專(zhuān)利名稱(chēng)：重組鹵代脂族脫鹵素酶的制作方法
制備大量的短鏈鹵代脂族烴(HAHs)用作有機(jī)溶劑、脫脂劑、殺蟲(chóng)劑、各種其它有機(jī)化合物合成的中間體以及用作制造塑料中的成分。這些鹵化化合物在工業(yè)過(guò)程中的廣泛使用對(duì)能夠改良和/或再利用低廉副產(chǎn)品的新技術(shù)產(chǎn)生了大量的機(jī)遇。
在化工生產(chǎn)過(guò)程中作為副產(chǎn)品而產(chǎn)生的過(guò)多HAHs可被燃燒產(chǎn)熱并且在有些情況下可被再利用成低廉的起始物質(zhì)，從而從廢產(chǎn)品或過(guò)多的副產(chǎn)品中得到一定的回收。在復(fù)雜的微生物環(huán)境(天然、水處理植物等)中，HAH降解通過(guò)微生物生物降解而發(fā)生。當(dāng)鹵素為氯化物時(shí)，HAHs的生物降解導(dǎo)致二氧化碳、水、和鹽酸的形成。
HAHs由選擇性微生物生物降解成二氧化碳、水和鹽酸公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利Nos.4,853,334和4,877,736中。用于分解氯代脂族烴而沒(méi)有指出涉及微生物的方法公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利No.4,749,491中。此外，在《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》.，52383-384(1986)中，Nelson等已報(bào)道不動(dòng)桿菌(Acinetobacter spp)對(duì)三氯乙烯的有氧代謝。Vogel等在《環(huán)境科學(xué)技術(shù)》，21722-736(1987)中給出了鹵化脂族化合物在環(huán)境中降解的概述。美國(guó)專(zhuān)利No.5,372,944公開(kāi)了產(chǎn)生將HAHs轉(zhuǎn)化為鹵代醇的脫鹵素酶的一些紅球菌屬(Rhodoccocus)的種類(lèi)。然而，這些文獻(xiàn)主要依賴(lài)于細(xì)胞系統(tǒng)并且沒(méi)有利用可在持續(xù)加料過(guò)程中使用固定化的修飾活性酶而得到好處的優(yōu)勢(shì)。最為相關(guān)的是，美國(guó)專(zhuān)利No.5,372,944依賴(lài)包括野生型或突變細(xì)胞的紅球菌培養(yǎng)物。然而，其中講述的突變技術(shù)沒(méi)有利用重組DNA方法的優(yōu)勢(shì)且因此未能利用這些方法對(duì)該脫鹵素酶活性改進(jìn)和表達(dá)而帶來(lái)的好處。
不是依賴(lài)由細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)HAHs的生物降解，而是具有改良的，可容易適應(yīng)于持續(xù)加料方法的重組酶將是優(yōu)越的，這里，HAHs可有效地轉(zhuǎn)化為用于制備其它有用產(chǎn)品的有用的中間體，如制備聚醚以形成聚氨基甲酸酯中的中間體或制備乙二醇和聚乙二醇以形成潤(rùn)滑劑、表面活性劑、乳化劑等的中間體。
本發(fā)明涉及包括基本上與圖2中殘基1-292的氨基酸序列同源的氨基酸序列且能夠?qū)AHs轉(zhuǎn)化為鄰位鹵代醇的重組酶。本發(fā)明的另一目的是提供編碼包括這樣酶多肽的DNA序列，更為具體地包括與圖2中堿基37-912核苷酸序列基本上同源多核苷酸的DNA序列。
本發(fā)明的另一目的是提供含有該DNA序列的載體和用于制備此多肽的方法，包括將該載體置于宿主細(xì)胞中和在能使此轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生脫鹵素酶的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供固定化形式的酶于固相支持物上以及用于將HAH轉(zhuǎn)化為醇或鹵代醇的方法，包括將此HAH與固定化酶接觸。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示載體pEXPROK的質(zhì)粒圖譜。質(zhì)粒pEXPROK源自商業(yè)上可得到的pPROK-1質(zhì)粒(Clontech，Mountain View，CA)，含有Ptac啟動(dòng)子和5S、T1T2終止子序列。在該圖中，T1T2區(qū)域表示為“Term”。此質(zhì)粒通過(guò)以一對(duì)導(dǎo)入限制性位點(diǎn)Nco I、Hind III、Xho I、Nhe I和Not I于接頭中的寡核苷酸代替pPROK-1多克隆位點(diǎn)而構(gòu)建。Nco I位點(diǎn)的“ATG”序列代表有功能的符合讀框的起始位點(diǎn)。Nhe I位點(diǎn)后接EXFLAG接頭序列。EXFLAG接頭序列相應(yīng)于圖2中的核苷酸919-975并且編碼圖2中所示RDhl蛋白序列中的氨基酸295-315。
圖2(即圖2A和2B)列出編碼推導(dǎo)的紫紅紅球菌TDTM003鹵代鏈烷脫鹵素酶的核苷酸序列和源自此核苷酸序列的氨基酸序列。氨基酸殘基1-292相應(yīng)于紅球菌脫鹵素酶(RDhl)結(jié)構(gòu)基因并且由核苷酸37-912所編碼。氨基酸殘基-12到-1(核苷酸1-36)代表含有多組氨酸的氨基末端尾部，其中的殘基-12和-11同時(shí)參與翻譯起始位點(diǎn)和Nco I克隆位點(diǎn)的形成。氨基酸殘基293-294(核苷酸913-918)由Nhe I克隆位點(diǎn)所編碼并且其后接氨基酸295-305，其在此又稱(chēng)為EXFLAG肽。EXFLAG接頭(核苷酸919-975)編碼EXFLAG肽和2個(gè)翻譯終止位點(diǎn)(每個(gè)由星號(hào)表示)。
圖3顯示載體pEXPROK-RDhl的質(zhì)粒圖譜。
圖4(即圖4A和4B)列出了推斷的紫紅紅球菌TDTM003鹵代鏈烷脫鹵素酶、自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus)GJ 10脫鹵素酶、Renilla reniformis螢光素單加氧酶和假單胞菌類(lèi)(Pseudomonas spp)LinB基因產(chǎn)物(四氯環(huán)己雙烯水解酶)氨基酸序列的比較圖。
圖5顯示包括在IPTG-可誘導(dǎo)的Ptac轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下推斷的紫紅紅球菌TDTM003鹵代鏈烷脫鹵素酶基因的載體pRDhl-KO2.3-EXPROK的質(zhì)粒圖譜。
圖6顯示包括在T7轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下推斷的紫紅紅球菌TDTM003鹵代鏈烷脫鹵素酶基因的高水平表達(dá)載體pRSET-RDhl的質(zhì)粒圖譜。
圖7顯示包括在trc轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下推斷的紫紅紅球菌TDTM003鹵代鏈烷脫鹵素酶基因的高水平表達(dá)載體pTrcHis-RDhl的質(zhì)粒圖譜。
圖8顯示高水平表達(dá)載體pTrixFus-RDhl的質(zhì)粒圖譜，該質(zhì)粒包括融合到編碼大腸桿菌硫氧環(huán)蛋白基因上的推斷的紫紅紅球菌TDTM003鹵代鏈烷脫鹵素酶基因的修飾體，此連接的融合基因在PL轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制之下。
圖9顯示與部分純化的rRDhl酶比較的表達(dá)pEXPROK-RDhl克隆細(xì)胞裂解液樣品的SDS-PAGE凝膠圖。
圖10顯示與圖9中相同的SDS-PAGE凝膠的抗-FLAG抗體免疫印跡圖。
圖11顯示表達(dá)pRSET-RDhl細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞提取物的SDS-PAGE凝膠圖。
圖12顯示與圖11中相同的SDS-PAGE凝膠的抗-FLAG抗體免疫印跡圖。
圖13顯示來(lái)自表達(dá)pTrcHis-RDhl細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞提取物的SDS-PAGE凝膠圖。
圖14顯示與圖13相同的SDS-PAGE凝膠的抗-FLAG抗體免疫印跡圖。
圖15顯示表達(dá)pTrxFus-RDhl細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞提取物的SDS-PAGE凝膠圖。
圖16顯示作用于底物1，2，3-三氯丙烷的固定化酶生物反應(yīng)器的產(chǎn)率圖。
圖17顯示EPPCR-突變的紫紅紅球菌鹵代鏈烷脫鹵素酶活性的柱狀圖。
圖18顯示EPPCR-突變的紫紅紅球菌鹵代鏈烷脫鹵素酶活性的柱狀圖。
圖19顯示帶有羧基末端S-Tag多肽尾部的RDhl酶和帶有羧基末端EXFLAG多肽尾部的RDhl酶的酶活性數(shù)據(jù)圖。
本發(fā)明源于下面的深入研究，包括從紅球菌屬微生物中獲取編碼具有鹵代脂族脫鹵素酶活性的多肽的DNA序列、通過(guò)將該DNA序列本身或其修飾形式整合入載體中而制備重組DNA序列，和以該重組載體轉(zhuǎn)化微生物。篩選具有脫鹵素酶活性水平的轉(zhuǎn)化子并且從具有增高活性的轉(zhuǎn)化子中分離脫鹵素酶。然后評(píng)估各種固體支持物固定系統(tǒng)以鑒定出其中的酶可有效地將鹵化的脂族烴轉(zhuǎn)化為醇或鹵代醇的酶-支持物組合。
用固定化脫鹵素酶轉(zhuǎn)化的鹵化脂族烴(HAHs)包括C2-C10脂族烴分子和其有2個(gè)或更多個(gè)附著鹵素原子的基因，其中的至少2個(gè)鹵素原子位于相鄰的碳原子上。優(yōu)選的HAHs為飽和的烴，其中至少一個(gè)鹵素原子占據(jù)該分子或基團(tuán)的伯位；更為優(yōu)選的是其中不止1個(gè)鹵素占據(jù)相同碳原子的那些HAHs。特別優(yōu)選的HAHs包括1，2-二鹵代基團(tuán)的飽和烴，其實(shí)例有1，2-二鹵代乙烷、1，2-二鹵代丙烷、1，2-二鹵代丁烷和1，2，3-三鹵代丙烷分子和基團(tuán)。這些種類(lèi)包括，例如，1，2-二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷、1，2，3-三氯丙烷和1，2-二溴-3-氯丙烷分子和基團(tuán)。
如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“鹵素”意為氯、溴或碘。優(yōu)選的鹵素為溴和氯。最為優(yōu)選的鹵素為氯且在最為優(yōu)選的HAHs中有易揮發(fā)的氯代脂族烴(VCAH)分子和基團(tuán)；尤其優(yōu)選的VCAHs包括1，2-二氯丙烷和1，2，3-三氯丙烷分子和基團(tuán)。
如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“鹵代醇”意為鄰位鹵代醇，即除了羧酸以外的在分子的相鄰碳原子上同時(shí)具有羥基取代基和鹵素取代基的任何脂族有機(jī)化合物。α，β-鹵代醇為最為優(yōu)選的鄰位鹵代醇。
術(shù)語(yǔ)“免疫印跡(immunoblot)”和“免疫印跡(immunoblotting)”在此使用是指下面的過(guò)程1)從電泳凝膠，如用于PAGE中的聚丙烯酰胺凝膠中將蛋白轉(zhuǎn)移到結(jié)合蛋白的膜上；且然后2)用對(duì)可能包括轉(zhuǎn)移到此膜上那些蛋白的蛋白組分特異性的抗體檢測(cè)該膜；并且然后3)用本領(lǐng)域眾所周知的各種生色方法中的任何一種，如用直接或間接連接到此抗體上的可著色標(biāo)記顯色而檢測(cè)該抗體的位置。免疫印跡方法的實(shí)例為Western印跡。
術(shù)語(yǔ)“透化(permeablize)”、“透化的(permeablizing)”和“透化(permeablization)”在此使用表示使有些物質(zhì)可通透的方法，如使細(xì)胞壁可通透、術(shù)語(yǔ)“超聲處理”在此使用表示用超聲波迅速振蕩試管或其它容器中的內(nèi)容物以將其徹底混合。術(shù)語(yǔ)“旋渦振蕩”在此使用表示沿其底部機(jī)械旋轉(zhuǎn)試管而同時(shí)手工按住試管的頂部不動(dòng)以將其內(nèi)容物混合的操作。
這里使用的詞語(yǔ)“可篩選”意為“能夠被選擇”。例如，術(shù)語(yǔ)“可選擇標(biāo)記”或“顯性可選擇標(biāo)記”表示遺傳特征，如編碼抗生素抗性酶的基因，其存在使該基因的宿主細(xì)胞在相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基如，含有該抗生素的培養(yǎng)基中增殖。與沒(méi)有接受或含有該質(zhì)粒的那些細(xì)胞相反，當(dāng)此遺傳特征摻入到含有編碼RDhl酶基因的質(zhì)粒中，且然后處理這些細(xì)胞從而接受該質(zhì)粒時(shí)，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞使實(shí)際上接受該質(zhì)粒的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)，這允許容易地鑒定含有RDhl基因的細(xì)胞。
如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)構(gòu)建體”指本領(lǐng)域中已知的質(zhì)粒、病毒、病毒顆粒、類(lèi)病毒、轉(zhuǎn)座因子、柯斯構(gòu)建體、結(jié)合DNA鏈的可轉(zhuǎn)染運(yùn)載體(如，DNA包被的“基因槍”團(tuán)粒(pellet)或DNA包被的天然或合成的組蛋白樣粒子)或其它本領(lǐng)域中已知的DNA-到-細(xì)胞的運(yùn)載系統(tǒng)。
如這里所使用的，在描述氨基酸序列的上下文中，應(yīng)用了下面的單字符命名。
A，a丙氨酸(Ala) M，m甲硫氨酸(Met)C，c半胱氨酸(Cys) N，n天冬酰胺(Asn)D，d天冬氨酸(Asp) P，p脯氨酸(Pro)E，e谷氨酸(Glu) Q，q谷氨酰胺(Gln)F，f苯丙氨酸(Phe) R，r精氨酸(Arg)G，g甘氨酸(Gly) S，s絲氨酸(Ser)H，h組氨酸(His) T，t蘇氨酸(Thr)I，i異亮氨酸(Ile) V，v纈氨酸(Val)K，k賴(lài)氨酸(Lys) W，w色氨酸(Trp)L，l亮氨酸(Leu) Y，y酪氨酸(Tyr)
如這里所使用的，在描述DNA序列的上下文中，應(yīng)用了下面的單字符定義A腺嘌呤G鳥(niǎo)嘌呤 N A，C，G或TC胞嘧啶T胸腺嘧啶R A或GY C或T這里使用了下面的縮略語(yǔ)和定義@ 在，如@37℃為“在37℃”并且@60分鐘為“在60分鐘”埃(一埃為1×10-10米)A 吸光度，如，A280為“在280nm處測(cè)得的吸光度”aa氨基酸Amp 氨芐青霉素2-AMP 2-氨基丙醇AMPSO 3-〔(1，1-二甲基-2-羥乙基)氨基〕-2-羥基-丙磺酸ATCC 美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD，美國(guó))堿基為多核苷酸一部分的核苷酸bp堿基對(duì)CAPSO 3-(環(huán)己氨)-2-羥-1-丙磺酸CD壓縮盤(pán)CHES 2-(N-環(huán)己氨)乙磺酸CM羧甲基CnBr 溴化氰Δ變化或差異，如A為“吸光度變化”dATP 脫氧腺苷三磷酸DCB 1，4-二氯丁烷DCH 2，3-二氯-1-丙醇dCTP 脫氧胞苷三磷酸DEAE 二乙氨乙基dGTP 脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸dTTP 脫氧胸苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽EPPCR易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)GC 氣相色譜GIA 戊二醛gm 革蘭氏(Grams)hr 小時(shí)Hz 赫茲(以每秒循環(huán)單位數(shù)對(duì)頻率的計(jì)量)ID 內(nèi)徑Ig 免疫球蛋白，如IgG為“免疫球蛋白G”IPTG 異丙基硫代半乳糖基吡喃糖苷IUB 國(guó)際生化聯(lián)盟kbp 千堿基對(duì)kD 千道爾頓(一道爾頓重為12O原子的1/12)Ki 抑制常數(shù)LB Luria培養(yǎng)基μg 微克μL 微升μM 微摩爾濃度μmole 微摩爾M(體積)摩爾的(每升溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù))mg 毫克min 分鐘mL 毫升mm 毫米mM 毫摩爾MW 分子量N當(dāng)量的(每升溶液中化學(xué)活性溶質(zhì)基團(tuán)的摩爾數(shù)，如，H2SO4具有2個(gè)酸性的氫且因此1M H2SO4為2N的溶液)nm 納米ng 納克
NP-40Nonoxynol；p-(n-C9H19)-C6H4-(OCH2CH2)nOH；也稱(chēng)為壬基苯氧基聚乙二醇(一種非離子型去污劑表面活性劑)OD 光密度，如OD600“在600nm處測(cè)得的光密度”oligo寡核苷酸P- 質(zhì)粒，如pRSET，pTrcHis，pTrxFus，或pUCPAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PEI 聚乙烯亞胺pfu 蝕斑形成單位phage噬菌體QAE 四乙銨(一種陰離子交換基)RDhl 紅球菌鹵代鏈烷脫鹵素酶殘基 為多肽一部分的氨基酸rpm 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)rRDhl重組的紅球菌鹵代鏈烷脫鹵素酶SDS 十二烷基磺酸鈉spp. 種類(lèi)TCP 1，2，3-三氯丙烷T(mén)M 商標(biāo)Tris 三(羥甲基)氨基甲烷tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)RNAU單位Vmax 最大酶促速度％w/v每體積的百分重量，即每100mL溶液的溶質(zhì)克數(shù)，也寫(xiě)作“％(w/v)”％w/w每重量的百分重量，即，每100克含有物質(zhì)的混合物中該物質(zhì)的克數(shù)；也寫(xiě)作“％(w/w)”～ 大約為了獲得酶和固定化酶，達(dá)到本發(fā)明的目的，進(jìn)行下面的步驟。用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行這些步驟(1)分離和部分測(cè)定脫鹵素酶的氨基酸序列；(2)根據(jù)此部分的序列測(cè)定而構(gòu)建寡核苷酸探針；(3)用該寡核苷酸探針?lè)蛛x編碼脫鹵素酶的DNA片段，然后擴(kuò)增此DNA；(4)將該片段連接到具有適當(dāng)復(fù)制起點(diǎn)和編碼顯性選擇標(biāo)記基因的克隆載體中；(5)轉(zhuǎn)化并篩選含有該重組質(zhì)粒的微生物；(6)將該DNA序列轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中并用該重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(7)由該轉(zhuǎn)化子制備重組脫鹵素酶；和(8)純化該脫鹵素酶；然后(9)將該脫鹵素酶固定到各種固相支持物上；(10)在將HAHs轉(zhuǎn)化為醇或鹵代醇的過(guò)程中使用固定化的脫鹵素酶；和(11)篩選有效的脫鹵素酶支持系統(tǒng)。
令人驚奇的是，在進(jìn)行上述研究的過(guò)程中，獲得了新的重組脫鹵素酶，其較野生型的脫鹵素酶具有更為優(yōu)越的功能特征，由此而獲得了該重組酶。此外，還鑒定了有效的固定化脫鹵素酶支持系統(tǒng)。
用于本發(fā)明的脫鹵素酶優(yōu)選來(lái)源于紅球菌種類(lèi)ATCC 55388并且能夠?qū)AH轉(zhuǎn)化成鹵代醇或醇，優(yōu)選為鹵代醇。優(yōu)選的重組酶包括具有野生型脫鹵素酶最少功能部分的具有酶活性的多肽，即，在適當(dāng)?shù)恼郫B后維持鹵代鏈烷脫鹵素酶活性的其最小可能的片段。優(yōu)選地，此多肽基本上與圖2中殘基1-292的氨基酸序列同源。更為優(yōu)選地，此多肽與其有至少約90％的同源，更為優(yōu)選地至少有約95％的同源且再進(jìn)一步更為優(yōu)選地至少有約99％的同源。尤其優(yōu)選的是具有殘基1-292或圖2中殘基氨基酸序列的具有酶活性的多肽。
該優(yōu)選的重組酶也可包括一種或更多種其它的單元，如各種大小的標(biāo)記、標(biāo)簽、尾部、接頭、固相支持物、螯合劑，其它酶等它們與該酶的活性多肽一起制備或者在其形成后連接到其上。在其適當(dāng)折疊和/或固定化于固相支持物上后這樣的單元可從該酶中切除。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備帶有或連接到基本上親水尾部的酶。此尾部可以為表達(dá)為該酶一部分的親水寡肽或者可以為，例如，在其表達(dá)后由宿主細(xì)胞附著到核心酶上的寡糖部分。該尾部必需有足夠的長(zhǎng)度和親水性從而使核心酶以懸液形式維持于水溶性培養(yǎng)基中。優(yōu)選的尾部為表達(dá)為該酶一部分的基本上親水的寡肽。更為優(yōu)選地，該酶被表達(dá)具有高度親水性的寡肽尾部。最為優(yōu)選地，此寡肽尾部表達(dá)于該酶的羧基末端。最優(yōu)選的寡肽尾部為富含組氨酸和/或天冬氨酸殘基的親水羧基末端尾部，尤其是約5到25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且含有至少約25％組氨酸或天冬氨酸殘基，更為優(yōu)選含有至少約50％這種殘基的尾部。此重組酶優(yōu)選由含有具有圖2中堿基37-912核苷酸序列至少一部分多核苷酸的宿主細(xì)胞制備。
本發(fā)明也涉及能夠表達(dá)本發(fā)明酶的重組DNA序列。這些DNA序列包括能夠通過(guò)不遵循或不完全遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA密碼的密碼子-到-氨基酸對(duì)應(yīng)模式的翻譯系統(tǒng)表達(dá)新的鹵代鏈烷脫鹵素酶的那些序列。這樣的系統(tǒng)包括其中的某些密碼子相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的DNA密碼受到“抑制”的那些系統(tǒng)。在其中的一種“抑制”表達(dá)系統(tǒng)中，大約20種氨基酸特異性的氨酰-tRNA(“aa-tRNA”)分子中至少有一種含有至少一種具有此類(lèi)反密碼子并連接到“錯(cuò)誤”氨基酸上的tRNA分子從而預(yù)先決定該翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)標(biāo)準(zhǔn)DNA密碼子的“踐踏”(violation)(即，通過(guò)在延伸多肽鏈中至少一個(gè)位置導(dǎo)致插入這樣的氨基酸，即不是與支配該位置的mRNA密碼子正常所見(jiàn)到的氨基酸)。在這樣系統(tǒng)的另一種變異中，氨酰-tRNA分子庫(kù)含有其反密碼子互補(bǔ)于正常翻譯信號(hào)起始或終止的mRNA密碼子因而抑制該信號(hào)的aa-tRNA。這些系統(tǒng)可能，例如，由于在一種或更多種tRNA分子或aa-tRNA合成酶中的突變而存在，或者由于非突變aa-tRNA合成酶的錯(cuò)誤，或由于人類(lèi)的干涉而迫使氨基酸與tRNA的非標(biāo)準(zhǔn)連接而存在。
在這樣的翻譯系統(tǒng)中，本發(fā)明的DNA序列將仍然產(chǎn)生新的鹵代鏈烷脫鹵素酶，或者是因?yàn)椤板e(cuò)誤”氨基酸的插入沒(méi)有導(dǎo)致酶缺失活性或者是因?yàn)榇薉NA序列在“不正確”氨基酸將要被插入的位置含有這樣的密碼子，即其“預(yù)期”到該翻譯系統(tǒng)中的變化從而使在其中或者插入“正確”的氨基酸或者使mRNA密碼子“正確”起始信號(hào)。優(yōu)選的DNA序列包括基本上與圖2中堿基37-912的核苷酸序列同源的多核苷酸。更為優(yōu)選地，此多核苷酸與其至少約90％同源，更為優(yōu)選至少約95％同源，進(jìn)而，更為優(yōu)選至少約99％同源。尤其優(yōu)選的為具有圖2中堿基37-912氨基酸序列的多核苷酸。
如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“基本上同源”表示主題序列-即主題核苷酸序列(寡核苷酸-或多核苷酸或DNA鏈)或主題氨基酸序列(寡肽-或多肽或蛋白)與有關(guān)的參照核苷酸或氨基酸序列間的相似性程度。此術(shù)語(yǔ)定義為當(dāng)將這些序列進(jìn)行“比較”時(shí)主題與參照序列間至少約75％的“對(duì)應(yīng)”(即，相同成分-核苷酸或氨基酸平行排列的狀態(tài))。在本文中，當(dāng)主題和/或參照序列中插入了最少數(shù)目的“無(wú)義”部分從而使二者序列間存在的對(duì)應(yīng)部分?jǐn)?shù)目最大時(shí)稱(chēng)(序列)“比較”存在。“無(wú)義”部分不是主題與參照序列的部分；同樣，插入主題序列中“無(wú)義”部分的最少數(shù)目可能與插入?yún)⒄招蛄兄凶钌贁?shù)目不同?？杀硎緸?，如，“90％同源”的給定序列的增加的同源性程度同樣也是參照它們與參照序列間的序列一致性程度而定義的。
在該定義中，在以下情況中認(rèn)為參照序列與主題序列“相關(guān)”1)兩種核苷酸序列均編碼可鑒定為相同IUB亞類(lèi)的蛋白或蛋白的一部分或2)無(wú)論鑒定是根據(jù)功能特性、序列同源性或母本來(lái)源，兩種氨基酸序列構(gòu)成可鑒定為相同IUB亞類(lèi)的蛋白或蛋白的一部分?！澳副緛?lái)源”指這樣的事實(shí)，即一種給定的酶由于其已認(rèn)識(shí)到的主要或次要功能而可能在起始被劃分為一IUB亞類(lèi)，但在編碼該酶的DNA序列積累一種或更多種突變時(shí)，此編碼的酶可能顯示出不同IUB亞類(lèi)的功能活性-無(wú)論其還同時(shí)維持其最初功能性與否；此“不同的IUB亞類(lèi)”可能位于相同或不同的IUB主類(lèi)。有關(guān)“蛋白的一部分”指根據(jù)鑒定為其一個(gè)功能域的亞類(lèi)也認(rèn)為雙功能和多功能酶-包括融合蛋白屬于給定的IUB亞類(lèi)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，鹵代鏈烷脫鹵素酶至少在母本上屬于IUB亞類(lèi)3.8.1。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的酶具有較紅球菌中發(fā)現(xiàn)的野生型鹵代鏈烷脫鹵素酶，如，美國(guó)專(zhuān)利No.5,372,944中使用的脫鹵素酶出人意料的優(yōu)越特性。一般地，除了其在反應(yīng)條件下的穩(wěn)定性外，一種給定酶的二種特征將決定其在商業(yè)中的用途其對(duì)產(chǎn)物的親和力以及其對(duì)底物的親和力。當(dāng)酶對(duì)產(chǎn)物分子的親和力相對(duì)較高時(shí)，其將對(duì)該產(chǎn)物的反饋抑制極其敏感。這種酶在其中常需要顯著產(chǎn)品濃度存在下才能工作的商業(yè)過(guò)程中用處較少。酶對(duì)產(chǎn)物相對(duì)親和力的方便指標(biāo)是在90％抑制時(shí)測(cè)得的抑制常數(shù)(“Ki(90)”)，即酶僅維持其10％Vmax時(shí)產(chǎn)物的濃度，Vmax在產(chǎn)物濃度為0時(shí)測(cè)得的。至于本發(fā)明，野生型鹵代鏈烷脫鹵素酶具有20mM測(cè)得的Ki(90)，而本發(fā)明的重組酶(見(jiàn)圖2)具有50mM測(cè)得的Ki(90)。換句話(huà)說(shuō)，此重組酶對(duì)產(chǎn)物的反饋抑制要不敏感得多并且可因此在將會(huì)基本上完全抑制野生型酶的產(chǎn)物濃度存在下起作用。
本發(fā)明的酶可單獨(dú)表達(dá)或沿著其氨基和/或羧基末端共價(jià)附著一種或更多種多肽尾部。該尾部可由與編碼該酶的外顯子分離的外顯子所編碼或由為編碼該酶外顯子的一部分的DNA序列所編碼。當(dāng)此編碼尾部的DNA為編碼該酶外顯子的一部分時(shí)，此編碼尾部的DNA可通過(guò)以下任一方式附著或“融合”到該酶基因的3′和/或5′末端，如或者1)在通過(guò)將編碼此尾部的核苷酸序列包括進(jìn)寡核苷酸引物中而進(jìn)行的酶基因擴(kuò)增過(guò)程中或2)在通過(guò)將編碼尾部的DNA直接連接到含有該酶基因的質(zhì)粒中而進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中(無(wú)論該酶基因是在編碼尾部DNA的插入之前或之后插入此質(zhì)粒中)。
在適當(dāng)?shù)倪z傳控制元件-即增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始與終止序列等的影響下-此種DNA(或mRNA)融合基因的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生在一個(gè)或兩個(gè)末端具有多肽尾部的脫鹵素酶。優(yōu)選的沒(méi)有尾部酶的實(shí)例為具有圖2中殘基1-292氨基酸序列的酶。一些優(yōu)選多肽尾部的實(shí)例包括多組氨酸序列、多酸(如，多-天冬氨酸和/或多谷氨酸)序列、纖維素結(jié)合區(qū)域和c-myc、S-Tag和FLAG肽。結(jié)合這些典型尾部的抗體和親和柱在商業(yè)上是可得到的并且可容易地用于純化或固定此表達(dá)的融合蛋白。然而，也可使用許多其它的尾部而同時(shí)維持有功能的脫鹵素酶。無(wú)論編碼尾部的序列包括進(jìn)此表達(dá)基因中與否，該基因必需在該酶基因或該酶-尾部融合基因以外的位置包括翻譯起始位點(diǎn)，優(yōu)選為ATG，且將也優(yōu)選包括內(nèi)切核酸酶限制位點(diǎn)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單個(gè)外顯子的開(kāi)放閱讀框編碼在氨基和/或羧基末端具有達(dá)大約30個(gè)氨基酸殘基尾部的有功能的脫鹵素酶。在此實(shí)施方案中，當(dāng)兩個(gè)末端均具有尾部時(shí)，兩個(gè)尾部可以是大約相同的長(zhǎng)度。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該酶表達(dá)為同時(shí)具有氨基末端和羧基末端尾部，但羧基末端尾部顯著長(zhǎng)于氨基末端的尾部。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選此氨基末端尾部達(dá)到大約25個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度而羧基末端尾部為大約2到150個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在這些實(shí)施方案中的任一方案中，優(yōu)選地，該氨基和/或羧基末端尾部將含有一段至少5個(gè)相鄰的組氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，氨基末端尾部大約10-150個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且優(yōu)選含有或其本身為多組氨酸序列。在該實(shí)施方案中，該酶可通過(guò)與以螯合的二價(jià)金屬離子，如，Mg2+或Ni2+包被的表面接觸而被可逆地固定或可逆的失活。在此實(shí)施方案中，含有多組氨酸的氨基末端尾部可以是如此之長(zhǎng)從而部分或完全封閉進(jìn)入該酶的活性位點(diǎn)。在此實(shí)施方案的其它版本中，該尾部可設(shè)計(jì)成含有將尾部的構(gòu)型從多組氨酸序列中見(jiàn)到的情形變?yōu)閺澢⒎崔D(zhuǎn)或彈性連接的構(gòu)型的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基從而增加達(dá)到該酶的活性位點(diǎn)。
在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，此開(kāi)放閱讀框編碼具有約1到25個(gè)氨基酸氨基末端尾部和具有多組氨酸序列，F(xiàn)LAG肽序列(可獲自柯達(dá)成像系統(tǒng)/VWR，Rochester，NY)和/或S-Tag肽序列的羧基末端延伸的有功能脫鹵素酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，此開(kāi)放閱讀框編碼有功能的脫鹵素酶1)達(dá)到大約10個(gè)氨基酸的氨基末端尾部和多組氨酸序列和2)包括(即，含有)FLAG(見(jiàn)圖2)或S-Tag肽序列的羧基末端尾部。
該酶和/或上述脫鹵素酶的尾部可用定向進(jìn)化技術(shù)加以修飾從而提高其產(chǎn)率、穩(wěn)定性和/或抑制圖形。一種直接進(jìn)化技術(shù)使用美國(guó)專(zhuān)利No.5,605,793中由Stemmer等公開(kāi)的基因改組(gene Shuffling)方法，其中的眾多類(lèi)似DNA序列被片段化并以隨機(jī)的方式重新裝配從而產(chǎn)生高度多樣性的可篩選具有目的特征酶的文庫(kù)。該技術(shù)的另一種形式包括使用易錯(cuò)基因擴(kuò)增技術(shù)。定向進(jìn)化的第三種形式利用這兩種方法的組合。定向進(jìn)化的第四種方式為由Zhao等在《自然生物技術(shù)》(1988)(目前待出版)文獻(xiàn)中公開(kāi)的所謂“搖擺延伸”(staggered extension)方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，易錯(cuò)基因擴(kuò)增用于以每基因擴(kuò)增反應(yīng)每基因拷貝大約1-6個(gè)點(diǎn)突變的速率導(dǎo)入半隨機(jī)突變至脫鹵素酶基因(如，圖2，殘基1-292)中，然后將此突變文庫(kù)導(dǎo)入細(xì)菌中，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白并且優(yōu)選在空間上可標(biāo)記的網(wǎng)狀形式(如96孔或384孔板)中篩選活性。
有效使用定向進(jìn)化以改進(jìn)一種酶或酶家族需要最優(yōu)化的誘變策略以及表達(dá)系統(tǒng)和有效檢測(cè)到該酶所需表現(xiàn)特征的篩選策略與篩選條件。對(duì)于(非-隨機(jī))的引物依賴(lài)性誘變方法(如，易錯(cuò)基因擴(kuò)增和限定的基于引物的重組)，特異性的蛋白亞域可容易地選定為通過(guò)引物設(shè)計(jì)和定位的誘變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用這樣的引物，即與其在表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)部出現(xiàn)的一樣能夠誘變整個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)域。優(yōu)選地，這些引物只涉及表達(dá)構(gòu)建體的蛋白編碼區(qū)域靶DNA(包括尾部)。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，以這樣的方式設(shè)計(jì)引物，如定向誘變脫鹵素酶基因而同時(shí)保留該尾部序列。例如，對(duì)于圖2，當(dāng)易錯(cuò)基因擴(kuò)增技術(shù)同時(shí)使用互補(bǔ)于緊接著核苷酸36前面的核苷酸的引物和互補(bǔ)于緊接著核苷酸912后面核苷酸的引物時(shí)，此脫鹵素酶基因可以為唯一的誘變靶序列。同樣，當(dāng)這些引物與核苷酸1-951區(qū)域的外部退火時(shí)整個(gè)圖2編碼區(qū)為誘變靶序列；當(dāng)這些引物與核苷酸1-36或913-951區(qū)域的外部退火時(shí)圖2氨基尾部或羧基尾部分別為靶序列。
編碼本發(fā)明酶或融合蛋白的DNA序列將優(yōu)選插入表達(dá)載體中，然后將該載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞且在表達(dá)該酶的條件下培養(yǎng)此宿主細(xì)胞。已知有很多種重組的用于原核細(xì)胞的宿主載體表達(dá)系統(tǒng)并可用于本發(fā)明中。例如，商業(yè)上可得到的載體如pKK233-2、pKK388-1、pSE380、pTrcHis(A、B和C)、pRSET(A、B和C)、pProEX-1和噬菌體λ(gt11)、T3和T7均能夠指導(dǎo)異源蛋白在大腸桿菌和其它革蘭氏陰性原核細(xì)胞中表達(dá)。在這些表達(dá)形式中，也可使用多種菌株適宜的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。此外，其它原核生物(如芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬、放線(xiàn)菌屬(Actinomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或紅球菌屬生物)、真核微生物(如酵母和真菌，如畢赤酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、或曲霉屬(Aspergillus)的微生物，如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或啤酒糖酵母)、其它真核細(xì)胞和細(xì)胞系(如以桿狀病毒來(lái)源載體感染的Sf 21細(xì)胞)及甚至藻類(lèi)細(xì)胞能夠產(chǎn)生活性形式的原核來(lái)源的異源蛋白；在這些其它細(xì)胞用于本發(fā)明中的事件中，將選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體用于其中。而眾多的原核表達(dá)載體可公開(kāi)得到并可用于本發(fā)明中，在此用商業(yè)上可得到的載體pTrcHis、pRSET和pTrxFus系列(可獲自美國(guó)加州圣地亞哥的Invitrogen)與大腸桿菌宿主細(xì)胞舉例說(shuō)明該新酶的表達(dá)。
當(dāng)使用定向進(jìn)化技術(shù)，如易錯(cuò)基因擴(kuò)增(如，易錯(cuò)PCR或“EPPCR”)時(shí)，將由此產(chǎn)生的突變基因集合的DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼?即，在突變靶序列之外具有限制位點(diǎn)的那些內(nèi)切核酸酶)消化；其次，純化這些突變基因并連接到原核表達(dá)載體中以形成質(zhì)粒文庫(kù)。然后用該質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主細(xì)胞，如，優(yōu)選為大腸桿菌細(xì)胞并培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中在大腸桿菌情況，將細(xì)胞鋪板于含有選擇培養(yǎng)基的瓊脂上。然后將這些細(xì)胞稀釋以形成單菌落，或者在原核生物如大腸桿菌情況時(shí)，它們可經(jīng)過(guò)起始的生長(zhǎng)期，然后單個(gè)地挑出細(xì)胞菌落并轉(zhuǎn)移到分離的容器中，如96孔板小孔中從而每孔含有單克隆轉(zhuǎn)化細(xì)胞。根據(jù)此克隆文庫(kù)，可擴(kuò)增單個(gè)克隆、誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并篩選目的活性。
優(yōu)選通過(guò)檢測(cè)在底物分子當(dāng)碳-鹵共價(jià)鍵水解時(shí)釋放的質(zhì)子或鹵化離子而完成對(duì)新酶鹵代脂族脫鹵素酶活性的篩選。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，伴隨質(zhì)子釋放的pH改變用作酶活性的量度；此pH改變優(yōu)選用熒光或在靶酶功能pH范圍中經(jīng)過(guò)可檢測(cè)到顏色改變的可見(jiàn)pH指示劑加以測(cè)定。在其它的方法中，可利用多種平行的pH探針。
在活性篩選測(cè)定中，該測(cè)定混合物將含有1)完整的細(xì)胞、透化的細(xì)胞、細(xì)胞裂解液或獲自表達(dá)突變脫鹵素酶細(xì)胞，優(yōu)選獲自細(xì)菌細(xì)胞的純化酶；2)底物；和3)低濃度緩沖液(一般＜10mM)。當(dāng)需要使用透化細(xì)胞時(shí)，可用化學(xué)去污劑(如，脫氧膽酸鈉)或物理凍/融方法使細(xì)菌細(xì)胞通透。底物將優(yōu)選包括一種或更多種上述的鹵化脂族烴。該緩沖液可選自任何已知有效或該酶在其中維持活性的pH范圍中發(fā)現(xiàn)有效的緩沖液。在有些情況，將見(jiàn)到細(xì)胞殘?jiān)旧硖峁┳銐虻木彌_能力從而能夠準(zhǔn)確地定量活性。只要使用增加的緩沖液，其將優(yōu)選具有約6到10范圍的pKa，雖然可使用其它緩沖液。優(yōu)選緩沖液的實(shí)例包括甘氨酸、2-AMP、CAPSO、乙醇胺、CHES、硼酸鹽、絲氨酸和AMPSO；尤其優(yōu)選的為CAPSO且甚至更為優(yōu)選的為約5mM CAPSO的濃度。
活性篩選測(cè)定也將需要用測(cè)定方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)pH改變。優(yōu)選地，pH指示劑將包括進(jìn)該測(cè)定混合物中。可以使用該酶在其中具有活性的pH范圍內(nèi)具有顏色變化的任何pH指示劑。優(yōu)選地，該pH指示劑在大約pH 6到pH 10的范圍內(nèi)，更為優(yōu)選在大約pH 7到pH 9的范圍內(nèi)將經(jīng)歷顏色變化。優(yōu)選可見(jiàn)pH指示劑的實(shí)例包括m-甲酚紫、甲酚紅、酚紅、溴百里酚藍(lán)和百里酚藍(lán)；優(yōu)選熒光pH指示劑的實(shí)例包括α-萘酚磺酸、1，4-萘酚磺酸、香豆酸、3，6-二氧基鄰苯二甲酸二氰和orcinaurine。在別的實(shí)施方案中，可用pH探測(cè)器檢測(cè)pH變化。尤其優(yōu)選的是用可見(jiàn)的pH指示器，m-甲酚紫，且甚至更為優(yōu)選的是大約50μM m-甲酚紫的濃度。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)以下的方式檢測(cè)底物中鹵化離子的釋放而完成檢測(cè)1)在測(cè)定的混合物中包括鹵化物敏感的熒光染料，如硝酸雙-N-甲基吖啶(Iucigenin)(可獲自Molecular Probes ofEugene，OR，美國(guó))當(dāng)與鹵化離子接觸時(shí)，硝酸雙-N-甲基吖啶被猝滅且因此在其中測(cè)得的熒光下降；或2)使用鹵化離子反應(yīng)性檢測(cè)裝置，如鹵化物-反應(yīng)性電極。
在第三優(yōu)選的實(shí)施方案中，用偶聯(lián)的酶系統(tǒng)完成酶活性的檢測(cè)。例如，偶聯(lián)酶系統(tǒng)可用于檢測(cè)產(chǎn)物分子的產(chǎn)生鹵代鏈烷的脫鹵化作用導(dǎo)致醇產(chǎn)生，并且許多醇為一種或更多種商業(yè)上可得到的醇脫氫酶(其活性由NADH的消失加以測(cè)定)的底物。通過(guò)偶聯(lián)到NADH且需要脫氫酶對(duì)醇的檢測(cè)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
本發(fā)明的酶可固定到一種或更多種固相支持物上。酶固定技術(shù)最方便地分為共價(jià)和非共價(jià)方法。共價(jià)方法利用一些氨基酸側(cè)鏈上存在的反應(yīng)性基團(tuán)而直接或通過(guò)用雙功能的交聯(lián)劑結(jié)合到聚合物或無(wú)機(jī)支持物上。該方法的主要優(yōu)勢(shì)為連接的堅(jiān)固性。非-共價(jià)固定方法更多并且范圍從直接和間接(如，螯合-或螯合劑-介導(dǎo)的)離子、吸附或生物親和支持物連接(如，生物素-親和素)到凝膠-包載或微囊化作用。
用于商業(yè)酶方法的特定固定化技術(shù)的挑選基于多種因素。其中主要因素是支持基質(zhì)的價(jià)格及其生物相容性連接或偶聯(lián)化學(xué)。其次是固定時(shí)活性的恢復(fù)和反應(yīng)條件下固定支持物的堅(jiān)固性。不幸的是，由于每種酶都是獨(dú)特的，尋找最佳系統(tǒng)的方法是經(jīng)驗(yàn)性的。然而，有關(guān)本發(fā)明的酶，優(yōu)選的固定方法包括通過(guò)反應(yīng)性基團(tuán)如環(huán)氧化物、活化的親核物質(zhì)、異尿素(isourea)等將此酶共價(jià)連接到支持物上。這些反應(yīng)性基團(tuán)可存在于支持材料的自然表面或者該支持材料可修飾成帶有含這些基團(tuán)的連接體。優(yōu)選的連接體包括含有二醛、二酸、二氨基、二異氰酸酯、氰酸酯和二酰亞胺基團(tuán)；如果二氨基沒(méi)有與碳二酰亞胺聯(lián)合使用，也可使用包括至少一個(gè)碳二酰亞胺基團(tuán)的連接體，在優(yōu)選的固相支持物中有基于氧化鋁的支持物和基于硅的支持物；更為優(yōu)選的為基于聚乙烯亞胺浸滲的氧化鋁或硅支持物。固定的優(yōu)選方法包括用戊二醛預(yù)處理該固相支持物且然后將此支持物與酶接觸。
一旦被固定，該酶可方便地用于轉(zhuǎn)化其底物/反應(yīng)物成為產(chǎn)品。此反應(yīng)可在基本上不影響脫鹵素酶活性的任何合適介質(zhì)中完成。優(yōu)選地，該酶促轉(zhuǎn)化在含有緩沖系統(tǒng)或一種或更多種pH控制裝置的水溶性介質(zhì)中完成。
雖然在有些情況中，也可使用超飽和的底物混合物、底物乳濁液或純底物制品，但鹵化烴底物通常加入反應(yīng)介質(zhì)中至底物飽和點(diǎn)。如果大多數(shù)鹵化烴底物達(dá)到飽和點(diǎn)，所用的鹵化烴濃度將一般為約0.005％到0.5％(w/v)的范圍、優(yōu)選地，鹵化烴的濃度從約0.005％到約0.25％。更為優(yōu)選的為鹵化烴在介質(zhì)中的濃度為從約0.005％到約0.2％。起初可以批量的方法將底物加入到反應(yīng)溶液中，或者加入到持續(xù)加料方法中的液體流中。在此持續(xù)加料方法中，該液體流可起初含有底物或者此底物可首先加入其中因?yàn)橐后w流為進(jìn)入反應(yīng)器中的途中。在這兩者中的任一情況中，更多的底物可直接加入到反應(yīng)器的液體流中從而確保高濃度的底物在整個(gè)反應(yīng)器中呈遞給酶。在該方法中，此液體流可以不同水平的底物重新飽和從而能夠以高于此底物溶解極限的濃度積累產(chǎn)物。批量方法反應(yīng)通常用振蕩或攪拌來(lái)完成。盡管反應(yīng)時(shí)間或反應(yīng)器滯留時(shí)間可隨反應(yīng)條件如底物濃度或酶量而變化，但優(yōu)選選擇這樣的反應(yīng)條件從而使反應(yīng)在最多120小時(shí)內(nèi)完成。
通過(guò)考慮下面的實(shí)施例，本發(fā)明將得以進(jìn)一步澄清，這些實(shí)施例意在徹底例證本發(fā)明。如果沒(méi)有特別指明，所有的百分?jǐn)?shù)均為百分重量。常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)基所有的寡核苷酸均由Genosys Biotechnologies公司(Woodland，TX)、Life Teehnologies公司(Rookville，MD)或Integrated DNATechnologies公司(Coralville，IA)合成與純化。限制酶和DNA修飾酶購(gòu)自Gibco-Bethesda Research Laboratories(Gaithersburg，MD)、New England Biolab公司(Beverly，MA)或StratageneCloning System(La Jolla，CA)并且按照制造商的方法使用。感受態(tài)大腸桿菌AG1細(xì)胞購(gòu)自Stratagene Cloning Systems，感受態(tài)大腸桿菌JM109和TOP 10F′細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen公司(圣地亞哥，加州)。小規(guī)模質(zhì)粒DNA分離用Rapid Pure Miniprep(RPMTM)系統(tǒng)(BIO101，公司.，La Jolla，CA)完成。DNA連接用預(yù)先測(cè)試的購(gòu)自Stratagene Cloning System的試劑盒完成。DNA片段的純化用QIAquick凝膠提取試劑盒和QIA quick PCR純化試劑盒，兩者均購(gòu)自Qiagen公司(Chatsworth，CA)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠和相關(guān)的緩沖液與染料以及電印跡轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)自Integrated SeparationSystem(ISS，Natick，MA)?？贵w、抗FLAGTM單克隆抗體M2以及羊抗-小鼠IgG1分別獲自International Biotechnology公司(IBI，New Haven，CT)和Southern Biotechnology Associate(Birmingham，AL)。細(xì)菌培養(yǎng)于使用購(gòu)自Gibco-Bethesda ResearchLaboratories(G-BRL；Gaithersburg，MD)預(yù)混合的試劑的Luria-培養(yǎng)基(“LB”)中。試劑1，4-二氯丁烷、60％高氯酸、硝酸鐵及硫氰酸汞來(lái)自Aldrich。無(wú)水乙醇來(lái)自Quantum/USI(Tuscola IL，美國(guó))。1，2，3-三氯丙烷由Dow Chemical Company’s Allylics Group(Freeport，TX，美國(guó))惠贈(zèng)。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、咪唑、鹽酸胍、EDTA二鈉、硫酸銨、及無(wú)Tris堿來(lái)自Fisher Biotech Grade。硫酸來(lái)自Fisher(ACS級(jí))。支持材料Tresyl-Toyopearl層析支持物來(lái)自TosoHaas(Lot#65TRM72R)。交聯(lián)葡聚糖G-25預(yù)包裝柱來(lái)自發(fā)瑪西亞。Celite R-648來(lái)自Manville。聚乙烯亞胺，50,000 MW和PEI-二氧化硅來(lái)自Sigma。同樣來(lái)自Sigma的1級(jí)(Grade 1)25％戊二醛水溶液貯存于-20℃直至使用前。用于固定中的其它樣品包括Davison Low SA氧化鋁、Norton SA 6176氧化鋁、Calcicat C型氧化鋁、Calcicat s-88-473A型二氧化硅、Shell 5980-F二氧化硅、Davison 952-08-5X二氧化硅、Borecker亞單位碳和AmCy 5701-Sn碳。方法PCR反應(yīng)用Perkin-Elmer-Cetus(Nutley，NJ)提供的標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液進(jìn)行DNA擴(kuò)增。一般地，50μL的反應(yīng)包括1×濃度的制造商供應(yīng)的緩沖液、1.5mM的MgCl2、125μM dATP、125μM dCTP、125μM dGTP、125μM dTTP、0.1-1.0μM的正向及反向引物、5單位Ampli Taq DNA聚合酶及＜1ng的靶DNA。除非特別說(shuō)明，否則DNA擴(kuò)增的加熱方式為94℃，5分鐘；55℃，1分鐘；72℃，1分鐘的35輪循環(huán)加熱方式。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白的檢測(cè)將可溶性蛋白與增溶緩沖液(Tris/SDS/β-巰基乙醇)1∶1混合并且在上樣于10-20％凝膠(Daiichi，Natick，MA)中之前煮沸5分鐘并用Tris-甘氨酸緩沖液(ISS)進(jìn)行電泳。凝膠用Pro-BlueTM(ISS)染色。標(biāo)準(zhǔn)的氯化物檢測(cè)分析以測(cè)定酶活性單位當(dāng)用1，4-二氯丁烷(Aldrich)作為底物時(shí)，將100mM pH 9的甘氨酸鈉加入到每個(gè)9mL加蓋的小瓶中至6mL的終體積。當(dāng)用1，2，3-三氯丙烷作為底物時(shí)，使用10mM的Tris硫酸鹽/1mM EDTA(pH7.0)。然后加入6μL底物并旋渦振蕩內(nèi)容物。將小瓶于30℃孵育攪拌1小時(shí)。通過(guò)在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出1mL混合物并將其置于含有5.25MHClO4中100μL 0.375M Fe3-(NO3)3的Eppendorf管中而進(jìn)行取樣。旋渦振蕩Eppendorf管。當(dāng)收集完所有樣品時(shí)，將乙醇中飽和的100μL硫氰酸汞(II)加入到每支管中。再一次將樣品旋渦振蕩，然后離心3分鐘。在460nm處讀數(shù)光密度。測(cè)定代表一定時(shí)間吸收改變的斜率(ΔA/分鐘)并除以1.52(用ΔA/μmole Cl-為單位以NaCl作為標(biāo)準(zhǔn)在460nm處的消光系數(shù))以得到μmole Cl-/分鐘。一個(gè)單位的酶活性定義為在指定的條件下需要脫鹵素1.0μmole底物/分鐘所需要的酶量。易錯(cuò)PCR誘變的方法在該定向進(jìn)化方法中，將RDhl酶基因或RDhl融合蛋白基因提供為EPPCR誘變的靶基因，如，通過(guò)用適當(dāng)?shù)南拗泼赶写税蠨NA序列的質(zhì)粒。在大多情況中，通過(guò)凝膠電泳純化靶DNA，然后凝膠提取此靶DNA。除了標(biāo)準(zhǔn)的PCR緩沖液補(bǔ)充以足夠的氯化鎂和氯化錳從而達(dá)到7mM氯化鎂和0.15mM氯化錳的反應(yīng)混合物以外，EPPCR包括用適當(dāng)寡核苷酸引物對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR基因擴(kuò)增。此方法可對(duì)一種或更多種EPPCR產(chǎn)物進(jìn)行重復(fù)以在其中導(dǎo)入進(jìn)一步的突變。
將得到的EPPCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體(如，pTrcHis、pTrxFus)中且然后用這些載體轉(zhuǎn)化合適的感受態(tài)宿主細(xì)胞，如大腸桿菌AG1或JM109細(xì)胞而用于酶表達(dá)和酶活性分析。通過(guò)在LB/Amp瓊脂板上選擇性培養(yǎng)而鑒定含有質(zhì)粒的克隆。用牙簽將單菌落轉(zhuǎn)移到含有選擇培養(yǎng)基的96孔平板的小孔中并于37℃孵育～8-12小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。在最初的培養(yǎng)期后，復(fù)制平板并擴(kuò)增，且按下面部分所述測(cè)定其單個(gè)克隆的脫鹵素酶活性。通過(guò)檢測(cè)pH變化而測(cè)定RDhl酶活性的方法通過(guò)測(cè)定由于此酶在對(duì)底物脫鹵素中作用而導(dǎo)致的pH變化測(cè)定RDhl酶的活性。在加入pH指示劑、緩沖液和底物之前將表達(dá)該酶的原核宿主細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中、定量并且透化。
96孔微量培養(yǎng)板的每孔中加入200μL補(bǔ)充了約50-100μg/ml氨芐青霉素(“SOB/Amp”)的SOB培養(yǎng)基(獲自Difco，Detroit，MI，美國(guó))。將來(lái)自產(chǎn)生酶大腸桿菌克隆的單菌落的細(xì)胞接種到該平板的一個(gè)孔中。當(dāng)檢測(cè)rRDhl酶或rRDHL融合蛋白文庫(kù)時(shí)，每孔接種來(lái)自不同大腸桿菌克隆的細(xì)胞。6個(gè)孔沒(méi)有加入細(xì)胞而用作陰性對(duì)照并且6個(gè)其它孔接種產(chǎn)生野生RDhl酶的大腸桿菌克隆作為陽(yáng)性對(duì)照。接種物在Psycrotherm爐中于37℃孵育過(guò)夜同時(shí)以250rpm振蕩。
孵育后，通過(guò)加入IPTG至1mM的終濃度，然后再在Psycrotherm爐中于37℃孵育5小時(shí)并同時(shí)以150rpm振蕩而誘導(dǎo)培養(yǎng)物。孵育5小時(shí)后，用1.573 Vmax/Kinetic微平板計(jì)數(shù)器(Molecular Derices，Sunnyvale，CA，美國(guó))而測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度。然后將每種誘導(dǎo)培養(yǎng)物的20μL等份加入到新鮮96孔板的小孔中并且將2.2μL pH8.0的10×透化緩沖液(10mM脫氧膽酸鈉，1％NP-40，50mMTris和50mM EDTA)加入到每等份中去，然后以適中的振蕩速度振蕩3-5分鐘。然后每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物等份中加入200μL含有5mMCAPSO和100μM甲酚紫的DCB-飽和的pH 9.2-9.5的緩沖液(＞1μLDCB/mL緩沖系統(tǒng))。用Spectro Max Plus微量培養(yǎng)板計(jì)數(shù)器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，美國(guó))測(cè)定指示劑形成的顏色變化并且繪制顏色變化的斜率以外推起始酶的活性。實(shí)施例1脫鹵素酶從紅球菌中的分離按美國(guó)專(zhuān)利No.5,372,944中所述培養(yǎng)紅球菌種類(lèi)ATCC 55388。按美國(guó)專(zhuān)利No.5,373,944中大致所述通過(guò)以下方法從該培養(yǎng)物中制備酶提取物，包括采用25％-75％硫酸銨截流，2個(gè)離子交換層析步驟(1.DEAE-交聯(lián)葡聚糖；2.DEAE-聚丙烯酰胺葡聚糖)，(其中的鹽濃度以梯度的形式在0-400毫摩爾硫酸鈉范圍內(nèi)變化)，用交聯(lián)葡聚糖G-75的凝膠過(guò)濾層析且然后通過(guò)超濾濃縮以獲得通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺分析而含有大于65％脫鹵素酶的酶制品。
將(～25mg)的純化酶進(jìn)行溴化氰消化。以0-80％乙腈/含有0.1％三氟乙酸的水梯度用RP-8 Macrosphere(Altech)混合方式的陽(yáng)離柱分離肽片段。
用自動(dòng)的Edman降解將三種純化蛋白和純化的溴化氰(CnBr)片段進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定N-末端和三個(gè)CnBr片段的序列。其中一個(gè)CnBr片段與該N-末端序列相同。其它兩個(gè)相應(yīng)于獨(dú)特的內(nèi)部脫鹵素酶序列。所有肽的序列顯示于表1中。
表1純化紅球菌脫氫酶的N-末端和蛋白水解片段的序列
DNA引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物RDhl 5.4和RDhl 3.12從而使擴(kuò)增并克隆編碼紅球菌脫鹵素酶(RDhl)基因的開(kāi)放閱讀框到表達(dá)系統(tǒng)pEXPROK中。RDhl5.4的序列來(lái)自該蛋白的N-末端序列而RDhl 3.12是基于實(shí)際的DNA序列而設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)引物RDhl 5.7和RDhl 3.13從而產(chǎn)生RDhl基因于表達(dá)系統(tǒng)pRSET和TrcHis中。設(shè)計(jì)引物Trx2++和Trx-以產(chǎn)生RDhl基因于表達(dá)系統(tǒng)pTrxFus中。這些寡核苷酸引物的序列如下表2用于克隆紅球菌脫鹵素酶中的寡核苷酸引物的序列和方向<
Bio＝生物素；N＝A，C，G或T；()＝在給定位置一定的堿基半余，下劃線(xiàn)序列相應(yīng)于欲向擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物中導(dǎo)入與欲克隆載體(pEXPROK)相容的限制位點(diǎn)的5′序列。部分的紅球菌脫鹵素酶基因的克隆按下述通過(guò)從基因組DNA文庫(kù)中的擴(kuò)增而完成紅球菌脫鹵素酶基因的克隆。用P.J.Asturias和K.Timmis的方法(細(xì)菌學(xué)雜志1754631-4640(1993))從紅球菌ATCC菌株5538中分離基因組DNA。將純化的基因組DNA(100μg)機(jī)械打斷成＜10kbp的平均大小。將這些片段連接到BamHI接頭上，然而用BamHI消化并連接入BamHI消化的噬菌體λ-ZAP ExpressTMDNA(獲自Stratagene公司，LaJolla，CA，美國(guó))的制品中。商業(yè)制備含有基因組紅球菌DNA片段的文庫(kù)(Stratagene公司，LaJolla，CA)并且以1×104pfu/μL(蝕斑形成單位/微升)供應(yīng)。用固相亞磷酰胺化學(xué)合成相應(yīng)于N-末端序列氨基酸6-13密碼子的半余DNA引物(RDhl 5.4)并通過(guò)HPLC純化(表2)。
將RDhl 5.4引物與識(shí)別T3噬菌體啟動(dòng)子序列(并且位于λZAPExprexxTM載體內(nèi)部)的商業(yè)上可得到引物聯(lián)合使用從而從單個(gè)擴(kuò)增的基因組DNA噬菌體文庫(kù)中擴(kuò)增脫鹵素酶基因。用含有1μM RDhl 5.4引物、100nm生物素化的T3 Pro引物(New England Biolabs)，10×Amplitaq反應(yīng)緩沖液(Perkin-Elmer-Cetus)、1.5mM MgCl2、5U rAmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer-Cetus)和4μL噬菌體文庫(kù)(完整噬菌體)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(50μL)完成擴(kuò)增。用下面的加熱方式進(jìn)行35輪擴(kuò)增94℃ 1分鐘；55℃ 2分鐘；72℃ 2分鐘。通過(guò)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物并且鑒定1.3kb的分離帶，從凝膠中切下(條帶)并且用QiaQnick凝膠純化試劑盒(Qiagen公司)分離。確定此DNA也能夠由其它紅球菌脫鹵素酶特異性引物擴(kuò)增后，用限制酶NcoI和PstI消化此片段并連接入NcoI/PstI消化的pGEM52f(+)(ProMega，Madison，WI)。對(duì)該克隆片段的3′-非翻譯區(qū)的測(cè)序使得能夠鑒定推斷的終止密碼子和隨后用引物RDhl 5.4和RDhl 3.12對(duì)該編碼區(qū)的擴(kuò)增。
序列和限制酶分析根據(jù)前面的測(cè)序結(jié)果而對(duì)每連續(xù)輪設(shè)計(jì)的生物素化引物(表3)通過(guò)連續(xù)多輪的雙脫氧方法對(duì)脫鹵素酶基因進(jìn)行雙鏈測(cè)序。條帶于5.5-6.0％聚丙烯酰胺尿素測(cè)序膠中分離，并通過(guò)毛細(xì)轉(zhuǎn)移將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上并用眾所周知的鏈親和素-堿性磷酸酶顯色方法再聯(lián)合化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行觀(guān)察。表3用于測(cè)序紅球菌脫鹵素酶基因中寡核苷酸引物的序列與方向
*Bio＝生物素；N＝A，C，G或T；()＝給定位置一定的堿基半余。不包括已在表2中描述過(guò)的同時(shí)用于測(cè)定該基因序列的生物素化引物。也使用了T3、T7和SP6啟動(dòng)子特異性的商業(yè)上可得到的(New England Biolads)生物素化引物但沒(méi)有在此列出。
載體pEXPROK(圖1)為商業(yè)上可得到的pPROK-1載體(Clontech公司，Mountain View，CA)的衍生物。而pEXPROK具有pPROK載體的功能元件(包括氨芐青霉素抗性標(biāo)記、Ptac轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和多接頭后部的成對(duì)的(paired)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào))，pEXPROK載體用延伸的稱(chēng)為EXFLAG的合成多接頭代替pPROK-1的EcoRI-到-HindIII多接頭。設(shè)計(jì)EXFLAG接頭從而在NcoI位點(diǎn)與NheI位點(diǎn)之間插入開(kāi)放閱讀框。具有六-核苷酸NheI位點(diǎn)的框內(nèi)為11氨基酸肽，其中的最后八肽相應(yīng)于眾所周知的FLAG肽(柯達(dá)成像系統(tǒng)，Rochester，紐約)，針對(duì)其抗體和親和試劑在商業(yè)上是可得到的。EXFLAG接頭的序列與特征如下EcoR INco IHind IIIXba IXho I Nhe I I-----EXFLAG
用引物RDhl 5.4和RDhl 3.12從pGEM5構(gòu)建體中PCR擴(kuò)增RDhl5.4/T3 Pro基因，然后由NcoI和NheI消化從而將紅球菌脫鹵素酶基因連接入適當(dāng)消化的表達(dá)載體中。此方法用于將RDhl基因插入pEXPROK中。pEXPROK和pEXPROK-RDhl的質(zhì)粒圖譜分別示于圖1和3中。然后通過(guò)自動(dòng)DNA測(cè)序證實(shí)pEXPROK-RDhl構(gòu)建體的DNA序列。
序列分析脫鹵素酶基因的完整DNA和得到的蛋白序列示于圖2中。DNA序列數(shù)據(jù)顯示出876bp的開(kāi)放閱讀框，得到292個(gè)氨基酸的推導(dǎo)的蛋白序列和33kD的預(yù)期分子量。這類(lèi)似于報(bào)道的眾多其它水解脫鹵素酶的分子量。
為了測(cè)定是否該分離的基因有可能編碼脫鹵素酶，用MacVectorv.4.5.2(柯達(dá)公司)序列分析軟件包比較該得到的蛋白序列與Entrez序列數(shù)據(jù)庫(kù)(該數(shù)據(jù)庫(kù)由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心維持)中含有的其它已知蛋白的序列。RDhl多肽顯示出與包括數(shù)種鹵代鏈烷和鹵代酸水解酶家族脫鹵素酶、環(huán)氧化物水解酶的所謂α/β具有多種不同催化功能酶成員間最大的相似性。Dow紅球菌脫鹵素酶與兩種其它脫鹵素酶和非-脫鹵素酶(螢光素單加氧酶)的序列比較示于圖4中。包括在圖中的酶及其公開(kāi)文獻(xiàn)如下自養(yǎng)黃色桿菌鹵代鏈烷脫鹵素酶D.B.Janssen，等.，細(xì)菌學(xué)雜志1716791-6799(1989)；四氯環(huán)己二烯水解酶(TCCH或LinB)-Y.Nagata，等.，細(xì)菌學(xué)雜志175(20)6403-6410(1993)；Renilla reniformis螢光素單加氧酶-W.W.Lorenz，等.，美國(guó)自然科學(xué)院院報(bào)88(10)4438-4442(1992)。Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)最新發(fā)布的詞條也顯示出Dow RDhl蛋白與2種未知功能的假定的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)蛋白(由K.Badcock和C.M.Churcher等分別于7-22-96和7-23-96提交的Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)許可號(hào)1449324和1478233)以及紫紅紅球菌中分離的鹵代鏈烷脫鹵素酶(由A.N.Kulakova等于2-15-96提交的Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)許可號(hào)1196824)之間顯著的相似性。
在圖4中比較的序列中，僅僅黃色桿菌脫鹵素酶在結(jié)構(gòu)與機(jī)理水平上進(jìn)行了充分的特征分析。顯然，已知直接參與黃色桿菌催化循環(huán)的三個(gè)殘基中的2個(gè)(2個(gè)最為重要的殘基，Asp-124和His-289)在紅球菌序列中是保守的。這些相似性及圖中所示的相似性表明在該家族蛋白成員間高度的結(jié)構(gòu)與機(jī)理保守性。脫鹵素酶蛋白表達(dá)為了證實(shí)上述克隆的脫鹵素酶的特性，我們力求在大腸桿菌中表達(dá)此全長(zhǎng)蛋白。為了完成此操作，從pRDhIKO 2.1-pGEM5構(gòu)建體中切下含有RDhl基因的1300bp的NcoI/SpeI限制片段并且與NcoI/NheI-消化的pEXPROK載體連接。因?yàn)镾peI和NheI產(chǎn)生與連接相容性的限制性片段，這樣導(dǎo)致產(chǎn)生含有在IPTG可誘導(dǎo)的Ptac啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下及內(nèi)源性RDhl 3′非翻譯區(qū)終止控制下的完整推斷RDhl基因的表達(dá)構(gòu)建體(圖5)。
將以該得到質(zhì)粒(pRDhIKO 2.3-EXPROK)轉(zhuǎn)化的菌落于2mL微培養(yǎng)瓶(miniculture)中培養(yǎng)過(guò)夜，然后沉淀，清洗并超聲處理1mL的每種培養(yǎng)物。然后測(cè)定提取物在加入RDhl底物，1-氯丁烷后催化氯化物釋放的能力。在不含該克隆基因的培養(yǎng)物中缺失氯化物釋放活性；具有該克隆基因的培養(yǎng)物顯示出氯化物釋放活性，當(dāng)該基因的轉(zhuǎn)錄活性通過(guò)添加IPTG而增加時(shí)該活性增加。因此，在含有pRDhIKO2.3-pEXPROK構(gòu)建體的重組大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物中可誘導(dǎo)脫鹵素酶活性。實(shí)施例2編碼此脫鹵素酶的基因已被分離并克隆入細(xì)菌大腸桿菌中。DNA序列分析顯示此分離的基因編碼與其它已知脫鹵素酶具有高度序列相似性的蛋白。為了增加生物合成水平至商業(yè)上有意義的水平(即“表達(dá)”)，檢測(cè)了眾多報(bào)道能夠在大腸桿菌中高水平制備異源蛋白的系統(tǒng)。
為了構(gòu)建表達(dá)載體pEXPROK-RDhl，用限制酶NcoI/NheI消化質(zhì)粒pEXPROK且然后用QIAqmick凝膠提取試劑盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)加以純化。用引物RDHL 5.4作為正向引物(含有NcoI位點(diǎn)以指導(dǎo)翻譯起始)并且用引物RDHL作為反向引物(且含有NheI位點(diǎn))擴(kuò)增RDhl開(kāi)放閱讀框。用NcoI和NheI消化擴(kuò)增的DNA后，將該基因連接入pEXPROK載體中。然后將新的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌AG1感受態(tài)細(xì)胞并挑取氨芐青霉素抗性的菌落。通過(guò)分析性的限制酶消化鑒定含有RDhl基因的質(zhì)粒并稱(chēng)為pEXPROK-RDhl構(gòu)建體。pEXPROK-RDhl質(zhì)粒圖譜示于圖3中。pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl表達(dá)載體的構(gòu)建為了構(gòu)建pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl表達(dá)載體，用寡核苷酸引物RDhl 5.4和RDhl 3.13以標(biāo)準(zhǔn)的PCR條件從pEXPROK-Rdhl中擴(kuò)增RDhl基因。擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上分離并用標(biāo)準(zhǔn)的方法加以純化。
pRSET和pTrcHis載體均為來(lái)自克隆載體pUC18和19系列的IPTG可誘導(dǎo)的表達(dá)載體。它們均購(gòu)自Invitrogen公司(圣地亞哥，加州)并含有下面的特征(a)兩者均設(shè)計(jì)用于高水平蛋白表達(dá)并且均具有氨芐青霉素抗性基因。
(b)兩者均含有編碼六個(gè)組氨酸殘基N-末端融合肽的序列。這些殘基作為金屬結(jié)合區(qū)而起作用并且可允許以后通過(guò)親和層析而純化重組蛋白。
(c)這些載體編碼位于脫鹵素酶編碼區(qū)域下游的腸激酶切割識(shí)別序列(FLAG和/或EXFLAG肽)，它們使其能夠通過(guò)抗-FLAG抗體加以檢測(cè)和固定。
pRSET載體的高水平表達(dá)特性是由于在該異源基因的上游存在T7啟動(dòng)子。由于大腸桿菌不含有T7聚合酶，然而，需要含有T7 RNA聚合酶基因的M13噬菌體用于蛋白表達(dá)。實(shí)際上，通過(guò)以含有T7 RNA聚合酶的T7噬菌體感染重組大腸桿菌而引入含有在T7啟動(dòng)子控制下異源基因的細(xì)菌來(lái)制備該異源蛋白。作為選擇，商業(yè)上可得到的穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶(即，BL21)的大腸桿菌可用pRSET構(gòu)建體加以轉(zhuǎn)化。
通過(guò)用限制性酶NcoI/HindIII消化質(zhì)粒pRSET且然后摻入在5′端含有NcoI位點(diǎn)且在3′端含有HindIII位點(diǎn)的RDhl基因片段而構(gòu)建pRSET-RDhl表達(dá)載體。然后將此新構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞并挑取氨芐青霉素抗性的菌落。通過(guò)分析性的限制酶消化鑒定含有RDhl基因的質(zhì)粒并稱(chēng)為pRSET-RDhl構(gòu)建體。pRSET-RDhl表達(dá)構(gòu)建體示于圖6中。將一個(gè)這樣的克隆(克隆16-4)用于對(duì)用該pRSET系統(tǒng)的蛋白表達(dá)進(jìn)行特征分析。
pTrcHis載體含有另一種高水平轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子-trc啟動(dòng)子，為詳細(xì)分析過(guò)trp啟動(dòng)子與lac啟動(dòng)子的融合。pTrcHis載體也含有位于此異源基因上游的小順?lè)醋?mini-cistron)，這使得多克隆位點(diǎn)中克隆蛋白高度有效而反復(fù)地起始翻譯。
用類(lèi)似的方法，我們將RDhl基因片段克隆入pTrcHis載體從而構(gòu)建pTrcHis-RDhl表達(dá)載體。為了表達(dá)研究，將大腸桿菌TOP 10′感受態(tài)細(xì)胞用pTrcHis新構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl表達(dá)載體均含有位于NheI位點(diǎn)下游的11氨基酸EXFLAG肽。
EXFLAG肽序列與此克隆蛋白的開(kāi)放閱讀框一致并對(duì)于分析檢測(cè)和親和純化是有用的。圖7顯示完整pTrcHis-RDhl表達(dá)構(gòu)建體的圖譜。其中一個(gè)這樣的克隆(克隆18-3)被鑒定為高表達(dá)克隆并用于對(duì)TrcHis表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)一步特征分析。pTrxFus-RDhl表達(dá)載體的構(gòu)建Thio FusionTM表達(dá)系統(tǒng)( Invitrogen公司，圣地亞哥，加州)通過(guò)將編碼這樣蛋白的基因融合到編碼大腸桿菌蛋白，硫氧環(huán)蛋白的基因上而提供在pTrxFus表達(dá)載體中表達(dá)大量異源蛋白的方法。此硫氧環(huán)蛋白部分可賦予其融合部分的溶解性及熱穩(wěn)定性，因而開(kāi)啟了用于通過(guò)滲透在休克或加熱處理而純化的方法。該表達(dá)載體，pTrxFus允許外源基因插入其多克隆位點(diǎn)中。其利用噬菌體λ的PL啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)以及同樣來(lái)自噬菌體λ的cl阻遏子控制轉(zhuǎn)錄的水平。cl阻遏子基因的表達(dá)在trp啟動(dòng)子及阻遏子蛋白的控制下。通過(guò)加入色氨酸至培養(yǎng)基中而切斷cl阻遏子的合成并且允許從PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。
設(shè)計(jì)引物Trx2++和Trx-(見(jiàn)DNA引物設(shè)計(jì))以修飾具有TrxFus多克隆位點(diǎn)獨(dú)有的酶限制位點(diǎn)的RDhl基因片段。將質(zhì)粒pEXPROK-RDhl用作模板并且通過(guò)用在5′端加入BamHI位點(diǎn)和3′端加入PstI位點(diǎn)的引物Trx2++和Trx-進(jìn)行PCR產(chǎn)生基因片段。用QIAquick PCR純化試劑盒純化此片段。將pTrxFus載體和基因片段進(jìn)行酶消化、瓊脂糖凝膠純化并連接。將新構(gòu)建體，pTrxFus-RDhl(圖8)摻入根據(jù)制造商說(shuō)明制備的GL174電感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen公司)。表達(dá)分析細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)與誘導(dǎo)-為了表達(dá)研究，將鑒定為含有適當(dāng)DNA構(gòu)建體的克隆培養(yǎng)于15mL圓底聚丙烯培養(yǎng)管中含有50μg/mL氨芐青霉素的3mL Luria培養(yǎng)基(LB)或SOB培養(yǎng)基(Difco，Detroit，MI，美國(guó))中。將這些培養(yǎng)管于37℃振蕩(于旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)中200轉(zhuǎn)/分鐘)孵育過(guò)夜或培養(yǎng)至OD600為0.6。之后，加入2mL具有IPTG的新鮮培養(yǎng)基中(至1mM的IPTG終濃度)并將培養(yǎng)管于37℃再次恒定振蕩4-5小時(shí)進(jìn)行孵育。為了重組克隆pRSET，在IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)后將細(xì)胞培養(yǎng)物用預(yù)先滴定的M13/T7噬菌體感染并按前述繼續(xù)誘導(dǎo)。
至于pTrxFus的克隆，將含有RDhl基因的克隆培養(yǎng)于具有100μg/mL氨芐青霉素的1mL RM培養(yǎng)基中并且于37℃振蕩(于旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)中200轉(zhuǎn)/分鐘)孵育過(guò)夜。第二天，加入9mL新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基并于30℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD550為0.5。然后，用色氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物(至100μg/mL的終濃度)并轉(zhuǎn)入37℃的培養(yǎng)箱中且再以200rpm振蕩2到4小時(shí)。
無(wú)細(xì)胞提取物的制備為了蛋白分析，通過(guò)于4℃離心(在SorvallSS-34轉(zhuǎn)頭中5000rpm10分鐘)而沉淀誘導(dǎo)的過(guò)夜細(xì)胞培養(yǎng)物。在含有1mM EDTA二鈉的冷的10mM Tris硫酸鹽緩沖液(pH 7.5)中清洗細(xì)胞沉淀且然后再次離心。對(duì)于pEXPROK、pRSET和pTrcHis克隆，最終的懸液用小尖端超聲處理探測(cè)器(small-tip sonicatingprobe)(Soniprep 150，MSE公司.，Crawley，Sussex)以14Hz在冰上經(jīng)過(guò)20秒“開(kāi)”，30秒“關(guān)”的3次重復(fù)進(jìn)行超聲處理。通過(guò)以10,000rpm離心10分鐘去除不溶性殘?jiān)?。然后將無(wú)細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至干凈的聚丙烯管中并進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治?。將pTrxFus克隆的最終細(xì)胞懸液超聲處理3次10-秒噴射(brust)且然后于干燥的冰/乙醇浴中快速冰凍。冰凍后不久，于37℃快速融化細(xì)胞裂解物并且再進(jìn)行2次快速的超聲處理-凍-融循環(huán)。最后一次融化后，繼續(xù)上述去除細(xì)胞及不溶性殘?jiān)牟襟E。pEXPROK-RDhl的表達(dá)與純化圖9的左側(cè)(2-5道)顯示pEXPROK-RDhl克隆12-4細(xì)胞裂解樣品的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝膠并且于右側(cè)(8-11道)顯示部分純化的rRDhl酶的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝膠。1道含有分子量標(biāo)準(zhǔn)且6道和7道含有單個(gè)60ng和180ng 55kD分子量的FLAG-肽蛋白條帶。2-5道顯示來(lái)自無(wú)細(xì)胞提取物的所有可溶性蛋白。由于rRDhl酶不是提取物中的主要蛋白，對(duì)相同凝膠進(jìn)行免疫印跡以確證此重組酶的存在。圖10顯示在每個(gè)樣品道中由抗-FLAG抗體在預(yù)計(jì)分子量～35kD所識(shí)別的該重組酶條帶。圖10中的6道和7道分別為20ng和60ng的FLAG-肽蛋白。在Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝膠和免疫印跡膜上分析親和純化的重組酶。將四種親和-純化rRDhl酶的連續(xù)餾份在圖10中所示的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝膠中8-11道走膠。除了位于～35kD分子量的明顯條帶外，該凝膠上其它蛋白條帶也是可見(jiàn)的。然而，部分純化酶(圖10，8-11道)的免疫印跡證實(shí)在～35kD的重組酶是唯一用抗-FLAG抗體染色的蛋白并且因此似乎為正確翻譯的rRDhl蛋白。此數(shù)據(jù)表明rRDhl酶在大腸桿菌胞內(nèi)環(huán)境中及整個(gè)純化過(guò)程中均可染色。pRSET-RDhl和pTrcHis-RDhl的表達(dá)分析獲自pRSET重組酶表達(dá)系統(tǒng)和pTrcHis重組酶表達(dá)系統(tǒng)克隆的無(wú)細(xì)胞提取物中重組RDhl蛋白的存在。簽定到含有正確大小NcoI/HindIII DNA片段的5個(gè)克隆，培養(yǎng)過(guò)夜、裂解并通過(guò)SDS-PAGE凝膠分析rRDhl的表達(dá)(圖11)。1道顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)且7和8道含有單個(gè)60ng及180ng 55kD分子量的FLAG-肽蛋白條帶。2-6道顯示此5個(gè)克隆的1μL無(wú)細(xì)胞提取物樣品且9-12道顯示0.1μL的無(wú)細(xì)胞提取物樣品。當(dāng)抗-FLAG抗體用于染色此免疫印跡(圖12)時(shí)，這些提取物的免疫印跡顯示出2條帶(35kD和38kD)。這可能表明在pRSET-RDhl系統(tǒng)中有2個(gè)起始密碼子。第一個(gè)起始密碼子最初設(shè)計(jì)位于pRSET載體系統(tǒng)中實(shí)際克隆位點(diǎn)之前的大約41個(gè)氨基酸(123bp)，這使得從6個(gè)組氨酸后的Met ATG密碼子開(kāi)始翻譯。第二個(gè)起始密碼子可能位于NcoI克隆位點(diǎn)本身上，其被設(shè)計(jì)位于RDhl基因片段最初的5′端引物中。然而，抗-FLAG抗體反應(yīng)條帶的存在證實(shí)了rRDhl酶的存在。
圖13顯示來(lái)自pTrcHis系統(tǒng)無(wú)細(xì)胞提取物的Pro-BlueTM染色的SDS-PAGE凝膠并且圖14顯示相同SDS-PAGE凝膠的免疫印跡。pTrcHis系統(tǒng)的所有克隆在～35kD分子量處顯示出過(guò)載的抗-FLAG反應(yīng)的條帶，其證實(shí)該提取物中rRDhl酶的存在。由于最初培養(yǎng)物的體積和無(wú)-細(xì)胞提取物制品在所有三個(gè)系統(tǒng)中是相同的，所以這些過(guò)載的條帶顯示在pTrcHis系統(tǒng)中有更高的酶產(chǎn)量。pTrxFus-RDhl的表達(dá)用還原性SDS-PAGE檢測(cè)pTrxFus系統(tǒng)的細(xì)胞提取物可溶性蛋白。圖15顯示以Pro-BlueTM染色的凝膠。12道顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)且11道顯示單個(gè)150ng的55kD分子量和FLAG-肽蛋白。在1道至9道中于47kD分子量處清晰可見(jiàn)硫氧環(huán)蛋白融合條帶的主要蛋白。此大小相應(yīng)于12kD的硫氧環(huán)蛋白和35kD的rRDhl酶。相反，10道具有來(lái)自細(xì)胞裂解不溶性物質(zhì)的樣品，這顯示不存在高水平表達(dá)的硫氧環(huán)融合蛋白。這證實(shí)所有的融合蛋白均為可溶性狀態(tài)。來(lái)自其它實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示此融合蛋白條帶在免疫印跡膜中相同的分子量處可由抗-FLAG抗體所識(shí)別(數(shù)據(jù)未顯示)。水解脫鹵素活性的分析為了定量該重組酶的水解脫氯化反應(yīng)活性，使用了460nm處的氯化物釋放比色分析。
通過(guò)加入適當(dāng)量的無(wú)細(xì)胞提取物(按上述制備)至玻璃瓶中6.0mL的反應(yīng)緩沖液中而測(cè)定重組蛋白的活性。100mM甘氨酸鈉緩沖液(pH9.0)用于測(cè)定對(duì)1，4-二氯丁烷(DCB)(Aldrich化學(xué)公司)的活性并且100mM Tris-SO4緩沖液(pH 7.0)用于測(cè)定對(duì)1，2，3-三氯丙烷(TCP)的活性。加入鹵化的底物(6μL)和微攪拌棒并封閉小瓶。將封口的小瓶于30℃水浴中攪拌孵育。
每間隔一定時(shí)間取出1.0mL樣品并用于自由氯化物的測(cè)定。加入試劑1，5-25N高氯酸中0.375M硝酸鐵(10％v/v)以終止水解反應(yīng)并且加入試劑2，乙醇中的飽和硫氰酸汞(10％v/v)以顯色。于460nm處在Perkin-Elmer 552A UV/VIS分光光度計(jì)計(jì)數(shù)最終樣品。在校正對(duì)空白的非酶性水解后測(cè)定比率(rates)重組紅球菌脫鹵素酶的脫鹵素活性盡管前面的數(shù)據(jù)表明與野生型紅球菌相比，該重組脫鹵素酶可以高得多的水平在大腸桿菌中合成，但它們沒(méi)有說(shuō)明此表達(dá)蛋白的活性。的確，增強(qiáng)脫鹵素酶的產(chǎn)量是本工作的關(guān)鍵目的。簽于此原因，我們測(cè)定了上述每種構(gòu)建體代表性克隆中脫鹵素酶活性的相對(duì)水平。活性通過(guò)自由氯化物釋放分析加以測(cè)定并與圖13-15中記錄的蛋白表達(dá)作比較。蛋白表達(dá)通過(guò)高分辨率掃描光密度儀在SDS-PAGE凝膠上加以定量并且測(cè)得的rRDhl的量以總可溶性蛋白％來(lái)表示。下表顯示在所有四種表達(dá)系統(tǒng)中的總可溶性蛋白中脫鹵素活性與rRDhl酶百分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。<
>*DCB單位測(cè)定為該酶脫鹵素1，4-二氯丁烷時(shí)指示劑顏色改變的程度(ΔOD/min)。
該數(shù)據(jù)顯示rRDhl蛋白表達(dá)與觀(guān)察到的脫鹵素酶活性間強(qiáng)烈的相互關(guān)系。
在此實(shí)施例中，紅球菌鹵代鏈烷脫鹵素酶可以高水平在檢測(cè)的大腸桿菌4種系統(tǒng)中的3種中表達(dá)。重組的紅球菌脫鹵素酶在所有4種系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)并且在預(yù)期的分子量處由抗-FLAG抗體所識(shí)別。此重組酶顯示出與野生型脫鹵素酶類(lèi)似的活性水平以及與異源蛋白表達(dá)成比例的活性水平。實(shí)施例3多孔氧化鋁支持物的制備將代表22TCP活性單位的蛋白(385mg)于4℃在溫和攪拌下固定于2.0g自由揮發(fā)的氧化鋁(美國(guó)，IL，DesPlaines UOP的lot#1587k-4氧化鋁)上。方法按照GIA-活化的UOP標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，包括聚乙烯亞胺包被，水清洗和酶的加入。輕輕倒掉浸泡液并用2mM Tris/1mMEDTA，(pH 7.5)清洗支持物5次。用于固定的酶純化及制品用pTrcHis表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中制備重組紅球菌脫鹵素酶。用于所有固定研究的酶制品首先用4℃ 45％到70％飽和度的硫酸銨沉淀部分純化，然后于10mM Tris硫酸鹽，1mM EDTA(pH 7.5)中透析和澄清.此堿性緩沖液用于整個(gè)純化步驟中。通過(guò)280nm處吸光度測(cè)得這些制品從裂解液中常規(guī)被純化4-5倍，并且通過(guò)SDS-PAGE估計(jì)為30-35％純度的脫鹵素酶蛋白。通過(guò)用0-400mM硫酸銨梯度洗脫的再一次DEAE-瓊脂糖層析步驟得到更為高度純化的酶制品。這樣得到了具有85-90％酶活性大約從裂解液中10倍的純化。該步驟后用更窄的0-120mM硫酸銨梯度進(jìn)行QAE-瓊脂糖(Sepharose)FF層析，得到從裂解液約12-倍的純化，并進(jìn)行SDS-PAGE以證明酶的均一性。從TrcHis RDhl表達(dá)系統(tǒng)中純化的RDhl一般在此稱(chēng)為“rRDhl”、支持物的制備將所有陰離子交換支持物根據(jù)制造商說(shuō)明徹底水合(如果必要)，然后徹底沖洗以去除乙醇并通過(guò)以10mM Tris硫酸鹽1mM EDTA連續(xù)沖洗而轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩猁}形式。整個(gè)過(guò)程使用此相同的起始緩沖液以上樣酶制品。
根據(jù)已很好建立的方法(美國(guó)專(zhuān)利No.4,268,410和Mosbach，固定化酶，于44酶學(xué)方法(1976)(學(xué)術(shù)出版社，紐約))用聚乙烯亞胺和戊二醛修飾無(wú)機(jī)支持物。秤量干燥的支持物樣品并分散于12mL的加蓋小瓶中。加入2.5％聚乙烯亞胺水溶液至總的每克支持物10mL。將瓶封閉且然后于室溫在搖動(dòng)的搖瓶機(jī)上輕輕攪動(dòng)1小時(shí)。將樣品轉(zhuǎn)移至輕輕真空去除液體的小的布氏漏斗中。將支持物轉(zhuǎn)移至玻璃皿中并讓其于室溫空氣干燥過(guò)夜(約18個(gè)小時(shí))。將樣品轉(zhuǎn)移至其中以每克(gm)支持物20mL的比例加入新鮮融化的25％戊二醛水溶液的新小瓶中。將混合物封閉且然后于布兜(hood)中不停振蕩1小時(shí)。輕輕倒去戊二醛并用水徹底沖洗直到品紅試驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到醛為止。在酶固定之前，輕輕倒出支持物但不讓其干燥。酶的固定所有的酶固定于冷的4℃室溫用搖動(dòng)的搖瓶機(jī)進(jìn)行以提供緩慢的攪動(dòng)。用于酶制品結(jié)合到支持物上的時(shí)間為從用于離子-交換支持物的1小時(shí)到用于以PEI-GIA修飾無(wú)機(jī)支持物實(shí)驗(yàn)的最大為4天的范圍。緩沖液更換僅僅用于Celite R648結(jié)合能力研究，其中的Tris緩沖液在預(yù)裝的交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-25柱上更換以10mM磷酸鉀，1mM EDTA(pH 7.0)緩沖液。酶從離子交換支持物上的脫落將2套250μL等份的樹(shù)脂懸浮液(slurry)與酶11.1 DCB U(Toyopearl)或6.63 DCB U(PEI Cellulose)結(jié)合過(guò)夜。小心去除結(jié)合上清液并加以分析。將樹(shù)脂于6,000rpm離心8分鐘。去除其它的上清液并用100mM甘氨酸鈉緩沖液(pH 9)清洗樹(shù)脂2次。將每套中的一管用0.5M(NH4)2SO4處理1小時(shí)從而使酶從支持物上脫落。再次用緩沖液沖洗這些樹(shù)脂。用DCB作為底物分析樹(shù)脂和上清液的活性。離子交換支持物陰離子交換層析已廣泛用于野生型和重組脫鹵素酶的純化及特征分析。該酶在中性pH(在其中進(jìn)行脫鹵素反應(yīng))時(shí)為陰離子性的并且陰離子交換支持物經(jīng)常在固定此類(lèi)蛋白中發(fā)揮良好功能。因?yàn)榇朔椒稍试S對(duì)酶進(jìn)行同時(shí)純化與固定，故其也是具有吸引力的，為了證實(shí)此潛在的用途，我們?cè)趶V泛的pH范圍內(nèi)檢測(cè)了rRDhl蛋白在陰離子與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上的結(jié)合與洗脫。圖2顯示在5個(gè)pH單位范圍中脫鹵素酶在DEAE瓊脂糖離子交換樹(shù)脂上幾乎定量的滯留。相反，CM-瓊脂糖在高于pH 5時(shí)迅速喪失其結(jié)合能力。固定檢測(cè)眾多支持材料固定rRDhl的效率。在這些研究中，使用脫鹵素酶40-70％硫酸銨截流的部分。制備固定于13種離子交換支持物中每種支持物上的兩套酶。立即用氯化物釋放分析測(cè)定每套酶中的其中一種酶的脫鹵素活性。將第二種酶用TCP-飽和的10mM Tris緩沖液(pH7.5)于45℃處理1小時(shí)。此處理后，去除上清液并也通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的氯化物方法測(cè)定該套酶。表4總結(jié)了這些測(cè)定的結(jié)果。表4在底物存在下于45℃孵育1小時(shí)后在13種離子交換支持上對(duì)TrcHis RDhl的篩選支持物 供應(yīng)商 Lot/批號(hào)# TCP處理后的活性％硅膠PE1-Silica Sigma 24H0810 0DEAE交聯(lián)葡聚糖A-50 Sigma 24H0485 19PE1纖維素(med.mesh)Sigma 94H7200 54Glass，氨丙基 Sigma 34H8260 43ToyopearlSuper Q-650M TosoHaas65QAM02RM 79DEAETrisacryl Plus-M Sigma 92H0861 21Spectra/凝膠離子交換1×8 Spectrum16865 14Dowex1×8-200離子交換樹(shù)脂 Aldrich 12627-85-954*DE52 Whatman 1152032 50季銨纖維素 Whatman 9852032 2DEAE瓊脂糖 Sigma 53H0177 30AG3×4 100-200 Bio-Rad 52594A18AG4×4 100-200 Bio-Rad 47426A9*于37C孵育這些結(jié)果顯示這些基質(zhì)作為脫鹵素酶支持物的效率具有顯著的差異性。類(lèi)似的差異性也將見(jiàn)于催化類(lèi)似反應(yīng)的類(lèi)似的脫鹵素酶。
篩選出四種最佳候選支持物在TCP存在下一定時(shí)間后仍具穩(wěn)定性。它們?yōu)镻EI纖維素、ToyopearlSuper Q-650M，GlassAminopropyl和DEAE Sepharose。制備2套，其中一套用于最初的氯化物檢測(cè)分析，另一套用于在暴露至TCP后的測(cè)定。表5顯示4個(gè)當(dāng)中的3個(gè)在頭24小時(shí)中丟失顯著的活性但在起始的(活性)丟失后維持穩(wěn)定的活性達(dá)至少7天。Toyopearl經(jīng)歷了類(lèi)似但延遲的丟失(于48-120小時(shí))并且然后似乎穩(wěn)定。表5于室溫中TCP存在于4種離子交換支持物上TrcHis RDHL的穩(wěn)定性研究支持物 經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后的活性％24hr48hr120hr192hrPE1 Cellulose(med.mesh)Sigma 83 79 78 78Glass，Aminopropyl Sigma 78 87 75 66ToyopearlSuper Q-650M TosoHaas 100 100 78 82DEAE Sepharose Sigma 76 79 73 62所有四種樹(shù)脂似乎均為固定脫鹵素酶的良好候選材料并且似乎提供用于延長(zhǎng)酶活性的合適表面。共價(jià)偶聯(lián)至Tresyl-活化的聚丙烯聚合物上為了測(cè)定經(jīng)突出氨基將rRDh1共價(jià)偶聯(lián)至任何支持物上的可行性，對(duì)Tresyl-Toyopearl進(jìn)行了評(píng)估。此活化的樹(shù)脂提供了與該酶間穩(wěn)定的伯氨基鍵
用于這些研究的rRDhl制品已用抗-FLAG抗體柱從大腸桿菌裂解液中得到親和純化并且通過(guò)SDS-PAGE估計(jì)約有20％的純度。在制造商描述的條件下將0.35單位的酶(1.96mg總蛋白)偶聯(lián)到40mgTresyl-Toyopearl上。3小時(shí)后，通過(guò)A280處觀(guān)察到(吸收)的下降測(cè)得93％的蛋白已被偶聯(lián)。再加入10mg樹(shù)脂并繼續(xù)偶聯(lián)1小時(shí)以結(jié)合＞98％的蛋白。重新測(cè)定清洗凝膠的脫鹵素酶活性顯示回收0.11單位的活性(31％)。用2.6單位相同酶制品和1.0gm活化樹(shù)脂的再次試驗(yàn)證實(shí)有37％活性的回收。根據(jù)制造商的說(shuō)明，從偶聯(lián)至該支持物酶的活性回收通常在40-60％的范圍，故31-37％代表合情合理的回收并且足以通過(guò)其氨基將該酶偶聯(lián)至固定支持材料而用于小規(guī)?；蚬I(yè)反應(yīng)器變成商業(yè)實(shí)踐。
親水樹(shù)脂的這種共價(jià)附著也是固定脫鹵素酶的有效方法。與戊二醛交聯(lián)的聚乙烯亞胺浸滲的無(wú)機(jī)支持物由于容易得到、價(jià)格低廉、高的上樣能力、再生與再利用的易行性以及廣泛的孔徑大小，故無(wú)機(jī)支持物也在工業(yè)酶領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)有廣泛的用途。多孔的氧化鋁、二氧化硅和Celite(硅藻土)作為固定化酶的支持物已發(fā)現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用，其中基于鈦和碳的支持物應(yīng)用較為有限。
可通過(guò)三種機(jī)制將酶固定于無(wú)機(jī)支持物上。該酶可經(jīng)離子相互作用與無(wú)機(jī)支持物結(jié)合或可經(jīng)離子-交換機(jī)制結(jié)合到已浸滲入無(wú)機(jī)支持物中的離子聚合物上，或者可用雙功能化學(xué)接頭交聯(lián)至離子聚合物上。第一種方法未見(jiàn)有廣泛的應(yīng)用因?yàn)槲⑷醯碾x子相互作用頻繁導(dǎo)致酶的沖洗掉。聚乙烯亞胺(PEI)由于其低廉的價(jià)格而成為浸滲的最佳聚合物。這些氨基要用到廣泛的交聯(lián)化學(xué)。戊二醛是研究得最多并且是所用的廉價(jià)交聯(lián)劑。對(duì)rRDhl的研究完全集中于此偶聯(lián)化學(xué)。
使用已確立的用于制備PEI-浸滲的多孔支持物然后戊二醛交聯(lián)的方法(美國(guó)專(zhuān)利No.4,268,410和Mosbach，于44酶學(xué)方法中的固定化酶，(1976)(學(xué)術(shù)出版社，紐約))。最初篩選2種支持物rRDhl活性的回收。已用PEI浸滲的多孔二氧化硅獲自Sigma(標(biāo)準(zhǔn)250孔徑大小)。Celite R-648獲自Manville(標(biāo)準(zhǔn)孔徑約150)并根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利No.4,268,410的方法用Sigma的PEI(平均50,000MW)浸滲。將兩種支持物均以戊二醛(GIA)處理且然后用水徹底清洗。將5.5單位(1.0mL，0.55mg蛋白/mL)高度純化的rRDhl酶制品(由SDS-PAGE(測(cè)定為)＞98％純度)用于偶聯(lián)至500mg每種以戊二醛處理，PEI浸滲的2種支持物上。此上樣水平(0.11％w/w)認(rèn)為比該支持物的已知上樣能力至少低2個(gè)數(shù)量級(jí)。在徹底清洗以去除未連接的蛋白之前，將該酶與支持物在4℃輕輕振蕩孵育過(guò)夜(18個(gè)小時(shí))、用DCB重新測(cè)定這兩種支持物證明PEI-Celite R-648有40％的回收且PEI-二氧化硅有31％的回收。在反應(yīng)條件(飽和DCB)下將這些樣品貯存于室溫1周并進(jìn)行再次測(cè)定。Celite固定的酶制品在1周中丟失49％的活性而二氧化硅固定的酶制品丟失其28％的活性。
為了快速測(cè)定哪一種類(lèi)型的無(wú)機(jī)支持物將得到rRDhl活性的最佳回收，篩選數(shù)種商業(yè)上可得到的多孔支持物，與在前面的實(shí)驗(yàn)中一樣，將高度純化rRDhl酶的上樣水平設(shè)定比該支持物預(yù)期的上樣能力低三個(gè)多數(shù)量級(jí)(0.0055％w/w)從而僅僅根據(jù)回收的活性比較支持物而依賴(lài)于上樣能力、孔徑大小等。
篩選出三種多孔的氧化鋁、三種多孔的二氧化硅及二種多孔的碳。此外，在相同條件下重新評(píng)估Sigma PEI-Silica和Celite R-648(在以前的篩選中評(píng)價(jià)過(guò))。與以前一樣用PEI浸潤(rùn)所有的支持物并以戊二醛處理。將25μL酶制品(13.8μg)與每種支持物于4℃輕輕攪動(dòng)孵育72小時(shí)從而確保最大的上樣。在洗浴液中酶的上樣通過(guò)測(cè)定24和72小時(shí)的A280而加以監(jiān)測(cè)。孵育72小時(shí)后在洗浴液(未結(jié)合的)及洗過(guò)的凝膠(結(jié)合的)上測(cè)定對(duì)DCB的活性。表6和7顯示這些研究的結(jié)果。
表6由A280監(jiān)測(cè)到的rRDhl酶向PFI-浸滲GIA處理的多孔支持物中的浸入支持物于24小時(shí)上樣的百分?jǐn)?shù) 于72小時(shí)上樣的百分?jǐn)?shù)氧化鋁-Davison Low SA 83％62％氧化鋁-Norton SA 6176 86％84％氧化鋁-Calcicat Type C 84％67％二氧化硅-Calcicat S-88-473 TypeA69％72％二氧化硅-Shell 5980-F 81％93％二氧化硅-Davison 952-08-5×91％92％碳-Borecker Subunit 77％91％碳-AmCy 5701-Sn 90％95％硅藻土-Manville R64882％95％PEI-二氧化硅-Sigma 85％93％表7在PEI-浸滲GIA處理支持物上酶活性的回收支持物 ％結(jié)合％未結(jié)合％丟失*氧化鋁-Davison Low SA7％ 38％55％氧化鋁-Norton SA 61763％ 17％80％氧化鋁-Calcicat Type C 7％ 34％59％二氧化硅-Calcicat S-88-473 TypeA 12％ 28％60％二氧化硅-Shell 5980-F12％ 8％ 80％二氧化硅-Davison 952-08-5× 17％ 11％72％碳-Borecker Subunit 5％ 9％ 86％碳-AmCy 5701-Sn 7％ 5％ 88％硅藻土-Manville R648 21％ 5％ 74％PEI-二氧化硅-Sigma 6％ 7％ 87％*％丟失＝100％-(％結(jié)合+％未結(jié)合)72小時(shí)后每種支持物顯示出62％到95％浸入范圍的不同浸入模式。對(duì)于大多數(shù)系統(tǒng)，72小時(shí)對(duì)于在4℃完成可完成蛋白的最大上樣是足夠的。然而，三種氧化鋁系統(tǒng)實(shí)際上在24小時(shí)表現(xiàn)出較72小時(shí)更大的浸入。與未處理可溶性酶對(duì)照相比，在72小時(shí)結(jié)合酶活性的回收為3％到21％的范圍。在所有檢測(cè)的系統(tǒng)中，有55％到87％的相當(dāng)多活性沒(méi)有被計(jì)算或“丟失”。同樣，以前用的支持物(Sigma PEI-Silica和Manville Celite R 648)顯示出更少的結(jié)合回收。這可能是由于用于該實(shí)驗(yàn)中較低的酶上樣比例或更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。如果有了此結(jié)合效率和該結(jié)合酶活性的回收，硅藻土、、二氧化硅、碳和氧化鋁均可用作本發(fā)明中有效的固定支持材料，雖然硅藻土和二氧化硅的表現(xiàn)優(yōu)于氧化鋁和碳。然而，就穩(wěn)定性而言，氧化鋁支持物似乎表現(xiàn)更優(yōu)越(見(jiàn)下面)。
此結(jié)合樣品也進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究。用DCB作為底物分析后，沖洗支持物并浸于TCP-飽和的緩沖液中。在給定的時(shí)間點(diǎn)，去除TCP緩沖液，再次沖洗支持物并用DCB進(jìn)行分析。表8室溫中PEI交聯(lián)支持物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究支持物 維持的活性％at 41 hrat 136 hr氧化鋁1 38 57氧化鋁2 66 67氧化鋁3 58 75二氧化硅1 76 81二氧化硅2 79 46二氧化硅3 60 30碳1 75 0碳2 37 48硅藻土57 12PEI-二氧化硅 43 60因此，在固定反應(yīng)中表現(xiàn)出中間回收水平的2種支持物，二氧化硅和氧化鋁證明經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后具有最好的穩(wěn)定性。也篩選所有這些支持物沒(méi)有PEI或GIA修飾而直接結(jié)合該酶的能力。然而，結(jié)合很弱且不可重復(fù)并且容易用沖洗從支持物上除去酶。具有通過(guò)離子交換而結(jié)合酶的聚乙烯亞胺浸滲的無(wú)機(jī)支持物同樣已知PEI的分子量對(duì)固定化酶的整體產(chǎn)量和穩(wěn)定性具有影響。此外，PEI能夠作為各種支持物上的離子交換配體或作為戊二醛交聯(lián)受體而起作用。由于這些原因，根據(jù)前面的部分所述的方法將兩種不同分子量的PEI浸滲入各種多孔的無(wú)機(jī)支持物中。然而，在這些實(shí)驗(yàn)中，酶(含有1-2U/mL的半純化制品)通過(guò)離子交換而結(jié)合但省略了GIA交聯(lián)步驟。對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性篩選從而檢測(cè)是否PEI大小為重要的因素。表9沒(méi)有交聯(lián)的PEI浸滲的多孔支持物的穩(wěn)定性篩選支持物 供應(yīng)商 MW PEI 維持的活性％at 24 hrat 120 hr1氧化鋁 Norton SA 6176 50,00070 622氧化鋁 Calcicat Type C 50,00061 423二氧化硅 Calcicat S-88-473 Type A 50,000101 644二氧化硅 Shell 5980-F 50,00080 555碳 Borecker Subunit 50,00041 326碳 AmCy 5701-Sn 50,00039 177硅藻土 Manville R 648 50,00083 508氧化鋁 Norton SA 6176 2000 82 559氧化鋁 Calcicat Type C 2000 91 6110二氧化硅 Calcicat S-88-473 Type A 2000 94 5711二氧化硅 Shell 5980-F 2000 76 5512碳Borecker Subunit 2000 44 5013碳AmCy 5701-Sn 2000 42 2114硅藻土Manville R 648 2000 58 2除了硅藻土外，不同分子量的PEI似乎沒(méi)有對(duì)酶的固定效率或穩(wěn)定性具有重要影響。實(shí)施例4pRSET-RDhl.Nde的構(gòu)建通過(guò)用限制酶NdeI和Hind III消化質(zhì)粒pRSET RDhl克隆16-4然后將5′端含有NdeI位點(diǎn)且3′端含有Hind III位點(diǎn)的RDhl基因片段摻入該構(gòu)建體中而構(gòu)建pRSET-RDhl.Nde表達(dá)載體。然后將該新的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(獲自美國(guó)加州Carlsbad的Invitrogen)中并挑取氨芐青霉素抗性的菌落。通過(guò)分析性限制酶消化鑒定含有RDhl基因的質(zhì)粒并稱(chēng)為pRSET-RDhl.Nde構(gòu)建體。重組Rdhl蛋白的制備將兩種新的構(gòu)建體-pRSET-RDhl.Nde和pTrcHis-RDhl轉(zhuǎn)化入大腸桿菌B834(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(來(lái)自Novagen公司，Madison，WI，美國(guó))。通過(guò)脫鹵素活性分析證實(shí)活性脫鹵素酶的產(chǎn)生并用PAGE研究酶產(chǎn)生的水平。用460nm處氯化物釋放比色分析測(cè)定脫鹵素活性從而分析對(duì)1，4-二氯丁烷(DCB)的酶促脫氯化活性。
我們觀(guān)察到在此宿主-大腸桿菌B834(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中增加的重組RDhl酶的產(chǎn)生。下表顯示在不同表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞中脫鹵素活性與總可溶性蛋白中rRDhl酶百分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。
*DCB單位為對(duì)1，4-二氯丁烷(DCB)脫氯化活性的量度。+大腸桿菌AG1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Stratagene(La Jolla，CA，美國(guó))；大腸桿菌TOP 10F′化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad，CA，美國(guó))；大腸桿菌G1 174細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad，CA)并根據(jù)供應(yīng)商說(shuō)明制成電感受態(tài)。實(shí)施例5修飾的紅球菌脫氫酶由于由TrcHis RDhl構(gòu)建體制備的紅球菌脫氫酶已在氨基及羧基端用額外的氨基酸加以修飾，故建立質(zhì)粒構(gòu)建體從而測(cè)試這些修飾中的每種修飾可能對(duì)該酶活性具有的影響。通過(guò)以NcoI和AgeI酶促消化pTrcHis Rdhl 18-3質(zhì)粒并將17bp的寡核苷酸連接到得到的缺口中而去除氨基末端的多-組氨酸尾部。
此寡核苷酸對(duì)的DNA序列如下RDhl ΔHis-6-F5′-CATGGGTGAAATAGGTA-3′RDhl ΔHis-6-R5′-CCGGTACCTATTTCACC-3′用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法，將His-6-F和His-6-R寡核苷酸退火、連接入消化的18-3構(gòu)建體中并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌TOP 10F′細(xì)胞中。通過(guò)培養(yǎng)于LB/Amp瓊脂板上篩選轉(zhuǎn)化的克隆。得到的氨基末端序列為-12 -11 3ATG GGT GAA ATA GGTMet Gly Ile(以最初未修飾序列的氨基酸編號(hào)顯示)。
消化和重新連接得到其中的Ala-293 Ser-294序列(圖2)變?yōu)锳la-293 Arg-294序列的構(gòu)建體。編碼Arg密碼子的后面為相應(yīng)于原始序列中堿基927-979處的TGA核苷酸三聚體的終止密碼子。
通過(guò)以AvrII和NheI消化pTrcHis RDhl 18-3并且再連接該質(zhì)粒而去除羧基末端EXFLAG。
通過(guò)酶促消化和凝膠電泳篩選單個(gè)克隆。將候選克隆于37℃培養(yǎng)于5mL培養(yǎng)物中，以IPTG誘導(dǎo)并通過(guò)超聲處理裂解。通過(guò)PAGE、Western印跡和氯化物檢測(cè)分析來(lái)分析裂解物。缺乏氨基末端多組氨酸或羧基末端EXFLAG的那些克隆顯示出與原初構(gòu)建體同等的催化活性。實(shí)施例6pTrcHis RDhl-S-Tag和pRSET RDhl-S-Tag的構(gòu)建材料與方法CTERM S-Tag F(正向)和CTERM S-Tag R(反向)為被設(shè)計(jì)將FLAG多肽-一種11氨基酸肽-轉(zhuǎn)變?yōu)镾-Tag多肽-一種15氨基酸序列的兩條引物。這些寡核苷酸的序列如下(S-Tag片段的每條鏈被下劃線(xiàn))
---Avr II---CTERM S-Tag F 5’-CTA GGT GAC AAA GAA ACC GCT GCT GCT AAA---Nsp V---TTC GAA CGC CAG CAC ATG GAC AGC AAA TAAGTT TAA ACA TCA TTCCAATTGC---Not I---CTERM S-Tag R 5’-GGCCGCAATTGGAATGATGTTTA AAC TTA TTT GCT--Nsp V---GTC CAT GTG CTG GCG TTC GAA TTT AGC AGC AGCGGT TTC TTT GTCACpTrcHis RDhl-S-Tag的構(gòu)建為了構(gòu)建質(zhì)粒pTrcHis RDhl-S-Tag，用限制酶AvrII和NotI消化質(zhì)粒pTrcHis RDhl克隆18-3并與S-Tag片段連接(通過(guò)室溫將引物CTERM S-Tag F和引物CTERM S-Tag R一起退火而制備S-Tag片段)。將此新的構(gòu)建體，pTrcHis RDhl-S-Tag摻入到大腸桿菌AG1感受態(tài)細(xì)胞(來(lái)自Stratagene，La Jolla，CA，美國(guó))并挑取氨芐青霉素抗性的菌落。通過(guò)分析性限制酶消化鑒定含有S-Tag片段的質(zhì)粒。pRSET RDhl-S-Tag的構(gòu)建也使用與用于構(gòu)建pTrcHis RDhl-S-Tag相同的方法構(gòu)建pRSETRDhl-S-Tag，但是用限制酶AvrII和NotI消化的質(zhì)粒pRSET RDhl克隆16-4起始并將該構(gòu)建體連接到上述的S-Tag片段上。
將半純化的rRDhl(來(lái)自TrcHis RDhl克隆18-3的EXFLAG標(biāo)記的蛋白)與該實(shí)施例中制備的半純化RDhl-S-Tag蛋白進(jìn)行動(dòng)力學(xué)比較。在0mM到5mM的TCP濃度范圍檢測(cè)氯化物釋放活性。如圖19中所示，S-Tag-修飾的蛋白顯示出較EXFLAG修飾蛋白Vmax大約15％的一致性增加。與EXFLAG蛋白相比，S-Tag蛋白也顯示出對(duì)TCP～25％更低的Km。這些結(jié)果證實(shí)TDhl酶C-末端的改變可用于調(diào)節(jié)和提高該酶的活性。實(shí)施例7反應(yīng)器設(shè)計(jì)及行為表現(xiàn)反應(yīng)器設(shè)置用總共316根1/4英寸ID的不銹鋼裝配殼形及管形的小規(guī)模反應(yīng)器。反應(yīng)器的進(jìn)出口管也為不銹鋼。用Lauda循環(huán)水浴(具有恒溫器)維持反應(yīng)器于30℃。反應(yīng)器以上流(up-flow)方向的固定化rRDhl酶流填充。固定化rRDhl酶首先通過(guò)將部分純化的酶制品(SDS-PAGE鑒定約為70％純度)上樣至PEI浸滲的以25％(w/v)戊二醛預(yù)處理2小時(shí)的氧化鋁(來(lái)自UOP的ISP 4000級(jí))中而加以制備；然后以蒸餾水充分沖洗，將足夠的蛋白導(dǎo)入氧化鋁中以得到每gm支持物300mg蛋白(通過(guò)Lowry方法)。在室溫下結(jié)合過(guò)夜。通過(guò)測(cè)定浸泡液中未結(jié)合的酶活性或通過(guò)280nm處的最終光吸收而估計(jì)結(jié)合酶的活性。
用2mm玻璃珠作為間隔體在進(jìn)出口處將固定化的rRDhl酶轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中。用預(yù)溫的10mM磷酸鈉/10μM EDTA緩沖液(pH 7.0)的液體加料開(kāi)始灌流。清洗數(shù)小時(shí)去除任何未結(jié)合的酶后，用1，2，3-三氯丙烷(TCP)飽和液體加料并以0.15mL/min的流速作為連續(xù)攪拌的溶液而輸送。在通過(guò)GC分析取樣進(jìn)出口液流的反應(yīng)物TCP和產(chǎn)物2，3-二氯-1-丙醇(DCH)濃度之前讓反應(yīng)器平衡～2個(gè)滯留時(shí)間。為了制備用于GC的樣品，將每種樣品首先以硫酸鈉飽和且然后用含有10mM 2種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)中每一種(1，1，1，2-四氯乙烷和3-氯-1-丙醇)的氯仿(2體積)提取。然后用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)方法從GC數(shù)據(jù)中估計(jì)TCP和DCH水平并且計(jì)算其產(chǎn)率(每時(shí)間每體積的百分產(chǎn)量)。此最初的產(chǎn)率用作最初酶活性的量度。小規(guī)模rRDhl生物反應(yīng)的產(chǎn)率將生物反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行三個(gè)月的時(shí)間、同時(shí)根據(jù)上述方法周期性取樣進(jìn)出口液流。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定該酶的容量產(chǎn)率(每分鐘每液流體積的產(chǎn)物重量)并且在此段時(shí)間里轉(zhuǎn)換百分?jǐn)?shù)從約60％下降到約40％。測(cè)定結(jié)果列于圖16中。根據(jù)此數(shù)據(jù)，估計(jì)此固定化酶的半壽期約為3500小時(shí)。這使得該固定化脫鹵素酶為至今報(bào)道的最為穩(wěn)定蛋白催化劑中的一員。實(shí)施例8EPPCR對(duì)脫鹵素酶的定向進(jìn)化對(duì)AgeI和Nhe-消化的已通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化并從凝膠中提取出的質(zhì)粒pTrc/His RDhl 18-3進(jìn)行易錯(cuò)PCR誘變。將EPPCR產(chǎn)物連接到具有AgeI和NheI切割位點(diǎn)的表達(dá)載體中。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)AGI細(xì)胞，將其在補(bǔ)充氨芐青霉素的瓊脂上培養(yǎng)成菌落。用通過(guò)測(cè)定pH改變而測(cè)定RDhl酶活性的方法測(cè)試此得到的細(xì)胞克隆“pTrc/HisRDhl”EPPCR文庫(kù)，方法如下用來(lái)自pTrc/His RDhl EPPCR文庫(kù)的單菌落接種96-孔微量培養(yǎng)板的B1到H12孔，每孔含有200μL SOB/Amp培養(yǎng)基，A1-A6孔僅含有陰性對(duì)照培養(yǎng)基，且用野生型pTrc/His RDhl18-3菌落接種A7-A12孔作為陽(yáng)性對(duì)照。代表結(jié)果列于圖17和18中。
結(jié)果顯示由EPPCR誘變產(chǎn)生的大多數(shù)克隆顯示出較由TrcHisRDhl克隆18-3產(chǎn)生的野生型RDhl相等或更小的活性范圍。然而，在分析84個(gè)來(lái)自EPPCR文庫(kù)隨機(jī)克隆脫鹵素酶活性的每種情況中，每只96-孔板中有少數(shù)顯示出較野生型酶顯著更高的活性。
于1998年2月3日，將三種質(zhì)粒，pTrcHis RDhl克隆18-3、pRSET RDhl克隆16-4，及pTrxFus RDhl克隆根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)并且分別得到下面的命名ATCC 209609、ATCC 209610和ATCC 209611。于1998年2月3日，將細(xì)胞培養(yǎng)物大腸桿菌TrxFusRDhl克隆4根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)并得到下面的命名ATCC 202087。
于1998年1月30日，將細(xì)胞培養(yǎng)物，大腸桿菌TrxHis RDhl克隆18-3和大腸桿菌RSET RDhl克隆16-4根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)并分別得到下面的命名ATCC202086和ATCC 202085。
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序列表一般信息申請(qǐng)人名稱(chēng)Dow化學(xué)公司街道1790 Bldg.Washington Street城市馬里蘭州MI國(guó)家美國(guó)郵編48674電話(huà)517-636-1687電傳517-638-9786發(fā)明題目重組鹵代脂族脫鹵素酶序列數(shù)目26計(jì)算機(jī)可讀形式介質(zhì)類(lèi)型3-1/2″軟盤(pán)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)操作系統(tǒng)MS-DOS軟件PatentInSEQ ID NO1信息序列特征長(zhǎng)度305類(lèi)型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性最初來(lái)源生物紫紅紅球菌單個(gè)分離株TDTM003特征名稱(chēng)/關(guān)鍵RDhl酶位置1..292特征名稱(chēng)/關(guān)鍵羧基-末端EXFLAG尾部位置295..305特征名稱(chēng)/關(guān)鍵氨基-末端多-His尾部位置-10..-1序列描述SEQ ID NO1Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ser Glu Ile Gly-12 -10 -5 -1 1Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg510Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu PheLeu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg Asn Ile Ile ProHis Val Ala Pro Ser His Arg Trp Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly MetGly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Asp Tyr Phe Phe Asp Asp His ValArg Tyr Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val ValLeu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala LysArg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Cys Met Glu Phe Ile ArgPro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr PheGln Ala Phe Arg Thr Ala Asp Val Gly Arg Glu Leu Ile Ile Asp GlnAsn Ala Phe Ile Glu Gly Val Leu Pro Lys Cys Val Val Arg Arg LeuThr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Lys Pro ValAsp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Ile Pro Ile Ala GlyGlu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Ala Tyr Met Asn Trp LeuHis Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly ValLeu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Glu Ser Leu Pro AsnCys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu His Tyr Leu Gln Glu AspAsn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Pro Gly Leu290Ala Ser Lys Leu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys295 300 305SEQ ID NO2RDhl圖2 DNACC ATG GGG GGT TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT ATG TCT GAA ATA 47GGT ACC GGT TTT CCC TTC GAC CCT CAT TAT GTG GAA GTC CTG GGC GAGCGT ATG CAC TAC GTC GAT GTT GGA CCG CGG GAT GGC ACG CCT GTG CTGTTC CTG CAC GGT AAC CCG ACC TCG TCC TAC CTG TGG CGC AAC ATC ATCCCG CAT GTA GCA CCG AGT CAT CGG TGC ATT GCT CCA GAC CTG ATC GGGATG GGA AAA TCG GAC AAA CCA GAC CTC GAT TAT TTC TTC GAC GAC CACGTC CGC TAC CTC GAT GCC TTC ATC GAA GCC TTG GGT TTG GAA GAG GTCGTC CTG GTC ATC CAC GAC TGG GGC TCA GCT CTC GGA TTC CAC TGG GCCAAG CGC AAT CCG GAA CGG GTC AAA GGT ATT GCA TGT ATG GAA TTC ATCCGG CCT ATC CCG ACG TGG GAC GAA TGG CCG GAA TTC GCC CGT GAG ACCTTC CAG GCC TTC CGG ACC GCC GAC GTC GGC CGA GAG TTG ATC ATC GATCAG AAC GCT TTC ATC GAG GGT GTG CTC CCG AAA TGC GTC GTC CGT CCGCTT ACG GAG GTC GAG ATG GAC CAC TAT CGC GAG CCC TTC CTC AAG CCTGTT GAC CGA GAG CCA CTG TGG CGA TTC CCC AAC GAG ATC CCC ATC GCCGGT GAG CCC GCG AAC ATC GTC GCG CTC GTC GAG GCA TAC ATG AAC TGGCTG CAC CAG TCA CCT GTC CCG AAG TTG TTG TTC TGG GGC ACA CCC GGCGTA CTG ATC CCC CCG GCC GAA GCC GCG AGA CTT GCC GAA AGC CTC CCCAAC TGC AAG ACA GTG GAC ATC GGC CCG GGA TTG CAC TAC CTC CAG GAAGAC AAC CCG GAC CTT ATC GGC AGT GAG ATC GCG CGC TGG CTC CCC GGACTC GCT AGC GGC CTA GGT GAC TAC AAG GAC GAT GAT GAC AAA TAA TGAGCGGCCGC AAGCTTSEQ ID NO3TCCH氨基酸Met Ser Leu Gly Ala Lys Pro Phe Gly Glu Lys Lys Phe Ile Glu IleLys Gly Arg Arg Met Ala Tyr Ile Asp Glu Gly Thr Gly Asp Pro IleLeu Phe Gln His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg Asn IleMet Pro His Cys Ala Gly Leu Gly Arg Leu Ile Ala Cys Asp Leu IleGly Met Gly Asp Ser Asp Lys Leu Asp Pro Ser Gly Pro Glu Arg TyrAla Tyr Ala Glu His Arg Asp Tyr Leu Asp Ala Leu Trp Glu Ala LeuAsp Leu Gly Asp Arg Val Val Leu Val Val His Asp Trp Gly Ser AlaLeu Gly Phe Asp Trp Ala Arg Arg His Arg Glu Arg Val Gln Gly IleAla Tyr Met Glu Ala Ile Ala Met Pro Ile Glu Trp Ala Asp Phe ProGlu Gln Asp Arg Asp Leu Phe Gln Ala Phe Arg Ser Gln Ala Gly GluGlu Leu Val Leu Gln Asp Asn Val Phe Val Glu Gln Val Leu Pro GlyLeu Ile Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ala Glu Met Ala Ala Tyr Arg GluPro Phe Leu Ala Ala Glu Ala Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro ArgGln Ile Pro Ile Ala Gly Thr Pro Ala Asp Val Val Ala Ile Ala ArgAsp Tyr Ala Gly Trp Leu Ser Glu Ser Pro Ile Pro Lys Leu Phe IleAsn Ala Glu Pro Gly Ala Leu Thr Thr Gly Arg Met Arg Asp Phe CysArg Thr Trp Pro Asn Gln Thr Glu Ile Thr Val Ala Gly Ala His PheIle Gln Glu Asp Ser Pro Asp Glu Ile Gly Ala Ala Ile Ala Ala PheVal Arg Arg Leu Arg Pro AlaSEQ ID NO4Rlucif氨基酸Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile ThrGly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp SerPhe Ile Asn Tyr Tyr Asp Set Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val IlePhe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val ValPro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile GlyMet Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu AspHis Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro LysLys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe HisTyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala GluSer Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile GluGlu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val LeuGlu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met ArgLys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys GluLys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile ProLeu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn TyrAsn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile GluSer Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys LysPhe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser GlnGlu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val GluArg Val Leu Lys Asn Glu GlnSEQ ID NO5XDhl氨基酸Met Ile Asn Ala Ile Arg Thr Pro Asp Gln Arg Phe Ser Asn Leu AspGln Tyr Pro Phe Ser Pro Asn Tyr Leu Asp Asp Leu Pro Gly Tyr ProGly Leu Arg Ala His Tyr Leu Asp Glu Gly Asn Ser Asp Ala Glu AspVal Phe Leu Cys Leu His Gly Glu Pro Thr Trp Ser Tyr Leu Tyr ArgLys Met Ile Pro Val Phe Ala Glu Ser Gly Ala Arg Val Ile Ala ProAsp Phe Phe Gly Phe Gly Lys Ser Asp Lys Pro Val Asp Glu Glu AspTyr Thr Phe Glu Phe His Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ile Glu ArgLeu Asp Leu Arg Asn Ile Thr Leu Val Val Gln Asp Trp Gly Gly PheLeu Gly Leu Thr Leu Pro Met Ala Asp Pro Ser Arg Phe Lys Arg LeuIle Ile Met Asn Ala Cys Leu Met Thr Asp Pro Val Thr Gln Pro AlaPhe Ser Ala Phe Val Thr Gln Pro Ala Asp Gly Phe Thr Ala Trp LysTyr Asp Leu Val Thr Pro Ser Asp Leu Arg Leu Asp Gln Phe Met LysArg Trp Ala Pro Thr Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ser Ala Tyr Ala AlaPro Phe Pro Asp Thr Ser Tyr Gln Ala Gly Val Arg Lys Phe Pro LysMet Val Ala Gln Arg Asp Gln Ala Cys Ile Asp Ile Ser Thr Glu AlaIle Ser Phe Trp Gln Asn Asp Trp Asn Gly Gln Thr Phe Met Ala IleGly Met Lys Asp Lys Leu Leu Gly Pro Asp Val Met Tyr Pro Met LysAla Leu Ile Asn Gly Cys Pro Glu Pro Leu Glu Ile Ala Asp Ala GlyHis Phe Val Gln Glu Phe Gly Glu Gln Val Ala Arg Glu Ala Leu LysHis Phe Ala Glu Thr GluSEQ ID NO6RDhl 5.4GGTTCCATGG GNTTYCCNTT YGAYCCNCAY TASEQ ID NO7RDhl 3.12CAGAGCTAGC GAGTCCGGGG AGCCAGCGSEQ ID NO8RDhl 5.7CGTACATATG GCCATGGGGG GTTCTCATCA TCATCATCAT CATGGTATGT CTGAAATAGGTACCGGTTTT CCCTTCGACC CTCATTASEQ ID NO9RDhl 3.13GATGACAAAT AATGAGCGGC CGCAAGCTTG TACSEQ ID NO10Trx2++CCGGGGATCC CATGGCTTCT GAAATACGTA CCGGTTTTCC CTTCGACCCT CATTASEQ ID NO11Trx-TCGACTGCAG GCGGCCGCTC ATTATTTGTC ATCSEQ ID NO12Dh1 Seq 7CCTGTCCCGA AGTTGTTGSEQ ID NO13Dh1 Seq 8CGGGCCGATC TCCACTGSEQ ID NO14Dh1 Seq 11TGCTCCAGAC CTGATCGSEQ ID NO15Dh1 Seq 12TCTGATCGAT GATCAACSEQ ID NO16Dh1 Seq 13TCCCGACGTG GACGAATGSEQ ID NO17Dh1 Seq 14GAGCGCGACG ATGTTCGCSEQ ID NO18Dh1 Seq 15CACCCGGCGT ACTGATCCSEQ ID NO19Dh1 Seq 18GAGACCGGTC AGCATTCCSEQ ID NO20PROK-Seq 1GAGCGGATAA CAATTTCASEQ ID NO21PROK-Seq 2TCTCATCCGC CAAAACAGSEQ ID NO22EXFLAG接頭GAATTCAGCC ATGGCATAAG CTTTCTAGAC TCGAGGGAGC TAGCGGCCTA GGTGACTACAAGGACGATGAT GACAAATAAT GAGCGGCCGC TAGCTTSEQ ID NO23RDhl ΔHis-6-FCATGGGTGAA ATAGGTASEQ ID NO24RDhl ΔHis-6-RCCGGTACCTA TTTCACCSEQ ID NO25CTERM S-Tag FCTAGGTGACAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCAAATAAGTTTAAACATCATTCCAATTGCSEQ ID NO26CTERM S-Tag RGGCCGCAATTGGAATGATGTTTAAACTTATTTGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTGTCAC
權(quán)利要求
1.能夠?qū)Ⅺu化脂族烴轉(zhuǎn)換為鹵代醇的酶，所述的酶含有基本上與圖2中殘基1-292的氨基酸序列同源的多肽。
2.權(quán)利要求1的酶，其中所述的酶含有與圖2中殘基1-292氨基酸序列至少約90％到100％同源的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的酶，其中所述的酶含有與圖2中殘基1-292氨基酸序列至少約95％同源的氨基酸序列。
4.DNA序列可表達(dá)與圖2中殘基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽，所述的多肽能夠?qū)Ⅺu化脂族烴轉(zhuǎn)換為鹵代醇。
5.權(quán)利要求4的DNA序列，其中所述的多肽與圖2中殘基1-292的氨基酸序列至少約90％到100％同源。
6.權(quán)利要求5的DNA序列，其中所述的多肽與圖2中殘基1-292的氨基酸序列至少約95％同源。
7.含有與圖2中堿基37-912的核苷酸序列基本上同源多核苷酸的DNA序列，所述的多核苷酸能夠表達(dá)能夠?qū)Ⅺu化脂族烴轉(zhuǎn)換為鹵代醇的多肽。
8.權(quán)利要求7的DNA序列，其中所述的多核苷酸與圖2中堿基37-912的核苷酸至少90％到100％同源。
9.權(quán)利要求8的DNA序列，其中所述的多核苷酸與圖2中的堿基37-912的核苷酸序列至少95％同源。
10.含有重組質(zhì)粒的微生物，其中的質(zhì)粒能夠指導(dǎo)含有與圖2中殘基1-292中氨基酸序列基本上同源多肽的酶的合成。
11.權(quán)利要求10的微生物，其中的微生物為埃希氏菌屬、畢赤酵母屬、芽孢桿菌屬、糖酵母屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、放線(xiàn)菌屬或曲霉屬。
12.權(quán)利要求11的微生物，其中的微生物為埃希氏菌屬。
13.含有編碼與圖2中殘基1-292氨基酸序列基本上同源多肽的DNA序列的表達(dá)構(gòu)建體。
14.具有鹵代鏈烷脫鹵素酶的固定化酶，該脫鹵素酶具有鹵代脂族脫鹵素酶活性并被附著到固相支持物上。
15.權(quán)利要求14的酶，其中的酶能夠從鹵化脂族烴、鹵化脂族醇和鹵化脂族多元醇分子及基團(tuán)的分子或基團(tuán)中水解去除至少一個(gè)鹵素取代基。
16.權(quán)利要求15的酶，其中所述的分子或基團(tuán)具有至少一個(gè)鹵素原子和2到10個(gè)碳原子，所述碳原子中的每一個(gè)以一個(gè)或幾個(gè)的所述鹵素原子獨(dú)立取代，前提條件是當(dāng)所述的分子或基團(tuán)為醇或多元醇時(shí)，具有羥基取代基的碳原子不再有鹵素取代基。
17.權(quán)利要求16的酶，其中所述的分子或基團(tuán)含有至少2個(gè)鹵素原子。
18.權(quán)利要求17的酶，其中所述的分子或基團(tuán)為1，2-二鹵代分子或基團(tuán)。
19.權(quán)利要求17的酶，其中所述的分子或基團(tuán)選自1，2-二鹵代乙烷、1，2-二鹵代丙烷、1，2-二鹵代丁烷及1，2，3-三鹵代丙烷。
20.權(quán)利要求19的酶，其中所述的分子或基團(tuán)分別選自1，2-二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷、1，2-二溴-3-氯丙烷及1，2，3-三氯丙烷。
21.權(quán)利要求20的酶，其中所述的分子或基團(tuán)轉(zhuǎn)換成至少一種下面的產(chǎn)物分子或產(chǎn)物基團(tuán)，包括2-氯乙醇、1-氯-2-丙醇、2-氯-1-丙醇、1-氯-2-丁醇、2-氯-1-丁醇、1-溴-3-氯-2-丙醇、2-溴-3-氯-1-丙醇、2，3-二溴-1-丙醇、1，2-二氯-3-丙醇及1，3-二氯-2-丙醇。
22.權(quán)利要求14的酶，其中所述的鹵代鏈烷脫鹵素酶獲自紅球菌。
23.制備含有與圖2中殘基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的酶的方法，包括以下步驟1)提供包括能夠表達(dá)所述多肽多核苷酸的DNA片段，2)將所述的DNA片段插入表達(dá)構(gòu)建體中，3)用所述的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，和4)提供宿主細(xì)胞表達(dá)所述多肽的環(huán)境。
24.權(quán)利要求23的方法，在所述方法的步驟4之后，進(jìn)一步包括純化所述酶的步驟。
25.制備共價(jià)連接到固相支持物上含有與圖2中殘基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的固定化酶的方法，包括以下步驟1)提供含有與圖2中殘基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的酶，2)提供附著到具有至少一種反應(yīng)性基團(tuán)連接子上的固相支持物，和3)將所述酶與所述連接子在生物可接受條件下接觸，其中所述的反應(yīng)性基團(tuán)與共價(jià)附著到所述多肽上的氨基、羧基、羥基或巰基反應(yīng)以形成共價(jià)附著。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述的連接子具有至少一種選自如下的基團(tuán)，包括二醛類(lèi)、二酸類(lèi)、二胺類(lèi)、二異氰酸酯類(lèi)、氰酸酯類(lèi)、二亞胺類(lèi)及碳化二亞胺類(lèi)，前提條件是二胺不與碳化二亞胺合用。
27.根據(jù)權(quán)利要求25方法制備的固定化酶。
28.將鹵化脂族烴轉(zhuǎn)換為醇或鹵代醇的方法，包括以下步驟1)提供含有與圖2中殘基1-292的氨基酸序列基本上同源多肽的酶，2)提供附著到具有至少一種反應(yīng)性基團(tuán)連接子上的固相支持物，3)將所述酶在生物可接受的條件下與所述連接子接觸，其中所述的反應(yīng)性基團(tuán)與共價(jià)附著到所述多肽上的氨基、羧基、羥基或巰基反應(yīng)以產(chǎn)生共價(jià)附著并形成固定化酶，和4)在其中所述酶可將鹵化脂族烴轉(zhuǎn)換為醇或鹵代醇的條件下將所述的固定化酶與鹵化脂族烴接觸。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的酶為權(quán)利要求2或3的酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的酶，其中所述的酶為具有一個(gè)或兩個(gè)末端多肽尾部的融合蛋白。
31.權(quán)利要求30的酶，其中所述的融合蛋白具有達(dá)30個(gè)氨基酸的單一氨基末端尾部，其中含有至少六個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的序列。
32.權(quán)利要求30的酶，其中所述的融合蛋白具有達(dá)150個(gè)氨基酸的單個(gè)羧基末端尾部。
33.權(quán)利要求32的酶，其中所述的羧基末端尾部為親水性的。
34.權(quán)利要求30的酶，其中所述的融合蛋白同時(shí)具有達(dá)30個(gè)氨基酸的氨基末端尾部和達(dá)150個(gè)氨基酸的羧基末端尾部。
35.權(quán)利要求34的酶，其中所述的氨基末端尾部含有具有至少6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的序列。
36.權(quán)利要求34的酶，其中所述的羧基末端尾部含有選自如下的多肽EXFLAG多肽、S-Tag多肽、含有六組氨酸序列的多肽及纖維素結(jié)合域。
37.具有鹵化脂族脫鹵素酶活性的酶，其DNA是通過(guò)定向進(jìn)化方法從相關(guān)DNA序列中得到的，其中所述的酶具有較相關(guān)DNA序列更大的脫鹵素活性。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的酶，其中所述的相關(guān)DNA序列編碼野生型或重組的脫鹵素酶。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的酶，其中所述的相關(guān)DNA序列編碼野生型或重組的鹵代鏈烷脫鹵素酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的酶，其中所述的相關(guān)DNA序列編碼野生型或重組的紅球菌鹵代鏈烷脫鹵素酶。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的酶，其中所述的定向進(jìn)化方法包括進(jìn)行易錯(cuò)PCR。
42.根據(jù)權(quán)利要求37的酶，其中的酶為具有一個(gè)或兩個(gè)末端多肽尾部的融合蛋白。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的酶，其中的一個(gè)尾部或兩個(gè)尾部通過(guò)定向進(jìn)化方法加以修飾。
44.選自ATCC 209609、ATCC 209610和ATCC 209611的表達(dá)載體。
45.選自ATCC 202085、ATCC 202086和ATCC 202087的細(xì)胞培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠?qū)Ⅺu化的脂族底物分子轉(zhuǎn)換為鄰位鹵代醇的鹵代脂族脫鹵素酶、以及編碼這些酶多肽的DNA序列、含有此DNA的表達(dá)構(gòu)建體、和通過(guò)將該表達(dá)構(gòu)建體置于宿主細(xì)胞中從而在足以使這些轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生脫鹵素酶的條件下制備這類(lèi)酶的方法。同時(shí)分開(kāi)了將該酶固定于固體支持物上的方法和該固定化酶轉(zhuǎn)化鹵化的脂族烴為醇的用途。
文檔編號(hào)C12P7/16GK1252100SQ98804107
公開(kāi)日2000年5月3日 申請(qǐng)日期1998年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月13日
發(fā)明者J·A·阿夫霍爾特, P·E·斯萬(wàn)森, H·L·坎, R·A·里查德 申請(qǐng)人:唐化學(xué)原料公司