專利名稱：血液制品儲存和維持的改善的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改善血液制品包括包裝的紅細胞(RBC)、血小板等儲存穩(wěn)定性(包括抗溶血及提高活性)的方法。具體地，通過將血液制品儲存在包含有效劑量的L-肉堿或鏈烷酰L-肉堿的懸浮液中，提供了一種延長這些制品的存活和其對諸如輻照等膜破壞因素的抗性的方法。發(fā)明背景國內(nèi)和國際血液供應問題正日益受到人們的關(guān)注。就現(xiàn)存血液供應的完整性與可信性以及是否能夠建立更大規(guī)模的血庫等問題，都已經(jīng)列入議事日程。其中原因之一是血液制品保存穩(wěn)定的時間相對較短。目前，作為輸血及其它類似用途血液制品的主要形式，包裝紅細胞(也就是紅細胞濃縮物，簡稱RCC)的保存期只有42天。超過這一時限，血液制品中ATP水平明顯下降，同時伴隨有pH顯著降低，這是缺乏活性的顯著特征，即使偶存活性，輸血后其循環(huán)壽命也將極短。在體內(nèi)全血也不能長時間儲存。對于血小板來說，當前其儲存期更短，22℃只能保存5天。血小板濃縮物(PC)和紅細胞之間這種儲存穩(wěn)定性的差別主要是由于血小板進行的代謝反應造成的，這部分是因為血小板中存在線粒體而紅細胞中沒有。一段時間后，兩種血液制品在出現(xiàn)ATP下降、pH降低的同時伴隨著乳酸的產(chǎn)生，血小板中的線粒體由于糖酵解作用加劇此情況的惡化。
同時，人們對于血液資源的可靠性和完整性也日益重視。特別是不斷有被細菌或其它微生物因子或病毒污染的血液資源被檢測出來。這種情況在那些缺乏精密采血手段和保存方法的國家更為嚴重。雖然通過添加藥物可以降低收集的血液制品的污染，但那樣會對回輸給受血病人不利。一種較好的替代方法是對經(jīng)過包裝的血液制品，一般是用強化乙烯塑料容器，進行輻照處理。但這種輻照處理會由于破壞紅細胞和血小板的儲存而導致這些細胞功能喪失。
另外，一小部分但日益增多的受血人群還面臨一種名為輸血相關(guān)的移植物抗宿主疾病(TAGVHD)致命疾病的威脅，這種疾病是由于存在有活力的同種異體白細胞引起的。這種綜合癥較典型的發(fā)生在免疫抑制病人身上，如癌癥病人和骨髓移植患者，但也可以在具有限制性人類白細胞座系A(HLA)多態(tài)型的免疫正常人群中發(fā)生。
更多的注意力投向?qū)ふ已娱L儲存穩(wěn)定性方法上來。美國專利5466573號引述了一種延長血小板濃縮物儲存期的方法，該專利涉及提供帶有醋酸鹽離子的血小板濃縮物，醋酸鹽既可以作為氧化磷酸化的底物也可以作為緩沖劑中和由于乳酸產(chǎn)生而引起的pH降低。這種方法不能直接解決溶血和膜降解等問題。另外一種可供選擇的方法見于已公知的美國專利5496821。這件專利中，將全血制品儲存于含L-肉堿(LC)或是其鏈烷酰衍生物的制劑中。但此專利沒有描述其對血液產(chǎn)品如血小板或紅細胞懸浮液的作用，也至少沒有涉及LC對血漿性質(zhì)的影響。
前面已經(jīng)提到，醫(yī)學界越來越重視微生物因子或病毒對血液制品的污染問題。關(guān)于污染，血液制品滅菌和提高可靠性的一種方法是輻照血液制品。一般說來，約25厘戈瑞(cG)的伽瑪射線輻照劑量照射密封在塑料、玻璃或其它容器中的血液制品即可達到令人滿意的效果。遺憾的是，輻照能引起細胞膜損壞造成紅細胞溶血。對于包括全血、包裝紅細胞和血小板等在內(nèi)的血液制品的輻照都面臨這些問題。
因此本領(lǐng)域技術(shù)人員需要提供一種延長紅細胞和血小板活性和輸血后半壽期的方法。另外本領(lǐng)域技術(shù)人員要找到如何使包括全血、包裝紅細胞和血小板在內(nèi)的血液制品經(jīng)受輻照而沒有大量膜破壞、損傷和溶血的途徑。發(fā)明概述申請人經(jīng)過全面研究發(fā)現(xiàn)，紅細胞及血小板經(jīng)儲存或接受輻照出現(xiàn)的膜破壞作用可以通過將血液制品懸浮在常規(guī)保藏液(如AS-3)中，其含有0.25-50mM(或者更高)的L-肉堿或其鏈烷酰衍生物，而大大延遲和抑制。申請人的發(fā)現(xiàn)是基于這樣一種認識，即絕大多數(shù)血液制品變質(zhì)過程中常常伴隨著的ATP水平和pH值下降都可歸因于膜破壞和溶血。通過脂的再?；安糠滞ㄟ^L-肉堿可進行膜的維持和修復工作，通過創(chuàng)造性的研究工作已確認紅細胞及其它類似血液制品中不可逆的攝取L-肉堿。附圖簡述

圖1.在對照和LC條件下保存42天后不同供血者的紅細胞的輸血后壽命值。箭頭分別表示對照和LC保存的紅細胞的平均值±SD。圖中上部所列為精確計算出的p值。
圖2.在血液儲存過程中不同儲存周數(shù)紅細胞肉堿的含量。肉堿的分析如材料與方法部分所述。每個值為三次重復實驗的平均值。各次實驗間誤差不超過7％?？招膱A圈代表單獨用AS-3儲存紅細胞；實心圓圈代表紅細胞儲存于含補加LC(5mM)的AS-3中。發(fā)明詳述本發(fā)明利用L-肉堿及其鏈烷酰衍生物作為支持血液制品中細胞膜維護、修復和抑制溶血的試劑。其中鏈烷酰L-肉堿包括乙?；?、丁?；惗□；⑽祯；?、異戊?；吞貏e是丙?；鵏-肉堿。在此，一般用LC指代此家族以L-肉堿為代表范例。此處已經(jīng)提到過的鏈烷酰L-肉堿以及其藥學可接受的鹽均可以替代L-肉堿。
向包括紅細胞和血小板濃縮物的血液制品中加入LC時需要有效劑量的LC以實現(xiàn)膜維護、修復和抑制溶血。已進行的研究表明(包括下面實施例所列的結(jié)果)，對于絕大多數(shù)供血來講最低的有效劑量范圍為約0.25mM-0.5mM。這里所定的上限主要是從實用性角度出發(fā)而非從生理角度。即使?jié)舛冗_到甚至超過50mM，人仍能輕松耐受。將毒理作用因素和滲透作用因素綜合考慮后的值可以接受。優(yōu)選的濃度范圍在1-30mM內(nèi)。1-10mM或更高的濃度范圍都適用，在4-6mM濃度范圍獲得的值有顯著性差異。本發(fā)明的作用包括延長活力、延長其輸血后的循環(huán)半壽期均可能具有高度供體依賴性。因此，一般來說LC的有效劑量在0.5-50mM范圍之間。但本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員很可能會根據(jù)供血者的特殊性在上限和/或下限方向拓寬這個范圍。這種范圍的拓寬不需要創(chuàng)造性勞動。
LC存在于一般是用于提供緩沖作用的常規(guī)支持溶液(穩(wěn)定化溶液)中。一般常用的此類溶液有ACED(檸檬酸-檸檬酸鈉-葡萄糖)、CPD(檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖)和其改進形式，包括CPD2/A-3以及相關(guān)的組分。這些組分一般包含碳水化合物如葡萄糖或甘露糖醇、至少一種磷酸鹽、一種檸檬酸鹽和其它平衡鹽類。通常LC易于溶解，可在需要的范圍內(nèi)自由添加到這些組分中。
美國專利5496821號所述及的合適溶液在此引入作為參考。然而，其它不同于這些常規(guī)使用的支持液的溶液也可以使用，其中包括人造血漿和其它生理上可接受的溶液，只要它們含有根據(jù)本發(fā)明的LC即可。在支持液中最重要的組成成分是LC。
下述體內(nèi)、體外的實驗結(jié)果闡明，當LC加入諸如紅細胞和PC等血液制品懸浮液中，其可延長有效期和相應的保存期以及輸血后在受血者體內(nèi)的循環(huán)壽命。在實驗中利用的是LC，其它的鏈烷酰L-肉堿也可以使用。下面特別重要的是通過改善細胞膜的維持(包括修復)和抑制溶血獲得了改善的品質(zhì)。材料與方法研究設計1存在和不存在LC條件下紅細胞體內(nèi)和體外儲存質(zhì)量的評估受試者受試人群為男性或女性，年齡在18-65歲之間，沒有已知的精神和身體殘疾，沒服用可能影響紅細胞活力的藥物。征募的志愿者均達到美國血庫協(xié)會標準和美國國立紅十字會血液服務指令第二章，聯(lián)邦登記代碼所列的常規(guī)同種異體供血者的標準。本研究經(jīng)HamptonRoads醫(yī)學院公共機構(gòu)審查委員會批準，并且在參與本研究之前獲得受試者同意。
每一個獻血者間隔72天采血一次，首次采血隨機分成測試臂或?qū)φ毡邸?br> 血液儲存系統(tǒng)標準CP2D/AS-3系統(tǒng)(Miles，Inc.)使用以二乙基-己基-鄰苯二甲酸(DEHP)為增塑劑的聚氯乙烯塑料袋。每一測試組中，將245mg LC(溶于1.1ml純凈的無熱原溶液，置于無菌玻璃瓶中)加入含有AS-3添加溶液的容器內(nèi)，使LC最終濃度達到5mM。對于對照組來講，將1.1ml 0.9％的NaCl于同樣條件加入AS-3溶液。通過帶注射器的采樣位點聯(lián)結(jié)器將LC或鹽水注射入袋中。以上操作在紫外燈照射下于層流通風櫥中進行。
獻血和處理過程采用標準靜脈切開術(shù)和抽血方法收集大約450±50ml全血。全血樣品處理前于室溫放置4-8小時。用標準條件離心樣品，離心后擠壓出上清血漿，將沉積的包裝紅細胞重新懸浮于標準的AS-3溶液(對照組)或含L-肉堿的AS-3溶液(測試組)中。懸浮的紅細胞樣品置4℃儲存42天。
體外測定分別對前(0天)、后(42天)期樣品進行測定，檢測項目包括紅細胞ATP水平；總的和上清中的血紅蛋白、血細胞比容(Hct)；紅細胞、白細胞和血小板計數(shù)；紅細胞滲透脆性；紅細胞形態(tài)；乳酸鹽和葡萄糖含量；上清中鉀離子水平。這些測定均采用以前所述的標準方法，Heaton等人，Vox Sang 5737-42(1989)。
體內(nèi)輸血后的測定保存42天后，取出樣品用標準方法對細胞進行Cr標記。同時為了確定紅細胞量，將從獻血者收集到的新鮮紅細胞進行99Tc標記。標記后，將15μCi51Cr標記的儲存過的細胞和15μCi99Tc-標記的新鮮細胞混勻，且同時輸入。在輸血后長達35天里于多個時間間隔采血樣(5ml)，以計算24小時的恢復百分比和存活百分比。24小時的恢復百分比的確定可以通過單標記方法進行，其中對于第5、7.5、10和15分鐘收集的血樣放射活性進行l(wèi)og線性回歸以用于確定0時的水平，也可以通過雙標記方法，即利用99Tc檢測確定的獻血者紅細胞的量來計算。
于輸血后第24小時采樣，隨后5周內(nèi)每周采樣兩次確定輸血后存活的Cr標記的紅細胞的循環(huán)壽命。放射活性水平按每天被洗脫掉1％進行校正。以輸血后的天數(shù)作為自變量(x軸)，校正的Cr計數(shù)為因變量(y軸)時，數(shù)據(jù)符合線性方程。則擬合的直線與x軸的交點即為紅細胞的壽命。
統(tǒng)計分析對體內(nèi)、體外測試實驗的數(shù)據(jù)進行成對t-檢測或傳統(tǒng)的無參數(shù)統(tǒng)計分析以確定對照組和測試組之間是否具有統(tǒng)計學上的顯著性差異(單尾)。當p值小于0.05時認為具有統(tǒng)計學顯著性。研究設計2儲存42天后紅細胞LC的攝取和脂再?；芯炕瘜W試劑基本上無脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)獲自SIGMA化學試劑公司，St.Louis，Mo.(美國)。[l-14C]棕櫚油酸(58Ci/mol)獲自新英格蘭核公司，Boston，Mass.(美國)。帶預吸收層的Whatman LK6(硅膠)(20×20cm)薄層板由Carlo Erba，Milan(意大利)提供。其余所有化合物均為試劑級。
紅細胞肉堿分析從儲存的RCC中抽取血液樣品，用4倍體積的冷0.9％ NaCl沖洗。將紅細胞重新懸浮于0.9％的NaCl溶液，至終血細胞比容為50％，按Cooper等人所述的方法用高氯酸去除蛋白質(zhì)，生物化學及生物物理學雜志(Biochem.Biophys.Acta)959100-105(1988)。對最終提取物等分樣品按照放射化學的方法分析游離LC含量，參見Pace等人，臨床化學(Clin.Chem.)2432-35(1978)。結(jié)果研究1AS-3紅細胞濃縮物(RCC)樣品儲存前的特性經(jīng)全血樣品加工后得到的AS-3紅細胞濃縮物制品的性質(zhì)與預計的一樣。通過對樣品體積、血細胞比容和白血球計數(shù)以及體外對紅細胞性質(zhì)如ATP水平、上清血紅蛋白、鉀離子水平和滲透脆性等的測定，沒有發(fā)現(xiàn)對照組與測試組之間存在明顯差異(見表1)。儲存42天后紅細胞特性代謝在測試組和對照組在42天儲存中有相似的葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)生量(見表2)。正如預料的一樣，這兩個糖酵解參數(shù)間存在相反的高相關(guān)性(r＝0.76)。但是與對照組相比，肉堿保存的紅細胞組具有溶血少和ATP水平較高的特性。如圖1中可見，除了一組樣品外其余樣品全部具有較高的ATP水平(p＜0.01)。
膜如圖2所示，帶L-肉堿的組儲存結(jié)束后溶血百分比較低。另一方面，42天儲存結(jié)束后在上清液鉀離子水平、滲透休克反應和形態(tài)學得分方面無明顯差異，均在預期的范圍內(nèi)。
輸血后的存活力對照組平均24小時恢復百分比與以前的發(fā)現(xiàn)相近。但肉堿保存的紅細胞平均24小時恢復百分比高于對照組保存的細胞(p＜0.05)。此外，L-肉堿保存的細胞輸血后平均循環(huán)壽命也較高(圖1)。獻血者兩次獻血的紅細胞量經(jīng)檢測沒有統(tǒng)計學差異，具有極高相似性(r＝0.98)。
相關(guān)性研究如預期，24小時恢復百分比與ATP水平(r＝0.63)和其它紅細胞膜完整性檢測如溶血(r＝0.57)、滲透脆性(r＝0.71)和形態(tài)學得分(r＝0.59)有顯著相關(guān)性。溶血率與紅細胞樣品中的ATP水平(r＝0.83)和白細胞含量(r＝0.83)密切相關(guān)。紅細胞的循環(huán)壽命與任何體外參數(shù)沒有明顯的相關(guān)性。研究2儲存紅細胞中肉堿的攝取僅儲存于AS-3基質(zhì)中的紅細胞在整個儲存過程中沒有顯示出任何明顯LC濃度損失(圖2)。這與Cooper等人(出處同前)的發(fā)現(xiàn)一致，表明人紅細胞LC不能與血漿或等滲緩沖液進行自由交換。當紅細胞儲存于補加LC的AS-3中時，檢測發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)LC的量較單純AS-3保存時高(圖2)。儲存期間內(nèi)LC濃度呈線性增長，至42天增加到4倍。討論在儲存42天后對紅細胞樣品進行的體內(nèi)和體外實驗均顯示出，肉堿儲存的紅細胞樣品與對照儲存的紅細胞之間存在明顯差別。多種體外反映代謝和膜完整性的指征，如ATP和溶血百分比，連同細胞存活能力(24小時恢復百分比和循環(huán)壽命)直接測定的結(jié)果一同顯示出肉堿儲存的紅細胞明顯較好。輸血后24小時存活的紅細胞平均循環(huán)壽命的延長引人注意。這一發(fā)現(xiàn)可能與儲存期間LC的不可逆吸收這樣一種空前的、出乎預料的發(fā)現(xiàn)相關(guān)。獲自對照樣品中的多種紅細胞性質(zhì)指標在意料之中，與以往研究結(jié)果沒有差別。血樣采集時測試組與對照組的樣品或紅細胞性質(zhì)也沒有明顯差別。正如圖1-3所示，紅細胞的ATP水平、溶血百分比和循環(huán)壽命與獻血者個體密切相關(guān)，由于在第一次和第二次抽血進行的研究為帶有5個測試組和5個對照組的隨機成對設計，因此觀察到的差異不是由于偶然因素或研究設計失誤造成的。因此研究中觀察到的差異顯然是由于測試樣本中加入肉堿引起。當然，也不能排除儲存紅細胞壽命的延長反映了Cr洗脫下降這種可能性，但這同已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與體內(nèi)生存能力有關(guān)的儲存紅細胞的體外測定的改善不一致。
眾多研究發(fā)現(xiàn)，L-肉堿及其?；Πt細胞在內(nèi)的多種細胞都有細胞保護和膜穩(wěn)定作用。見如，Snyder等人，Arch.Biochem.Biophys.276132-138(1990)。此研究發(fā)現(xiàn)，在儲存期間紅細胞不可逆的攝取L-肉堿。雖然此作用尚不完全清楚，但可排除存在L-肉堿攝取的特異性載體參與的可能性。就我們所知，唯一已知的L-肉堿載體是在胞內(nèi)L-肉堿濃度高于正常胞外環(huán)境許多倍的細胞系統(tǒng)中活動。紅細胞中的L-肉堿濃度同血漿中的類似。這樣無論在儲存中發(fā)生溫度降低、ATP缺失以及其它可能的代謝變化，只要紅細胞儲存于含有相對較高濃度L-肉堿的基質(zhì)中，其對L-肉堿的單向攝取就可以完成。在此領(lǐng)域內(nèi)未見有關(guān)的預見。
L-肉堿對儲存紅細胞的作用本質(zhì)可以認為是對膜隔的生物物理和/或代謝性干預。儲存紅細胞的輸血后存活率與膜功能的完整性有關(guān)，這從紅細胞回輸后的體內(nèi)生活能力與它表面積-體積比測定值的顯著相關(guān)性中可以看出。對紅細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能起主要貢獻的是細胞骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，Marchesi，細胞生物學年鑒(Ann.Rev.Cell Biol.)1531-536(1985)，這是一種位于紅細胞細胞膜內(nèi)部血小葉(hemileaflet)下方的超大分子量蛋白組織。Wolfe等人在對儲存紅細胞的細胞骨架膜蛋白的組分和功能的研究中發(fā)現(xiàn)，唯一相關(guān)的變化是血影蛋白與肌動蛋白結(jié)合能力下降，而這與蛋白4.1存在與否沒有關(guān)系。見Wolfe等人，J.Clin.Invest.781681-1686(1986)。我們介紹了LC通過含有再封閉血影的蛋白4.1在剪應力增加時改變紅細胞膜的變形性。Arduini等人，生命科學(Life Sci.)472395-2400(1990)。這樣，L-肉堿通過血影蛋白與一個或幾個細胞骨架組件相互作用而對膜穩(wěn)定性發(fā)揮作用。最近Butterfield和Rangachari生命科學，52297-303(1992)對紅細胞血影蛋白-肌動蛋白相互作用的電子順磁共振研究表明，LC明顯降低了血影蛋白旋轉(zhuǎn)標記位點上的片段運動。
除了前面提到的可能的生物物理作用，LC儲存的紅細胞所具有的性質(zhì)改善很可能是由有利的代謝過程導致的。一般來說，膜磷脂的脫?；?再?；h(huán)需要ATP或者是?；o酶A的產(chǎn)生。?；o酶A的?；糠衷偻ㄟ^溶血磷脂?；o酶A轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到溶血磷脂上。此外紅細胞磷脂的膜修復過程在面臨氧化時遵循著同樣的代謝途徑。目前研究顯示，CPT通過調(diào)整脂肪酸活化步驟和轉(zhuǎn)移到溶血磷脂之間的?；o酶A積累而影響紅細胞和神經(jīng)元細胞膜磷脂的再?；^程。Arduini等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)26712673-12681(1992)。此外脈沖追蹤和ATP耗貧研究顯示，紅細胞的?；鈮A池可作為活化?；鶊F的儲備池不耗費ATP。Arduini等人，生物化學生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)187353-358(1994)。
較高的24小時恢復百分比和循環(huán)壽命的提高顯示其效力大約提高了15％(受血者輸血后有效的循環(huán)紅細胞平均壽命值)。這一能力的提高在臨床上可以降低需要長期輸血患者如患有地中海貧血或骨髓衰竭等的要求。另一方面它很可能延長流態(tài)保存紅細胞的儲藏期限。
我們的發(fā)現(xiàn)提示，紅細胞儲存過程中保藏介質(zhì)含有LC可以節(jié)省膜修復過程中磷脂再?；瘯r對ATP池的作用。結(jié)合可能有益的生物物理作用，這一有利的代謝過程可用于解釋LC儲存紅細胞時出現(xiàn)的溶血減少、ATP水平較高以及體內(nèi)恢復和存活率改善等現(xiàn)象。輻照血液制品包括全血、紅細胞、血小板濃縮物等被諸如細菌、其它微生物因子或病毒污染的問題可以通過輻照而大大緩解。滅菌所必需的、基本達到上述污染因子100％致死率的輻照水平已被廣泛研究。
此外，更重要的一點是類似的輻照可以將白細胞破壞。包括伽瑪射線(鈷GG，Van de Graff加速器)、UV照射、紅外線照射等在內(nèi)的許多輻照形式都可以采用。只要與20-50cG的伽瑪輻照相似的量就足夠了。
在世界范圍內(nèi)，每年約采集6-8千萬份全血用于各種患者群體的輸血供應上。在發(fā)展中國家每千人的采血率很低，主要的輸血用于產(chǎn)科和兒科病例治療上，尤其是用于伴隨貧血的瘧疾治療。而發(fā)達國家的千人采血率大約是不發(fā)達國家的50-10倍，其中大部分輸血用于外科手術(shù)(50％)或有諸如伴隨貧血的腫瘤、骨髓移植、非惡性腸胃出血疾病的患者(圖1)。同種異體輸血也有許多潛在的副作用。較特別的與輸血過程相關(guān)的很少出現(xiàn)但卻常常致命的并發(fā)癥稱為輸血伴隨移植物抗宿主疾病(TAGVHD)，它是一種由存活的同種異體免疫細胞介導的并發(fā)癥。
TA-GVHD疾病是一種輸血少見的并發(fā)癥，主要存在于兩類受血人群中。TA-GVHD的死亡率接近100％，目前對付其唯一有效的手段就是預防。第一種是免疫抑制患者，象骨髓或其它器官移植后的病人、何杰金氏病人或遺傳性免疫系統(tǒng)缺陷病人。第二種是非免疫抑制患者，當供血者與受血者有著類似的組織相容性抗原時容易發(fā)生。這種現(xiàn)象在近親直接供血或在有著非常有限的組織相容性抗原多形態(tài)的群體間直接供血時最容易發(fā)生，如在日本和以色列?？紤]到所有這些，一般采用大約25cG這一中等輻照劑量伽瑪射線對血液制品進行輻照以破壞存活免疫細胞的復制能力。值得注意的是，TA-GVHD與新鮮的細胞制品也就是說一般不到15天相關(guān)。但是血液制品的“老化”在防止這種并發(fā)癥上并不被人接受。雖說免疫細胞是同種異體白細胞群的一部分，但目前通過第三代濾器達到的白細胞清除程度還不能防止此并發(fā)癥的發(fā)生。這樣，目前伽瑪射線輻照仍為唯一接受的預防干預手段。
伽瑪射線對紅細胞進行照射所面臨的困難實際上在于輻照可能對細胞膜造成損壞。體外紅細胞ATP減少、溶血增加和上清液鉀離子增加的測定表明在這種劑量輻照下，紅細胞的效力喪失大約7-8％方面。這些變化與膜破壞作用相一致。這些體外變化伴隨著經(jīng)伽瑪輻照的紅細胞24小時恢復程度的下降。對于血小板制品也有這種存活能力下降的報道。
令人信服的證據(jù)表明伽瑪射線通過產(chǎn)生各種活性氧發(fā)揮作用，象單線態(tài)氧、氫氧基和超氧離子。這些類型的氧引起細胞內(nèi)DNA破壞，阻止細胞復制，而這是TA-GVHD發(fā)生的先決條件。但同樣是這些氧也可以氧化紅細胞膜和血小板膜上的脂類物質(zhì)，使膜破碎導致細胞制品品質(zhì)(能力)下降。
已知LC在跨線粒體膜輸送長鏈脂肪酸的過程中起重要作用。肉堿系統(tǒng)轉(zhuǎn)運長鏈脂肪酸的功能喪失這種遺傳性障礙導致骨骼肌功能顯著下降。近來，對L-肉堿在紅細胞膜中所起作用的興趣越來越高。但令人驚訝的是紅細胞中不含有線粒體，因而讓人好奇集中于LC和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，這種酶參與LC的可逆?；?。首先不清楚的是它們在紅細胞內(nèi)部的作用。紅細胞很可能在其體內(nèi)循環(huán)的全過程中一直面臨氧分壓的威脅，因此涉及LC的氧化膜脂修復對于紅細胞的正常存活非常重要。
在ATP效力增加時早期?；鈮A增加很可能是作為活化脂肪酸的儲備，其可以在隨后用于修復遭破壞的氧化膜脂。這可以很好的解釋體外儲存紅細胞制品出現(xiàn)的溶血減少，另外也解釋了在體內(nèi)恢復和存活的改善。LC加入的凈效應是大約使品質(zhì)升高17％。
因此，LC或前面提及的鏈烷酰LC都可以用于消除或預防輻照造成的膜破壞。這可以通過在體外紅細胞中儲存的肉堿修復氧化膜脂的能力而達到。
為了降低血液制品對膜破壞和溶血的敏感性，可以將血液制品先懸浮于含0.25mM-50mM的LC或前面提及的鏈烷酰LC的一種溶液中。通過對密封的血液制品進行用于滅菌的輻照可以達到細胞膜維護和抑制溶血的滿意程度，還可以延長儲存期限及輸血后的循環(huán)半壽期。與目前這種材料更接近無菌且不易導致TA-GVHD的能力相似的能力可由于密封后對血液制品懸浮液進行輻照滅菌實現(xiàn)。需要強調(diào)的是剛才提到的術(shù)語血液制品的范圍還可以拓寬，它可以包括全血、血漿、包裝紅細胞、血小板濃縮物、其混合物等。
為證實紅細胞成分中添加LC后經(jīng)伽瑪輻照滅菌或破壞免疫細胞可以提高紅細胞的存活率，進行了下面的實驗。材料與方法血液儲存系統(tǒng)使用標準的四層儲存袋CP2D/AS-1系統(tǒng)(Baxter，Inc.)。對測試組樣本，將245mg L-肉堿內(nèi)鹽(LC)溶解于1.1ml無熱原純鹽水后加入含AS-1添加溶液的儲存袋中，使終濃度達到5mM。對于對照組樣本，在同樣條件將1.1ml鹽水加入AS-1溶液中。
獻血和處理過程采用標準靜脈切開術(shù)和抽血方法收集大約450±50ml全血。全血樣品處理前室溫放置4-8小時。用標準條件離心樣品(見Heaton W.A.等人；Vox sanguinis，1989，5737-42)后，棄上清血漿，將沉淀的包裝紅細胞(RBC)再懸浮于標準AS-1溶液(對照組)或含LC的AS-1溶液(測試組)。
紅細胞樣品的儲存條件和伽瑪輻照懸浮紅細胞樣品(對照和測試)于1-6℃儲存14天后進行25cG劑量的伽瑪輻照。然后紅細胞樣品繼續(xù)在1-6℃保存至42天。
體外測定對保存前-(0天)、后-(42天)樣品進行包括上清血紅蛋白和平均細胞體積(MCV)的測定。測定按照前面提到過的Heaton等人的標準方法進行。
統(tǒng)計分析樣品量依前面測定的上清血紅蛋白的變化確定。這樣總共抽取94份紅細胞樣品，每只臂47份(對照和測試)。對血漿血紅蛋白數(shù)據(jù)分布的分析顯示出顯著的不對稱(＞2)和峰態(tài)(8-10)。因此，數(shù)據(jù)通過分析軟件(Epistat，Richardson，TX)利用無參數(shù)檢驗進行中值分析。結(jié)果全血處理完以后，紅細胞樣品儲存前性質(zhì)與預料的一樣。對照和含LC紅細胞樣品的上清血紅蛋白和細胞平均體積之間沒有顯著差別(表A)。儲存結(jié)束后(42天)，伽瑪射線照射的紅細胞在對照組和含LC的測試組之間有統(tǒng)計學上的明顯差異(見表A中的p值)。特別是與對照紅細胞組相比，發(fā)現(xiàn)測試組紅細胞樣品的溶血較低。含LC紅細胞樣品組的細胞平均體積值也比對照組低。
上述檢測結(jié)果顯示，紅細胞制品中添加LC可以防止紅細胞制品經(jīng)伽瑪射線照射在儲存過程中所帶來的破壞。
表A0天 42天對照 L-肉堿P 對照L-肉堿 P細胞平均體積(fL)91.2 90.7 0.46100.2 97.50.006血漿血紅蛋白濃度11.8 11.5 0.58495 382 0.05(毫克/分升)本發(fā)明以一般類型樣品和參考特殊實施例加以公開。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以不需要創(chuàng)造性勞動進行改變。特別是替換穩(wěn)定劑成分、血液制品、防腐劑、抑制劑及其它類似物質(zhì)均可以改變而不需創(chuàng)造性技能。此外，特定的水平、生存期和循環(huán)半壽期會由于供血者個體之間和受血者個體之間的差異而有一定的變化。除非在下面的權(quán)利要求書中特別明確排除在外的變化，其余這些變化仍在本發(fā)明所覆蓋范圍之內(nèi)。表1紅細胞濃縮物保存前的特性對照組 測試組(L-肉堿)樣品體積(mL) 305±38295±41UniHe(Jo) 60±3 60±3樣品白細胞(×109) 2.6±1.1 2.4±1.1ATP(μmol/g dL) 4.6±0.2 4.3±0.4上清液Hb(mg/dL) 34±15 26±8上清液K+(mEq/L) 23±0.22.2±0.3滲透脆性(％) 50±4 49±4表2紅細胞濃縮物的保存后(42天)特性對照組 實驗組(L-肉堿)體外參數(shù)葡萄糖(毫克/分升)208±33193±40乳酸(毫克/分升) 201±27199±37pH 6.33±0.03 6.32±0.04ATP(μmol/g Hb) 3.01±0.42 3.24±0.38*溶血百分率(％) 0.47±0.41 0.30±0.22*上清K+(mEq/L)61±4 60±3滲透脆性(％) 51±3 50±4形態(tài)學得分 69±8 68±15體內(nèi)參數(shù)24小時恢復百分比(單標記) 81.1±6.2 84.0±4.424小時恢復百分比(雙標記) 80.1±6.0 83.9±5.0*紅細胞含量(毫升) 1634±510 1591±534存活時間(天) 85.9±14.3 96.1±11.2**(p＜0.05)
權(quán)利要求
1.一種改善紅細胞或血小板濃縮物經(jīng)儲存后的膜維持和抑制溶血的方法，包括將所述的紅細胞或血小板濃縮物懸浮于支持溶液，該支持溶液含有選自L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿或其藥學可接受的鹽類及其混合物的一種肉堿制品，與缺少所述的L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿或其藥學可接受的鹽類及其混合物的相同支持溶液相比，所含肉堿的量可有效提高所述的紅細胞或血小板濃縮物維持紅細胞或血小板濃縮物膜的能力，并籍此抑制溶血。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿及其混合物的濃度范圍在0.25-50mM之間。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿及其混合物的量在1-20mM之間。
4.一種含支持溶液中的紅細胞的密閉容器，所述的支持溶液包含范圍在0.25-50mM之間的L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿及其混合物。
5.一種含穩(wěn)定化溶液中的紅細胞的密閉容器，所述的穩(wěn)定化溶液包含量在0.25-50mM之間的L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿及其混合物。
6.權(quán)利要求4所述的密閉容器，其中該容器密封后經(jīng)輻照以基本上滅菌和破壞其中的白細胞。
7.權(quán)利要求5所述的容器，其中該容器密封后經(jīng)輻照以基本滅菌和破壞其中的白細胞。
8.一種對選自全血、血漿、紅細胞、血小板濃縮物及其混合物的血液制品進行基本滅菌的方法，包括將該血液制品懸浮于支持液，該支持液含有0.25-50mM量的L-肉堿，將所述的血液制品密閉于容器后對該血液制品輻照，以基本上將所述血液制品滅菌。
9.一種對選自全血、血漿、紅細胞、血小板濃縮物及其混合物的血液制品進行處理以抑制其中的白細胞的方法，包括對懸浮于含有0.25-50mM L-肉堿的支持液中的血液制品輻照，以基本上破壞該樣品中的白細胞，同時抑制對所述血液制品的膜損害。
10.一種改善在對出于破壞其中免疫細胞目的而輻照的紅細胞或血小板濃縮物在儲存過程中的膜維持和抑制溶血的方法，包括將所述的紅細胞或血小板濃縮物懸浮于支持液，該支持液含有選自L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿及其混合物的一種肉堿制品，與缺少L-肉堿、鏈烷酰L-肉堿及其混合物的相同支持溶液相比，所用肉堿的量可以有效提高所述紅細胞或血小板濃縮物維持紅細胞或血小板濃縮物膜的能力，并且籍此抑制溶血。
11.權(quán)利要求1、2、3、8、9和10所述的方法，其中的鏈烷酰L-肉堿選自乙?；?、丙酰基、丁酰基、異丁?；?、戊?；彤愇祯；鵏-肉堿。
12.權(quán)利要求4-7所述的密閉容器，其中的鏈烷酰L-肉堿選自乙酰基、丙?；?、丁酰基、異丁酰基、戊?；彤愇祯；鵏-肉堿。
全文摘要
紅細胞和血小板濃縮物細胞膜的維持通過添加1mM至10mM L－肉堿及其衍生物而得以改善。這種改善可以延長包裝紅細胞和血小板濃縮物的有效期。此外,經(jīng)過如此處理的制品輸入病人體內(nèi)后其循環(huán)半壽期延長。這種方法改善了膜維持,使得對密閉容器內(nèi)血液制品進行輻照以基本滅菌和破壞其中的白細胞成為可能。
文檔編號C12N5/02GK1252687SQ98804212
公開日2000年5月10日 申請日期1998年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月16日
發(fā)明者S·多拖利 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司