專利名稱：乳清苷－5′－磷酸脫羧酶基因、含該基因的構(gòu)建體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或其同系物及其用途。本發(fā)明還涉及含有具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或其同系物的載體或生物體。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型微生物的方法和將DNA插入尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型微生物的方法。
維生素B2也稱核黃素，是人和動物必需的。維生素B1缺陷與口部和咽喉粘膜炎癥、瘙癢和皮膚皺褶炎癥和類似皮膚損傷、結(jié)膜炎、視敏度下降以及角膜混濁相關(guān)聯(lián)。在嬰幼兒中，會引發(fā)生長停止和體重下降。因此維生素B2具有經(jīng)濟上的重要性，特別是在維生素缺陷時作為維生素添加劑和動物飼料添加劑。此外，它還用作食品色素，例如用于蛋黃醬、冰激凌、牛奶凍等。
維生素B2通過化學(xué)或微生物方法制備(參見，例如Kurth et al.，1996，核黃素，《Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書》，VCH weinheim)。在化學(xué)制備方法中，核黃素通常作為多階段過程的純化終產(chǎn)物獲得，其中需要使用相對昂貴的起始原料，如D-核糖。另一種獲得核黃素的方法是利用微生物制備該物質(zhì)。這種情況下使用的起始原料是可再生的原料，如糖或植物油。通過阿舒氏假囊酵母或棉桃阿舒氏囊霉等真菌發(fā)酵制備核黃素已為人所知(Merck Index，Windholz et al.，eds.Merck & Co.，p1183，1983)，但如假絲酵母、畢赤酵母和糖酵母等酵母菌或如芽孢桿菌、梭菌或棒桿菌等細菌也已被報導(dǎo)用作核黃素生產(chǎn)者。
DE4420785公開了棉桃阿舒氏囊霉的6個核黃素生物合成基因和用這些基因轉(zhuǎn)化的微生物以及這些微生物作為核黃素生產(chǎn)者的用途。
迄今為止，將基因插入棉桃阿舒氏囊霉等核黃素真菌生產(chǎn)者是利用leu2(亮氨酸營養(yǎng)缺陷型)，thr4(蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型)或kan(卡那霉素抗性)標(biāo)記(WO92/00379)。酵母菌中報導(dǎo)的其他標(biāo)記是met15(蛋氨酸營養(yǎng)缺陷型，Cost et al.，Yeast，Vol.12，1996939-941)。這種標(biāo)記的缺陷是轉(zhuǎn)化效率極低和/或選擇時必需一直添加抗生素。但是，在上述各例中，反向選擇丟失了標(biāo)記而保留了插入基因的微生物是不可能的或者極其困難，所以一般不可能向這些微生物中再插入帶有這些標(biāo)記的基因。因此，需要一種具有較高轉(zhuǎn)化效率、容易選擇和可以進行反向選擇的選擇標(biāo)記。
啤酒糖酵母的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(URA3基因)是具有所需特性的經(jīng)典標(biāo)記之一，可用于將基因轉(zhuǎn)化進酵母菌和真菌等微生物。種特異性URA3基因的分離和真菌相應(yīng)基因(pyrG)的分離以及具柄畢赤酵母、博伊丁氏假絲酵母、馬克斯克魯維氏酵母、Yamadazymaohmeri、麥芽糖假絲酵母、黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、卷枝毛霉、布拉氏須霉、產(chǎn)黃青霉和泡盛曲霉的該基因序列已經(jīng)在多種文獻中報導(dǎo)(Appl.Environ.Microbiol.,Vol.60,No.12,19944245-4254,Nucl.Acids Res.,Vol.18,No.23,1990:7183,J.Ferment.Bioeng.,Vol.73,No.4,1992255-260,Yeast,Vol.9,1993677-681,Yeast,Vol.10,19941601-1612,Curr.Genet.,Vol. 23,1993205-210,Nucl.Acids Res.,Vol.16,No.5,19882339,Curr.Genet.,Vol.16,1989159-163,Gene,Vol.61,1987385-399,Gene,Vol.116,199259-67,Mol.Gen.Genet.,Vol.224,1990269-278,Nucl.Acids Res.,Vol.16,No.16,19888177,Nucl.Acids Res.,Vol.18,No.23,19907183和Curr.Genet.,Vol.27,1995536-540) 。
Rose等的研究(Gene,Vol.29,1984113-124)已經(jīng)證實啤酒糖酵母的URA3基因?qū)嶋H上能夠互補大腸桿菌等原核生物中的相應(yīng)突變(pyrF基因=URA3)，并可用作選擇標(biāo)記。
但是，對棉桃阿舒氏囊霉的核黃素生物合成(維生素B2生物合成)的研究已經(jīng)證實，啤酒糖酵母的URA3基因或大腸桿菌的pyrF基因不能互補棉桃阿舒氏囊霉的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變體，因此，這些基因不能用于將基因克隆進棉桃阿舒氏囊霉中。
因為棉桃阿舒氏囊霉中相應(yīng)于URA3基因或pyrE基因的基因還是未知的，已經(jīng)嘗試克隆該基因。采用文獻中描述的方法，通過與URA3基因片段雜交，或利用基于各種乳清苷-5’-磷酸脫羧酶的保守氨基酸序列的簡并寡核苷酸篩選cDNA文庫或進行PCR，來克隆阿舒氏囊霉的嘗試未能成功(Bergkamp et al.Yeast，Vol.9,1993677-681,Piredda et al.,Yeast,Vol.10,1994:1601-1612,Benito et al.,Gene,Vol.116,1992:59-67和Diaz-Minguez et al.,Mol.Gen.Genet.,Vol.224,1990269-278) 。
本發(fā)明的目的之一是提供易于選擇的標(biāo)記，其可以高效轉(zhuǎn)化，容易進行反向選擇，這使得它可以將基因插入微生物中。
我們發(fā)現(xiàn)，利用具有序列1序列的新型乳清苷-5’-磷酸脫羧酶或與序列1序列具有至少80％同源性的其同系物可以實現(xiàn)該目的。
具有序列1序列的新型乳清苷-5’-磷酸脫羧酶的同系物是指例如等位變體，其衍生氨基酸水平的同源性至少為80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％。序列1衍生的氨基酸序列可以參見序列1。等位變體具體包括可以通過缺失、插入或置換序列1所示序列的核苷酸獲得的功能變體，插入一個或多個基因時該衍生的合成蛋白的酶活性最好仍保留。但是，如果要通過產(chǎn)生尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型微生物的新方法借助于序列1或其同系物在乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因中產(chǎn)生突變，將使用無功能基因，即產(chǎn)生無酶活性蛋白的基因。在這種情況下，優(yōu)選使用與序列1或其同系物具有同源性的序列，最好為在3’或5’端的序列。
序列1的同系物還包括例如真菌或植物同系物、截短序列、編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。序列1的同系物在序列1所示全部DNA區(qū)域中在DNA水平的同源性為至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％。
序列1的同系物也包括例如啟動子變體的衍生物。所示核苷酸序列上游的啟動子可以通過一個或多個核苷酸交換、插入和/或缺失進行修飾，而不影響啟動子的功能特性或活性。也可以修飾啟動子序列使其活性提高，或用活性更高的啟動子完全取代，來自異源生物的啟動子也可以。
衍生物也包括在起始密碼子前-1到-200之間區(qū)域的核苷酸序列已經(jīng)被修飾從而改變，優(yōu)選增加了基因表達和/或蛋白表達的變體。
也可以并優(yōu)選從梅奇酵母科的微生物中分離序列1或其同系物，特別優(yōu)選從假囊酵母屬、阿舒氏囊霉屬或針孢酵母屬的微生物中分離，更優(yōu)選從阿舒氏假囊酵母或棉桃阿舒氏囊霉中分離。
新的基因構(gòu)建體是指URA3基因序列序列1和其同系物已經(jīng)與一個或多個調(diào)節(jié)信號有效連接，使得基因表達增加較為有利。這些調(diào)節(jié)序列的實例是誘導(dǎo)物或抑制物結(jié)合因而調(diào)節(jié)核酸表達的序列。除了這些新的調(diào)節(jié)序列之外，在結(jié)構(gòu)基因之前的這些序列的天然調(diào)節(jié)也還可以存在，適當(dāng)?shù)臅r候，也可以進行遺傳修飾，以便關(guān)閉天然調(diào)節(jié)，增加基因表達。但是，基因構(gòu)建體也可以具有較簡單的結(jié)構(gòu)，即沒有在序列1或其同系物之前插入其他調(diào)節(jié)信號，具有調(diào)節(jié)作用的天然啟動子未缺失。相反，天然調(diào)節(jié)序列已經(jīng)被突變使得不再存在調(diào)節(jié)，基因表達增加。基因構(gòu)建體還可以包括與啟動子有效連接的一個或多個所謂的增強子序列，使得核酸序列表達增加得以實現(xiàn)。還可以在DNA序列3’端插入其他有利的序列，如其他調(diào)節(jié)元件或終止子。URA3基因在基因構(gòu)建體中可以以一個或多個拷貝存在，基因也可以被滅活。在新方法中，可以借助這(種)些滅活基因產(chǎn)生尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變體。在基因構(gòu)建體中存在其他基因以便將其插入微生物中較為有利。這些基因可以位于URA3基因內(nèi)部，在這種情況下，在構(gòu)建體中存在一個完整拷貝的URA3基因和/或另一個可選擇的基因例如leu2，thr4或kan較為有利，或者它們可以位于URA3基因之外。即使在構(gòu)建體中存在完整URA3基因，適當(dāng)?shù)臅r候，也可以存在其他標(biāo)記如上述標(biāo)記以便進行選擇。
新方法中的有利調(diào)節(jié)序列存在于例如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL等啟動子中，優(yōu)選用于革蘭氏陰性細菌。其他有利調(diào)節(jié)序列存在于例如革蘭氏陽性啟動子amy和SP02中，酵母菌或真菌啟動子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH或植物啟動子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，nos或遍在蛋白或菜豆蛋白啟動子中。在這種連接中的有利的啟動子也可以是來自例如漢遜酵母的丙酮酸脫羧酶和甲醇氧化酶啟動子。也可以使用人工啟動子進行調(diào)節(jié)。
原則上，在新方法中可以使用如上所述的所有天然啟動子和其調(diào)節(jié)序列。也可以并優(yōu)選另外還使用合成啟動子。
如上所述的基因構(gòu)建體也包括待插入微生物的基因。這些基因可以插入ura3，leu2，thr4或kan等標(biāo)記基因內(nèi)部或之外。原則上，借助于具有序列1序列的新URA3基因或其同系物，所有種類的基因都可以插入微生物中。可以并優(yōu)選通過URA3序列在宿主微生物中插入并表達調(diào)節(jié)基因，如誘導(dǎo)物或抑制物基因，或者通過其酶活性干預(yù)調(diào)節(jié)的酶的基因，或者一種生物合成途徑的一個或多個或所有基因，如rib基因等核黃素生物合成的基因，或者產(chǎn)生其他精細化學(xué)產(chǎn)物、次級代謝物或蛋白的多個生物合成途徑的基因，如生物素、賴氨酸、蛋氨酸、維生素B12或類胡蘿卜素生物合成的基因，或者產(chǎn)生調(diào)味品、生長因子或氣味物質(zhì)的基因，或者蛋白酶或脂酶等酶的單獨的基因。插入的基因可以有自身的啟動子或者處于序列1或其同系物序列的啟動子的控制之下。
為在前述宿主生物體中表達，優(yōu)選基因構(gòu)建體插入載體中，如質(zhì)粒、噬菌體或其他DNA，它們使基因在宿主中最佳表達成為可能。大腸桿菌中合適質(zhì)粒的實例為pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11或pBdCI，鏈霉菌中合適的質(zhì)粒為pIJ101，pIJ364，pIJ702或pIJ361，在芽孢桿菌中合適的質(zhì)粒為pUB110，pC194或pBD214，在棒桿菌中合適的質(zhì)粒為pSA77或pAJ667，在真菌中合適的質(zhì)粒為pALS1，pIL2或pBB116，在酵母菌中合適的質(zhì)粒為2μm，pAG-1，Yep13或PEMBLYe23，在植物中合適的質(zhì)粒為pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004或pDH51．所述質(zhì)粒代表可能的質(zhì)粒中的一小部分選擇。其他質(zhì)粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可以參見例如《克隆載體》(Pouwels P.H.等編，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN0444904018)。
為了表達所存在的其他基因，基因構(gòu)建體優(yōu)選包括其他3’和/或5’末端調(diào)節(jié)序列，以增強表達，這種調(diào)節(jié)序列根據(jù)選定的宿主生物和基因來進行選擇以進行最佳表達。
這些調(diào)節(jié)序列旨在使基因和蛋白特異表達成為可能。這可能意味著，根據(jù)宿主生物，基因僅在誘導(dǎo)后表達或過表達，或其立即表達和/或過表達。
調(diào)節(jié)序列或因子也可以優(yōu)選對導(dǎo)入的基因的表達具有有益效果，因此增加其表達。調(diào)節(jié)元件可以以這種方式通過使用強轉(zhuǎn)錄信號如啟動子和/或增強子在轉(zhuǎn)錄水平得以增強。但是，也可以通過例如提高mRNA的穩(wěn)定性來增加翻譯。
在載體的另一個實施方案中，新基因構(gòu)建體也優(yōu)選以線性DNA形式導(dǎo)入微生物中，并通過同源或異源重組整合進宿主生物的基因組。該線性DNA可以為線性質(zhì)?；蛑挥凶鳛檩d體的基因構(gòu)建體。
原則上對新基因構(gòu)建體合適的宿主生物是所有的原核或真核生物。優(yōu)選所用的宿主生物是微生物如細菌、真菌、酵母菌、動物或植物細胞。優(yōu)選使用真菌或酵母菌，特別優(yōu)選真菌，更優(yōu)選假囊酵母、阿舒氏囊霉或針孢酵母等梅奇酵母科的真菌。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型微生物的方法。為了產(chǎn)生尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變體，對具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或其同系物通過例如誘變進行修飾，使得該基因編碼的蛋白被滅活。該滅活的基因隨后通過例如轉(zhuǎn)化或電穿孔被導(dǎo)入微生物。最后，在微生物中的同源重組產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型突變體，它們可以通過對5-氟乳清酸的抗性來篩選(見Boeke et al.,Mol.Gen.Genet.,Vol.197,1984345-346)。
本發(fā)明還涉及將DNA插入生物體的方法，包括將一種含有具有序列1序列的完整URA3基因或其同系物的載體插入乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(URA3基因)有缺陷的一種生物體內(nèi)，優(yōu)選一種微生物體內(nèi)，優(yōu)選與其他DNA一起插入，更優(yōu)選與至少一種其他基因一起插入，并在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該生物體。只有能夠獲得載體的生物體能在該培養(yǎng)基中生長。優(yōu)選線性DNA在該方法中用作載體。在該方法中使用的微生物優(yōu)選是真菌，特別是假囊酵母、阿舒氏囊霉或針孢酵母等梅奇酵母科的真菌，特別優(yōu)選阿舒氏囊霉屬的微生物。
用作載體的可以是任何可在細胞中自主復(fù)制的合適質(zhì)粒(特別是攜帶啤酒糖酵母2m質(zhì)粒的復(fù)制起點的質(zhì)粒)，也可以是如上所述整合進宿主基因組的線性DNA片段。整合可以通過同源或異源重組進行。但如上所述，優(yōu)選通過同源重組進行(Steiner et al.,Genetics,Vol.140,1995973-987)。
具有序列1的新URA3基因或其同系物優(yōu)選用作新方法中的選擇標(biāo)記，也可以并優(yōu)選使用該選擇標(biāo)記基因?qū)⒒虿迦朊尢野⑹媸夏颐埂?br> 其他優(yōu)點是在轉(zhuǎn)化棉桃阿舒氏囊霉時，可以借助于該基因進行選擇，而不需使用外源DNA(即不是來源于棉桃阿舒氏囊霉的DNA)。
在用具有序列1的基因或其同系物轉(zhuǎn)化棉桃阿舒氏囊霉時也可以插入其他任何基因。這使得可以構(gòu)建在質(zhì)?；蚱浠蚪M中攜帶多個拷貝的單個基因或多個基因的菌株。
也可以構(gòu)建基因的染色體拷貝通過插入具有序列1的URA3基因或其同系物被破壞的阿舒氏囊霉菌株。
AgURA3基因的特別優(yōu)點是可以在同一菌株中連續(xù)使用標(biāo)記幾次。
如果同樣的核苷酸序列以相同的方向置于基因的5’和3’(所謂的同向重復(fù))，需要時可以通過同源重組和在含尿嘧啶和FOA的培養(yǎng)基中選擇再次缺失AgURA3基因，然后在另一輪中借助于該基因插入其他DNA。其他優(yōu)點是與thr、leu或kan標(biāo)記相比顯著較高的轉(zhuǎn)化效率。在新方法中，載體包括至少一種核黃素生物合成的基因作為其他基因。核黃素生物合成的基因是指這些基因參與阿舒氏囊霉等核黃素生產(chǎn)者的整個代謝中的合成代謝。
實施例實施例1由棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895制備基因組基因文庫棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895的基因組DNA通過WO97/03208所述的方法制備。衍生自該DNA的基因組基因文庫在pRS314和Yep351(Hill et al.,Yeast,Vol.2,1986163-167)中構(gòu)建，使用的方法參見Sambrook,J.et al.(1989)《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室出版社或者F.M.et al.(1994)《分子生物學(xué)最新方法》，John Wiley and Sons。根據(jù)WO97/03208可以預(yù)期其他質(zhì)粒如pRS系列的質(zhì)粒(Sikorski and Hieter,Genetics,1989,19-27)或粘粒如SuperCos1(Stratagene,La Jolla,USA)也適用于產(chǎn)生基因文庫。
實施例2最初試圖通過啤酒糖酵母相應(yīng)的URA3營養(yǎng)缺陷型突變體的功能互補從棉桃阿舒氏囊霉中克隆乳清苷-5’-磷酸脫羧酶(OMP-DC)基因。
為此，由棉桃阿舒氏囊霉的基因組DNA在pRS314中構(gòu)建基因文庫(如實施例1所述)。該DNA用于轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母菌株MW3317-21A(基因型MATα，trp1，ade8△Kpn，ura3-52，hom3-10，met13，met4，ade2，his3-Kpn，參見例如Kramer et al.,Mol.Cell.Biol.9,19894432-4440)，使用乙酸鋰法(參見，例如Kramer et al.,Mol.Cell.Biol.9,19894432-4440)。沒有獲得啤酒糖酵母菌株ura3基因的基因組缺失被阿舒氏囊霉的基因片段互補的克隆。
通過大腸桿菌pyrF突變體中的功能互補克隆棉桃阿舒氏囊霉的URA3基因的嘗試也未成功。
實施例3通過與啤酒糖酵母相應(yīng)基因片段的雜交從棉桃阿舒氏囊霉中克隆OMP-DC基因的嘗試也告失敗。
為此目的，啤酒糖酵母的完整URA3基因(基因文庫條目yscodcd)用作探針(長度1.1kb)，以篩選棉桃阿舒氏囊霉的基因組粘?；蛭膸?參見實施例1)。按照文獻所述進行試驗(Sambrook，J.et al.(1989)《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室出版社或者F.M.et al.(1994)《分子生物學(xué)最新方法》，John Wiley andSons)，使用的雜交溫度為52℃到68℃。不可能在基因文庫中鑒定到任何與作為探針的啤酒糖酵母URA3基因產(chǎn)生陽性信號的克隆。
實施例4在另一種方法中，試圖利用簡并寡核苷酸和PCR技術(shù)通過擴增基因片段擴增棉桃阿舒氏囊霉的OMP-DC基因。
在該試驗中，比較了下列生物體的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶的已知氨基酸序列，選出了所有酶中顯示最大保守程度的區(qū)域黑曲霉(入藏號P07817)構(gòu)巢曲霉(入藏號P10652)粟酒裂殖酵母(入藏號P14965)產(chǎn)黃青霉(入藏號P09463)乳克魯維氏酵母(入藏號P07922)白色假絲酵母(入藏號P13649)粗糙鏈孢霉(入藏號P05035)玉蜀黍黑粉菌(入藏號P15188)啤酒糖酵母(入藏號Q01637)黑尾果蠅(入藏號Q01637)
小鼠(入藏號P13439)人(入藏號P11172)括號中給出的代號來自于SWISSPIR-Translated DatenbankRelease103。
簡并寡核苷酸根據(jù)該信息合成。
簡并寡核苷酸是指合成時在一些位置整合了核苷酸混合物的寡核苷酸。
在寡核苷酸中，R代表G或A，Y代表C或T，W代表A或T，M代表A或C，K代表G或T，S代表C或G，H代表A、C或T，V代表A、C或G，B代表C、G或T，D代表A、G或T，N代表G、A、T或C。
使用了下列寡核苷酸URA3-A5’-YTNGGNCCNTAYATHTGY-3’URA3-B5’-TAYTGYTGNCCNARYTTRTCNCC-3’URA3-C5’-TTYYTNATHTTYGARGAYMGNAARTT-3’URA3-D5’-GCNARNARNARNARNCCNC-3’使用這些寡核苷酸作為引物，用棉桃阿舒氏囊霉的基因組DNA作為模板進行PCR。
使用下列引物組合URA3-A+URA3-B；URA3-A+URA3-D；URA3-C+URA3-B以及URA3-C+URA3-D。
使用下列雜交溫度52℃、48℃、44℃、40℃和37℃。
PCR產(chǎn)物通過常規(guī)方法克隆進載體pGEMT(Promega)并測序。不可能擴增與上述已知OMP-DC基因顯示同源性的任何片段。
實施例5如DE4420785A1所述從棉桃阿舒氏囊霉構(gòu)建cDNA文庫(實施例1)。
實施例6基因文庫中核酸序列的分析從大腸桿菌克隆中選擇出包括如實施例5所述來自棉桃阿舒氏囊霉的基因文庫的單個克隆。在合適的培養(yǎng)基中(如加有100mg/l氨芐青霉素的Luria肉湯)通過常規(guī)方法培養(yǎng)細胞，從這些細胞中分離質(zhì)粒DNA。
在載體部分雜交的寡核苷酸作為測序cDNA克隆的引物。克隆的cDNA片段以這種方式檢測。如實施例7所述分析序列。
實施例7使用BLAST算法(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215，403-410)和借助于PAM250權(quán)重表的Clustal算法，或Wilbur-Lipman DNA序列比較算法(如在DNAstar提供的程序包MegAlign3.06中運行)，通過比較新鑒定的序列與現(xiàn)有DNA和蛋白數(shù)據(jù)庫，進行計算機輔助的核苷酸序列分析。
實施例8鑒定攜帶棉桃阿舒氏囊霉OMP-DC基因(AgURA3)的大腸桿菌克隆。
如實施例6和7所述檢測大量克隆(＞100克隆)后，發(fā)現(xiàn)了與已知OMP-DC基因具有類似性的序列。類似過程用于再次篩選阿舒氏囊霉基因文庫(見實施例1)，可能鑒定產(chǎn)生特異陽性信號并攜帶共同的1.3kb XhoI-EcoRI片段的克隆和粘粒。對所述克隆測序產(chǎn)生了序列1所述的序列。該序列與已知URA3基因具有類似性并編碼大小為約29246道爾頓的蛋白。
實施例9具有抗生素抗性基因AgURA3基因的染色體拷貝的破壞基因的破壞是指該基因的染色體拷貝的功能被破壞，通過以下方法破壞(a)缺失基因序列的一部分，(b)向基因中引入一段外源DNA打斷基因，(c)用外源DNA取代基因的一部分?？梢允褂萌魏瓮庠碊NA，但優(yōu)選賦予對任何合適化學(xué)品的抗性的基因。任何合適的抗性基因可以用于破壞基因。
為了破壞棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895的AgURA3基因，使用來自Tn903的卡那霉素抗性基因，其處于棉桃阿舒氏囊霉的TEF啟動子控制之下(參見Yeast10，pp1793-3808，1994或WO92/00379)。該基因5’和3’側(cè)翼有幾個限制性內(nèi)切酶切割位點，所以可以使用常規(guī)體外DNA操作構(gòu)建基因盒，它使得任何所需的基因破壞的構(gòu)建成為可能。
AgURA3的內(nèi)部370bp PstI-KpnI片段(序列1中442位到892位)用上述抗性盒取代。產(chǎn)生的構(gòu)建體命名為ura3∷G418.所得的質(zhì)?？梢栽谵D(zhuǎn)化進大腸桿菌之后復(fù)制。Ura3∷G418構(gòu)建體的XhoI-SphI片段(見

圖1)通過瓊脂糖凝膠電泳純化，然后從凝膠中洗脫出DNA(參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA76，615-619，1979)，將DNA用來轉(zhuǎn)化棉桃阿舒氏囊霉。圖1A顯示AgURA3基因以及5’和3’非翻譯區(qū)(5’-UTR和3’-UTR)的限制圖。圖1B顯示如上所述插入卡那霉素抗性盒(TEF-kanR)的位置。
通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Gene 109，99-105，1991)等或優(yōu)選通過電穿孔(BioRad Gene Pulser，條件小池裂縫寬度0.4mm，1500V，25μF，100Ω)將片段轉(zhuǎn)化進棉桃阿舒氏囊霉。在含有G418的固體培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化細胞(WO97/03208)。
產(chǎn)生的G418抗性克隆通過常規(guī)PCR和Southern印跡分析方法分析(Sambrook，J.et al.(1989)《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室出版社或者F.M.et al.(1994)《分子生物學(xué)最新方法》，John Wiley and Sons)，以證實AgURA3基因的基因組拷貝是否確實被破壞。AgURA3基因被破壞的克隆是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型，對1mg/ml5’-氟乳清酸(FOA)具有抗性。
實施例10不使用抗生素抗性基因破壞AgURA3基因的基因組拷貝使用URA3基因的最大好處是可以選擇基因存在和基因不存在。可以用具有功能滅活URA3基因的FOA微生物進行篩選，通過選擇尿嘧啶原養(yǎng)型選擇功能活性的URA3基因。
為了破壞URA3基因的基因組拷貝，為簡便起見，URA3基因的內(nèi)部片段(PstI片段)從具有序列1序列的基因的編碼區(qū)中缺失(序列1序列的442位到520位)。用該缺失的ura3片段轉(zhuǎn)化棉桃阿舒氏囊霉如實施例10所述進行。不使用缺失基因的部分區(qū)域的方法，原則上也可以使用所有其他滅活基因的方法，如通過插入、重復(fù)、倒轉(zhuǎn)、取代幾個核苷酸產(chǎn)生突變或點突變。不優(yōu)選點突變，因為其容易回復(fù)。
轉(zhuǎn)化子通過對FOA的抗性選擇。與野生型克隆相反，攜帶破壞的AgURA3基因的克隆對1mg/ml FOA具有抗性。
實施例11使用AgURA3基因?qū)⑵渌鸇NA插入棉桃阿舒氏囊霉借助WO97/03208(實施例4和5)所述的質(zhì)粒pAG100，將WO97/03208所述的異檸檬酸裂合酶基因插入棉桃阿舒氏囊霉的AgURA3破壞突變體(見實施例9和10)，使用AgURA3基因代替G418抗性作為棉桃阿舒氏囊霉中的選擇標(biāo)記。
序列表(1)一般信息(ⅰ)中請人(A)名稱BASF Aktiengesellschaft(B)街道Carl Boshch Strasse(C)城市Ludwigshafen(D)聯(lián)邦州Rheinland-Pfalz(E)國家德國(F)郵編D-67056(ⅱ)發(fā)明名稱乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因、含該基因的構(gòu)建體及用途(ⅲ)序列數(shù)2(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM兼容(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)序列1資料(ⅰ)序列特征(A)長度1380堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物棉桃阿舒氏囊霉(ⅶ)直接來源(B)克隆ura3(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置210..1013(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞5’UTR(B)位置1..199(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞3’UTR(B)位置1014..1380(ⅹⅰ)序列描述序列1CTCGAGCAAC TCATTGGAAG CCCTTCGCAA ACGACCTCTA TATCTCGTCT CAAGTTCCTA 60CTATCATGTA TGCTGTCACT ACAGAAAAAT TTTTGTCTAT AGCTGGCAAG AAGCACATCA 120CATACATTCT GATGGTGTAG GCTCCACATC ACAGTAAGCA TTTGTATAAG GCTGATCACA 180TAGGGTGCTA CCGACCTAGC CATTGCCAC ATG TCA ACG AAA TCT TAC GCA GAA 233Met Ser Thr Lys Ser Tyr Ala Glu1 5AGG GCC AAG GCA CAC AAT TCG CCA GTT GCT AGA AAG CTT CTG GCA TTG 281Arg Ala Lys Ala His Asn Ser Pro Val Ala Arg Lys Leu Leu Ala Leu10 15 20ATG CAC GAG AAG AAA ACC AAT CTC TGC GCT TCC CTT GAT GTG CGG ACG 329Met His Glu Lys Lys Thr Asn Leu Cys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr25 30 35 40TCT AGA AAG CTT CTG GAG CTA GCA GAC ACG CTG GGA CCG CAC ATT TGT 377Ser Arg Lys Leu Leu Glu Leu Ala Asp Thr Leu Gly Pro His Ile Cys45 50 55CTG CTG AAG ACA CAT GTC GAC ATA CTG ACG GAC TTC GAC ATC GAG ACG 425Leu Leu Lys Thr His Val Asp Ile Leu Thr Asp Phe Asp Ile Glu Thr60 65 70ACA GTC AAG CCG CTG CAG CAG CTT GCG GCT AAG CAC AAC TTC ATG ATC 473Thr Val Lys Pro Leu Gln Gln Leu Ala Ala Lys His Asn Phe Met Ile75 80 85TTC GAG GAC CGC AAG TTC GCT GAC ATT GGC AAC ACG GTT AAG CTG CAG 521Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly Asn Thr Val Lys Leu Gln90 95 100TAC TCC TCC GGC GTG TAC CGT ATC GCG GAG TGG GCG GAT ATT ACC AAT 569Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Arg Ile Ala Glu Trp Ala Asp Ile Thr Asn105 110 115 120GCA CAC GGC GTC ACC GGC CCC GGT GTG ATA GCC GGG CTG AAG GAG GCT 617Ala His Gly Val Thr Gly Pro Gly Val Ile Ala Gly Leu Lys Glu Ala125 130 135GCG AAA CTG GCC TCA CAG GAA CCC AGG GGG TTG CTG ATG CTG GCA GAG 665Ala Lys Leu Ala Ser Gln Glu Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu140 145 150CTC TCT TCT CAG GGC TCT TTG GCG CGC GGA GAC TAT ACC GCG GGC GTC 713Leu Ser Ser Gln Gly Ser Leu Ala Arg Gly Asp Tyr Thr Ala Gly Val155 160 165GTT GAA ATG GCG AAG CTG GAC GAA GAC TTT GTG ATC GGG TTC ATC GCG 761Val Glu Met Ala Lys Leu Asp Glu Asp Phe Val Ile Gly Phe Ile Ala170 175 180CAG CGT GAC ATG GGT GGG CGT GCA GAC GGC TTT GAC TGG CTC ATC ATG 809Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Ala Asp Gly Phe Asp Trp Leu Ile Met185 190 195 200ACC CCG GGG GTT GGC CTG GAC GAC AAA GGA GAC GGC CTG GGC CAG CAG 857Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp Lys Gly Asp Gly Leu Gly Gln Gln205 210 215TAC CGC ACG GTG GAT GAG GTC GTC AGC GAC GGT ACC GAT GTG ATC ATT 905Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val Ser Asp Gly Thr Asp Val Ile Ile220 225 230GTT GGC AGA GGG CTC TTT GAC AAG GGA AGA GAC CCC AAG GTC GAG GGT 953Val Gly Arg Gly Leu Phe Asp Lys Gly Arg Asp Pro Lys Val Glu Gly235 240 245GCC CGC TAC CGC AAG GCC GGT TGG GAG GCT TAC TTG CGC CGT ATG GGC 1001Ala Arg Tyr Arg Lys Ala Gly Trp Glu Ala Tyr Leu Arg Arg Met Gly250 255 260GAG ACT TCG TAGTCTATCG CTGGCGCCCA CAGTATATAG GCGGATTCCA 1050Glu Thr Ser265CCGCCGATTA CCATCTCAGC AACCTTTTTG TAATTATATG CCCCTATTGC CCTTATTTCC1110GAGCTGGTGC CGGGATCGGT TTATAGACGG GCAACAAGTT GATACTTTGT TCAGTAGCAT1170GCATCCAACA CTTGCAGGCT TGGGGTGTGG AAGGCCTCGC CGCGGATAAT TCGTATTACC1230CGCACTTCGT GAAGTATTGC TTTATGAAAA ATCTTCACTT TGGGCTAACT AGAGCCATAA1290CTCGACACAA GCCCCTTCCT ACACACTTCG AGCTGGGACT AAAGTGACAA CGAATAGCAA1350ATAATTAGCA AATATGGATG CGTTGAATTC 1380(2)序列2資料(ⅰ)序列特征
(A)長度267氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述序列2Met Ser Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Arg Ala Lys Ala His Asn Ser Pro1 5 10 15Val Ala Arg Lys Leu Leu Ala Leu Met His Glu Lys Lys Thr Asn Leu20 25 30Cys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr Ser Arg Lys Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45Asp Thr Leu Gly Pro His Ile Cys Leu Leu Lys Thr His Val Asp Ile50 55 60Leu Thr Asp Phe Asp Ile Glu Thr Thr Val Lys Pro Leu Gln Gln Leu65 70 75 80Ala Ala Lys His Asn Phe Met Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp85 90 95Ile Gly Asn Thr Val Lys Leu Gln Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Arg Ile100 105 110Ala Glu Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Pro Gly115 120 125Val Ile Ala Gly Leu Lys Glu Ala Ala Lys Leu Ala Ser Gln Glu Pro130 135 140Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Gln Gly Ser Leu Ala145 150 155 160Arg Gly Asp Tyr Thr Ala Gly Val Val Glu Met Ala Lys Leu Asp Glu165 170175Asp Phe Val Ile Gly Phe Ile Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Ala180 185 190Asp Gly Phe Asp Trp Leu Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp195 200 205Lys Gly Asp Gly Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val210 215 220Ser Asp Gly Thr Asp Val Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Phe Asp Lys225 230 235 240Gly Arg Asp Pro Lys Val Glu Gly Ala Arg Tyr Arg Lys Ala Gly Trp245 250 255Glu Ala Tyr Leu Arg Arg Met Gly Glu Thr Ser260 26權(quán)利要求
1．具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或與序列1序列具有至少80％同源性的其同系物。
2．權(quán)利要求1的同系物，其編碼的基因產(chǎn)物是有功能的。
3．具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或其同系物，其中基因或其同系物來自棉桃阿舒氏囊霉。
4．權(quán)利要求1到3任一項的基因或其同系物編碼的氨基酸序列。
5．權(quán)利要求4的氨基酸序列，其包括具有酶活性的蛋白。
6．含有權(quán)利要求1到3任一項的具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或其同系物的基因構(gòu)建體，其中基因或其同系物與一個或多個調(diào)節(jié)信號有效連接。
7．權(quán)利要求6的基因構(gòu)建體，其基因表達通過調(diào)節(jié)信號得以增加。
8．包括權(quán)利要求6或7的基因構(gòu)建體的載體。
9．包括權(quán)利要求6或7至少一種基因構(gòu)建體的微生物。
10．產(chǎn)生尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型微生物的方法，包括修飾權(quán)利要求1到3任一項的具有序列1序列的乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或其同系物，使得該基因編碼的蛋白無活性，該修飾基因被導(dǎo)入微生物中并通過同源重組整合進生物體基因組中，然后通過對5-氟乳清酸的抗性選擇這些微生物。
11．將DNA插入微生物中的方法，包括以下步驟將權(quán)利要求1到3任一項的包括具有序列1序列的完整乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因或其同系物，與至少一種其他基因一起，插入乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因有缺陷的微生物中，在無尿嘧啶培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物。
12．權(quán)利要求11的方法，其中線性DNA被用作載體。
13．權(quán)利要求11或12的方法，其中棉桃阿舒氏囊霉菌株用作乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因有缺陷的微生物。
14．權(quán)利要求11到13任一項的方法，其中至少一種核黃素生物合成基因被作為其他基因插入微生物中。
15．權(quán)利要求1到3任一項的基因序列或其同系物作為選擇標(biāo)記的用途。
16．權(quán)利要求15在棉桃阿舒氏囊霉中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有序列1序列的乳清苷－5’－磷酸脫羧酶基因或其同系物,含有該基因或其同系物的基因構(gòu)建體及其用途。本發(fā)明還涉及含有具有序列1序列的乳清苷－5’－磷酸脫羧酶基因或其同系物的載體或生物體。此外,本發(fā)明涉及產(chǎn)生尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型微生物的方法和將DNA導(dǎo)入尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型微生物的方法。
文檔編號C12N15/60GK1285873SQ98813111
公開日2001年2月28日 申請日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月15日
發(fā)明者M·蓬佩朱斯, J·L·雷沃伊爾塔多瓦爾, M·A·桑托斯加西爾 申請人:Basf公司