋白質(zhì)內(nèi)的跨膜域的位置和數(shù)量?？缒さ鞍椎陌庥蚴嵌喾N多樣的，然而在各種胞外域多次重復(fù)發(fā)現(xiàn)保守序列。保守結(jié)構(gòu)和/或功能已被歸于不同的胞外主題。舉例來說，細(xì)胞因子受體的特點是半胱氨酸簇和WSXWS(W=色氨酸，S=絲氨酸，X=任意氨基酸)。免疫球蛋白樣域是高度保守的。粘液素樣域可能與細(xì)胞粘附有關(guān)，富亮氨酸重復(fù)參與到了蛋白-蛋白相互作用中。與其他分子結(jié)合時會涉及到很多胞外域。一方面，胞外域就是受體。與受體域結(jié)合的因子包括循環(huán)配基，可能是多肽，蛋白質(zhì)或者小分子，比如腺苷等等。舉例來說，生長因子，比如EGF，F(xiàn)GF和PDGF是循環(huán)生長因子，會與它們的同源受體結(jié)合來引發(fā)各種細(xì)胞反應(yīng)。 其他影響因子包括細(xì)胞因子、有絲分裂因子，神經(jīng)因子等等。依照本發(fā)明，功能性單克隆抗體可以和細(xì)胞表面蛋白胞外特定域互相作用，并直接或者間接性的引發(fā)生物學(xué)反應(yīng)。激動劑可以激活受體并導(dǎo)致強(qiáng)烈的生物學(xué)反應(yīng)。大多數(shù)自然配基都是全功能激動劑。相對于全功能激動劑來說，部分激動劑不會徹底激活受體，它們只能引發(fā)部分反應(yīng)。拮抗劑可以與受體結(jié)合但是不會激活受體。這樣就會導(dǎo)致受體阻礙，抑制其他激動劑的結(jié)合。 反激動劑通過抑制受體基本活性，會降低受體活力。與受體結(jié)合的單克隆抗體有任一種或者多種所述的作用。本發(fā)明使單個樣品或者群體中痕量(IO5-IO6分之一，)抗體的靈敏檢測成為可能。 本方法中還提供了在短時間內(nèi)(三個月或者更短時間)識別和確定靶標(biāo)特異性天然人類抗體群的方法。此外，本發(fā)明的方法允許在自然構(gòu)象下，利用天然人類抗體，在自然配對的重鏈和輕鏈下對靶標(biāo)分子進(jìn)行探測，從而實現(xiàn)有靶標(biāo)特異性的高質(zhì)量抗體的篩選。從人類供體得到的人類IgG+記憶B細(xì)胞單個個體中，人類免疫系統(tǒng)包含101 細(xì)胞純系型和IO9以上的組合抗體(Jerne NK, Scand J Immunol. 38(1) :1-9(1993))。然而，其中所用的B細(xì)胞群包含至少IO5不同種類的IgG抗體，優(yōu)選至少106，更加優(yōu)選至少IO7不同種類的IgG抗體，IgG抗體可以視為人類對疾病、機(jī)能失調(diào)和傳染病抗原自然免疫響應(yīng)的代表。每個供體中至少收集10 細(xì)胞。 其中預(yù)期得到的人類天然抗體庫和陣列充分包含完整的人類免疫系統(tǒng)對疾病、機(jī)能失調(diào)或者傳染病響應(yīng)時所可能產(chǎn)生的抗體，通常從10不同供體中收集至少105，優(yōu)選至少106，更加優(yōu)選至少IO7不同種類的自然產(chǎn)生的抗體。靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)含有從血漿中獲得的純化的自然人類抗體群，可以反映出其生成體的集體抗體免疫的情況。人們注意到，不同地域的供體庫特定抗體的濃度不同。因此，本發(fā)明中供體庫是由不同地域的供體中采集到的，從而提高靶標(biāo)特異性抗體的多樣性。本發(fā)明中一方面，供體群包括未治療過的患者，未被一般病原體感染的正常人，或者已經(jīng)接受常規(guī)疫苗治療的病人。另一方面，本發(fā)明中所述瞄準(zhǔn)特異性傳染病病原體或人類疾病的抗體是人們期望的供體庫，選擇出來用于患有常見病的患者，或已被感染的或針對接種常見傳染病疫苗的人。實施方案中，供體被目標(biāo)疾病感染，例如傳染病，比如流行性感冒病毒，肝炎病毒C (HCV)，單純皰疹病毒(HSV)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)，埃-巴二氏病毒(EBV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，假單胞菌，假絲酵母；呼吸障礙如哮喘，過敏癥，慢性障礙性肺病(COPD)，先天性肺纖維化(IPF)，成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)， 代謝障礙比如虛弱，惡病體質(zhì)，肌消失癥，肥胖，血脂異常，代謝綜合癥，心肌梗塞(MI)，慢性腎衰竭(CRF)，骨質(zhì)疏松癥的腸易激綜合征的消化系統(tǒng)紊亂(IBS)，炎性腸病(IBD)，克羅恩氏病(節(jié)段性回腸炎)，脂肪肝，纖維癥，藥物性肝?。簧窠?jīng)障礙包括阿耳茨海默氏病(早老性癡呆病)，多發(fā)性硬化(MQ，帕金森氏癥，牛海綿狀腦病(BSE，瘋牛病)；腫瘤包括乳腺癌， 腎癌，胃癌惡性黑色素瘤，肺癌，結(jié)腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，淋巴瘤和前列腺腫瘤。在一個實施方案中，為確定治療相關(guān)靶標(biāo)的抗體的存在進(jìn)行B淋巴細(xì)胞篩選，所述的靶標(biāo)物包括與神經(jīng)狀況相關(guān)的多肽，細(xì)胞因子，趨化細(xì)胞因子，生長因子，粘附分子，共刺激分子，瘤細(xì)胞抗原，惡性腫瘤細(xì)胞抗原及其受體。多肽與多種神經(jīng)變性疾病相關(guān)，比如亨丁頓舞蹈癥(HD)，帕金森氏癥(PD)，阿爾茨海默病(AD)，和肌萎縮性側(cè)索硬化(ALQ包括亨廷頓蛋白，重組人蛋白-1，雄激素受體， 共濟(jì)失調(diào)蛋白1，共濟(jì)失調(diào)蛋白2，共濟(jì)失調(diào)蛋白3，CACNA1A(鈣離子通道，電壓增益，P/Q類型，αΙΑ亞單位)，共濟(jì)失調(diào)蛋白-7，α-突觸核蛋白(synuclein)，淀粉樣前體蛋白(APP)， τ，β-淀粉樣蛋白，低分子量神經(jīng)纖維(LNF)，α-絲連蛋白，外周蛋白，N-Cor，mSin3a， CBP(c-AMP_應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)，α-銜接蛋白，α-l-抗胰凝乳蛋白酶，synphilin-Ι，泊蛋白，UCH-Ll(泛素羧基端酯酶Li)，hip-Ι，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶-1，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶-2，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶_3，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶-6，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶_8，需鈣蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶2 (HD AC2)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，多聚谷氨酰胺結(jié)合蛋 S -1 (PQBPl), β-突觸核蛋白，Y-突觸核蛋白，SODl，載脂蛋白E (APOE)，hip-Ι，早老素 PS-I，和早老素PS-2。細(xì)胞因子是各種多肽媒介物的一個統(tǒng)稱，它與很多生理功能包括免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)的激活有關(guān)。細(xì)胞因子包含且不限于下述物質(zhì)白細(xì)胞介素(IL-Ia，IL-I β，ILIra 和IL-2到IL-18)，腫瘤壞死因子(TNF- α和TNF-β)，干擾素(INF-α，β和γ)，克隆朿Ij 激因子(G-CSF，M-CSF，GM-CSF，IL-3和其他白細(xì)胞介素)和生長因子(EGF，F(xiàn)GF，PDGF， TGFa，TGF β，BMP, GDF，CTGF和ECGF)。細(xì)胞因子包含且不僅限于心營養(yǎng)素_1 (CT-I)； CD27 ；CD27L ；CD30Ki_I ；CD30L ；CD40L (TRAP)；干擾素 a (IFN-a )；干擾素 β (IFN-β )； 干擾素Y (IFN-y)；干擾素ω (IFN-ω)；干擾素敏感基因15(ISG_15)；肥胖基因OB ；白血病抑制因子LIF;淋巴毒素LT/TNFi3 ；巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(M-CSF)；巨噬細(xì)胞刺激蛋白- a (MSP-α)；巨噬細(xì)胞刺激蛋白- β (MSP-β)；移動抑制因子(MIF)；抑瘤素M(OSM)； RANKL ；可溶性 IL6 R 復(fù)合物 sIL6RC (gpl30+sIL6R)；可溶性 Fas 配體 sCD95L ；TNF I 型受體 TNF-RI ；TNFII 型受體 TNF-RII ；TNFSF-18 ；腫瘤壞死因子 α TNF-α 和 TNFSF-12。趨化細(xì)胞因子是對白細(xì)胞有激活或者趨化作用的細(xì)胞因子。趨化細(xì)胞因子受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體組。舉例來說，HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞需要趨化細(xì)胞因子受體，那么它們的拮抗劑就可以用于AIDS的治療。趨化細(xì)胞因子包含且不限于B-淋巴細(xì)胞趨化物 (BLC)；趨化細(xì)胞因子受體(CCK-I)；皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子CTACK ；嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-1 ；嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-2MPIF-2 ；嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-3 CCL26 ；神經(jīng)趨化因子；粒細(xì)胞趨化蛋白2(GCP-2) ；MGSA ；ΜΙΡ-2 α ；ΜΙΡ-2 β ；血液透析CCl (HCC-I)；血液透析 CC4(HCC-4) ； IFN γ誘導(dǎo)蛋白IO(IP-IO) ； IFN誘導(dǎo)T細(xì)胞α趨化細(xì)胞因子(I-TAC)；白細(xì)胞間介素-8(IL-8)；白細(xì)胞衍生趨化因子-2 ;Limgkine ；淋巴細(xì)胞趨化因子(LPTN)；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ia ；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1β ；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白IS ；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白IY ； 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3α ；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3β ；巨噬細(xì)胞衍生趨化因子(MDC)；單核細(xì)胞趨化蛋白-KMCP-I ；單核細(xì)胞趨化蛋白-2(MCP-2)；單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3)；單核細(xì)胞趨化蛋白-4(MCP-4)；單核細(xì)胞趨化蛋白-5(MCP-5) ；IFN γ誘導(dǎo)的單核因子(MIG)；骨髓抑制因子(MPIF)；血小板堿性蛋白(PBP)；血小板因子4;肺部活化調(diào)節(jié)趨化因子(PARC)； RANTES(依賴激活T細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)蛋白)；二級淋巴組織趨化因子(SLC)；間質(zhì)細(xì)胞衍化因子I(SDF-I)；胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子(TARC)和胸腺表達(dá)趨化因子(TECK)。生長因子包含且不限于酸性纖維原細(xì)胞生長因子(aFGF)；活化素βΑ;刺豚鼠相關(guān)蛋白(AGRP)；雙調(diào)蛋白AR;血管生成素樣因子(ALF)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)；乙胞素因子；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP》；骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白5(BMPQ ；骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(ΒΜΡ6)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白7 (BMP 7)；畸胎瘤衍生生長因子-I(CRGF)；表皮生長因子(EGF)；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；纖維原細(xì)胞生長因子 17(FGF-17)；纖維原細(xì)胞生長因子18(FGF-18)；纖維原細(xì)胞生長因子19 (FGF-19)；纖維原細(xì)胞生長因子2(FGF-2)；纖維原細(xì)胞生長因子4(FGF-4)；纖維原細(xì)胞生長因子6 (FGF-6)； 纖維原細(xì)胞生長因子7(FGF-7)；纖維原細(xì)胞生長因子8(FGF-8)；纖維原細(xì)胞生長因子 9 (FGF-9) ；Flt3配體(Flt3L)；卵泡抑素(FSP)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；粒細(xì)胞/ 巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)；增殖分化因子11 (OTF-Il)；增殖分化因子15 (⑶F-15)；生長抑制特異性基因6(feS-6)；肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)；肝細(xì)胞生長因子(HGF)；肝細(xì)胞生成素A(HPTA)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白；調(diào)蛋白α ；調(diào)蛋白β ；IGF結(jié)合蛋白I(IGFBP-I) ；IGF 結(jié)合蛋白-2(IGFBP-2) ；IGF結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3) ；IGF結(jié)合蛋白-4(IGFBP-4)；抑制素 A ；抑制素B;胰島素樣生長因子IA(IGF-IA)；胰島素樣生長因子IB (IGF-IB)；胰島素樣生長因子II(IGF-II)；巨噬細(xì)胞半乳糖特異性血凝素I(MAC-I)；神經(jīng)突蛋白；神經(jīng)秩蛋白； 食欲素A ；骨粘連蛋白；血清護(hù)骨素；血小板源性生長因子α (PDGF-A)；血小板源性生長因子β (PDGF-B)；催乳激素(PRL)；感覺和運(yùn)動神經(jīng)元衍生因子(SMDF)；可溶性GM-CSF 受體(sGM-CSFR)；干細(xì)胞因子(SCF)；促血小板生成素(TPO)；胸腺介質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素 (TSLP)；促胸腺生成素(Tpo)；轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)；轉(zhuǎn)化生長因子β l(TGF_i3 1)；轉(zhuǎn)化生長因子i3 2(TGF-i3 2)；轉(zhuǎn)化生長因子i3 3(TGF-i3 3)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。靶向細(xì)胞粘附分子和趨化因子/趨化因子受體作為白細(xì)胞溢出和遷移作用的調(diào)節(jié)物可以作為諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥性疾病的治療方法。(Vergimst CE 等人，Scandinavian Journal of Rheumatology 34 :6，415-425.)細(xì)胞粘附分子(CAM)是在與其他細(xì)胞或者細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)合，即細(xì)胞粘附過程中所涉及的一種位于細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)。大多數(shù)CAM屬于以下四種蛋白家族Ig(免疫球蛋白)總科(IgSFCAMs)，整合素，鈣粘著蛋白和選擇素。免疫球蛋白總科CAMs (IgSF CAMs)是親同種抗原或異染性的，并與整合素或者不同的IgSF CAM結(jié)合。IgSF CAM包含且不僅限于NCAM(神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子)；ICAM-I (細(xì)胞間粘附分子)；VCAM-I (血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子)；PECAM-I (血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子)；Ll ；CHLl ；MAG ；結(jié)合素和結(jié)合素樣分子。鈣粘著蛋白家族的成員包括E-鈣粘著蛋白(位于上皮)，P-鈣粘著蛋白(位于胎盤1)和N-鈣粘著蛋白(位于神經(jīng)元)。 選擇素家族成員的例子有E-選擇素(位于內(nèi)皮)，L-選擇素(位于白細(xì)胞)和P-選擇素 (位于血小板)。整合素是可以和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的細(xì)胞表面受體，是很多胞外信號傳遞的媒介物。細(xì)胞粘附在傳染病和神經(jīng)障礙疾病中都有涉及。共刺激性信號是一種在T細(xì)胞激活過程中使用的抗原非特異性信號，是細(xì)胞表面表達(dá)共刺激分子的抗原所在細(xì)胞和T細(xì)胞相互作用時產(chǎn)生的。(Tacke等人，Eur. J. Immunol.，1997，27 =239-247.)由T細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子⑶28即是一個實例，它可以與APC細(xì)胞膜上的⑶80和⑶86相互作用。其他由T細(xì)胞表達(dá)的共刺激受體包括ICOS (可誘導(dǎo)共刺激分子)，CTLA-4和PD1。共刺激信號的抑制物可用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腎移植期間的治療，以及T細(xì)胞共刺激缺乏癥的治療，尤其是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)，血中丙球蛋白貧乏癥，選擇性免疫球蛋白不足，比如選擇性IgA不足和普通可變性免疫缺陷 (CVID)。含有淋巴細(xì)胞的樣本可以在不同時間點從病人供體采集。在一個實施方案中， 從已經(jīng)從靶標(biāo)疾病恢復(fù)的病人體內(nèi)采集淋巴細(xì)胞樣本，恢復(fù)時間至少為1，5，10，15，20，25 天，至少為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 個月，或至少為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 年。另一實施方案中，從目前患有靶標(biāo)疾病的病人體內(nèi)采集淋巴細(xì)胞，該病人在采集之前已經(jīng)被診斷出患有靶標(biāo)疾病至少1，5，10，15，20，25天，或者至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10月，或者1,2, 3，4，或者5年。為了制備供體特異性人類抗體庫，需要從人體(病人供體)中收集含有B淋巴細(xì)胞的樣品。舉例來說，這個樣品可能取自骨髓，血液，脾臟，淋巴結(jié)，扁桃體等等。外周血液單核細(xì)胞是最常見的樣本來源，人們注意到，骨髓是單個個體成熟抗體庫的完整“化石檔案”，在脾臟內(nèi)的單核細(xì)胞中IgG抗體存在的比例更高。初級人類B細(xì)胞的最好來源是脾單核細(xì)胞，扁桃體和外周血液單核細(xì)胞。(Olsson等人J. Immunol. Methods 61:17-32(1983)； Karpas A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1799-1804(2001))。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，本程序開始于從人類血液中分離外周血液單核細(xì)胞(PBMC)，通常是使用Ficoll梯度離心法。用B細(xì)胞選擇性標(biāo)記物比如anti-⑶19將 PBMC染色。將染色的B細(xì)胞用流式細(xì)胞(計量)術(shù)進(jìn)行分類。在本發(fā)明中，每5mL血液樣本中可以獲得約5-10x104B細(xì)胞?？寺】贵w生成B細(xì)胞抗體生成B細(xì)胞可以在多孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。在一個實施方案中，96，384或者 1536孔板的每個孔內(nèi)為寡克隆，每個孔內(nèi)含有一個以上B細(xì)胞克隆。一個孔容納至少1， 2，5，10，15或20不同的B細(xì)胞克隆，優(yōu)選是1-100B細(xì)胞克隆。優(yōu)選地，一個孔容納10個左右不同的B細(xì)胞克隆。可以依據(jù)Love等人(Love et al.，Nature Biotechnology, 24, pp. 703-707(2006) (" Love "))的方法構(gòu)建高密度庫。優(yōu)選地在微孔板內(nèi)處理B細(xì)胞；更加具體的說是96孔，384孔或1536孔微孔板。使用微孔板(例如與使用Love的 nano-format相比)的優(yōu)點是便于B細(xì)胞的回收。人們預(yù)期，微孔板單個孔可以容納多個B 細(xì)胞，每個孔的多個B細(xì)胞可以生成不同的人類自然抗體。另一實施方案中，在一個96，384 或者1536孔孔板的每個孔進(jìn)行克隆，孔內(nèi)平均包含有不超過一個B細(xì)胞克隆，這個實施方案在人類B細(xì)胞非永生化時為優(yōu)選的。在限制每孔稀釋約10個細(xì)胞的情況下，將細(xì)胞分類到微孔板中可選的兩個辦法包括從半固體培養(yǎng)基中挑選克隆(Davis，J. Μ.，等人J. Immunol. Methods 50， 161-171(1982) ;Rueda，A. Z.&Coll，J.M.J· Immunol. Methods 1 14,213-217(1988))和熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS ;Herzenberg，L. Α.等人· Clin. Chem. 48，1819-1827 (2002)； Carroll, S.& Al-Rubeai, Μ. Expert Opin.Biol. Ther. 4，1821-1829(2004)) 任選地，B細(xì)胞克隆可以在孔板內(nèi)任意擴(kuò)增。在體外刺激B細(xì)胞會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生成更多免疫球蛋白mRNA，克隆擴(kuò)增的細(xì)胞分離，從而提高釋放到培養(yǎng)基中的可溶性免疫球蛋白生成量。本文已經(jīng)描述了多種體外有效刺激原始B細(xì)胞的方法。^ibler和他的同事們 (Wen等人，Eur J. Immunol. 198717 :887)描述了在B細(xì)胞培養(yǎng)中利用EL4亞克隆突變株 EL4-B5作為刺激物/飼養(yǎng)細(xì)胞的方法。Banchereau和他的同事們(Valle等人，Eur J Immunol. 1989 19 :1463)描述了拮抗劑anti_CD40單克隆抗體的使用，用于呈現(xiàn)Fc-γ受體表達(dá)用作飼養(yǎng)細(xì)胞的成纖維細(xì)胞。最近，CD40L轉(zhuǎn)染細(xì)胞系已經(jīng)用于刺激物/飼養(yǎng)細(xì)胞 (Armitage 等人，Nature. 1992 357 :80 和 Spriggs 等人，J Exp Med. 1992 176 :154；3)，此外應(yīng)用的還有⑶40L可溶性片段的重組細(xì)胞(HollerAaugh等人，EMBO J. 1992 11 :4313和 Mazzei等人，JBiol. Chem. 1995 270 :7025)。美國專利5540擬6描述了一種有助于B細(xì)胞增殖的方法將激活的B細(xì)胞暴露在體外直至達(dá)到可溶性gp39蛋白的有效濃度。在用美國商陸有絲分裂原或者EBV使雜種細(xì)胞融合前用增殖的刺激物處理初始B細(xì)胞。(Olsson等人 J. Immunol. Methods 61:17-32(1983) ；Butler JL 等人 J. Immunol. 130 165-168 (1983))。 美國專利5851531描述了一種用含有美國商陸(Phytolacca americana)血凝素的美國商陸有絲分裂原刺激B細(xì)胞的方法。已知含有未甲基化的CpG 二核苷酸的寡核苷酸具有免疫刺激作用，尤其是在基礎(chǔ)環(huán)境(CpG motifs)下，對人類白細(xì)胞有高度的刺激作用，會引起 B 細(xì)胞的增殖。(Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321 1-10 ；Krieg, A.M. , Applied Antisense Oligonucleotide Technology, 24 :431-448(1998)).通過刺激B細(xì)胞，能夠使可溶性免疫球蛋白釋放到培養(yǎng)基中，從而使工作人員可以方便的篩選B細(xì)胞培養(yǎng)以確定抗原特異性重鏈抗體的存在。例如，人們可以通過從細(xì)胞中去除條件培養(yǎng)基來檢測條件上清液，用免疫配置中的部分或者全部樣品對培養(yǎng)基中的免疫球蛋白的濃度進(jìn)行定量，顯示其中已被刺激B細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。這樣使人們在后續(xù)的免疫球蛋白基因克隆步驟中，能夠排除未成功刺激的B細(xì)胞群。B細(xì)胞克隆的永生化能產(chǎn)生人類天然抗體的初始人類B細(xì)胞能夠通過EBV轉(zhuǎn)換，形成雜和細(xì)胞或者重組的方式在原位實現(xiàn)永生化和堆積?？寺∵@些抗體的雜和細(xì)胞法有很多潛在的優(yōu)勢，包括操作方便，抗體表達(dá)產(chǎn)量高和自然構(gòu)象下捕獲抗體的能力強(qiáng)。B細(xì)胞克隆可以通過本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)方法進(jìn)行擴(kuò)增，如雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的使用，舉例來說，Harlow 等(Harlow 等人，Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988))禾口 Hammerling 等(Hammerling,等人’在 Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681(Elsevier, N. Y. ,1981))者M(jìn)故過相關(guān)描述。在改進(jìn)的雜交瘤細(xì)胞生成法中，Dessain等(J. Immunol. Methods 291, 109(2004))證明通過使用可以表達(dá)人類端粒酶(hTERT)和鼠白細(xì)胞介素_6 (mIL_6)的鼠融合伙伴細(xì)胞系(MPT)能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的人類B細(xì)胞雜交細(xì)胞。另一個熟知的擴(kuò)增人類B細(xì)胞系的方法是用EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化。生成EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞系的實驗方案在本領(lǐng)域內(nèi)很知名，比如《Current Protocols in Immunology)) (Coligan 等人，Eds.，1994，John Wiley & Sons, N. Y.)第 7 章 22 節(jié)中概述的方案，也全部納入了參考資料。在進(jìn)行EBV轉(zhuǎn)化前一般需將組織制作成單細(xì)胞懸浮液。此外，會在含有B 細(xì)胞的樣本溶液中執(zhí)行物理去除T細(xì)胞或者滅活T細(xì)胞(例如用環(huán)孢霉素處理)的步驟， 因為從抗EBV抗體血清反應(yīng)呈陽性的個體中取得的T細(xì)胞會用EBV抑制B細(xì)胞永生化。通常，將EBV接種到人類B細(xì)胞樣本中培養(yǎng)3-4周。典型的EB病毒來源是B95-8 細(xì)胞系(ATCC#VR-149》培養(yǎng)上清。通常EBV轉(zhuǎn)化的物理特征在3-4周的培養(yǎng)周期結(jié)束后可以看到。利用相差顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)化細(xì)胞呈現(xiàn)個大，清晰，多毛的特征，并傾向于聚集成緊密的細(xì)胞簇。初始條件下，EB病毒系一般是多克隆的。然而，細(xì)胞培養(yǎng)時間過度延長的話， 由于特定B細(xì)胞克隆的選擇性生長，EB病毒系可能變成單克隆或者多克隆?；蛘叨嗫寺B 病毒轉(zhuǎn)化系可能是亞克隆的(例如通過控制稀釋培養(yǎng))，或者用合適的融合伙伴融合并至于限制稀釋的平板上以獲得單克隆B細(xì)胞系。用于EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的適宜的融合伙伴包括小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(例如SP2/0，X63-Ag8.653)，異源骨髓瘤細(xì)胞系(人鼠雜交，例如 SPAM-8, SBC-H20 和 CB-F7)和人細(xì)胞系(例如 GM1500，SK0-007, RPMI 8226 和 KR-4)。在一個最近改進(jìn)的EB病毒永生化方法中，在EB病毒暴露之前，先用CpG寡核苷酸刺激人類初始 CD 19+IgG+B 細(xì)胞。(Hartmann and Krieg. J. Immunol. 164 :944-953 (2000)) 以上過程可得到一個克隆擴(kuò)增的IgG+記憶B細(xì)胞培養(yǎng)庫，每個細(xì)胞培養(yǎng)都能產(chǎn)生1，2，3，4，5和/或10種不同的IgG。每個孔板內(nèi)的雜合細(xì)胞或者EB病毒永生化細(xì)胞可以被存儲作為特異性抗體種類的來源。作為抗體源的非永生化B細(xì)胞庫在分析上清液之前需從相應(yīng)的B細(xì)胞分離出條件上清，上清液分析期間，所有B細(xì)胞培養(yǎng)都要保存好。這樣孔板內(nèi)原始B細(xì)胞培養(yǎng)中的對應(yīng)于重要抗體的B細(xì)胞可以重新獲得，并用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的方法來拯救人類自然IgG編碼的mRNA。本發(fā)明建立了這樣一個B細(xì)胞庫，每個對應(yīng)于特定抗原特異性和/或每個代表1，2，5，10或者20能產(chǎn)生B 細(xì)胞的人類自然IgG能夠克隆，堆積和存儲(例如作為冷凍顆粒)。已除去用于分析的條件上清的B細(xì)胞顆粒在條件上清分析期間可以用多種方法存儲用適合于存儲活哺乳動物細(xì)胞的介質(zhì)(即含有10% DMSO細(xì)胞培養(yǎng)基)以完整的冷凍細(xì)胞的形式存儲，用RNA保護(hù)性細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞顆粒，以冷凍細(xì)胞溶解產(chǎn)物的形式(也就是TRIzol ，Invitrogen(Carlsbad, California))來存儲，或者不降解細(xì)胞的情況下，在室溫或者更低溫度下在防RNA降解的緩沖液中存儲(也就是RNAlater Ambion(Austin，Texas))。從原始定義的單個人類B細(xì)胞克隆和表達(dá)抗體的策略是本領(lǐng)域所已知的 (Wardemann等人，Science 301 1374-1377 (2003))。依據(jù)本發(fā)明的后續(xù)發(fā)展，RNA是從存儲的B淋巴細(xì)胞中分離得到的。所得的RNA是從免疫庫中挑選出來的核酸的集合，其中含有編碼人類自然免疫球蛋白的mRNA。在本發(fā)明中，事先挑選免疫球蛋以便結(jié)合重要的抗原。 分離RNA的方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是已知的(Liedtke等人PCR Methods Appl. 1994 Dec ；4 (3) 185-187)，如TRIzol 試劑(Invitrogen)。從非永生化抗原特異性B淋巴細(xì)胞中能夠獲得足量的RNA以用于RT-PCR中抗體的拯救。利用可以與編碼抗體基因的核酸序列側(cè)鏈雜交的種群特異性寡核苷酸，像單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄PCR這樣的方法可以用于擴(kuò)增重鏈和輕鏈變異核酸序列或其碎片(Coronella， 等人^)00) Nucleic Acids Res. 28(20) :E85)。舉例來說，利用人類特異性寡核苷酸，人類變異的重鏈和輕鏈抗體域可以利用PCR擴(kuò)增(參見Sblattero and Bradbury Immunotechnology 3:271-278(1998))。擴(kuò)增的序列可以用DNA序列表征，作為單個序列在表達(dá)系統(tǒng)中直接克隆。從單個B細(xì)胞擴(kuò)增常規(guī)的4鏈抗體的免疫球蛋白的其他技術(shù)在 Takahashi 等(Takahashi 等人，Journal of Biotechnology 49 (1996)，201-210)和 Embleton 等(Embleton 等人，Nucleic Acids Research, Vol. 20，No. 15,3831—3837)的文章中均有描述。Tiller 等(J Immunol Methods. 329(1-2) :1 12-124(2008))描述了用嵌套RT-PCR擴(kuò)增單個人類B細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)錄得到的重鏈和對應(yīng)輕鏈的方法，該人類B細(xì)胞可以用熒光活性細(xì)胞分類法獲得。接下來，被擴(kuò)增的核酸序列可以引入到合適的表達(dá)體系中存儲和進(jìn)一步的使用。 在表達(dá)體系中生成重組蛋白，如抗體，的方法是本領(lǐng)域所熟知的。通常，在宿主細(xì)胞中編碼抗體的核酸序列能夠以一種適宜表達(dá)抗體或其片段的形式被插入到重組表達(dá)載體中。適宜的表達(dá)形式要求重組表達(dá)載體含有一個或者多個與編碼抗體或其片段的核酸相關(guān)的調(diào)控序列，在某種程度上此序列會允許從核酸到mRNA的轉(zhuǎn)錄過程和mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程的進(jìn)行。調(diào)控序列可能包括啟動子，增強(qiáng)子和其他表達(dá)的調(diào)控元件(例如Poly A信號)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員都熟知的(Goeddel D. D. ，ed. ，Gene Expression Technology, AcademicPress, San Diego, Calif. (1991))。應(yīng)該理解解表達(dá)載體的設(shè)計可能會受轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的選擇和/或所要求的表達(dá)水平不同這些因素的影響。在一個實施方案中，為進(jìn)行免疫球蛋白的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)拯救， 將為RT和PCR實驗準(zhǔn)備的新制的引物與酶/核苷的主混合物加入到所有孔內(nèi)，孔內(nèi)有新解凍的PCR擴(kuò)增條，擴(kuò)增條內(nèi)有在-80°C下存貯的B細(xì)胞。利用相同或者不同的合適的3’端引物，使cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增相繼在同一個管內(nèi)進(jìn)行。如領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所知，反應(yīng)在溫度循環(huán)器下進(jìn)行。一旦RT和PCR實驗開始，立即開始反應(yīng)混合物的分析(例如，用 STOR Mfe的熒光染色瓊脂糖凝膠)。PCR是一種有純化作用的擴(kuò)增。例如，利用Qiagen PCR凈化離心柱，在合適的限制酶作用下擴(kuò)增元可以被純化和消化，消化物通過瓊脂糖凝膠純化，如Qiaquick 的凝膠萃取試劑盒Oliagen)。這樣，與人類自然免疫球蛋白輕鏈和重鏈對應(yīng)的DNA就被捆綁到預(yù)先消化的含有誘導(dǎo)性啟動子的表達(dá)載體中，周質(zhì)空間領(lǐng)導(dǎo)人信號采用標(biāo)準(zhǔn)方式。用電穿孔的方式將捆綁混合物引入到感受態(tài)細(xì)胞中，在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。采用兩個引物分別退火克隆位點的5'和3'的克隆PCR法，篩選單個克隆以確定插入質(zhì)粒的克隆，用STOR Mfe瓊脂糖凝膠染色法檢測PCR擴(kuò)增長度。輕鏈和重鏈基因的克隆可以通過測序進(jìn)行證實。我們計劃建立一個從每個人類有效供體采集至少IO4記憶B細(xì)胞從而建庫的方法，制備人類B細(xì)胞群，其中B細(xì)胞群含有至少IO5不同種類的自然生成的抗體，每個抗體都有成對的重鏈和輕鏈；將所述的B細(xì)胞群隨機(jī)分入不同B細(xì)胞亞群，每個亞群平均可以產(chǎn)生1-100不同種類的抗體；擴(kuò)增每個B細(xì)胞亞群從而產(chǎn)生一個擴(kuò)增的B細(xì)胞培養(yǎng)；在適宜保存其RNA的條件下，儲存每個B細(xì)胞亞群，這樣可以生成一個每個群平均可以表達(dá)1-100不同種類的抗體的非永生化B細(xì)胞群庫。接下來，我們計劃制備與所存儲的 B細(xì)胞亞群相應(yīng)的RNA樣本，對RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；分離對應(yīng)于可以自然配對的Vh區(qū)和\區(qū)的DNA。再下一步，我們計劃在可以表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)的宿主內(nèi)，克隆所述的與Vh區(qū)和\區(qū)對應(yīng)的DNA，在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，就可以形成一個自然配對的免疫球蛋白。對克隆人類自然IgG基因的抗原反應(yīng)活性篩選可以在用于測序的相同細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制上進(jìn)行。在抗原覆蓋的ELISA平板上，細(xì)胞培養(yǎng)的萃取物可以平行地被篩選結(jié)合。篩選抗原特異性抗體的B細(xì)胞庫利用免疫測定的B細(xì)胞條件上清來檢測連結(jié)免疫球蛋白的抗原，允許人們檢測哪個孔內(nèi)含有被刺激的可以編碼與抗原連結(jié)的免疫球蛋白的B細(xì)胞。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員均能夠獲得選擇性免疫球蛋白免疫測定所需要的試劑。例如，這樣的試劑包括但不限于針對抗體輕鏈和/或重鏈的多克隆或者單克隆抗體。制備和表征這種多克隆或者單克隆抗血清的方法是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知的。Daley等(Clin Diag Lab Immunol. 2005 12 :380) 在其文章中對適用于檢測標(biāo)記物的非限制性試劑進(jìn)行了描述。被刺激的B細(xì)胞將可溶性免疫球蛋白釋放到培養(yǎng)基中，使得人們可以方便地對B 細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行篩選來確定抗原特異性重鏈抗體的存在情況。例如，人們除去細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，可以檢測條件上清，用免疫測定中用來定量培養(yǎng)基中免疫球蛋白濃度的全部或者部分樣本研究哪個被刺激的細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)含有成功刺激的B細(xì)胞。這使人們在后續(xù)的免疫球蛋白基因克隆步驟中能夠排除未成功刺激的B細(xì)胞培養(yǎng)。這樣的篩選方法的應(yīng)用，允許人們關(guān)注唯一相關(guān)B細(xì)胞克隆的免疫球蛋白基因的下游克隆(抗原特異性人類自然免疫球蛋白生成細(xì)胞)。有機(jī)會獲得被刺激的B細(xì)胞條件上清使人們能夠篩選能夠生成具有理想功能特點的免疫球蛋白的B細(xì)胞克隆，例如在可疑抗原處，能夠中和受體/配基相互作用，對受體激活有激動或者拮抗作用，有高抗原連結(jié)親和力，或者能夠抑制酶的活性。對這些特性的篩選可以在從B細(xì)胞培養(yǎng)條件上清中分離得到的抗體上進(jìn)行，但是在條件上清本身中進(jìn)行更加方便。篩選包含有B細(xì)胞條件上清的抗體，以確定以上提到的活性類型的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知悉的。多相實驗法(比如平板，珠，微陣列和生物測定免疫測定中的顯色，熒光和放射性信號)和均相實驗法(比如LANCE，Alphascreen 或者用共焦成像系統(tǒng)例如 ABI' s FMAT 或者Evotech' s Opera ) 二者都適用于結(jié)合及活性測定。關(guān)于親和測定方法，舉例如生物測定方法，表面質(zhì)膜回聲方法或者懸臂式MEMS方法和速率(rate-off) 選擇性免疫測定方法(Friguet等人，J Immunol Methods. 198577 305)作為非排他性例子曾被提到。在一個實施方案中，在克隆擴(kuò)增前篩選可以產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。Love等[Nature Biotech. 24(6) :703-707(2006)]描述了一種用于微型雕刻的軟性印刷技術(shù)，它采用密集的含有單個細(xì)胞的微孔(每個0. I-Inl)排列來打印相應(yīng)細(xì)胞分泌的分子排列。這些細(xì)胞在打印之后繼續(xù)培養(yǎng)，這個微陣列以類似商業(yè)化的蛋白質(zhì)或者抗體微陣列相似的方式被探測。該方法使人們實現(xiàn)了顯示出期望特征的細(xì)胞快速確定，這些特征包括抗原特異性抗體的分泌和其隨后恢復(fù)為克隆擴(kuò)增。由B細(xì)胞培養(yǎng)上清所產(chǎn)生的抗體可能被檢驗用于免疫特異性連接，其方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？梢詰?yīng)用的免疫測定包括且不限于競爭性或者非競爭性試驗體系，僅舉幾例western印記，放射性免疫測定，ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)，“三明治”免疫測定， 免疫沉淀反應(yīng)檢測，沉淀素試驗，凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)，免疫擴(kuò)散試驗，凝集試驗，補(bǔ)體結(jié)合試驗，免疫放射性試驗，熒光免疫測定，和蛋白A免疫試驗等。以上試驗方法為常規(guī)手段并且是本領(lǐng)域知悉的。(參見 Ausubel 等人，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1，John Wiley & Sons, Inc.，New York，在此通過引證全部并入本申請)。生成抗體庫陣列(ARAs)ARA的原材料通過培養(yǎng)永生化克隆產(chǎn)生分泌IgG抗體來生成。人類免疫球蛋白分 ^nTl^ffl ELISA !的t示}(Ε. Harlow, D. Lane, Antibodies :A laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，1988))來分析。在一個實施方案中，標(biāo)準(zhǔn)96孔板或者384孔板的孔內(nèi)附著有原始重鏈和輕鏈特異性抗體兔抗人類IgG。該抗體，與辣根過氧化物酶結(jié)合后，只能在1 3000磷酸緩沖鹽/0.1%牛血清白蛋白溶液中次要應(yīng)用。這些試驗方法是由使用顯色底物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)發(fā)展而來的。每個孔內(nèi)擴(kuò)增的B細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的B細(xì)胞培養(yǎng)上清可用來建立抗體庫陣列(ARA)。 典型地，IO4到IO5個特點，優(yōu)選的切104個特點一式兩份被印記到每個ARA上。幾個這樣的印記技術(shù)是本領(lǐng)域中知悉的。在不丟失ELISA微陣列活性的情況下，人類免疫的典型ARA的形成要求將抗體固定化在固體基質(zhì)上。在結(jié)構(gòu)上蛋白質(zhì)是比DNA更復(fù)雜的分子，由于其疏水性和與表面的離子相互作用，當(dāng)其被固定到固體基質(zhì)上時它可能解開折疊，失去活性。在烘干過程中，也有可能使蛋白質(zhì)變性。微陣列ELISA的抗體捕捉是在低體積(0. 3到InL)下印記的。由于印記體積下，抗體捕獲點干得非?？?，長時間的存儲通常需要芯片被預(yù)先干燥。當(dāng)抗體比大多數(shù)蛋白質(zhì)都穩(wěn)定時，由于干燥和存儲仍然有可能會喪失活性。目前有三種將抗體連結(jié)到載玻片上的固定化化學(xué)范疇(i)物理吸附，(ii)活性基團(tuán)通過共價鍵結(jié)合，(iii)載玻片上功能基團(tuán)與抗體之間的親和相互作用。(Reviewed in Seurynck-Servoss SL 等人，F(xiàn)rontiers in Bioscience 12:3956-3964(2007).(i)蛋白質(zhì)的物理吸附能夠通過在蛋白質(zhì)和載玻片表面覆蓋的物質(zhì)之間的疏水作用或者離子相互作用進(jìn)行，這些物質(zhì)包括瓊脂糖，聚丙烯酰胺，硝化纖維，聚-L-賴氨酸，或氨基硅烷。雖然這是一種簡易的固定化技術(shù)，但其不容易控制，而且可能導(dǎo)致高可變性和表面抗體分子取向任意的不理想情況?？贵w被隨便的固定化到表面可能會導(dǎo)致結(jié)合到抗體區(qū)的抗原直接吸附到玻璃表面，因此很難接近。(ii)共價連接是通過功能基團(tuán)連接的，功能基團(tuán)包括賴氨酸或者精氨酸的伯胺基團(tuán)，半胱氨酸鉸鏈區(qū)的活性硫醇基團(tuán)或者與恒定區(qū)(Fc)H2域連接的碳水化合物，其中恒定區(qū)可以用于將抗體永久固定在表面上。盡管通過硫醇或者碳水化合物的附著允許抗體直接定位，但附著的流程卻更加復(fù)雜。在附著到表面之前，必須減少二硫鍵或者必須氧化碳水化合物組。這些氧化還原反應(yīng)會破壞抗體結(jié)構(gòu)，降低活性，還可能需要額外的純化步驟。最常用的用于抗體共價固定化的表面化學(xué)是環(huán)氧化物，醛類和N-羥基琥珀酰亞胺酯，它們都可以與蛋白質(zhì)表面的伯胺反應(yīng)。附著在表面的胼通過碳水化合物殘余粘附，附著在表面的順丁烯二酰亞胺通過硫醇基殘余粘附。(iii)通基于親和相互作用的抗體永生化典型實例是利用抗體獨(dú)特的官能團(tuán)或者蛋白質(zhì)序列為抗原結(jié)合位點定位。目前用于親和抗體永生化的技術(shù)有(i)蛋白質(zhì)A或G涂片，其對抗體的 Fc 區(qū)域有高親禾口力(Kusnezow, W. &J. D. Hoheisel Journal of Molecular Recognition, 16,165-176 (2003) ；Anderson, G. P.,等人Biosensors and Bioelectronics, 12,329-336(1997))或者(ii)對抗體獨(dú)特標(biāo)記有特異性的親和載玻片(Cha, T.，等人 Proteomics, 5 :416-419(2005) ；Wingren，C，等人 Proteomics，5 :1281-1291 (2005)) 通過 Fc特異性抗體實現(xiàn)固定化是很有吸引力的，因為商業(yè)化的單克隆抗體不需經(jīng)過任何進(jìn)一步處理就可以使用。蛋白質(zhì)A和G在抗體種類和緩沖條件上是變化的。因此，在所有條件下用蛋白質(zhì)A和G固定化所有抗體可能是不可能的，可能需要換用抗人類Fc抗體。鏈霉生物素-親和素相互作用有很高的親和力，研究顯示通過鏈霉生物素或者生物素-親和素相互作用的抗體固定化可能導(dǎo)致高度敏感試驗(Delehanty，J. B. &F. S. Ligler. Analytical Chemistry, 74, 5681-5687 (2002)) 然而，有必要用生物素化抗體在鏈霉生物素或者抗生素圖層的載玻片上進(jìn)行捕獲。生物素可以以化學(xué)法加入。含有聚L-賴氨酸斑的抗體陣列利用交聯(lián)層附著在玻璃表面(Haab，B.B.等人Genome Biol. 2,research 0004. 1-0004. 12(2001)),含有聚 L-賴氨酸斑 IgG 陣列(CEL Associates, Pearland, Tex.)利用光反應(yīng)交聯(lián)層(Molecular Biosciences, Boulder, Colo.)或者聚丙烯酰胺凝膠(Packard Bioscience, Meriden, Conn.)或者已經(jīng)描述過的載玻片(Miller，JC 等人 Proteomics 3，56-63 (2003))。然而典型的ARA含有每個孔板內(nèi)擴(kuò)增B細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的B細(xì)胞培養(yǎng)上清，可以同樣包括待檢測的靶標(biāo)抗原的陽性對照，條形碼和關(guān)于ARA組成的相似識別信息。在一個實施方案中，我們計劃在ARA的每個斑點或者位點用一個以上獨(dú)特抗體對ARA進(jìn)行印記或者定位，優(yōu)選至少每個點一個抗體克隆，更加優(yōu)選每個點1-50個抗體克隆， 再更加優(yōu)選是每個點10-20個抗體克隆。篩選用于靶標(biāo)連結(jié)的ARA可以采用天然蛋白質(zhì)，多肽或者其他包括各種試劑和疾病條件在內(nèi)的抗原性分子探測方法來篩選ARA。Haab BB(Molecular & Cellular Proteomics 4 :377-383(2005))撰文評論了各種篩選方法。利用抗體庫進(jìn)行高通量篩選和蛋白質(zhì)定量分析的方法是本領(lǐng)域知悉的。(Chaga GS 441:129—151 in Tissue Proteomics, B. C-S. Liu and J. R. Ehrlich eds. , Methods in Molecular Biology (2008)Springer-Verlag(NY) ；Cahill D., Journal of Immunological Methods,250(1~2) :81-91 (2001) ；Sanchez-Carbayo Μ. ,Clin Chem. 52(9) : 1651-1659(2006))。Sanchez-Carbayo(Sanchez-Carbayo Μ. , Methods MoI Biol. 428 :263-87(2008))和 Kopf 等(Kopf 等人，Int J Biochem Cell Biol. 39(7-8) 1305-1317(2007))撰文討論了抗體陣列在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)方面的應(yīng)用。ARA可能包括附著在微陣列表面的抗體。用結(jié)合到可檢測化合物上的目的抗原對 ARA進(jìn)行探測(interrogate)，化合物舉例如下熒光標(biāo)記化合物，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或生物發(fā)光標(biāo)記，或者是將酶的底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)添加到ARA內(nèi)，并作用一段時間，然后檢測適宜抗體的存在。在將目的抗原添加到以涂層的孔內(nèi)后，可能還會添加連接有可檢測化合物的第二個抗體。任何可用于檢測的合適的標(biāo)記物或者篩選工具都可以用于此項探測(interrogation)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠知道那些能夠被改進(jìn)以提高可檢測信號的參數(shù)和其他本領(lǐng)域內(nèi)已知的ELISA參量。關(guān)于ELISA的進(jìn)一步討論，參見Ausubel 等撰寫的《Current Protocols in Molecular Biology》。(Ausubel 等人，eds，(1994)， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc. , New York, section 1 1. 2. 1.)。在一些實施方案中，可以直接用全病毒或表面表達(dá)抗原的細(xì)胞對ARA進(jìn)行篩選。 本實施方案中病毒或者細(xì)胞被固定化在ARA內(nèi)，可以被任何已知的，包括以上所討論的，檢測技術(shù)檢測?？乖瓕贵w的親和力和抗原-抗體相互作用解除率可以通過競爭性結(jié)合試驗測量。一個競爭性結(jié)合試驗的實施例是放射性免疫測定，它包括在未標(biāo)記抗原數(shù)量上升的情況下，用目的抗體培養(yǎng)標(biāo)記抗原(例如3H或125I)，檢測結(jié)合到標(biāo)記抗原上的抗體。目的抗體對特定抗原的親和力和結(jié)合解除率可以用katchard點分析的數(shù)據(jù)來確定。和第二抗體的競爭也可以用放射性免疫測定法來檢測。在本實施方案中，在未標(biāo)記的第二抗原數(shù)量上升的情況下，用結(jié)合有標(biāo)記化合物(例如咕或1251)的目的抗體培養(yǎng)抗原。對應(yīng)ARA “hits”孔板內(nèi)對抗體生成克隆的拯救永生化的抗體生成克隆可能會通過限制稀釋培養(yǎng)被解纏繞，然后用反拯救ELISA 進(jìn)行陽性抗體檢測。生產(chǎn)針對特定抗原的人類自然抗體的B細(xì)胞克隆被連續(xù)稀釋直至達(dá)到每孔內(nèi)一個B細(xì)胞的濃度，然后用反IgG捕獲ELISA法篩選所期望抗體的生成。這樣單個抗體生成B細(xì)胞雜合細(xì)胞對特定抗原的特異性就可以被確定和分離出來。在一個實施方案中，所期望的人類自然抗體的“拯救”涉及到在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)自然配對的克隆重鏈和輕鏈的表達(dá)。Coronella (Nucleic Acids Res. 28(20) :E85 (2000)) 發(fā)現(xiàn)了用FACS從單個B淋巴細(xì)胞中分離人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈并進(jìn)行擴(kuò)增的方法。用嵌套RT-PCR方法，Coronell乂2000)記述了一種在體內(nèi)重新產(chǎn)生成對的來自大量細(xì)胞的Vh 區(qū)和 Vl 區(qū)的方法。TillerQ. Immunol Methods. 329(1-2) :112-124(2008))也描述了擴(kuò)增重鏈和相應(yīng)輕鏈基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，其中輕鏈基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是從單個人類B細(xì)胞克隆中利用嵌套RT-PCR用熒光激活細(xì)胞分選法得到的。TilleH2008)進(jìn)一步描述了體細(xì)胞變異 Ig基因到原細(xì)菌系基因的回復(fù)突變，將免疫球蛋白基因從單個人類B細(xì)胞克隆到真核表達(dá)載體，在人類腎細(xì)胞系產(chǎn)生重組抗體。其中將Coronella(2000)和TilleH2008)的方法全部納入了參考范圍?？梢杂萌鏓LISA法和熒光免疫檢測法對自然配對的人類抗體重組體進(jìn)行篩選。通過此法，能夠獲得表達(dá)人類自然配對免疫球蛋白的細(xì)胞系。本發(fā)明涉及到人類 Ig重組體和表達(dá)重組體Ig的細(xì)胞系，其中重組體Ig包括輕鏈和重鏈的自然配對。抗體表征和鉛的選擇/驗證一旦B細(xì)胞雜合細(xì)胞或者EBV永生化克隆被確定為能夠生產(chǎn)預(yù)期種類的IgG， 永生化的B細(xì)胞系就可以采用領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行產(chǎn)生毫克級的所謂的"hit"抗 # W λ IS Il ^ Zfe ( # JaL Monoclonal Antibody Production, The National Academies Press (1999))ο這樣的永生化B細(xì)胞系可以利用單個抗體生成克隆的Vh區(qū)和\區(qū)基因的拯救進(jìn)行表征。額外的步驟，比如用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行Vh區(qū)和\基因的克隆和測序，可以被用于此新型永生化B細(xì)胞系的增殖。利用ARA平臺發(fā)現(xiàn)新的功能性抗原決定基本發(fā)明的抗體庫陣列(ARA)提供了一個高通量平臺，促進(jìn)新的功能性抗原決定基的確定和被保護(hù)實驗者的B細(xì)胞中相應(yīng)人類單克隆抗體(mAbs)的確定。這個平臺為發(fā)現(xiàn)能在自然構(gòu)象下結(jié)合靶標(biāo)的人類Abs提供了可能?？贵w庫可以在被不同mAb結(jié)合的抗原或者自然靶標(biāo)的不同抗原決定基下生成。由于給定蛋白質(zhì)或者抗原的不同抗原決定基與靶標(biāo)蛋白質(zhì)的不同功能特點有關(guān)，此ARA平臺可以實現(xiàn)被人類免疫系統(tǒng)瞄準(zhǔn)的多功能抗原決定簇的鑒定。典型的，ARA平臺可以用于篩選幾百個被特定疾病的特異性抗體影響的人類對象。由于每一個對象可以提供大約IO5IgG種類，此ARA平臺在生產(chǎn)高通量mAb庫方面非常有用，mAb能夠瞄準(zhǔn)幾乎所有被人類免疫系統(tǒng)瞄準(zhǔn)的功能性抗原決定基。由于ARA平臺允許基于成百上千的供體樣本的快速篩選，該高通量方法實現(xiàn)了在低試劑使用量下的微陣列蹄選。在本發(fā)明的一方面，ARA平臺用于恢復(fù) IO7種對抗濾過性毒菌靶標(biāo)，比如附圖2 所示的人類免疫缺陷性病毒(HIV)，的重組IgG種類。在該實施例中，涉及到的從暴露在HIV 下的實驗對象中采集的血液樣本和含有IgG+記憶B細(xì)胞。在多孔平板上培養(yǎng)單個的B細(xì)胞，實現(xiàn)克隆擴(kuò)增和抗體分泌細(xì)胞分化。ARA是通過人體B細(xì)胞培養(yǎng)中IgG的永生化形成的。用HIV感染相關(guān)的自然濾過性毒菌靶標(biāo)篩選該ARA。這些靶標(biāo)可能是從所有病毒粒子或者病毒樣蛋白質(zhì)，單個蛋白質(zhì)(例如表面蛋白或者包膜蛋白)或者被HIV感染的細(xì)胞中篩選出來的。確定ARA靶標(biāo)連結(jié)點對應(yīng)的B細(xì)胞培養(yǎng)，從細(xì)胞培養(yǎng)分離得到的B細(xì)胞裂解物中拯救IgG重組體。采用ARA平臺技術(shù)，抗HIV單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的方法提供了符合潛在保護(hù)性抗濾過性病原體反應(yīng)的人類IgG+記憶B細(xì)胞生成的存檔，該篩選是在靶標(biāo)的自然構(gòu)象下進(jìn)行的， 因此能產(chǎn)生更多的相關(guān)結(jié)果。
在本發(fā)明的一方面，實現(xiàn)了假設(shè)得自不同種類HIV變形或者相同靶標(biāo)蛋白質(zhì)內(nèi)的多靶標(biāo)的平行篩選。這使得其可以利用廣泛交叉反應(yīng)鑒定抗體。對應(yīng)給定靶標(biāo)上單個抗原決定簇的抗體的發(fā)現(xiàn)erbB2致癌基因可以編碼生長因子受體，生長因子受體的過度表達(dá)與侵襲性腫瘤和不良預(yù)后有關(guān)。有些指向該分子的抗體在體內(nèi)有抗癌作用，但是有些卻沒有。利用計算機(jī)指導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程和定點突變，對erbB2基因上抗原決定基結(jié)合作用的抑制(HERCEPTIN )和非抑制作用(HF)分析揭示了兩種不同的結(jié)合相互作用。(Wang等人MoI Immunol. (2004)40(13) :963-969)。非抑制作用抗體HF只能識別erbB2胞外域(ECD)的N末端，然而抑制作用抗體HERCEPTIN 結(jié)合到其專有的C末端。ARA篩選平臺可用于指向給定靶標(biāo)不同抗原決定基的抗體鑒別和表征。這使得具有與抗原決定簇結(jié)合的特異性功能有潛在活性的抗體的發(fā)現(xiàn)成為可能。在本發(fā)明的這一方面，噬菌體顯示庫的成員可以表達(dá)由給定靶標(biāo)基因片段表達(dá)的部分蛋白質(zhì)，該庫可以用于確定對給定靶標(biāo)產(chǎn)生假定免疫反應(yīng)的抗原決定基庫。在一個實施方案中，靶標(biāo)的功能性測試和其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，比如如定點突變，可以結(jié)合起來用于具有特異性功能的單個或者組基因片段關(guān)系的分析。由噬菌體顯示提供的基因片段決定了抗原決定基特異性，此ARA篩選平臺可用于使抗靶標(biāo)Abs成簇。從功能性抗原決定簇得到的Abs代表樣本的詳細(xì)表征(如測序 sequencing)可用于進(jìn)一步揭示相互作用的特點，該特點可能可以積極或者消極用于與每個抗原決定簇相關(guān)的功能。在本發(fā)明的一方面，兩個或者更多抗原決定簇的成對分析可用于確定潛在的或者隱藏的功能性抗原決定基。這些隱藏的抗原決定基可能可以促進(jìn)與不同抗原決定基得結(jié)合，或與已知功能相關(guān)的功能。該方法允許對抗原決定基間隔的擴(kuò)展，基于之前的方法在文獻(xiàn)中抗原決定基間隔被比喻成唯一可用的東西。在一個實施方案中，如附圖3所示，可以生成噬菌體基因片段顯示(GFPD)庫。利用本領(lǐng)域已知的方法可以生成一個噬菌體基因片段顯示表達(dá)庫。(參見Silverman G. J.， 第 20章Construction and Selection from Gene Fragment Phage-Display Expression Libraries, in Phage Display :A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K. Scott, Gregg J. Silverman, CSHL Press, 2004)基因片段是通過核酸內(nèi)切酶降解可以編碼給定靶標(biāo)基因得到的。通過將基因片段插入到噬菌體的基因組DNA 中，在噬菌體表面表達(dá)部分靶標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，就可以產(chǎn)生一個GFPD庫。通過在指向靶標(biāo)的人類抗體上篩選GFPD庫，獲得了一個包含有被恢復(fù)的基因片段的人類抗原決定簇庫。對應(yīng)不同抗原決定簇A、B、C等的基因片段(GFPD庫的成員)被分別定義。在一個實施方案中，將基因片段覆蓋在已知三維結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)蛋白質(zhì)上，以確定基因片段對應(yīng)的特定抗原決定基。在ARA平臺上，利用完整的蛋白質(zhì)或者病原體靶標(biāo)進(jìn)行的篩選通常能夠形成眾多 hit,如附圖4所示。用與抗原決定基A、B、C等對應(yīng)的GPDL成員完成同來源ARA的進(jìn)一步篩選。通常，每個抗原決定基篩選2-3個GPDL成員，盡管可被篩選的抗原決定基對GPDL成員數(shù)沒有任何上限。Hit形式的比較對用被抗原決定基特異性基因片段簇產(chǎn)生的完整蛋白質(zhì)也可以揭示以前未發(fā)現(xiàn)的新型抗原決定基。優(yōu)選地，抗原決定基特異性基因片段和完整靶標(biāo)都可以被抗體識別出來。因此，成千上萬個特定靶標(biāo)抗原的hit可以被分解為10，20， 30，40或者更多的對應(yīng)抗原決定簇的抗體“族”(“families”)?？贵w可以通過與可以識別新型抗原決定基的抗體Vh區(qū)對應(yīng)的基因測序來進(jìn)一步表征。附圖5為用ARA平臺來確定功能性抗原決定基抗體的步驟的示意圖。功能相關(guān)的篩選得到已知的和新確定的抗原決定基的典型的抗體在Vh區(qū)被排序并拯救，以用于進(jìn)一步的開發(fā)。用這個方法可以確定適合于治療方法發(fā)展和對靶標(biāo)特異性功能有效地主動和被動疫苗開發(fā)的獨(dú)特抗體。本發(fā)明同樣涉及特異性抗體庫，抗體和對本發(fā)明方法中抗體對應(yīng)的特異靶標(biāo)有效地治療方法和疫苗。利用ARA對進(jìn)行抗體功能篩選哮喘是一種復(fù)雜的肺部傳染病，其可以用氣道高反應(yīng)性(AHR)，嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，粘液分泌過多，皮下纖維化，IgE水平升高來表征。白細(xì)胞介素13 (IL-U)是哮喘過敏性反應(yīng)效應(yīng)階段的關(guān)鍵媒介物。(Huang SK，等人J Immunol. (1995) ；155(5) =2688-2694) 抗IL-13抗體在治療阻礙其相關(guān)信號途徑的哮喘方面非常有用。(W0/2005/062967)。IL-13 同樣與霍奇金病(HD)相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)其在HD細(xì)胞系中過量表達(dá)。(Kapp，U.，等人J. Exp. Med.，Volume 189，Number 12,1999 ；1939-1946)。對霍奇金病(HD)有效的抗 IL-13 抗體因IL-13的作用會影響受體結(jié)合。單克隆抗體(MAb)263是廣泛使用的單克隆抗體，它可以識別生長激素(GH) 受體的胞外域(EOT)，在體外和體內(nèi)都可作為GH激動劑。(Wan Y.，等人，Molecular Endocrinology 17(11) :2240-2250 (2003))。小鼠單克隆抗體，術(shù)語為BAH-I，在人類巨核細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)，其可以特異性識別血小板生成素(TPO)的細(xì)胞表面受體(C-Mpl)，顯示了其激動劑活性。(Deng B.，等人，Blood，92 (6) :1981-1988(1998)).并不是所有指向激素結(jié)合點的MAb和在激素結(jié)合時充當(dāng)全競爭物的MAb都可以作為激動劑并引發(fā)信號。(Rowlinson SW，等人，1998 J Biol Chem 273:5307-5314).有文獻(xiàn)報道過將激動劑限制在MAb的狹小范圍內(nèi)作用于促紅細(xì)胞生成素受體，大量研究顯示，96 個作用于受體的MAb，只有4個顯示出激動劑活性。(Elliott S，等人，1996 J Biol Chem 271 :24691-24697).erbB2致癌基因能編碼生長因子受體。erbB2的過量表達(dá)經(jīng)證明與很多侵略性腫瘤和預(yù)后較差有關(guān)。一些指向該分子的抗體在體內(nèi)具有抗腫瘤效果，但是有些抗體卻沒有此效果。(Wang 等人 MoI Immunol. 2004 Feb ；40 (13) :963-969).幾個用于抑制腫瘤壞死因子(TNF)功能的抗體通過與TNF結(jié)合以影響其不同功能的方式來發(fā)揮作用。INFLIXIMAB 通過與可溶性(在血液內(nèi)能自由移動)和跨膜形式 (位于T細(xì)胞和其他相似細(xì)胞的細(xì)胞膜膜外側(cè))的TNF α的高親和性結(jié)合來抑制TNF α的生物活性，抑制或者防止TNF α和其受體的有效結(jié)合。REMICADE and HUMIRA (另一種TNF拮抗劑)屬于抗TNF抗體的亞類(它們是自然生成形式的抗體)，能夠抑制各種形式 (胞外，跨膜，和與受體結(jié)合)的 TNF α。(Choy EH 等人 N EnglJ Med. 2001 ；344 :907-916)。 ENBREL ,第三種TNF拮抗劑，屬于不同的亞類，由于其修飾過的形式，不能抑制與受體結(jié)合的 TNF α。⑶觀存在于T細(xì)胞表面，在其激活過程中起著重要作用。⑶觀通過與其配基結(jié)合從而被觸發(fā)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過CD^進(jìn)行。CD^的激活依賴于其細(xì)胞質(zhì)域的磷酸化過程。CD28并沒有內(nèi)在的磷酸化活性，反之它依賴于外在的激酶作用，例如p561ck。然而，有些抗體可以通過預(yù)先排斥受體附近的磷酸酶(與激酶作用相反)，從而充當(dāng)CM8受體的超級激動劑。通過本發(fā)明的ARA平臺技術(shù)，針對不同抗原決定基的自然抗體的高通量鑒定和分類得以實現(xiàn)，并能夠?qū)Υ罅空{(diào)節(jié)不同抗原決定簇各種功能的抗體同樣進(jìn)行鑒定。本方法同樣可以鑒定隱藏的抗原決定簇。對有些確定的隱藏抗原決定基功能的調(diào)節(jié)同樣也是對已知的功能性抗原決定基或者整個靶標(biāo)功能調(diào)節(jié)的協(xié)同作用。在一個實例中，單克隆抗體可以排列在固體表面上并通過ARA內(nèi)離散的靶標(biāo)特異性元素克隆來分類。在一些實施方案中，MAb被固定在器皿的內(nèi)表面，這些器皿主要從微滴度孔，微滴度板，試管，培養(yǎng)皿，微通道和微陣列中選擇。這樣，就可以在原位對抗體從通信細(xì)胞引發(fā)信號的能力進(jìn)行檢測。通常情況下，在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是不擴(kuò)散的， 它結(jié)合到一種從樣品接受地(例如微滴度板，微陣列等)中分離出來的不溶性支撐物上。該不溶性支撐物可以是由任何抗體能夠結(jié)合上去的物質(zhì)組成的，它很容易從可溶性材料中分離出來，或者和整個篩選方法互不排斥。這種支撐物的表面可能是固體的，可能是多孔的或者任何可用的形狀。合適的不溶性支撐物舉例如下，如微滴度板，微陣列，膜和水珠。這些通常是由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖，尼龍或者消化纖維，聚四氟乙烯等制成的。微滴度板和微陣列尤其方便，因為利用他們，用少量的試劑和樣本就可以同樣進(jìn)行大量的檢測。 由于化合物的結(jié)合方法與試劑和整個方法是一致的，所以化合物的特殊結(jié)合方式不是至關(guān)重要的，這種結(jié)合方式可以維持化合物的活力并且是不可擴(kuò)散的。被改造為能夠直接或者間接表達(dá)對細(xì)胞表面受體活性調(diào)節(jié)做出響應(yīng)的可測量“信號”(“importer”)物質(zhì)(可檢測性標(biāo)簽)的細(xì)胞系可以被用于篩選能夠激活或者抑制受體的單克隆抗體。在一些實施方案中，細(xì)胞表面分子(例如受體)的激活與影響底物共價鍵斷裂的酶的活力是相耦合的。酶可以從本組物質(zhì)中選擇，包括內(nèi)酰胺酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，甘露糖苷酶，酸性磷酸酶，堿性磷酸酶，和磷酸二酯酶II。底物可以從本組物質(zhì)中選擇，包括對氨基苯-β -D-半乳糖苷，對氨基-α -D-半乳糖苷，對氨基-α -D-葡萄糖苷，對氨基_ β _D_葡萄糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯-β -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯磷酸鹽和對氨基苯磷酸膽堿或其衍生物。底物的斷裂通常與可檢測的變色或者熒光反應(yīng)相關(guān)連。在一些實施方案中，可檢測性標(biāo)簽是熒光基團(tuán)，化學(xué)染料，放射性結(jié)合試劑，化學(xué)發(fā)光結(jié)合試劑，電化學(xué)發(fā)光試劑，磁結(jié)合試劑，順磁結(jié)合試劑，熱磁結(jié)合試劑，能產(chǎn)生有色物質(zhì)的酶，能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的酶，能產(chǎn)生磁性物質(zhì)的酶。在一些特定實施方案中，可檢測性標(biāo)簽是釕或者多釕標(biāo)記物。篩選用染料或者熒光試劑處理的細(xì)胞的方式是本領(lǐng)域熟知的。相當(dāng)可觀的與細(xì)胞基因工程相關(guān)的文獻(xiàn)均利用能產(chǎn)生熒光的蛋白質(zhì)，例如將改性的綠色熒光蛋白(GFP)作為通信分子。Morise 等(Biochemistry 13(1974)，p. 2656-2662)和 Ward 等(Photochem. Photobiol. 31(1980)，p. 611-615)發(fā)現(xiàn)了野生型 GFP 的一些特點。Aequorea victoria 水母的GFP最大激發(fā)在395nm，最大發(fā)射波長在510nm，而且它不需要外部因子來激發(fā)起熒光活性。發(fā)出熒光的(luminogenic)可檢測性底物，例如熒光素酶，也可以利用。美國專利^016 和討361觀描述了檢測和評估胞外信號的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試驗方法和化合物，該方法利用了可以表達(dá)細(xì)胞表面受體的重組細(xì)胞，且該專利包含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的通信基因結(jié)構(gòu)，該轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件能夠?qū)?xì)胞表面受體活動做出響應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)高通量篩選(“HTS")用化合物和生物學(xué)試劑的混合物連同能夠注入到96 或者384標(biāo)準(zhǔn)微滴度板內(nèi)的指示劑化合物。每個孔內(nèi)測量的信號，熒光釋放，光密度或者放射能，與孔內(nèi)所有試劑發(fā)出的信號結(jié)合到一起顯示出孔內(nèi)所有分子的總平均數(shù)。Science Applications International Corporation (Science Applications International Corporation(SAIC) 130 Fifth Avenue, Seattle, Wash. 98109)描述了一種成像板式指示器。這個系統(tǒng)利用CCD相機(jī)對96孔板整個區(qū)域成像。所得圖像用于分析計算每個孔內(nèi)所有試劑的總熒光強(qiáng)度。Molecular Devices, Inc. (Sunnyvale, Calif.)描述了一種系統(tǒng) (FLIPR)，其利用低角度照射激光掃描和在96孔板的孔底200微米范圍內(nèi)選擇性激發(fā)熒光的方法來降低細(xì)胞單層膜成像時的背景影響。該系統(tǒng)利用CCD相機(jī)來對96孔板底部整個區(qū)域成像。盡管這個系統(tǒng)能夠測量孔底部細(xì)胞單層膜產(chǎn)生的信號，但是所測得的信號是孔內(nèi)整個區(qū)域的平均值，因此仍然認(rèn)為該信號是一種細(xì)胞群體的平均響應(yīng)值的測量。該圖像用于分析計算細(xì)胞試驗中每個孔內(nèi)的總熒光信號。細(xì)胞基篩選系統(tǒng)中，為了激活響應(yīng)也應(yīng)用了流體傳輸設(shè)備，例如FLira系統(tǒng)，來激發(fā)響應(yīng)，這樣利用宏觀成像系統(tǒng)就能夠觀察到整個孔內(nèi)群體平均響應(yīng)情況。與高通量篩選形成對照的是，各種高含量篩選(HCQ被開發(fā)出來以滿足細(xì)胞成分和作用過程中時空動力學(xué)詳細(xì)信息的需要。高含量篩選能夠自動提取與細(xì)胞結(jié)合的特異性熒光試劑的各色熒光信息(Giuliano and Taylor (1995), Curr. Op. Cell Biol. 7 4 ；Giuliano 等人(1995)Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24 :405)，并用可測量空間和時間動力學(xué)的光學(xué)系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行分析。(Farkas等人(1993)Ann. Rev. Wiysiol. 55 785 ；Giuliano 等人(1990)In Optical Microscopy for Biology. B. Herman and K. Jacobson(eds.), pp.543-557. ffiley-Liss, New York ;Hahn 等人(1992)Nature 359 736 ；Waggoner 等人(1996) Hum. Pathol. 27 :494)。高含量篩選可以利用熒光標(biāo)記抗體，生物配基，和/或核酸雜交探針在固定化細(xì)胞上實現(xiàn)；或利用多色熒光指示劑和“生物傳感器”(biosensor)在活細(xì)胞上實現(xiàn)。固定化細(xì)胞和活細(xì)胞的選擇取決于所需的特定細(xì)胞試驗方法。固定的細(xì)胞實驗是最簡單的，因為微滴度板內(nèi)的初始活細(xì)胞庫可以用各種化合物以檢測劑量處理，然后細(xì)胞就可以被固定用特異性試劑標(biāo)記和檢測。固定化之后不能對細(xì)胞進(jìn)行任何環(huán)境控制。僅可以在一個時間點獲得空間信息。數(shù)千種可用于細(xì)胞的抗體，配基和核酸雜交探針的可用性使得這個方法對于多種細(xì)胞篩選非常有吸引力。固定化和標(biāo)記步驟的自動實現(xiàn)，使得該方法效率很高?；罴?xì)胞試驗更加成熟有效，這是因為含有理想試劑的活細(xì)胞庫的能夠隨時間，空間被篩選。必須保持細(xì)胞的生理健康以適應(yīng)多種熒光測量的需要，所以測量中需要控制細(xì)胞的環(huán)境(溫度，濕度和二氧化碳)。目前可以顯示細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)變化和分子活動情況的熒光生理指標(biāo)和生物傳感器越來越多。(Giuliano等人，(19%)Arm. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24 :405 ；Hahn等人，(1993) In Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. W. T. Mason, (ed. ), pp. 349-359, Academic Press, San Diego).熒光試劑的使用和其可用性促進(jìn)了活細(xì)胞和固定化細(xì)胞的高含量篩選的發(fā)展。由
31于多色自動提取儀器制造的進(jìn)步，高含量信息使得發(fā)展HCS自動化儀器成為可能。Taylor 等(American Scientist 80 (1992)，p. 322-335)描述了很多相關(guān)的方法和應(yīng)用。典型試驗方法中，夠表達(dá)靶標(biāo)受體的細(xì)胞和被改造包含有對受體激活和抑制敏感的可檢測信號基因系統(tǒng)的細(xì)胞可用于接觸含有指向受體分子的單克隆抗體的ARA。在一些實施方案中，ARA包含一個多孔板(96或者384孔)，每個孔內(nèi)含一種已知單克隆抗體?？赡苡斜匾獪?zhǔn)備多個含有單個單克隆抗體的“點”，這樣的話MAb濃度才能足夠大以引發(fā)可檢測性信號。同樣地，每個孔內(nèi)必須含有103，104，或者IO5以上的細(xì)胞以激發(fā)可檢測性信號。 在實例中，例如U. S. Pub. Pat App. No. 20070275435所描述的，可以采用微孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)實時監(jiān)測的細(xì)胞培養(yǎng)芯片。在通訊細(xì)胞接觸ARA儀器表面后，未被檢測性單克隆抗體捕獲的細(xì)胞會通過流體剪切力去除。被捕獲的細(xì)胞在儀器上以允許細(xì)胞生長和通信物質(zhì)表達(dá)的方式被培養(yǎng)。保留在被捕獲的細(xì)胞內(nèi)部的通信物質(zhì)可以利用ARA設(shè)備直接測量(例如利用可檢測性底物)。 采用這種方法，擁有受體激動活性或者拮抗活性的單克隆抗體可以利用通信信號的有無來進(jìn)行確定，通信信號由代表成組的單克隆抗體的ARA設(shè)備上離散元素捕獲的細(xì)胞引發(fā)的。例如，NF-K B(核因子被激活的B細(xì)胞的κ輕鏈增強(qiáng)子)是一個蛋白質(zhì)復(fù)合物，它可以充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子。幾乎所有動物細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有NF-kB的存在，它與外界刺激的細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)。很多細(xì)胞表面受體的刺激，比如RANK，TNFR，會直接導(dǎo)致NF-κ B被激活，在基因表達(dá)中快速變化。人類胚胎腎臟細(xì)胞系在NF-K B響應(yīng)元件(NF-κ B-bla HEK 293T CellSensor Cell Line, Invitrogen Corp.，Calif.)的調(diào)控下能夠穩(wěn)定表達(dá) β -內(nèi)酰胺酶基因，對腫瘤壞死因子α (TNFa)的刺激作出響應(yīng)，使得NF-κ B信號途徑被激活，隨之開始表達(dá)β內(nèi)酰胺酶。β內(nèi)酰胺酶的表達(dá)通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)底物 (LiveBLAzer-FRET B/G Substrate, Invitrogen Inc.，Calif)來定量。底物為親脂性的酯化物，它可以很容易地進(jìn)入通信細(xì)胞系。經(jīng)內(nèi)源性細(xì)胞質(zhì)酯酶斷裂，底物被轉(zhuǎn)換成能夠在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)保留的帶負(fù)電荷的底物。內(nèi)酰胺酶的斷裂空間上分成兩個底物生色團(tuán)，分裂FRET并產(chǎn)生藍(lán)色熒光信號，波長為450nm(用409nm激發(fā))。β內(nèi)酰胺酶未裂解時，在 560nm(用409nm激發(fā))處底物產(chǎn)生綠色熒光信號。藍(lán)色熒光信號比例提高即顯示出β內(nèi)酰胺酶活性的提高。對Toll樣受體(TLR)的刺激會導(dǎo)致NF- κ B的激活(Hayden MS, West AP, Ghosh S(October 2006). " NF- κ B and the immune response " . Oncogene 25(51) 6758-6780)。單克隆抗體激動TLR的受體激動活力可能導(dǎo)致由于受體細(xì)胞系內(nèi)TNF α和隨后的β內(nèi)酰胺酶表達(dá)提高而引起的內(nèi)生NF-κΒ的高水平激活。反之，拮抗劑活性可能導(dǎo)致 β內(nèi)酰胺酶表達(dá)水平的降低。在執(zhí)行TLR的單克隆抗體存在時，TLR的調(diào)節(jié)水平可由監(jiān)控得到的由FRET底物產(chǎn)生的藍(lán)綠熒光信號比例變化得到，例如藍(lán)色熒光信號比例上升是TLR 催化劑的指示信號，藍(lán)色熒光信號比例下降是TLR抑制劑的指示信號。存在給定的Mab情況下TLR活性(activity)水平可以和對照(例如，存在已知活性的化合物情況下)的TLR 活性水平進(jìn)行比較。本發(fā)明的方法同樣涉及到可以由恢復(fù)的V基因序列產(chǎn)生的治療性抗體，該抗體可以指向靶標(biāo)病原體或者抗原的不同功能抗原決定基，或者對靶標(biāo)受體有功能性影響。本發(fā)明中的方法可以應(yīng)用到小分子篩選。通過鑒定與特異性功能相關(guān)的抗原決定基或者抗原決定簇，可以檢測人造小分子或者天然小分子與功能性抗原決定基結(jié)合的效力和活性，其中功能性抗原決定基由本發(fā)明方法確定。本發(fā)明中的方法同樣涉及到疫苗設(shè)計方法，通過確定不同的抗原決定簇，從而能夠制備指向靶標(biāo)病原體或者抗原的不同部位的疫苗。本發(fā)明中的方法同樣涉及到由回復(fù)的V基因序列和。生成的治療性抗體和。試劑盒本發(fā)明提供了所述的方法可以應(yīng)用的試劑盒。一實施方案中，試劑盒包含有本發(fā)明中抗體組成的陣列(ARA)，優(yōu)選地還包括一個或者多個內(nèi)有已純化了的抗體的容器。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包括不會與目的多肽反應(yīng)的對照抗體。另一特定實施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有檢測抗體和目的多肽結(jié)合的方法(例如，抗體可能與可檢測底物，比如熒光化合物、酶底物、放射性化合物或者發(fā)光化合物，成對結(jié)合；或者能識別第一抗體的第二抗體可能與可檢測底物結(jié)合)。試劑盒還包括獨(dú)立的通信標(biāo)記抗人類抗體。在本實施方案中，抗體和多肽抗原的結(jié)合可以利用所述的信號標(biāo)記抗體的結(jié)合來檢測。一些試劑盒中包括與胞外域蛋白質(zhì)(例如受體)功能相耦合的信號系統(tǒng)的細(xì)胞系。一些試劑盒中包括比色試劑，熒光檢測試劑或者光度檢測試劑。本發(fā)明的另一實施方案中，試劑盒為可篩選對增殖的和/或癌變的核苷酸和多肽有特異性的抗體血清的診斷性試劑盒。這樣的試劑盒內(nèi)包括不會和目的多肽反應(yīng)的控制抗體。這樣的試劑盒可能包括已充分分離的帶有抗原決定基的多肽抗原，該抗原決定基對至少一種抗多肽抗原抗體有免疫活性。此外，該試劑盒包括檢測所述的抗體和抗原結(jié)合的方法(例如，抗體可能與熒光化合物，如熒光素或若丹明，成對結(jié)合，即可被流式細(xì)胞術(shù)檢測)。在具體實施方案中，試劑盒可能含有重組生成的或者化學(xué)合成的多肽抗原。試劑盒中的多肽抗原被固定到固體支撐物上面。在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種可以篩選含有本發(fā)明的多肽抗原血清的診斷性試劑盒。該診斷性試劑盒包括充分分離的對多肽或者多核苷酸抗原有特異性免疫活性的抗體庫，和檢測所述的多肽或者多核苷酸抗原與抗體結(jié)合的方法。因此，本發(fā)明提供了一種測定系統(tǒng)(assay system)或者試劑盒來實現(xiàn)該診斷方法。試劑盒包括帶有表面結(jié)合重組抗原的支撐物和用來檢測表面結(jié)合抗抗原抗體的信號標(biāo)記抗人類抗體。本專利說明書中引用的所有出版物和專利申請在此通過引證并入本申請，就如同單個出版物或者專利申請是在具體情況下和分別被引用并入本申請。盡管為了清楚起見，已經(jīng)用說明和舉例的方式對前述發(fā)明進(jìn)行了一些詳細(xì)描述， 依照本發(fā)明的教導(dǎo)、在沒有脫離附上的權(quán)利要求書的精神或者范圍的情況下，對本申請進(jìn)行一些改變和修飾，，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易的。
權(quán)利要求
1.用于制備抗體庫陣列(ARA)的方法，該方法包括(a)從每個有效數(shù)量的人類供體中獲得至少IO4記憶B細(xì)胞；(b)制備人類B細(xì)胞群，所述的其中所述的細(xì)胞群含有至少IO5不同種類的自然生成抗體，其中每個抗體有自然配對的重鏈和輕鏈；(c)將所述的B細(xì)胞群分成B細(xì)胞亞群，每個細(xì)胞亞群產(chǎn)生至少1種不同種類的抗體；(d)擴(kuò)增每個B細(xì)胞亞群以產(chǎn)生擴(kuò)增的B細(xì)胞培養(yǎng)；(e)在所述的B細(xì)胞能夠分泌抗體到培養(yǎng)基的條件下，在所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的每個B細(xì)胞培養(yǎng)；和(f)將所述的分泌到培養(yǎng)基中的抗體置于固體表面，從而產(chǎn)生含有抗體庫的抗體庫陣列(ARA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括(g)用靶標(biāo)物探測抗體庫陣列來確定對所述的靶標(biāo)有特異性的抗體或者抗體可變區(qū)或者其部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中B細(xì)胞被永生化以產(chǎn)生永生化的B細(xì)胞培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟(h)決定哪個B細(xì)胞培養(yǎng)能夠產(chǎn)生所述的靶標(biāo)抗體；和(i)從所述的B細(xì)胞培養(yǎng)中分離能夠產(chǎn)生所述的靶標(biāo)抗體的B細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中抗體被放置于陣列表面，所述的表面包括依次捕獲抗體的Fc區(qū)的蛋白質(zhì)A或者蛋白質(zhì)G。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中b步驟中的B細(xì)胞被置于微梯度板的孔內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中b步驟中的B細(xì)胞群含有至少IO7種不同種類的自然生成的抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的有效的人類供體數(shù)至少為10。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中抗體庫包含至少IO5自然生成的有自然配對的Vh 區(qū)和\區(qū)的人類抗體，其中所述的抗體為從足夠多樣的病人群體采集得到的永生化人類B 細(xì)胞分泌得到的，以至于所述的庫內(nèi)的抗體有與人類整體免疫實質(zhì)上相似的結(jié)合活性的多樣性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中自然生成的人類抗體是由可以識別至少IO2不同靶標(biāo)的人類B細(xì)胞表達(dá)的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中的B細(xì)胞進(jìn)一步是永生化的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中永生化的B細(xì)胞能夠表達(dá)埃-巴二氏病毒抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中永生化的B細(xì)胞分泌抗病原體的抗體，所述的病原體從下述組成的組中選擇RNA病毒，DNA病毒，細(xì)菌，酵母，寄生蟲和真菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中永生化B細(xì)胞分泌針對由惡性或者良性腫瘤細(xì)胞所表達(dá)抗原的抗體
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中永生化的B細(xì)胞分泌抗體，其中抗原從下述物質(zhì)組成的組中選擇與神經(jīng)退行性疾病結(jié)合的多肽；細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子，黏附分子和共刺激分子及其受體。
16.制備自然配對的免疫球蛋白的方法，該方法包括下述步驟(a)從非永生化B細(xì)胞群中分離RNA樣本，其中每個B細(xì)胞群平均可以表達(dá)1-100不同種類的抗體；(b)利用眾多RNA樣本實施逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；和(c)分離可以自然配對的Vh區(qū)和\區(qū)對應(yīng)的DNA；(d)在合適的可以可以表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)的宿主內(nèi)克隆所述的Vh區(qū)和\區(qū)對應(yīng)的DNA ；和(e)在免疫球蛋白重鏈和輕鏈環(huán)境下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，從而形成自然配對的免疫球蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中平均可以表達(dá)1-100不同種類的抗體非永生化 B細(xì)胞群采用下述方法制備(a)從每個有效數(shù)量的人類供體中獲得至少IO4記憶B細(xì)胞；(b)制備人類B細(xì)胞群，其中所述的細(xì)胞群含有至少IO5不同種類的自然生成抗體，每個抗體有自然配對的重鏈和輕鏈；(c)將所述的B細(xì)胞群分成B細(xì)胞亞群，每個細(xì)胞亞群平均產(chǎn)生1-100種不同種類的抗體；(d)任選地，擴(kuò)增每個B細(xì)胞亞群以產(chǎn)生擴(kuò)增的B細(xì)胞培養(yǎng)；和(e)在適合保存其RNA內(nèi)容物的條件下，存儲每個細(xì)胞亞群，其中產(chǎn)生平均表達(dá)1-100種不同種類的抗體的非永生化B細(xì)胞群的庫。
18.制備靶標(biāo)特異性抗體的方法，該方法包括(a)從受靶標(biāo)影響的人類供體中獲得B細(xì)胞，其中所述的B細(xì)胞群含有至少IO5不同種類的自然生成抗體，每個抗體有自然配對的重鏈和輕鏈；(b)將所述的B細(xì)胞群分成B細(xì)胞亞群，每個細(xì)胞亞群平均產(chǎn)生1-100種不同種類的抗體；(c)在所述的B細(xì)胞能夠?qū)⒖贵w分泌到所述的培養(yǎng)基的條件下，擴(kuò)增每個B細(xì)胞亞群以產(chǎn)生擴(kuò)增的B細(xì)胞培養(yǎng)；(d)將所述的B細(xì)胞培養(yǎng)分泌到培養(yǎng)基中抗體置于固體表面的特定位置以生成抗體庫陣列(ARA)；和(e)用天然靶標(biāo)分子探測抗體庫陣列來確定對所述的靶標(biāo)有特異性的一個或者多個抗體群。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，進(jìn)一步包括下述步驟(f)對所述的靶標(biāo)有特異性的抗體庫對應(yīng)的B細(xì)胞培養(yǎng)中制備RNA樣本；(g)利用眾多RNA樣本實施逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；(h)分離可以自然配對的Vh區(qū)和\區(qū)對應(yīng)的DNA；(i)在合適的可以表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)的宿主內(nèi)克隆所述的Vh區(qū)和\區(qū)區(qū)對應(yīng)的 DNA ；和(j)在免疫球蛋白重鏈和輕鏈環(huán)境下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，從而形成自然配對的免疫球蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中的靶標(biāo)是病毒，細(xì)菌，酵母，寄生蟲和真菌或者其他病原體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中靶標(biāo)是人類免疫缺陷病毒(HIV)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中天然靶標(biāo)分子是病毒粒，病毒樣粒子，病毒感染的細(xì)胞，病毒蛋白質(zhì)及其片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，進(jìn)一步包括下述步驟確定交叉反應(yīng)抗體，其中靶標(biāo)包括多種類的靶標(biāo)或者這些靶標(biāo)的多種血清型。
24.基于抗原決定基成簇篩選抗體的方法，所述的方法包括(a)提供從代表部分靶標(biāo)蛋白的基因片段中生成的基因片度噬菌體顯示(GFPD)庫，其中依據(jù)一個或多個抗原決定基相互作用，GFPD庫成員是成簇的；(b)提供完整的靶標(biāo)蛋白質(zhì)；(c)提供依據(jù)權(quán)利要求1從研究對象血樣中生成的抗體庫陣列(ARA)，其中研究對象事先暴露在足夠引起其免疫反應(yīng)的靶標(biāo)物劑量下；(d)用完整的靶標(biāo)和/或從靶標(biāo)得到的GFPD庫成員中的抗原決定基特異性簇對ARA進(jìn)行探測；和(e)確定對一個或者多個對所述的完整靶標(biāo)和至少一個抗原決定簇有特異性抗體群。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，進(jìn)一步包含下述步驟(f)由對應(yīng)于對所述的抗原決定簇有特定性的抗體群的B細(xì)胞培養(yǎng)制備RNA樣本；(g)利用眾多RNA樣本實施逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；(h)分離可以自然配對的Vh區(qū)和\區(qū)對應(yīng)的DNA。(i)在合適的可以表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)的宿主內(nèi)克隆所述的Vh區(qū)和\區(qū)對應(yīng)的 DNA ；和(j)在免疫球蛋白重鏈和輕鏈環(huán)境下表達(dá)所述的Vh區(qū)和\區(qū)，從而形成自然配對的免疫球蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，進(jìn)一步包括利用完整靶標(biāo)和GFPD庫成員，基于ARA 的識別模式確定新的抗原決定簇。
27.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，依據(jù)一個或多個抗原決定基的關(guān)系，其中GFPD庫成員是成簇的，該方法包括提供能夠編碼靶標(biāo)蛋白質(zhì)的基因；將所述的基因分成基因片段；制備含有GFPD庫成員的噬菌體顯示庫；根據(jù)靶標(biāo)特異性抗體淘選GFPD庫；和依據(jù)與一個或者多個抗原決定簇的關(guān)系將每個GFPD庫成員分組。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括將GFPD庫成員分組，將GFPD庫成員覆蓋在靶標(biāo)的已知三維結(jié)構(gòu)上。
29.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，進(jìn)一步包括檢測兩個或者多個抗原決定基功能的協(xié)同作用，所述的方法為制備通過表達(dá)VH區(qū)和VL區(qū)形成的第一自然配對免疫球蛋白，其中VH區(qū)和VL區(qū)的序列得自于對抗原決定簇有特異性的抗體群；制備通過表達(dá)VH區(qū)和VL區(qū)形成的第二自然配對免疫球蛋白，其中VH區(qū)和VL區(qū)的序列得自于對抗原決定簇有特異性的抗體群；分別或者聯(lián)合對檢測系統(tǒng)施用第一和第二自然配對的免疫球蛋白來檢測完整靶標(biāo)的活性；和確定與已知功能相關(guān)的新抗原決定基的活性和協(xié)同活性。
30.一種疫苗制備方法，包括對根據(jù)權(quán)利要求M所述方法決定的功能性抗原決定基有效的抗體。
31.一種治療性抗體制備方法，包括在調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求M所述方法決定的與一個或多個抗原決定簇結(jié)合靶標(biāo)的功能方面有效的抗體。
32.—種篩選單克隆抗體以確定于細(xì)胞表面靶標(biāo)分子生理功能的方法，該方法包括提供根據(jù)權(quán)利要求1所述方法生成的抗體庫陣列(ARA)，該ARA包括一系列位于表面離散點的單克隆抗體，其中抗體指向存在于細(xì)胞表面特異性靶標(biāo)分子；用包括存在于細(xì)胞表面的特異性靶標(biāo)分子的細(xì)胞接觸所述的ARA ；和確定這些單克隆抗體中哪些對細(xì)胞表面的靶標(biāo)分子有抑制作用或者激活作用。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，進(jìn)一步包括用通信細(xì)胞接觸所述的ARA，其中通信細(xì)胞經(jīng)過改造當(dāng)與通信細(xì)胞表面的細(xì)胞表面靶標(biāo)分子激動劑或者拮抗劑接觸時能夠表達(dá)可檢測性信號；在能生成可檢測信號底物存在的條件下用單克隆抗體培養(yǎng)此通信細(xì)胞，其中可檢測信號水平的變化能夠顯示單克隆抗體的細(xì)胞表面靶標(biāo)分子激動劑或者拮抗劑的存在。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中細(xì)胞表面的特異性靶標(biāo)分子是受體分子。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的受體可以從本組中選擇，本組包括外周膜蛋白受體，跨膜受體，代謝性受體，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，受體酪氨酸激酶，鳥苷酸環(huán)化酶受體，對胞外配體響應(yīng)的離子型受體，受體酪氨酸激酶，細(xì)胞因子受體，受體鳥苷酸環(huán)化酶，受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，胰島素受體，胰島素樣生長因子受體，人生長激素受體， 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，表皮生長因子受體，低密度脂蛋白受體，瘦素受體，白細(xì)胞介素受體，IL-I受體，IL-2受體，毒蕈堿乙酰膽堿受體，腺苷受體，腎上腺素受體，GABA受體，血管緊張素受體，大麻受體，膽囊收縮素受體，多巴胺受體，胰高血糖素受體，代謝型谷氨酸受體，組胺受體，嗅覺受體，阿片受體，視紫紅質(zhì)，分泌素受體，血清素受體，生長激素抑制素受體，鈣敏感受體，生長因子受體，共刺激因子受體，蛋白酶活化受體，T細(xì)胞受體，B細(xì)胞受體，含ITIM受體，含ITAM受體，TNFR總科成員，TNF總科成員，離子通道和趨化因子受體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中抗體功能為全激動劑，部分激動劑，拮抗劑或受體蛋白的反激動劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中可檢測性信號為熒光基團(tuán)，化學(xué)染料，放射形結(jié)合試劑，化學(xué)發(fā)光結(jié)合試劑，電化學(xué)發(fā)光試劑，磁性結(jié)合試劑，順磁性結(jié)合，熱磁性結(jié)合試劑，能產(chǎn)生有色物質(zhì)的酶，能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的酶，能產(chǎn)生磁性物質(zhì)的酶或者釕。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中細(xì)胞表面分子的激活和與作用于底物的酶的活性相聯(lián)系胞外離子通道是耦合的。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中酶是選自下述組中β-內(nèi)酰胺酶，α-半乳糖苷酶，β -半乳糖苷酶，α -葡萄糖苷酶，β -葡萄糖苷酶，α -甘露糖苷酶，β -甘露糖苷酶， 酸性磷酸酶，堿性磷酸酶和磷酸二酯酶II。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的底物從下列物質(zhì)中選擇對氨基苯-β-D-半乳糖苷，對氨基苯-a-D-半乳糖苷，對氨基苯-a-D-葡萄糖苷，對氨基苯-β -D-葡萄糖苷，對氨基苯α -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯-β -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯磷酸鹽，和對氨基苯磷酸膽堿及其衍生物。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中酶對底物的作用是與化學(xué)反應(yīng)，發(fā)光反應(yīng)，比色反應(yīng)或者熒光反應(yīng)相耦合的。
42.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中ARA置于96或者384孔板內(nèi)，每個孔內(nèi)含有從單個B細(xì)胞克隆中得到的單克隆抗體，進(jìn)一步，其中單克隆抗體的濃度足以誘發(fā)細(xì)胞表面靶標(biāo)分子發(fā)出信號。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中每個孔都會與至少IO3通信細(xì)胞接觸。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中可檢測性標(biāo)簽不是通信細(xì)胞分泌的。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中可檢測性標(biāo)簽是通信細(xì)胞分泌的。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中每個孔都與通信細(xì)胞接觸，其中通信細(xì)胞在適合細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)，直至達(dá)到大于IO3通信細(xì)胞的濃度。
47.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中的篩選是高通量篩選。
48.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中的篩選是高含量篩選。
49.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中細(xì)胞表面靶標(biāo)分子的激活包含與β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)耦合的信號途徑的激活。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中內(nèi)酰胺酶的表達(dá)是熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)底物來定量的。
51.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中ARA包括表面每個離散點的抗體濃度足以引發(fā)細(xì)胞表面的特異性靶標(biāo)分子接觸的信號。
52.用權(quán)利要求1所述方法制備的抗體庫陣列(ARA)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括至少IO4由人類B細(xì)胞表達(dá)的，可識別至少IO2不同靶標(biāo)的人類自然抗體，每個抗體是由不同B細(xì)胞分泌的，含有自然配對的Vh區(qū)和\區(qū)鏈。
54.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA中的抗體可識別至少IO3不同靶標(biāo)。
55.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA中的抗體包含至少IO3被表達(dá)的人類自然抗體。
56.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中的ARA包含至少IO5自然生成的有自然配對的Vh區(qū)和\區(qū)的人類抗體，其中所述的抗體是由永生化的人類B細(xì)胞分泌得到的，B 細(xì)胞是從足夠不同的病人中采集的，從而所述的庫內(nèi)的抗體有與整體人類免疫實質(zhì)上相似的結(jié)合活性的多樣性。
57.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括針對病原體的自然生成的人類抗體，病原體從下面組內(nèi)選擇RNA病毒，DNA病毒，細(xì)菌，酵母，寄生蟲和真菌。
58.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括針對由惡性腫瘤或者良性腫瘤細(xì)胞表達(dá)抗原的自然生成的人類抗體。
59.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括針對抗原的自然生成的人類抗體，病原體從下面組內(nèi)選擇與神經(jīng)變性疾病結(jié)合的多肽；細(xì)胞因子，趨化因子，生長因子，黏附分子和共刺激分子及其受體。
60.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包含自然生成的針對從代表靶標(biāo)的基因片段噬菌體顯示庫(GFPD)得到的抗原決定基特異性簇的抗體。
61.根據(jù)權(quán)利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包含自然生成的針對細(xì)胞表面靶標(biāo)分子的人類抗體。
62.根據(jù)權(quán)利要求61中的抗體庫陣列(ARA)，其中細(xì)胞表面分子指的是受體分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及對靶標(biāo)抗原有特異性的抗體序列。發(fā)現(xiàn)方法和組合物包含人類抗體，包含此抗體的序列，表達(dá)此抗體的永生化B細(xì)胞和能夠包含這些抗體的非永生化B細(xì)胞庫。本發(fā)明提供了一種篩選對細(xì)胞表面分子，比如利用抗體庫陣列對靶細(xì)胞表面分子，有特異性的受體有功能性作用的單克隆抗體的方法，同時提供了得自于這些抗體的指向靶標(biāo)的功能性抗體和治療方法，并提供了對潛在性治療性抗體的高通量和平行篩選。本發(fā)明還涉及到指向靶標(biāo)和疫苗的功能抗原決定簇的抗體和源自于這些抗體的治療方法。
文檔編號G01N33/50GK102164957SQ200980137918
公開日2011年8月24日 申請日期2009年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者M·摩勒 申請人:特羅科隆科學(xué)有限公司