專利名稱：選擇性連接及擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性核酸靶序列的體外擴(kuò)增方法。本發(fā)明尤其涉及最初依賴于DNA聚合酶及連接酶共存活性以介導(dǎo)核酸靶擴(kuò)增的方法。此方法可用于選擇性擴(kuò)增含有如點(diǎn)突變、缺失及插入的序列變異的核酸序列。
背景技術(shù)：
許多遺傳及獲得性疾病與如點(diǎn)突變、缺失及插入等遺傳變異有關(guān)。某些變異與疾病的發(fā)生直接相關(guān)，而其它與疾病危險(xiǎn)率和/或預(yù)后相關(guān)聯(lián)。有超過(guò)500種人類遺傳疾病是由單基因突變所致。這些疾病包括囊性纖維化，肌營(yíng)養(yǎng)不良，α1-抗胰蛋白酶缺陷，苯丙酮尿癥，鐮狀細(xì)胞貧血或性狀，及各種其它血紅蛋白血癥。進(jìn)一步地，對(duì)某些共同多基因病癥如粥樣硬化性心臟病的易感性增加的個(gè)體已被證明與特定DNA序列多態(tài)性的遺傳相關(guān)。癌癥的發(fā)生被認(rèn)為是由于參與細(xì)胞增殖或分化的基因中的遺傳受損的累積所致。Ras原癌基因K-ras、N-ras及H-ras以及p53腫瘤抑制基因是人類癌癥中經(jīng)常突變的一些基因。這些基因的特異性突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)化可能性的提高。遺傳分析有希望成為臨床評(píng)價(jià)疾病危險(xiǎn)系數(shù)、診斷疾病、預(yù)報(bào)病人預(yù)后或?qū)χ委煹姆磻?yīng)及監(jiān)控病人病程進(jìn)展的途徑。如此遺傳試驗(yàn)的采用要依賴于開發(fā)對(duì)遺傳變異的簡(jiǎn)單、廉價(jià)及快速的分析。
由于對(duì)如此試驗(yàn)開發(fā)興趣的提高，在此領(lǐng)域已發(fā)表了許多參考資料，包括Abravaya，K.，Carrino，J.J.，Muldoon，S.and Lee H.H.(1995)用修飾的連接酶鏈反應(yīng)(Gap-LCR)檢測(cè)點(diǎn)突變。Nucleic Acids Research23，675-682；Barany，F(xiàn)(1991)使用克隆的熱穩(wěn)定連接酶進(jìn)行遺傳疾病檢測(cè)及DNA擴(kuò)增，Proc Natl Acad Sci 88，189-193；Belgrader，P.；Marino，M.M.；Lubin，M.and Barany，F(xiàn).(1996)用于人類鑒定試驗(yàn)的多重PCR-連接酶檢測(cè)反應(yīng)分析，Genome Science and Technology 77-78；Eggerding，F(xiàn).A.(1995)用于多重遺傳分型的一步法偶聯(lián)擴(kuò)增和寡核苷酸連接程序，PCR Methods and Applications 4，337-345。
在美國(guó)專利No 5,593,840中揭示了一種檢測(cè)特異核酸序列的方法。該專利中所揭示的方法是基于PCR及LCR的某些方面可被聯(lián)合用于檢測(cè)和擴(kuò)增靶核酸序列這一發(fā)現(xiàn)。該方法包含使用三個(gè)引物，且第三個(gè)引物與第一個(gè)引物5’末端的至少一部分相互補(bǔ)。互補(bǔ)于第一個(gè)引物5’末端堿基的第三個(gè)引物的位置含有一修飾從而避免了如經(jīng)聚合酶的鏈置換，這一點(diǎn)是該方法的基本特征。
關(guān)于PCR及LCR的進(jìn)一步報(bào)道可見于US 4683202，US 4683195，US 4800159，US 4965188，US 5176995，EP 0320308及EP 0439182這些參考文獻(xiàn)引入本文作參考。
發(fā)明概述本發(fā)明開發(fā)了一種用于特異靶核酸序列擴(kuò)增的靈敏及選擇性方法。該方法涉及LCR及PCR二者。由于該方法涉及選擇性連接及PCR所以被稱為“SLAP”。
由此本發(fā)明的第一方面包括一種擴(kuò)增特異靶核酸序列的方法，該方法包括(1)形成一反應(yīng)混合物，包括(i)靶序列；(ii)引物，包括第一個(gè)引物，其3’末端至少有一部分與靶序列第一個(gè)末端的第一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物，其5’末端至少有一部分與靶序列第二個(gè)末端的第二個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物的5’末端與第一個(gè)引物的3’末端相鄰，以及第三個(gè)引物，其與第二個(gè)引物3’末端的的一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)；(iii)至少四種不同的核苷酸堿基；(iv)熱穩(wěn)定聚合酶及熱穩(wěn)定連接酶；以及(2)循環(huán)加熱該反應(yīng)混合物。
本發(fā)明的另一方面包括一種在含有核酸的樣本中檢測(cè)特異靶核酸序列的方法，包括(1)形成反應(yīng)混合物，包括(i)懷疑包括靶序列的核酸樣本；(ii)引物，包括第一個(gè)引物，其3’末端至少有一部分與靶序列第一個(gè)末端的第一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物，其5’末端至少有一部分與靶序列第二個(gè)末端的第二個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物的5’末端與第一個(gè)引物的3’末端相鄰，以及第三個(gè)引物，其與第二個(gè)引物3’末端的的一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)；(iii)至少四種不同的核苷酸堿基；(iv)熱穩(wěn)定聚合酶及熱穩(wěn)定連接酶；以及(2)循環(huán)加熱該反應(yīng)混合物；以及(3)檢測(cè)代表特異靶核酸序列存在的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，此方法進(jìn)一步包括在循環(huán)加熱反應(yīng)混合物之后，進(jìn)行基本上滅活熱穩(wěn)定聚合酶，接著進(jìn)行第二輪熱循環(huán)反應(yīng)混合物的步驟。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，第三個(gè)引物基本上與之互補(bǔ)的第二個(gè)引物的區(qū)段是隨機(jī)序列。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包括第4個(gè)引物，其具有與第一個(gè)引物5’末端的區(qū)段相同的序列。
本發(fā)明的方法可用于簡(jiǎn)單地?cái)U(kuò)增選擇的序列，也可用于檢測(cè)特異序列的存在，如檢測(cè)突變的存在，等位基因，檢測(cè)特異微生物或病毒的存在等。靶序列可由此源于任何來(lái)源，如人及非人類動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、真菌及病毒。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“隨機(jī)序列”意指與靶序列不相關(guān)的序列。
本說(shuō)明書除非上下文另外要求，術(shù)語(yǔ)“包括”意指包括規(guī)定的元素或整體或元素或整體的集合，但不排除任何其它元素或整體或元素或整體的集合。
發(fā)明詳述(選擇性連接及PCR(SLAP)策略)為更清楚地了解本發(fā)明的性質(zhì)，參考以下實(shí)施本發(fā)明方法的非限制性一般論述及實(shí)施例闡述本發(fā)明的優(yōu)選形式。


圖1在3引物系統(tǒng)中引物的SLAP-排列。
圖2SLAP引物中變異堿基的位置。
圖3SLAP。
圖4選擇性連接及PCR。
圖54引物系統(tǒng)中引物的SLAP-排列。
圖6用通用引物的擴(kuò)增-4引物系統(tǒng)。
下面闡述SLAP擴(kuò)增的一般策略并在圖1-3中舉例示出。
可用3個(gè)引物進(jìn)行此方法，這些引物是5’連接引物(5’LP)，3’連接引物(3’LP)及通用引物(GP)[圖1]。LP完全或部分互補(bǔ)于靶序列。GP與位于LP末端如3’LP的3’末端的隨機(jī)序列(RS)互補(bǔ)。5’LP的3’末端及3’LP的5’末端可與靶序列上緊鄰的區(qū)域雜交(圖2A(ii)和B)，或與被一個(gè)或多個(gè)核苷酸的間隔隔開的兩個(gè)區(qū)域雜交(圖2A(i))。LP中變異堿基的存在使此方法可用于篩選單一點(diǎn)突變(堿基取代)。變異堿基與野生型序列配對(duì)或與特異堿基取代配對(duì)，變異堿基可位于5’LP的3’末端或其附近(圖2A)或位于3’LP的5’末端(圖2B)。
LP的其它特征可包括(i)5’LP具有3’羥基，如此其能與3’LP連接(圖2A(ii)和B)，或在與3’LP連接前經(jīng)DNA聚合酶延伸(圖2A(i))，5’LP的5’末端可被修飾(如羥基化)，如此其在此末端不能與其它片段連接。
(ii)3’LP的5’末端被磷酸化，以使其能與5’LP或5’LP的延伸產(chǎn)物連接。3’LP的3’末端可被修飾(如磷酸化)以防止被DNA聚合酶延伸和/或在此末端與其它片段連接。
SLAP擴(kuò)增所需步驟以圖3例解。反應(yīng)的所有步驟在一個(gè)試管內(nèi)進(jìn)行，且所有試劑在反應(yīng)開始時(shí)就存在。各步驟由反應(yīng)溫度的變化而部分介導(dǎo)。反應(yīng)策略包括一個(gè)利用共存的選擇性連接及選擇性PCR的初始階段。此反應(yīng)階段要求熱穩(wěn)定連接酶和DNA聚合酶活性。PCR由一種序列特異引物(5’LP)和一種通用引物(GP)介導(dǎo)。初始階段之后，加熱反應(yīng)以使DNA聚合酶變性。由于連接酶與DNA聚合酶相比是過(guò)量的，所以能保留明顯的連接酶活性，且在反應(yīng)第二階段經(jīng)連接反應(yīng)產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物。PCR所需的試劑如DNA聚合酶，通用引物及dNTP的量在反應(yīng)的第二階段以有限量存在以利于連接反應(yīng)而非PCR。包含于反應(yīng)內(nèi)的各步驟在以下進(jìn)一步詳述。實(shí)施例闡述了與圖2A(i)例解相似的引物排列的步驟(圖3)。
步驟1DNA變性；將基因組DNA(靶模板)經(jīng)高溫加熱使其單鏈化。
步驟2選擇性延伸(填補(bǔ)GAP)/選擇性連接及通用PCR；將5’LP和3’LP與變性的DNA模板退火。5’LP與3’末端完全配對(duì)，其經(jīng)DNA聚合酶(如DNA聚合酶，Stoffel片段)延伸，然后經(jīng)熱穩(wěn)定連接酶與3’LP連接。
在此初始階段期間連接與聚合共存。經(jīng)
a)用DNA聚合酶延伸5’LP以填補(bǔ)缺口，隨后與3’LP連接(圖3a)；或b)用靶序列作模板經(jīng)DNA聚合酶延伸5’LP(圖3b)而產(chǎn)生一條鏈。
用3’GP延伸以產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。模板可以是a)經(jīng)聚合酶延伸5’LP后與3’LP連接形成的產(chǎn)物；或b)經(jīng)用靶序列作模板經(jīng)聚合酶延伸5’LP后形成的產(chǎn)物。經(jīng)3’GP延伸形成的產(chǎn)物，由于其拷貝3’LP(圖3c)，在隨后的PCR回合可經(jīng)聚合酶進(jìn)一步延伸(圖3d)。由于PCR是通用的，所以預(yù)期所有產(chǎn)物將幾乎等效擴(kuò)增。
步驟3DNA聚合酶的變性提高溫度以使DNA聚合酶變性，由于連接酶在初始是過(guò)量的，因而仍存在明顯的連接酶活性。剩余的PCR試劑如殘存活性的DNA聚合酶，通用引物及dNTPs能使缺口填滿，但不足以保持經(jīng)PCR的有效擴(kuò)增。
步驟4經(jīng)連接產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物在最終階段形成的主要產(chǎn)物是單鏈產(chǎn)物，其由(延伸的)5’LP與3’LP的連接而得。
檢測(cè)單鏈連接產(chǎn)物的檢測(cè)可由各種方法包括用寡核苷酸捕獲進(jìn)行。產(chǎn)物檢測(cè)的一種方法包括標(biāo)記3’LP，并用寡核苷酸捕獲產(chǎn)物，該寡核苷酸與位于連接位點(diǎn)5′一側(cè)的區(qū)段雜交。
捕捉寡核苷酸可以是特異于靶基因的(與靶序列互補(bǔ))或通用的(與LP上的隨機(jī)序列互補(bǔ))。
SLAP的可變策略(1)一種SLAP的可變策略如圖4例解。
如上所述進(jìn)行步驟1和2(變性加選擇性連接和PCR)。在此可變策略中，3’LP附著至固相。5’LP可用報(bào)道分子(R)如熒光素標(biāo)記。在SLAP之后將反應(yīng)液相棄去，洗反應(yīng)容器，與反應(yīng)容器壁相接的標(biāo)記產(chǎn)物的存在表明突變的存在。特異序列可以經(jīng)用第二種報(bào)道分子標(biāo)記的寡核苷酸的雜交加以證實(shí)。
(2)SLAP另一可變策略如圖5例解。
SLAP可以用4種引物進(jìn)行，除3引物系統(tǒng)中的引物外，還可包括第4個(gè)引物。此引物是5’通用引物，其具有與位于5’LP的5’末端的隨機(jī)序列相同的序列。該引物僅可擴(kuò)增由3’GP延伸產(chǎn)生的產(chǎn)物(圖6)。5’GP引物及3’GP引物的引入，意味著PCR由兩種通用引物介導(dǎo)，且不太依賴于連接步驟的效率。
實(shí)施例方法使用SLAP方案以檢測(cè)K-ras原癌基因的密碼子12的第1位的點(diǎn)突變。人細(xì)胞系Calu I[ATCC HTB54]及T24[ATCC HTB4]得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。T24是K-ras的密碼子12為野生型的人膀胱癌細(xì)胞系。Calu 1是肺腺癌細(xì)胞系，且K-ras的密碼子12是雜合的，即同時(shí)具有野生型(GGT)及突變(TGT)序列(Ref 1)?；蚪MDNA提取自Calu 1和T24細(xì)胞，提取方法是在高溫將細(xì)胞在裂解緩沖液中溫育，加入另一種緩沖液及與DNA結(jié)合的陽(yáng)離子聚合物(USPatent No.5,582,988)。然后將此聚合物/DNA復(fù)合物離心至管底，經(jīng)加入NaOH并在高溫溫育將DNA從聚合物中洗脫出。將此NaOH/DNA溶液經(jīng)加入等摩爾的在Tris緩沖液中的HCl以中和，如此最終DNA溶液處于10mM Tris(pH7-7.5)及20mM NaCl中。用列于下表1的LP和GP經(jīng)SLAP擴(kuò)增DNA樣本。下劃線的序列是與K-ras原癌基因同源的，在標(biāo)為5KLP3X的LP中的黑體字堿基是特異于K-ras原癌基因野生型(X＝G)或特異突變(X＝A或T)的。標(biāo)為5KP3X的引物系列在其5’和3’末端均具羥基，引物3BKLP4在5’末端磷酸化及在3’末端生物素?；?。通用引物3GP4與3BKLP4的3’區(qū)互補(bǔ)。
表1 SLAP所用的引物序列

將來(lái)自T24，Calu 1及用T24以1∶10，1∶102，1∶103比例(重量)稀釋的Calu 1的基因組DNA經(jīng)SLAP在100μl總體積擴(kuò)增。反應(yīng)物包括基因組DNA，(1μg)，5pmole 3GP4，5pmole 3BKLP4，5pmole 5KLP3G或5KLP3A或5KLP3T，12.5μM每種dNTP(dATP，dCTP，dTTP，dGTP，)100U Ampligase熱穩(wěn)定DNA連接酶(100U/μl，Epicentre Technologies)及5U AmpiTaqRDNA聚合酶，Stoffel片段(10U/μl；Perkin Elmer)，在1×Ampligase反應(yīng)緩沖液中(25mMKCl，20mM Tris-HCl(pH8.3)，0.5mM NAD，10mM MgCl2及0.01％Triton X-100)，對(duì)照反應(yīng)缺少DNA或Ampligase熱穩(wěn)定DNA連接酶，將反應(yīng)物置于GeneAmp PCR系統(tǒng)2400(Perkin Elmer)內(nèi)，在94℃加熱2分鐘，然后進(jìn)行在94℃20秒，在64℃20秒的循環(huán)20次(每次循環(huán)在64℃所用時(shí)間多5秒)。之后，將反應(yīng)物在99.9℃加熱5分鐘，然后進(jìn)行下一輪在94℃20秒，在64℃2分鐘的20次循環(huán)。
將每個(gè)反應(yīng)的25μl等份不經(jīng)隨后操作在5％Nusieve GTG凝膠(FMC Bioproducts，Rockland，MD)中經(jīng)電泳而分析。凝膠用Stratagene Eagle Eye II圖象系統(tǒng)照相。
還將此反應(yīng)進(jìn)行比色分析。該分析與Findlay等[2]所述相似。經(jīng)與寡核苷酸探針雜交而特異捕捉SLAP擴(kuò)增子，該探針共價(jià)地與乳膠珠吸附。將此乳膠珠/寡核苷酸復(fù)合物應(yīng)用于在Periodontal Surecell空白對(duì)照中不連續(xù)的位置，捕捉寡核苷酸序列為SKCapD1 GCTCCAACTACCACAAGTTTATTCTAGTGAGAGSKCapD2 AGCTCCAACTACCACAAGTTTATTCTAGTGAGAKcap3 GCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAG寡核苷酸SKCapD1和SKCapD2互補(bǔ)于5’LP序列的一部分。寡核苷酸KCap3互補(bǔ)于位于3’LP的3’側(cè)的K-ras基因外顯子1序列的一部分(未經(jīng)用列于表1的引物經(jīng)SLAP方案擴(kuò)增)，Kcap3探針由此提供了非特異性擴(kuò)增和/或雜交的陰性對(duì)照。
將三種寡核苷酸乳膠珠的等份(0.25％在1.20μl 10mM Tris 1mMEDTA，pH7.4，25℃)施加在Surecell膜上不連續(xù)的位點(diǎn)，每Surecell孔中都有三種寡核苷酸。將寡核苷酸乳膠珠干燥15分鐘。用180μl 50mM KCl，10mM Tris(pH8.3 25℃)及10mM MgCl2稀釋每個(gè)反應(yīng)的25μl的等份。稀釋的SLAP產(chǎn)物在95℃變性6分鐘，并加到Surecell孔。然后將Surecell在50℃溫育5分鐘以使SLAP擴(kuò)增物與捕捉寡苷酸雜交。用300μl 50mM KCl，10mM Tris(pH8.3 25℃)及10mMMgCl2在50℃洗孔。將雜交的擴(kuò)增物與150μl結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶(EC 1.11.1.7)的鏈霉抗生物素蛋白綴合物反應(yīng)，并在室溫下溫育2分鐘。重復(fù)洗滌步驟以使非特異性相互作用降至最低，加入200μlLeucodye/H2O2，并在室溫下將Surecell溫育2分鐘。固定化復(fù)合物在染料分子從無(wú)色變至藍(lán)色的氧化轉(zhuǎn)變中作為催化劑。用200μl 0.1％NaN3中止反應(yīng)。對(duì)所得著色斑點(diǎn)經(jīng)與色圖比較加以目視評(píng)價(jià)，并分級(jí)為0(無(wú)色)至10(深藍(lán))。用180μl 50mM KCl，10mM Tris(pH8.325℃)及10mM MgCl2稀釋每種SLAP反應(yīng)的另一25μl等份，并不先在95℃變性施加于Surecell膜，如上述進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果對(duì)Calu 1和T24的SLAP分析的5％Nusieve凝膠的檢測(cè)結(jié)果示于下表2。88bp片段的存在是在K-ras的密碼子12的第1位存在特異序列的診斷依據(jù)。在不含DNA或不含連接酶的反應(yīng)中沒(méi)有診斷性產(chǎn)物。在所有反應(yīng)中都存在42bp產(chǎn)物，這種小產(chǎn)物由產(chǎn)生3BKLP4的互補(bǔ)鏈的3GP4的延伸而形成。
表2 SLAP的結(jié)果。<

>
在含有連接酶，DNA聚合酶及5’LP 5KLP3G和T24 DNA，Calu1DNA及用T24 DNA稀釋的Calu 1 DNA三者之一的反應(yīng)中存在88bp診斷性產(chǎn)物。這表明在K-ras的密碼子12的第1位具有G的野生型等位基因存在于來(lái)自T24和Calu 1細(xì)胞系的DNA中。88bp診斷性產(chǎn)物還存在于含連接酶，DNA聚合酶及5’LP5KLP3T和Calu 1DNA，或用T24 DNA以1∶10和1∶100(重量)稀釋的Calu 1 DNA的反應(yīng)中，但不存在于含有T24 DNA或用T24 DNA以1∶1000(重量)稀釋的Calu 1 DNA的反應(yīng)中，這表明在Calu 1 DNA而不是在T24 DNA中密碼子12的第1位存在由G至T的突變。Calu 1細(xì)胞系因而是雜合的，在K-ras的密碼子12的第1位包含野生型(G)及突變(T)堿基。由SLAP分析獲得的結(jié)果與文獻(xiàn)所報(bào)導(dǎo)的這些細(xì)胞系中的密碼子12的序列一致，并示出當(dāng)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)，此方案可在至少200個(gè)野生型等位基因背景下檢測(cè)出一個(gè)突變等位基因。
經(jīng)在Surecell上檢測(cè)的SLAP反應(yīng)的分析結(jié)果示于表3，用SKCapD1或SKCap D2對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)是在K-ras的密碼子12的第1位存在特異序列的診斷依據(jù)，在不含DNA或不含連接酶的反應(yīng)中未檢出診斷性產(chǎn)物。用捕捉寡核苷酸探針Kcap3無(wú)檢測(cè)物，表明沒(méi)有非特異性擴(kuò)增或雜交。
表3經(jīng)Surecell分析SLAP的結(jié)果

根據(jù)對(duì)在施加于膜之前被變性的SLAP產(chǎn)物的Surecell分析，在含有連接酶、DNA聚合酶及5’LP 5KLP3G和T24 DNA或Calu 1DNA或用T24 DNA稀釋的Calu 1 DNA的反應(yīng)中檢測(cè)出診斷性產(chǎn)物。這表明在K-ras的密碼子12的第1位具有G的野生型等位基因存在于來(lái)自T24和Calu 1細(xì)胞系的DNA中。診斷性產(chǎn)物還存在于含連接酶，DNA聚合酶及5’LP5 KLP3T和Calu 1 DNA，或用T24 DNA以1∶10、1∶100和1∶1000(重量)稀釋的Calu 1 DNA的反應(yīng)中，但不存在于含有T24 DNA的反應(yīng)中，這表明在Calu 1 DNA而不是在T24 DNA中密碼子12的第1位存在由G至T的突變。Calu 1細(xì)胞系因而是雜合的，其在K-ras的密碼子12的第1位包含野生型(G)及突變(T)堿基。得自Surecell分析的結(jié)果與先前公布的這些細(xì)胞系中K-ras的序列相一致。
在先將樣本變性或不變性后應(yīng)用于Surecell膜觀測(cè)到診斷性產(chǎn)物的檢測(cè)圖式相同，除了除非SLAP產(chǎn)物被變性否則5’LP5 KLP3T在含有用T24 DNA以1∶1000稀釋的Calu1 DNA的反應(yīng)中未檢測(cè)到診斷性產(chǎn)物。診斷性產(chǎn)物從在施加于Surecell膜前未被變性的SLAP產(chǎn)物中檢測(cè)出的事實(shí)表明單鏈產(chǎn)物經(jīng)由SLAP方案產(chǎn)生。
總之，由SLAP分析獲得的結(jié)果與文獻(xiàn)所報(bào)導(dǎo)的這些細(xì)胞系中的密碼子12的序列一致，并示出當(dāng)經(jīng)Surecell分析時(shí)，此方案可在至少2000個(gè)野生型等位基因背景下檢測(cè)出一個(gè)突變等位基因，當(dāng)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳分析時(shí)，此方案可在至少200個(gè)野生型等位基因背景下檢測(cè)出一個(gè)突變等位基因討論SLAP提供了一種簡(jiǎn)單而快速的適用于分析與疾病相關(guān)的遺傳突變的方法。在SLAP期間，連接酶和DNA聚合酶的活性促進(jìn)小到一個(gè)堿基變化的特異序列的選擇性擴(kuò)增。SLAP反應(yīng)在反應(yīng)初始時(shí)包含所有試劑，包括兩種酶。此反應(yīng)可在一密閉系統(tǒng)進(jìn)行以在擴(kuò)增期間降低污染機(jī)會(huì)。
SLAP具有其它利用PCR及連接反應(yīng)以介導(dǎo)突變序列檢測(cè)等方案所不具備的優(yōu)點(diǎn)。在初始階段突變模板經(jīng)共存的連接及PCR以選擇性擴(kuò)增，此反應(yīng)選擇性擴(kuò)增突變序列，是因?yàn)檫B接酶及DNA聚合酶僅在介導(dǎo)該方法的引物與模板在突變堿基位置配對(duì)時(shí)才起作用。在第二階段，產(chǎn)生突變的特異性單鏈產(chǎn)物。由于在反應(yīng)結(jié)束時(shí)存在的連接產(chǎn)物至少一部分是單鏈的，因而在檢測(cè)例如用寡核苷酸捕捉前不需要變性或其它操作。選擇性擴(kuò)增所需步驟數(shù)的減少使SLAP分析勞動(dòng)強(qiáng)度降低并更易于自動(dòng)化。另外由于GP是通用的，預(yù)期所有PCR鏈幾乎等效產(chǎn)生。在SLAP期間形成的產(chǎn)物量因而不十分依賴于初始連接步驟的效率。這提高了SLAP在含幾個(gè)基因/突變特異性LP的多重反應(yīng)中檢測(cè)多重突變的適用性。這將使得能在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)分析多個(gè)基因和/或外顯子。或者，如果只有一個(gè)5’LP包含在反應(yīng)中，則可鑒別出精確的核苷酸取代。如果該反應(yīng)在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，且每孔中5’LP不同，幾乎可同時(shí)篩選出90個(gè)堿基，特異性突變可被鑒別且在分析中可包括對(duì)照反應(yīng)。
SLAP可與許多捕捉及檢測(cè)系統(tǒng)共存。這使整個(gè)方案可以自動(dòng)化，并能迅速分析大量樣本。捕捉系統(tǒng)包括(1)與乳膠珠或磁珠附著的互補(bǔ)寡核苷酸；(2)用親和素或鏈親和素捕捉的生物素?；?；(3)用抗地高辛抗體捕捉的地高辛標(biāo)記的產(chǎn)物；(4)在GCN4包被的培養(yǎng)板上捕捉的帶GCN4識(shí)別標(biāo)記的PCR引物。檢測(cè)系統(tǒng)包括(1)用鏈親和素/辣根過(guò)氧化物酶顯色的生物素?；?；(2)用如異硫氰酸熒光素或堿性磷酸酶等分子直接標(biāo)記；(3)用抗地高辛抗體檢測(cè)的地高辛標(biāo)記的產(chǎn)物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到可對(duì)如具體實(shí)施方案所示的本發(fā)明在不超過(guò)所述本發(fā)明范圍之內(nèi)做各種改變和/或修改，本文的實(shí)施方案因而被認(rèn)為是舉例性的而非限制性的。
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權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增特異靶核酸序列的方法，該方法包括(1)形成一反應(yīng)混合物，包括(i)靶序列；(ii)引物，包括第一個(gè)引物，其3’末端至少有一部分與靶序列第一個(gè)末端的第一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物，其5’末端至少有一部分與靶序列第二個(gè)末端的第二個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物的5’末端與第一個(gè)引物的3’末端相鄰，以及第三個(gè)引物，其與第二個(gè)引物3’末端的的一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)；(iii)至少四種不同的核苷酸堿基；(iv)熱穩(wěn)定聚合酶及熱穩(wěn)定連接酶；以及(2)循環(huán)加熱該反應(yīng)混合物。
2.一種在含有核酸的樣本中檢測(cè)特異靶核酸序列的方法，包括(1)形成反應(yīng)混合物，包括(i)懷疑包括靶序列的核酸樣本；(ii)引物，包括第一個(gè)引物，其3’末端至少有一部分與靶序列第一個(gè)末端的第一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物，其5’末端至少有一部分與靶序列第二個(gè)末端的第二個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)，第二個(gè)引物的5’末端與第一個(gè)引物的3’末端相鄰，以及第三個(gè)引物，其與第二個(gè)引物3’末端的的一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ)；(iii)至少四種不同的核苷酸堿基；(iv)熱穩(wěn)定聚合酶及熱穩(wěn)定連接酶；以及(2)循環(huán)加熱該反應(yīng)混合物；以及(3)檢測(cè)代表特異靶核酸序列存在的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中該方法還包括在循環(huán)加熱反應(yīng)混合物之后，進(jìn)行基本上滅活熱穩(wěn)定聚合酶，接著進(jìn)行第二輪熱循環(huán)反應(yīng)混合物的步驟。
4.如權(quán)利要求1-3任一方法，其中與第三個(gè)引物與之基本上互補(bǔ)的第二個(gè)引物的區(qū)段是隨機(jī)序列。
5.如權(quán)利要求1-4任一方法，其中反應(yīng)混合物包括第四個(gè)引物，其具有與第一個(gè)引物5’末端的區(qū)段相同的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增特異靶核酸序列的方法,該方法包括:(1)形成一反應(yīng)混合物,包括:(i)靶序列:(ii)引物,包括第一個(gè)引物,其3’末端至少有一部分與靶序列第一個(gè)末端的第一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ),第二個(gè)引物,其5’末端至少有一部分與靶序列第二個(gè)末端的第二個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ),第二個(gè)引物的5’末端與第一個(gè)引物的3’末端相鄰,以及第三個(gè)引物,其與第二個(gè)引物3’末端的一個(gè)區(qū)段基本上互補(bǔ);(iii)至少四種不同的核苷酸堿基;(iv)熱穩(wěn)定聚合酶及熱穩(wěn)定連接酶;以及(2)循環(huán)加熱該反應(yīng)混合物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1252104SQ98804157
公開日2000年5月3日 申請(qǐng)日期1998年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月21日
發(fā)明者艾利森·韋利安·托德, 卡羅琳·簡(jiǎn)·富爾瑞 申請(qǐng)人:強(qiáng)生研究有限公司