專利名稱：產(chǎn)生具有降低的棉子糖類和植酸水平之種子的大豆植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)與遺傳學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品及食品，所述產(chǎn)品含明顯較低含量的棉子糖，水蘇糖和植酸以及明顯較高含量的蔗糖與無(wú)機(jī)磷酸鹽，這是因?yàn)槭褂昧司哂锌蛇z傳的，降低了在其種子中產(chǎn)生肌醇-1-磷酸能力之大豆品系的作用。
背景技術(shù)：
棉子糖類是一組含D-半乳糖的蔗糖寡糖，它們廣泛分布于植物中。棉子糖類的特征在于含通式0-α-D吡喃半乳糖基-(1→6)n-α-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D呋喃果糖苷，其中n＝1到n＝4時(shí)分別稱為棉子糖，水蘇糖，毛蕊糖和筋骨草糖。在大豆種子中，棉子糖和水蘇糖是含量最高的棉子糖類。相比而言，毛蕊糖和筋骨草糖是次要成分并且一般用標(biāo)準(zhǔn)分析方法檢測(cè)不出。
對(duì)棉子糖類之存在的廣泛植物學(xué)調(diào)查已在科學(xué)文獻(xiàn)中有報(bào)道[Dey，P.M.《綠色植物中儲(chǔ)存的碳水化合物的生物化學(xué)》(Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants)，Academic Press，London，(1985)53-129頁(yè)]。在非結(jié)構(gòu)性碳水化合物中，棉子糖類在植物王國(guó)中的豐富含量被認(rèn)為僅次于蔗糖。事實(shí)上，棉子糖類是無(wú)處不在的，至少在較高等植物中是這樣。棉子糖類在許多有經(jīng)濟(jì)意義的作物物種中的可食部分大量積累。實(shí)例包括大豆(Glycine max L.Merrill)，甜菜(Beta vulgaris)，棉花(Gossypiumhirsutum L.)，canola(Brassica sp.)和全部主要的可食性豆科作物，包括豆類(Vigna radiata)，鷹嘴豆(Cicer arietinum)，豇豆(Vigna unguiculata)，綠豆(Vigna radiata)，豌豆(Pisumsativum)，小扁豆(Lens culinaris)和白羽扇豆(Lupinus sp.)。
雖然在許多物種中豐富存在，棉子糖類對(duì)一些經(jīng)濟(jì)上重要的作物物種的有效利用來(lái)說(shuō)是一個(gè)障礙。棉子糖類不能被動(dòng)物直接消化，主要因?yàn)棣?半乳糖苷酶在小腸粘膜中不存在[Gitzelmann和Auricchio.(1965)《兒科學(xué)》(Pediatrics)36231-236；Rutloff等(1967)Nahrung.1139-46]。然而，在直腸中的微生物區(qū)系易于發(fā)酵棉子糖類，從而導(dǎo)致直腸的酸化并產(chǎn)生二氧化碳，甲烷和氫氣[Murphy等(1972)《農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志》(J.Agr.Food Chem.)20813-817；Cristofaro等，《營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的糖類》(SugarsinNutrition)(1974)第20章313-335頁(yè)；Reddy等(1980)《食品科學(xué)雜志》《J.Food Science》451161-1164]。產(chǎn)生的腸胃脹氣可嚴(yán)重限制豆科植物在動(dòng)物(包括人類)食物中的利用。此外，因?yàn)榇祟愇锓N是蛋白質(zhì)和纖維的優(yōu)越來(lái)源，令人遺憾的是棉子糖類的存在限制大豆在動(dòng)物(包括人類)食物中的使用。
大豆很適合機(jī)械與設(shè)備收獲，儲(chǔ)存和加工，這些在世界許多地區(qū)都是廣泛使用的。僅在美國(guó)，1998年產(chǎn)量約兩千八百萬(wàn)公噸[《油料作物情況和展望報(bào)告》(Oil Crops Situation and Outlook Report)，4月1989，美國(guó)農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟(jì)研究服務(wù)處]。一般而言，除去豆莢，然后用幾個(gè)提取系統(tǒng)之一中的己烷提取豆油。然后，剩余的脫脂餅被用于各種經(jīng)濟(jì)的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品[《大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品、特征、營(yíng)養(yǎng)概括和利用》(Soy Protein Products，Characteristics，Nutritional Aspectsand Utilization)(1987)大豆蛋白質(zhì)理事會(huì)]。其中最為大量使用的是大豆食品，它用做動(dòng)物，特別是那些單胃動(dòng)物如家禽和豬飼料的食品中蛋白質(zhì)的來(lái)源。
雖然大豆是植物蛋白質(zhì)的很好的來(lái)源，但是其使用中似乎是由于棉子糖的存在而效能差。與玉米(動(dòng)物食品中的另一主要成分)相比，大豆食物的總能量利用較低[Potter and Potchanakorn《第三屆世界大豆研討會(huì)科研報(bào)告集》(Proceedings World Soybean ConferenceIII)，(1984)218-224]。例如，雖然大豆食物比田產(chǎn)黃玉米的總能量高約6％，但是當(dāng)飼養(yǎng)雞時(shí)，它的可代謝能量不到約40至50％。這種總能量利用效能差似乎不是由于這種食物中蛋白質(zhì)部分的消化問(wèn)題，而是由于這種食物中碳水化合物部分的消化不良。已有報(bào)道用乙醇提取從大豆中除去棉子糖類導(dǎo)致烘焙食物的可代謝能量大增[Coon，C.N.等《大豆利用替代品科研報(bào)告集》(Proceedings Soybean Utilization Alternatives)，University of Minnesota(1988)203-211]。除去棉子糖類伴隨著增加大豆食物的纖維素和半纖維素部分的利用。
從大豆中生產(chǎn)出各種加工的植物蛋白質(zhì)產(chǎn)品。它們的范圍從加工最少的，脫脂的產(chǎn)品如大豆食物，粗粉和精粉到高度加工的產(chǎn)品如大豆蛋白質(zhì)濃縮物和大豆蛋白質(zhì)分離物。在其他大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品中，例如豆油是未提取的全脂精粉。除這些加工的產(chǎn)品外，還有些基于傳統(tǒng)東方加工方法的特產(chǎn)產(chǎn)品，它們利用完整的豆作為初始原料。例如包括大豆乳，大豆醬油，豆腐，日本豆豉，日本豆面醬，大豆發(fā)酵食品和yuba。
在人類食物中使用大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品實(shí)例包括大豆蛋白質(zhì)濃縮物，大豆蛋白質(zhì)分離物，膨化大豆蛋白質(zhì)，豆乳和嬰兒食品。從大豆生產(chǎn)蛋白質(zhì)濃縮物和分離物的設(shè)備和方法世界各地均可得到。大豆蛋白質(zhì)濃縮物與分離物的生產(chǎn)者所面臨的問(wèn)題之一是選擇性純化蛋白質(zhì)與棉子糖分開(kāi)的挑戰(zhàn)。除去大豆中存在的大量棉子糖類導(dǎo)致可觀的設(shè)備和操作成本。
棉子糖類所伴隨的問(wèn)題與成本可通過(guò)獲得使大豆種子的棉子糖類含量降低的基因而減少和消除。這類基因可用于產(chǎn)生有遺傳上降低了棉子糖類含量的大豆變種。有遺傳上降低了棉子糖類含量的大豆變種會(huì)改善所獲得的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量并降低除去棉子糖類所伴隨的加工成本。低棉子糖大豆變種將比常規(guī)種類的動(dòng)物和人類食品更有價(jià)值并將使人類更充分利用這種可食性豆科植物中所需要的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。
肌醇六磷酸(亦稱“植酸”)和棉子糖類共用肌醇在其合成反應(yīng)中作為共同中間物[Ishitani，M.等，(1996)《植物雜志》(The PlantJournal)9537-548]。與棉子糖類相似，植酸是被子植物種子的幾乎普遍存在的成分[Raboy，V，《植物中的肌醇代謝》(InositolMetabolism in Plants)(1990)Wiley-Liss，New York，55-76頁(yè)]。當(dāng)植酸一般占種子如大豆和玉米中總磷酸的50-70％時(shí)，所述磷酸是唯一不易于單胃動(dòng)物利用的。除僅部分是可消化的外，在動(dòng)物配料中存在的植酸導(dǎo)致其他限制性營(yíng)養(yǎng)如必需氨基酸，鈣和鋅的分泌[Morz，Z.等，(1994)《動(dòng)物科學(xué)雜志》(J.Animal Sci.)72126-132；Fos等，《營(yíng)養(yǎng)毒理學(xué)》(Nutritional Toxicology)第三卷，AcademicPress，San Diego(1989)59-96頁(yè)]。由于大豆食物是許多動(dòng)物飼料配料的主要部分，所以有降低了植酸含量并增加了可利用磷酸的食物應(yīng)導(dǎo)致改善含大豆配料中的飼料功效。酶處理含配料的大豆食物以從植酸中部分水解出磷酸基團(tuán)確能既改善磷酸鹽的可用性又改善其他限制性營(yíng)養(yǎng)成分的可用性[Mroz等見(jiàn)上文；Pen等(1993)《生物技術(shù)》(Biotechnology)11811-814]。
市售與野生大豆種質(zhì)的調(diào)查表明種子植酸的成分的有限遺傳變異性是存在的[Raboy等，(1984)《作物科學(xué)》(Crop Science)24431-434]。根據(jù)這些因素，顯然需要具有可遺傳的，顯著降低了其種子中棉子糖類和植酸含量的大豆植物。
發(fā)明綜述本發(fā)明涉及有可遺傳表型的大豆植物，所述表型是(i)種子植酸含量低于17微摩爾/克，(ii)種子棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克，和(iii)種子蔗糖含量高于200微摩爾/克，所述表型是由于降低了所述植物的種子中肌醇1-磷酸的合成能力。本發(fā)明還涉及從此類植物獲得的種子。
更具體而言，本發(fā)明涉及分離的編碼大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段或其互補(bǔ)片段，并涉及包含該核酸片段或所述核酸片段的亞片段的嵌合基因，所述片段被有效連接到適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，其中所述嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致編碼大豆肌醇1磷酸合酶的天然基因的表達(dá)降低。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是分離的編碼突變型肌醇1-磷酸合酶的核酸片段，所述酶具有降低的肌醇-1-磷酸合成能力。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種大豆植物，在其基因組中含一種嵌合基因，所述基因包含編碼大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段或該核酸片段的互補(bǔ)片段，所述片段有效連接到適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，其中所述嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致編碼大豆肌醇1-磷酸合酶的天然基因的表達(dá)降低。
還有一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案是一種大豆植物，其就至少一種編碼突變型肌醇1-磷酸合酶基因而言純合的，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供可遺傳的表型，包括(i)種子植酸含量低于17微摩爾/克，(ii)種子棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克，和(iii)種子蔗糖含量高于200微摩爾/克。
本發(fā)明還涉及來(lái)源于上述任意植物種子的種子和蛋白質(zhì)產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還涉及形成具有可遺傳表型的大豆植物的方法，所述表型是(i)種子植酸含量低于17微摩爾/克，(ii)種子棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克，和(iii)種子蔗糖含量高于200微摩爾/克，所述方法包括(a)將一種原種大豆植株與大豆品系LR33或在其基因組中含一嵌合基因的任意大豆植株雜交，所述嵌合基因包含編碼大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段或該核酸片段的互補(bǔ)片段，所述片段被有效連接到適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，或用一種原種大豆植株與一種純合的大豆植物雜交，其中至少一種基因編碼一突變型肌醇1-磷酸合酶，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力；和(b)篩選步驟(a)雜交中的子代植株，所述植株具有可遺傳的表型，包括(i)種子植酸含量低于17微摩爾/克，(ii)種子棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克，和(iii)種子蔗糖含量高于200微摩爾/克。
本發(fā)明還包括產(chǎn)生大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，包括(a)進(jìn)行農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良大豆植物與LR33或如上述的任何大豆植物的雜交；(b)篩選從步驟(a)獲得的子代植物的種子，就(i)種子植酸含量低于17微摩爾/克，(ii)種子棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克，和(iii)種子蔗糖含量高于200微摩爾/克；和(c)處理步驟(b)中篩選的種子以獲得所需要的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
最后，本發(fā)明包括使用純合大豆植物的方法，其至少一種基因編碼突變型肌醇1-磷酸合酶，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供可遺傳的表型，包括(i)種子植酸含量低于17微摩爾/克，(ii)種子棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克，和(iii)種子蔗糖含量高于200微摩爾/克，以產(chǎn)生子代品系，所述方法包括(a)將包含具有降低的合成肌醇1-磷酸能力的突變型肌醇1-磷酸合酶的大豆植株與不含突變的任何大豆親代進(jìn)行雜交，以產(chǎn)生F1雜交體；(b)所述F1雜交體自交至少一代；和(c)鑒定步驟(b)的子代，其至少一種編碼突變肌醇1-磷酸合酶的基因是純合的，所述合酶有降低了的合肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供一種可遺傳表型，包括(i)種子植酸含量低于17微摩爾/克，(ii)種子棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克，和(iii)種子蔗糖含量高于200微摩爾/克。
附圖簡(jiǎn)述與序列表從構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖和序列表可更充分理解本發(fā)明。所述序列表含三字符氨基酸編碼，如37C.F.R.1.822所定義的，此處引用為參考。


圖1.大豆種子中葡萄糖到植酸，棉子糖和水蘇糖的代謝。共同的輔助因子ATP，ADP，UTP，UDP，焦磷酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)沒(méi)有列出?？s寫(xiě)列出酶己糖激酶(HK)；葡糖磷酸異構(gòu)酶(PGI)；UDP葡糖焦磷酸化酶(UDPGPP)；UDP葡糖4’差向異構(gòu)酶(UDPG4’E)；肌醇1-磷酸合酶(MI 1-PS)；肌醇1-磷酸酶(MI 1-Pase)；肌醇1-磷酸激酶(MI 1-PK)；肌醇半乳糖苷合酶(GAS)；蔗糖合酶(SucS)；棉子糖合酶(RS)；和水蘇糖合酶(SS)。
SEQ DI NO1是1782堿基的cDNA5’到3’的核苷酸序列，其編碼存在于克隆p5bmi-1ps中的野生型大豆肌醇1-磷酸合酶。
SEQ ID NO2是從SEQ ID NO1可讀框推出的510氨基酸序列。SEQ ID NO3是上游(5’)引物的核苷酸序列，它用于從大豆品系LR33分離肌醇1-磷酸合酶cDNA。SEQ ID NO4是下游(3’)引物的核苷酸序列，它用于從大豆品系LR33分離肌醇1-磷酸合酶cDNA。SEQ ID NO5是1533堿基的cDNA核苷酸序列，其編碼克隆LR33-10中的LR33肌醇1-磷酸合酶。SEQ ID NO6是從SEQ ID NO5可讀框推出的510氨基酸序列。SEQ ID NO7是上游(5’)引物的核苷酸序列，它用于來(lái)自基因組DNA樣品的編碼肌醇1-磷酸合酶野生型等位基因的PCR擴(kuò)增。SEQ ID NO8是上游(5’)引物的核苷酸序列，它用于來(lái)自基因組DNA樣品的編碼肌醇1-磷酸合酶之LR33等位基因的PCR擴(kuò)增。
生物寄存如下生物學(xué)物質(zhì)已按照布達(dá)佩斯協(xié)議條款被寄存在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，并有如下登記號(hào)名稱 物質(zhì) 登記號(hào)寄存日期LR33 種子ATCC 979881997年4月17日4E76 種子ATCC 979711997年4月4日p5bmi-lps 質(zhì)粒ATCC 979701997年4月4日詳述本公開(kāi)的內(nèi)容，使用幾個(gè)術(shù)語(yǔ)。如本文所用“大豆”指物種大豆，野大豆，或與大豆有性雜交相容的任何物種?！捌废怠笔且唤M類似系譜的植物，其呈現(xiàn)極少或不呈現(xiàn)個(gè)體之間的至少一個(gè)特征上的遺傳變異。此類品系可通過(guò)一代或數(shù)代自花受粉和篩選而生成，或通過(guò)包括組織或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從單一親本的無(wú)性繁殖而生成?！巴蛔儭敝缚蓹z測(cè)到的并可遺傳的基因改變(自發(fā)或誘導(dǎo))，它不由隔離或遺傳重組所引起。“突變體”指的是具有突變的個(gè)體或個(gè)體譜系?！叭后w”是共有一個(gè)共同基因庫(kù)的任何一群個(gè)體。在本發(fā)明中，它包括M1，M2，M3，M4，F(xiàn)1和F2群體。如本文所使用的，“M1群體”是種子(和所產(chǎn)生的植株)的子代，所述子代已接觸了誘變劑，而“M2群體”是自花受粉的M1植株的子代，“M3群體”是自花受粉的M2植株的子代，而“M4群體”是自花受粉的M3植株的子代。如本文所使用的“F1群體”是一個(gè)品系與另一品系雜交受粉產(chǎn)生的子代。本文所使用的表達(dá)式描述這種雜交受粉為“雌性親本*雄性親本”?！癋2群體”是F1植侏自花受粉的子代?！癋2衍生品系”或“F2品系”是各F2植株自花受粉產(chǎn)生的品系。F2衍生品系可通過(guò)重復(fù)的自花受粉和從所述F2衍生品系的植株積累的種子所產(chǎn)生的后代(F3，F(xiàn)4，F(xiàn)5等)進(jìn)行繁殖。
術(shù)語(yǔ)“核酸”指單鏈或雙鏈大分子，由包含糖，磷酸和嘌呤或嘧啶的單體(核苷酸)組成?！昂怂崞巍笔且欢谓o定的核酸分子?！皝喥巍敝赴韧暾怂崞紊俚倪B續(xù)的核酸片段部分?！盎パa(bǔ)”指構(gòu)成核酸的嘌呤與嘧啶堿基的專一性配對(duì)腺嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì)而鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶配對(duì)。因此，第一核酸片段的“互補(bǔ)片段”指核苷酸序列與第一核酸序列互補(bǔ)的第二核酸片段。
在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)參與轉(zhuǎn)移DNA中的信息到蛋白質(zhì)中?！盎蚪M”是一個(gè)生物的每個(gè)細(xì)胞中所含有的遺傳物質(zhì)的整體，它可以是單或雙鏈，任選含有合成的，非天然的或改變的能摻入到DNA或RNA聚合物中的核苷酸堿基。術(shù)語(yǔ)“寡聚體”指短的核苷酸序列，通常可達(dá)100堿基長(zhǎng)度。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“同源的”指兩個(gè)核酸分子的核苷酸序列之間或兩個(gè)蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列之間的相關(guān)性。這種同源性通過(guò)在如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所理解的一定的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交(Hames和Higgins，編輯(1985)核酸雜交，IRL Press，Oxford，U.K.)；或通過(guò)比較兩核酸或蛋白質(zhì)的序列類似性，如通過(guò)Needleman等(《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)(1970)48443-453)的方法而得到估計(jì)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上類似”指核苷酸序列與權(quán)利要求的序列的編碼區(qū)(如相應(yīng)于所述編碼區(qū)的基因和假基因)在核苷酸水平上有高于90％整體一致性。本文所述核酸片段包括含可能變異(人工形成和自然形成)的分子，如但不限于(a)涉及不引起被編碼氨基酸變化的堿基改變的分子，或(b)涉及改變氨基酸但不影響所述DNA序列編碼的蛋白質(zhì)功能性質(zhì)之堿基改變的分子，(c)衍生于核酸片段的缺失，重排，擴(kuò)增，隨機(jī)或受控制的誘變的分子，和(d)甚至偶然的核苷酸測(cè)序的錯(cuò)誤的分子。
“基因”指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括編碼區(qū)的前(5’非編碼區(qū))和后(3’非編碼區(qū))調(diào)節(jié)序列?！疤烊坏摹被蛑赣萌缭谧匀唤绨l(fā)現(xiàn)的其自身的調(diào)節(jié)序列分離的基因?！扒逗匣颉敝赴谧匀唤缥窗l(fā)現(xiàn)的異源調(diào)節(jié)和編碼序列的基因?！皟?nèi)源性”基因指在其基因組的自然位置中正常發(fā)現(xiàn)的天然基因并且是未被分離的。“外源”基因指不是在其宿主生物中正常發(fā)現(xiàn)的，而是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移引入的基因?！凹倩颉敝覆痪幋a功能性酶的基因組核苷酸序列。
“編碼序列”指編碼特定蛋白質(zhì)而不包括非編碼序列的DNA序列。它可構(gòu)成一個(gè)“連續(xù)的編碼序列”，即沒(méi)有內(nèi)含子或可包括一個(gè)或多個(gè)以適當(dāng)?shù)募艚狱c(diǎn)為邊界的內(nèi)含子。“內(nèi)含子”是初級(jí)轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄的但通過(guò)細(xì)胞內(nèi)為產(chǎn)生可被翻譯成蛋白質(zhì)的成熟RNA而進(jìn)行的RNA切割和重接所移除的序列。
“起始密碼”和“終止密碼”指在蛋白質(zhì)合成(mRNA翻譯)中特異性起始和鏈終止編碼序列中分別三個(gè)鄰接核苷酸的單位?！翱勺x框”指由起始和終止密碼之間的內(nèi)含子連接起的編碼序列，它編碼氨基酸序列。
“RNA轉(zhuǎn)錄物”指DNA序列的RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完整拷貝時(shí)，指初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或它可以是初級(jí)轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄后加工而衍生的RNA序列，并亦指成熟的RNA?！靶攀筊NA(mRNA)”指沒(méi)有內(nèi)含子并可被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！癱DNA”指從mRNA衍生的雙鏈DNA?！坝辛x”RNA指包括mRNA的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x”RNA指與靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)的RNA轉(zhuǎn)錄物，并且所述轉(zhuǎn)錄物通過(guò)干擾其初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的加工，轉(zhuǎn)錄和(或)翻譯而阻斷靶基因的表達(dá)。反義RNA的互補(bǔ)性可存在于任何特定基因轉(zhuǎn)錄物部分，即在5’非編碼序列，3’非編碼序列，內(nèi)含子或編碼序列。此外，如本文所使用的，反義RNA可含核酶序列區(qū)域，它增強(qiáng)反義RNA阻斷基因表達(dá)的功效?！昂嗣浮敝复呋訰NA并包括序列特異性內(nèi)切核糖核酸酶。
如本文使用的，“適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列”指天然或嵌合基因的核苷酸序列，它位于本發(fā)明核酸片段的上游(5’)，其中和(或)下游(3’)，它控制本發(fā)明核酸片段的表達(dá)。
“啟動(dòng)子”指基因中的DNA序列，通常在其編碼基因的上游(5’)，它通過(guò)提供RNA聚合酶和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄所需要的其他因子的識(shí)別部位控制編碼序列的表達(dá)。在人工DNA構(gòu)建體中，啟動(dòng)子還可用于轉(zhuǎn)錄反義RNA。啟動(dòng)子也可含參與結(jié)合蛋白質(zhì)因子的DNA序列，所述因子根據(jù)生理和發(fā)育條件控制轉(zhuǎn)錄起始的效率。它也可包含增強(qiáng)子元件?！霸鰪?qiáng)子”是能刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列。它可以是啟動(dòng)子固有的元件或插入的異源元件以增強(qiáng)啟動(dòng)子的水平和(或)組織特異性。“組成型啟動(dòng)子”指在全部組織和全部時(shí)間內(nèi)指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子?！敖M織特異性”或“發(fā)育特異性”啟動(dòng)子如本文所指，是幾乎專性在特異性組織(如葉片或種子)中，在組織的特定發(fā)育階段(如分別在早期或晚期胚胎發(fā)生)中指導(dǎo)基因表達(dá)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指本發(fā)明的核酸片段衍生的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累，這與所述細(xì)胞的蛋白質(zhì)細(xì)胞器一起導(dǎo)致肌醇1-磷酸合酶水平的改變?！胺戳x抑制”指產(chǎn)生能阻止靶蛋白質(zhì)表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物?！俺磉_(dá)”指轉(zhuǎn)基因生物中基因產(chǎn)物的生產(chǎn)超過(guò)正?；蚍寝D(zhuǎn)化的生物中的生產(chǎn)水平。“共抑制”指與內(nèi)源基因有基本同源性的外源基因的表達(dá)導(dǎo)致所述外源基因與所述內(nèi)源基因表達(dá)均受抑制?！案淖兊乃健敝冈谵D(zhuǎn)基因生物中基因產(chǎn)物的產(chǎn)生數(shù)量或比例與正常或非轉(zhuǎn)化生物不同。本發(fā)明還涉及載體，包括本發(fā)明的核苷酸序列，用本發(fā)明載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞和通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明多肽。本文的“轉(zhuǎn)化”指外源基因轉(zhuǎn)移到宿主生物基因組中并可穩(wěn)定遺傳。“能育的”指能進(jìn)行有性繁殖的植物。
“棉子糖類”指有通用分子式O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)n-α-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-呋喃果糖苷(其中n＝1到4)的寡糖族。在大豆種子中，所述術(shù)語(yǔ)更特指所述家族成員含一個(gè)(棉子糖)和兩個(gè)(水蘇糖)半乳糖殘基。雖然已知較高的半乳糖聚合物(例如毛蕊糖和筋骨草糖)，但是大豆中這些較高聚合物的含量低于標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法所檢測(cè)出的含量，因此顯然不歸屬于總棉子糖含量。
“植物”指光合作用的生物(真核與原核)，而術(shù)語(yǔ)“高等植物”指真核植物。
本發(fā)明提供大豆基因的突變型和改進(jìn)大豆種子的碳水化合物與植酸成分的方法以及衍生的產(chǎn)物。本發(fā)明論述鑒別這種基因中的突變的方法的實(shí)例和使用衍生的突變體大豆品系降低大豆種子中的棉子糖和植酸成分的方法的實(shí)例。本發(fā)明還論述使用基因沉默技術(shù)和本發(fā)明中揭示的大豆肌醇1-磷酸合酶基因序列降低大豆種子中棉子糖含量的方法。
從本發(fā)明植物中獲得的種子表達(dá)一種與市售品種有關(guān)的改進(jìn)的可溶性碳水化合物含量，所述改進(jìn)導(dǎo)致總棉子糖加水蘇糖含量的降低。這些品系的碳水化合物資料與用于或產(chǎn)生于其他大豆育種規(guī)劃中的優(yōu)良或種質(zhì)品系中所見(jiàn)的資料明顯不同。
論述了兩種不同的產(chǎn)生本發(fā)明新型大豆基因的方法。第一種方法標(biāo)志著首次成功嘗試誘導(dǎo)突變來(lái)實(shí)現(xiàn)低棉子糖加水蘇糖含量。這種方法導(dǎo)致兩個(gè)主要的基因的發(fā)現(xiàn)，其中之一在本發(fā)明中詳細(xì)描述，它可被用于開(kāi)發(fā)(在降低棉子糖與水蘇糖結(jié)合含量的意義上)優(yōu)越于先前報(bào)道的任何品系的大豆品系。第二種方法利用在特異性基因沉默法的轉(zhuǎn)基因中使用的本發(fā)明所論述的基因序列以達(dá)到類似于通過(guò)隨機(jī)誘變和篩選所獲得的結(jié)果。
申請(qǐng)人最初想通過(guò)化學(xué)誘變?cè)谝吧痛蠖够蚪M中引入隨機(jī)誘變。本發(fā)明使用NMU(N-亞硝基-N-甲基脲作為誘變劑，盡管可能使用了其他已知改變DNA結(jié)構(gòu)和序列的試劑。NMU處理之后，播種大豆種子數(shù)代并篩選需要的表型；首選重要的是棉子糖含量的改變。初步篩選的誘變的大豆群體顯示兩種品系，LR33和LR28，它們表現(xiàn)出低棉子糖類(LR28在世界專利申請(qǐng)WO93/07742中公開(kāi))。通過(guò)自花受粉產(chǎn)生的LR33三代后代的分析(表1)證明了LR33的低棉子糖表型是可遺傳的。
通過(guò)一系列精細(xì)的遺傳和生化研究鑒定和表征了導(dǎo)致該品系呈現(xiàn)的獨(dú)特表型的LR33生理缺陷(見(jiàn)實(shí)施例2，后文)。LR33中的缺陷表現(xiàn)出遺傳和生化上不同于導(dǎo)致LR28品系低水蘇糖表型的LR28中的突變。而且，LR33中的突變證明比LR28中的缺陷有更大的多效性；本說(shuō)明書(shū)證明LR33表型不僅包括降低的棉子糖含量，而且包括導(dǎo)致種子植酸，無(wú)機(jī)磷酸鹽和蔗糖水平的改變。進(jìn)一步分析證實(shí)來(lái)自LR33的遺傳信息能單獨(dú)在子代大豆品系上提供這種獨(dú)特的表型，并且證實(shí)所述突變體基因或LR33中的基因不是增強(qiáng)源于其他突變體大豆品系的基因表型表達(dá)的簡(jiǎn)單遺傳修飾劑。
具體的生化缺陷與LR33所證實(shí)的可遺傳表型有關(guān)并鑒定了其子代。這通過(guò)考慮對(duì)大豆種子中的棉子糖類的生物合成以及植酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽水平的控制來(lái)完成。根據(jù)這些已知生物合成途徑，一系列的生化研究和隨后的分子遺傳分析鑒定了LR33種子中的缺陷是由于肌醇1-磷酸合酶活性的改變，導(dǎo)致肌醇1-磷酸合成能力的降低。
棉子糖與水蘇糖的生物合成已被十分清楚的表征[見(jiàn)Dey，P.M.《綠色植物中儲(chǔ)存的碳水化合物的生物化學(xué)》(Biochemistry ofStorage Carbohydrates in Green Plants)(1985)]。肌醇六磷酸或植酸和棉子糖類共有肌醇作為其合成反應(yīng)中的共同中間物[Ishitani，M等.《植物雜志》(The Plant Journal)(1996)9537-548]。以葡萄糖開(kāi)始作為碳源，描述成熟大豆種子中植酸，棉子糖和水蘇糖合成的途徑在附圖1中給出。
根據(jù)附圖1所示的互變反應(yīng)，葡萄糖或蔗糖均可作為植酸的多元醇部分的初始物，組成棉子糖和水蘇糖的全部己糖初始物和棉子糖合酶與水蘇糖合酶半乳糖供體的再循環(huán)部分(肌醇)的初始物。這些在成熟，野生型大豆種子中積累的互變反應(yīng)的終產(chǎn)物是(根據(jù)質(zhì)量的高低次序)蔗糖，水蘇糖，植酸和棉子糖。
公認(rèn)的棉子糖生物合成反應(yīng)涉及從UDP半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖苷(O-α-D吡喃半乳糖基-(1→1)-肌醇)。催化該反應(yīng)的酶是肌醇半乳糖苷合酶。來(lái)自蔗糖的棉子糖族中的棉子糖與較大的同系物的合成由半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，棉子糖合酶和水蘇糖合酶催化。
在許多附圖1中酶催化步驟中，控制這些終產(chǎn)物的比例受互變速率改變的影響。這種控制可受改變酶表達(dá)水平的影響或受改變所述酶的內(nèi)在活性的影響。然后，來(lái)自修飾途徑的終產(chǎn)物所產(chǎn)生的混合物可組成新比例的原終產(chǎn)物以及新產(chǎn)物混合物，其中包括一些正常中間產(chǎn)物的累積物。確切的混合物和組合物將取決于已改變了活性的酶和改變的程度。
六種酶，肌醇1-磷酸合酶，肌醇1-磷酸酶，UDP葡糖4’差向異構(gòu)酶，肌醇半乳糖苷合酶，棉子糖合酶，和水蘇糖合酶的活性可被降低以在不降低蔗糖含量的條件下，降低棉子糖或水蘇糖的合成。在這六種酶中，棉子糖與水蘇糖合成所獨(dú)有的三種酶活性可被降低，而不降低植酸含量。僅有肌醇1-磷酸合酶似乎參與全部三種終產(chǎn)物的合成，因此如果其活性被降低，可同時(shí)改變?nèi)咳N終產(chǎn)物的數(shù)量。
本發(fā)明論述了通過(guò)降低大豆種子細(xì)胞中的肌醇1-磷酸合酶活性而同時(shí)降低大豆種子中棉子糖和植酸含量并增加蔗糖與無(wú)機(jī)磷酸鹽含量的能力。本發(fā)明的實(shí)施例描述了這種酶的突變型的產(chǎn)生和發(fā)現(xiàn)，其中編碼該酶的核苷酸序列中的一個(gè)點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸替換，后者又依次降低了細(xì)胞內(nèi)酶的活性。專業(yè)人員眾所周知肌醇1-磷酸合酶的編碼區(qū)內(nèi)的其他突變可導(dǎo)致降低的酶活性并由此產(chǎn)生本發(fā)明的種子表型。使用眾所周知的異源基因表達(dá)和體外誘變技術(shù)，并應(yīng)用本文描述的各種酶檢測(cè)法，專業(yè)人員可鑒定導(dǎo)致降低的酶活性而無(wú)不適實(shí)驗(yàn)結(jié)果的肌醇1-磷酸合酶編碼區(qū)中的其他突變。然后這些突變的肌醇1-磷酸合酶基因可被引入到大豆基因組(見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,501,967)并導(dǎo)致呈現(xiàn)本發(fā)明表型的新的大豆變種。
或者，可利用基因沉默技術(shù)如反義抑制技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)5,107,065)和共抑制(美國(guó)專利號(hào)5,231,020)降低大豆種子細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)肌醇1-磷酸合酶活性。本說(shuō)明書(shū)論述了編碼野生型大豆肌醇1-磷酸合酶的基因序列。專業(yè)人員將容易意識(shí)到如何制備和如何使用含所述全部或部分野生型序列的嵌合基因或基本上類似的序列以降低大豆種子中的肌醇1-磷酸合酶活性。
因此，本發(fā)明涉及鑒定，表征和處理大豆酶，導(dǎo)致大豆種子的棉子糖，蔗糖，植酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽含量的改變，由此產(chǎn)生有價(jià)值而又有用的大豆產(chǎn)品。如本文所論述的，通過(guò)數(shù)種方法中的任何方法降低肌醇1-磷酸合酶的酶活性將導(dǎo)致大豆種子呈現(xiàn)本發(fā)明的表型。
實(shí)施例在如下實(shí)施例中，本發(fā)明被進(jìn)一步定義，其中所有份數(shù)和百分?jǐn)?shù)是重量，溫度是攝氏，除非另有說(shuō)明。顯而易見(jiàn)，這些實(shí)施例當(dāng)指出為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)，僅是以解釋的方式給出。從上述討論和實(shí)施例中，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可確信能對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修飾以使其適應(yīng)于各種用途和條件而不偏離其宗旨與范圍。而且，本發(fā)明范圍上不受寄存的生物物質(zhì)的限制，因?yàn)樗拇娴纳镂镔|(zhì)是要提供對(duì)物質(zhì)的解釋，從這些物質(zhì)可衍生出許多實(shí)施方案。全部此類修飾均屬于所附權(quán)利要求的范圍。
常用的分子生物學(xué)技術(shù)如細(xì)菌轉(zhuǎn)化，核酸的瓊脂糖凝膠電泳和蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳以描述這些方法的通用術(shù)語(yǔ)相稱。這些技術(shù)的實(shí)踐細(xì)節(jié)(本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知)在[Sambrook等(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)]中有詳細(xì)描述。在實(shí)驗(yàn)操作中使用的各種溶液以其通用名相稱如“SSC”，“SSPE”，“Denhardt’s溶液”等。這些溶液的組合物可通過(guò)參考Sambrook等[上述]的附錄B而找到。
實(shí)施例1提供改進(jìn)的碳水化合物組分的大豆基因的發(fā)現(xiàn)棉子糖含量檢測(cè)下述檢測(cè)被用于分析大豆種子的棉子糖含量。在每次分析測(cè)試確定棉子糖含量前，使種子空氣干燥至少一周直到濕度約為8％，然后在約40到50℃和40％相對(duì)濕度中存放。發(fā)明者自測(cè)試許多這類空氣干燥樣品表明，當(dāng)在這些條件下存放時(shí)，所述濕度不明顯偏離8％(范圍從7到10％)。
每次個(gè)別的棉子糖測(cè)試，一般從一給定的植株取5到10棵大豆在配有100目篩的Cyclotech 1093 Sample Mill(Tecator，Box70 S-26301，Hoganas，Sweden)中研磨生成種子粉末，然后進(jìn)行分析。在多數(shù)情況下，測(cè)定含“現(xiàn)有”溫度為約8％的種子或所獲得產(chǎn)物的棉子糖含量。在這些情況下，“現(xiàn)有”值通過(guò)用0.92除測(cè)量值被轉(zhuǎn)換成干基重(db)。為進(jìn)行某些品系之間或大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品之間的比較，在分析前，將研磨的種子粉末放在45℃的強(qiáng)力通風(fēng)爐中直到所述樣品達(dá)到恒定重量(0％濕度)。因此，除非另有說(shuō)明，在這種條件下所報(bào)道的全部棉子糖測(cè)量值是通用的干基重。
如下所述，使用三種檢測(cè)法(“酶法”，“TLC”和“HPLC”)測(cè)定了大豆中的棉子糖含量。全部三種方法用前述研磨過(guò)程中獲得的種子粉末進(jìn)行。
在準(zhǔn)備“酶法”檢測(cè)過(guò)程中，研磨每個(gè)種子樣品后，將約30毫克得到的粉末稱重到13×100毫米螺旋蓋的試管中并加入1.6毫升氯仿和1.4毫升甲醇∶水(4∶3，v/v)。記錄每個(gè)樣品的精確粉末重量并用來(lái)調(diào)整下述檢測(cè)結(jié)果的樣品重量之間的差別。然后蓋上試管并放在架子中在旋轉(zhuǎn)震蕩器上以1800轉(zhuǎn)/分鐘在室溫下震蕩60分鐘。提取后，使試管中的內(nèi)容物沉降15分鐘。沉降后，每份15微升的甲醇∶水相被放置在96孔微量滴定板的一個(gè)孔中并在45℃干燥20分鐘。被干燥的孔用做反應(yīng)容器以偶聯(lián)“酶法”檢測(cè)，該檢測(cè)如先前的描述使用α半乳糖苷酶和半乳糖脫氫酶[Schiweck and Busching，(1969)Zucker22377-384；Schiweck和Busching，(1975)Zuker28242-243；棉子糖檢測(cè)試劑盒(Raffinose DetectionKit)，Boehringer Mannheim GMBH，目錄號(hào)(Catalog Number)427 167]并修改了檢測(cè)條件。對(duì)檢測(cè)的修改包括加入牛血清白蛋白(15毫克/毫升)到所述檢測(cè)和α半乳糖苷酶緩沖液中，增加α半乳糖苷酶溫孵的溫度和時(shí)間從室溫到45℃和30分鐘，并增加半乳糖脫氫酶溫孵的時(shí)間從20分鐘到60分鐘，并使用水蘇糖代替棉子糖作為α-半乳糖苷的標(biāo)準(zhǔn)。溫孵之后，在BIO-TEKModel EL340微量平板讀數(shù)器測(cè)定樣品在340nm的吸收度。存在于樣品中的α半乳糖苷的量通過(guò)比較已知數(shù)量的水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)確定。為便利分析數(shù)千份樣品，酶檢測(cè)被影印一次，初級(jí)檢測(cè)中呈現(xiàn)棉子糖含量低的品系被隨后在一式三份中再次檢測(cè)(如果足夠物質(zhì)可用的話，從播種開(kāi)始)。在第二次檢測(cè)中其組成成分被確定的品系在田間環(huán)境中培育到成熟并再次檢測(cè)田間培育的植株的種子。在需要有關(guān)棉子糖和肌醇半乳糖苷資料的更具體信息的情況中，由酶檢測(cè)法鑒定的低棉子糖品系用HPLC檢測(cè)(下面描述)進(jìn)行再測(cè)試。
為便于快速篩選棉子糖種質(zhì)，開(kāi)發(fā)出一種薄層層析“TLC”檢測(cè)。在該檢測(cè)中，將約60毫克研磨的種子粉放入13×100毫米螺旋蓋測(cè)試管中，向其中加入1毫升4∶3(v/v)甲醇∶水和1毫升氯仿。蓋上試管放在試管架中，在旋轉(zhuǎn)震蕩器上混合60分鐘，條件為25轉(zhuǎn)/分鐘，室溫。提取之后，將試管在2100轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。從甲醇∶水層中取4微升樣品并放在20×20厘米“Baker″Silica Gel預(yù)吸收/通道化的有250毫米分析層的TLC平板上。使樣品在室溫干燥，然后將平板放在裝有3∶4∶4(v/v/v)的乙酸乙酯∶異丙醇∶20％醋酸(在水中)的溶液的TLC槽中。使所述溶液吸收分析通道10分鐘，此時(shí)移出平板并在通風(fēng)櫥中空氣干燥。然后用苯胺-二苯胺試劑噴淋平板以鑒定所述樣品中的碳水化合物。該試劑通過(guò)1毫升苯胺與100毫升丙酮，1克二苯胺和10毫升磷酸混合來(lái)制備。然后將平板放置在100℃烘箱中15分鐘至干燥并取出使其在讀取分析通道前冷卻。通過(guò)與純品標(biāo)準(zhǔn)所見(jiàn)的洗脫模式比較估計(jì)大豆樣品中水蘇糖與棉子糖的含量。
高效陰離子交換層析/脈沖電流檢測(cè)法(本文稱謂“HPLC”檢測(cè)法)被用于測(cè)定各棉子糖類(例如水蘇糖和棉子糖)，肌醇半乳糖苷的含量，并測(cè)定酶檢測(cè)或TLC檢測(cè)的結(jié)果。研磨和提取種子的條件與先前的“酶法”檢測(cè)所使用的相同。移出750微升一份的水相并在80℃減壓下干燥。然后將干燥物質(zhì)溶解在2毫升水中并劇烈混合30秒鐘。移出100微升1份并用水稀釋到1毫升。再次充分混合樣品，然后10,000Xg離心3分鐘。離心后，用150mM NaOH，1.3毫升/分鐘，室溫下，在DionexTMPA1柱上分析20微升的樣品。DionexTMPAD檢測(cè)儀使用參數(shù)為E1＝0.05v，E2＝0.60v和E3＝-0.60v，輸出信號(hào)范圍是3毫安。在層析條件下可很好地分離肌醇半乳糖苷，葡萄糖，果糖，蔗糖，棉子糖，水蘇糖和毛蕊糖。所述樣品的碳水化合物含量通過(guò)比較與可靠的標(biāo)準(zhǔn)比較確定。
從所述碳水化合物所獲得的分析結(jié)果用軟件SuperANOVA(Abacus Concepts，Inc.，1984 Bonita Avenue，Berkeley，CA94704)進(jìn)行方差分析。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，用Fisher’s Protected LSD作為平均值比較的post-hoc測(cè)驗(yàn)。在其他比較中，如果其標(biāo)準(zhǔn)差(SEM’s)定義的范圍不重疊，則平均值被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在棉子糖類的平均值與對(duì)照品系的平均值比較的情況中，若所述平均值在對(duì)照平均值以下至少三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，則平均值被認(rèn)為明顯低于對(duì)照。誘變與突變體的篩選LR13(與Williams82基本一致的品系)的約130,000個(gè)種子(22.7公斤)被滲泡在150升自來(lái)水中，連續(xù)通風(fēng)8小時(shí)。通風(fēng)是泵入空氣通過(guò)放在滲泡容器低部的標(biāo)準(zhǔn)水族箱“氣石”而完成。吸收液體的種子被干燥并轉(zhuǎn)移到由0.1M磷酸鹽緩沖液在連續(xù)通風(fēng)下，在pH5.5緩沖的98升2.5mM N-亞硝基-甲脲(NMU)溶液。在所述NMU溶液中保持種子3小時(shí)，然后通過(guò)一系列沖洗并瀝出殘留的NMU。在第一次瀝出時(shí)，處理過(guò)的種子被轉(zhuǎn)移到45升自來(lái)水中1分鐘。在第二次瀝出時(shí)種子被轉(zhuǎn)移到45升新鮮自來(lái)水中在連續(xù)通風(fēng)下持續(xù)1小時(shí)。在第三次瀝出時(shí)，種子被轉(zhuǎn)移到45升新鮮自來(lái)水中在連續(xù)通風(fēng)下2小時(shí)。在第四次瀝出時(shí)，種子被轉(zhuǎn)移到連續(xù)通風(fēng)下的45升新鮮自來(lái)水中。兩小時(shí)后，一半種子從第四次瀝出物中移出(亞群1)，而另一半種子從五小時(shí)后的第四次瀝出物中移出(亞群2)。從第四次瀝出物移出后，種子被排出外來(lái)水分并撒在紙板上在太陽(yáng)下曬干一小時(shí)。然后將這種吸收了液體的M1種子進(jìn)行大田種植(Isabela，Puerto Rico，USA)，每行間隔46厘米，行內(nèi)密度約為每英尺14棵種子，而深度在2.5厘米。
從M1植株大量收獲M2種子的兩個(gè)庫(kù)(來(lái)自亞群1和2)。將亞群1的約40,000個(gè)M2種子和來(lái)自亞群2的52,000個(gè)種子種植在Isabela，Puerto Rico，USA。在每個(gè)亞群內(nèi)，收獲3,000個(gè)M2植株中每一個(gè)的5個(gè)豆莢并囤積以獲得大量的M3種子群體。將M3大批種植在Isabela，Puerto Rico。成熟時(shí)來(lái)自5,000M3植株的種子被單獨(dú)收集以從每個(gè)亞群獲得5000 M34品系。
在1991年冬季，篩選總共至少8,000M34品系以用上述的酶法測(cè)量棉子糖類的含量。在初篩時(shí)，鑒定出含降低的棉子糖類的兩個(gè)品系，這證明了這兩個(gè)品系在第二代(自花受粉)是可遺傳的。這些品系之一命名為L(zhǎng)R33，與同樣環(huán)境下對(duì)照的優(yōu)良大豆栽培物相比，該品系已經(jīng)降低了水蘇糖與棉子糖的水平。與生長(zhǎng)在同樣環(huán)境的三種優(yōu)良栽培作物的平均價(jià)值相比，LR33的水蘇糖含量在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上明顯較低。從三代LR33獲得的自花受粉品系收獲的大批種子含量的可溶性碳水化合物含量在表1中給出。
表1自花受粉LR33品系衍生的大豆品系成熟種子中的可溶性碳水化合物品系水蘇糖棉子糖肌醇半乳糖苷蔗糖LR33 6118 0 N.D.11ST-833811 0 1531991原種(平均數(shù)) 9319 0 N.D.12ST-885113 0 2091992原種(平均數(shù)) 6812 0 N.D.13ST-101 2580 1261993原種(平均數(shù)) 7617 0 N.D.1(全部數(shù)值是微摩爾/克)1N.D.未確定結(jié)果品系(1ST-83，2ST-88和3ST-101)全部通過(guò)LR33的自花受粉獲得。三品系中的每個(gè)品系均含比對(duì)照品系低的水蘇糖含量。
實(shí)施例2與LR33低棉子糖表型有關(guān)的生理缺陷的鑒定用LR33作為低棉子糖親本進(jìn)行遺傳雜交在力圖進(jìn)一步降低大豆種子的總棉子糖含量的過(guò)程中，進(jìn)行了LR33與LR28的遺傳雜交。LR28品系在世界專利中請(qǐng)WO93/07742中有描述。簡(jiǎn)言之，它也是一種低結(jié)合棉子糖與水蘇糖的品系，是在極類似于實(shí)施例1中描述的篩選方法中發(fā)現(xiàn)的。低棉子糖與水蘇糖含量在上代與下代之間是一致的。此外，LR28品系的成熟種子和與其他親本雜交衍生的品系的肌醇半乳糖苷含量與野生型大豆種子相比顯著提高了。
培養(yǎng)來(lái)自LR33與LR28雜交的F1植株并自花受粉以產(chǎn)生分離的F2子代。LR28衍生品系的種子，原種栽培種子和LR28與LR33雜交產(chǎn)生的分離群體的種子被種植在同樣的環(huán)境中。從每個(gè)F2植株收獲F23種子并用上述酶檢測(cè)法篩選α-半乳糖苷成分。從初篩得到的低α-半乳糖苷篩選物進(jìn)一步進(jìn)行HPLC檢測(cè)以獲得完整的棉子糖類資料。篩選出的低總α-半乳糖苷含量的典型品系的碳水化合物資料在表2中給出。
表2從LR28與LR33雜交品系以及隨后與原種栽培品系回交獲得的成熟種子中可溶性碳水化合物(LR33和5ST-1003(LR28衍生品系)被包括在內(nèi)作為雜交親本的實(shí)例；2242作為原種栽培品系對(duì)照)品系 水蘇糖棉子糖肌醇半乳糖苷蔗糖LR336118 0 N.D.15ST-14415718 0 N.D.15ST-14346 15 0 2165ST-13090 5 0 28722427518 0 1685ST-1003194 65 200(全部數(shù)值以微摩爾/克計(jì))1N.D.未確定5ST-1441，5ST-1434和5ST-1309全部從LR28與LR33雜交獲得。意外的是，即使5ST-1441品系十分類似于所述LR33親本，品系5ST-1434與5ST-1309的棉子糖與水蘇糖水遠(yuǎn)低于親本品系并且不含LR28品系的升高的肌醇半乳糖苷水平特征。體外檢測(cè)棉子糖類途徑中的酶活性在為找出衍生于LR28與LR33雜交的某些品系中觀察到的意外的棉子糖，水蘇糖和肌醇半乳糖苷表型的原因而設(shè)計(jì)的研究中，在即將進(jìn)入快速棉子糖類生物合成期的生理成熟期前測(cè)量大豆種子中的酶活性和代謝物庫(kù)。從豆莢移出剛剛開(kāi)始發(fā)黃的種子。選擇豆莢也失去綠色或剛剛開(kāi)始發(fā)黃的種子進(jìn)行棉子糖類合成中的最后三個(gè)酶的檢測(cè)(見(jiàn)附圖1)。
從所述豆莢中移出種子，稱重，然后在10個(gè)體積的50mM HEPES-氫氧化鈉，pH7的有5mM 2-巰基乙醇的緩沖液中用研缽和杵研磨。在10，←000xg離心研磨的樣品10分鐘并通過(guò)用研磨緩沖液平衡好的Sephadex G-25使所述上清液脫鹽。
檢測(cè)肌醇半乳糖苷合酶時(shí)，加入10微升脫鹽提取物到含20mM肌醇，10mM二硫蘇糖醇，1mM氯化錳和1mMUDP-[14C]半乳糖(1.25微居里/微摩爾)的90μL、pHT的HEPES緩沖液中。所述檢測(cè)混合物被溫孵在25℃10分鐘，然后加入400微升的乙醇終止反應(yīng)。向終止的反應(yīng)體系中加入200微升Dowex AG-1X8陰離子交換樹(shù)脂(BioRAD)并震搖所述混合物25分鐘。通過(guò)離心除去樹(shù)脂并取上清液進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。取非陰離子放射性作為肌醇半乳糖苷合成的測(cè)量值。
檢測(cè)棉子糖合酶與水蘇糖合酶時(shí)，加入50微升脫鹽提取物到50微升25mM，pH7的HEPES緩沖液中，其中還含10mM二硫蘇糖醇，10mM肌醇半乳糖苷和40mM蔗糖，以檢測(cè)40mM棉子糖或棉子糖合酶以檢測(cè)水蘇糖合酶。25℃溫孵1小時(shí)后，加入40微升的乙醇終止反應(yīng)，然后放在沸水中水浴1分鐘以沉淀蛋白質(zhì)。反應(yīng)混合物被離心到澄清，使上清液通過(guò)0.22微米濾器，然后在真空條件下減壓干燥。所得殘留物被重新溶解在0.5毫升水中并在Dionex HPLC系統(tǒng)上如前述分離20微升用于棉子糖和水蘇糖定量。用1994年8月收獲的野生植株種子所做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在表3中給出。
表3三個(gè)大豆品系的發(fā)黃種子中肌醇半乳糖苷合酶，棉子糖合酶和水蘇糖合酶的活性(野生型對(duì)照是1923品系。酶活性表示為在檢測(cè)條件下每克新鮮種子重量每小時(shí)產(chǎn)生的產(chǎn)物微摩爾數(shù)。數(shù)值是平均值±五個(gè)平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差。)品系肌醇豐乳糖苷合酶 棉子糖合酶 水蘇糖合酶19237.5±4.1 0.10±0.05 0.65±0.18LR2816.5±5.20.004±0.007 0.81±0.24LR28×LR33 22.6±8.80.006±0.008 0.87±0.21棉子糖與水蘇糖合成的三個(gè)關(guān)鍵酶中，與野生型相比，只有棉子糖合酶顯示出在突變株(低棉子糖類品系)中有明顯降低。引起棉子糖合酶活性降低的突變與所述生物合成途徑中該酶的位置以及在只攜帶LR28作為低棉子糖類表型來(lái)源的品系中觀察到的肌醇半乳糖苷積累相一致。肌醇半乳糖苷與蔗糖是棉子糖合酶的兩個(gè)底物，并且兩個(gè)代謝物均在含LR28品系中積累(見(jiàn)附圖1和表2)。
盡管當(dāng)LR33品系與LR28品系雜交時(shí)，所獲得的水蘇糖，棉子糖與肌醇半乳糖苷的水平低，但是由LR28突變提供的降低的棉子糖合酶活性是唯一被改變的活性。雖然似乎LR33品系中的損傷引起的降低的肌醇半乳糖苷合酶活性應(yīng)當(dāng)是與LR28結(jié)合時(shí)所述突變致使肌醇半乳糖苷含量降低的一個(gè)可能候選因素，并沒(méi)有測(cè)量出該酶在體外活性的降低。成熟中的大豆種子游離肌醇含量的檢測(cè)雖然沒(méi)有LR28與LR33雜交中體外肌醇半乳糖苷合酶活性的降低，卻檢測(cè)到了LR33衍生品系的成熟種子中肌醇半乳糖苷合酶體內(nèi)活性受其底物之一可用性限制的可能性。UDP-葡糖4’差向異構(gòu)酶中的突變可使UDP-半乳糖給肌醇半乳糖苷合酶的供應(yīng)減少，而影響其合酶或產(chǎn)生游離肌醇形式(附圖1)的特異性磷酸酶的突變可限制肌醇的供應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)野生型和LR33衍生種子的總游離肌醇成分可核查肌醇庫(kù)。三個(gè)大豆品系，野生型栽培品系A(chǔ)2872，和兩個(gè)LR33×LR28衍生品系(5ST-1434與5ST-1309)在溫室中培養(yǎng)16小時(shí)，每日/夜溫度標(biāo)準(zhǔn)為30℃/20℃。種子是從剛開(kāi)始發(fā)黃的豆莢中取出的，并且豆莢本身正從十分綠色變成黃色。每個(gè)品系取三個(gè)種子在8毫升80％甲醇中研磨。所述混合物在12,000xg離心15分鐘，緩沖液傾入50毫升燒瓶。所述提取重復(fù)兩次并合并上清液。將合并的上清液在40℃真空中干燥，殘留物重新溶解在1毫升水中。重新溶解的提取物通過(guò)3毫升混合的層離子交換樹(shù)脂(BioRad AG501X8)去離子，流出物加4毫升洗滌液被再次減壓干燥。殘留物被重新溶解在500微升的水中并將70微升1份用70％乙腈以1毫升/分鐘流速，通過(guò)HPLC在ZorbaxAmino柱(DuPont)上洗脫而分離。用不同的折射率檢測(cè)柱洗脫物中的糖。蔗糖與肌醇的標(biāo)準(zhǔn)混合物的分離顯示肌醇后出現(xiàn)并只有部分與蔗糖分開(kāi)。在分析所述種子提取物時(shí)，蔗糖峰后的1毫升洗脫物被收集用于按實(shí)施例1的描述再注入DionexPAD系統(tǒng)。在Dionex系統(tǒng)中，肌醇全部在蔗糖前出現(xiàn)并可與染有Zorbax Amino柱級(jí)分的蔗糖完全分開(kāi)。通過(guò)與肌醇的外部標(biāo)準(zhǔn)比較，5微升野生型2872品系的注入物含3.2nmoles的肌醇，而5微升5ST-1434和5ST-1309的注入物分別含0.39和0.23nmoles。
進(jìn)行第二次實(shí)驗(yàn)以表征野生型與LR33衍生種子的游離肌醇含量的差別。取自第二對(duì)照品系(2242)和LR33衍生品系5ST-1434的七個(gè)單一種子按照上述成熟標(biāo)準(zhǔn)收集。所述種子被分別稱重，放置在1.5毫升微離心管中，用刮鏟搗碎，在干冰上冷凍并凍干。干燥的殘留物被稱重并加入1毫升80％甲醇，其中含1微摩爾海藻糖以作為Zorbaxamino柱上的肌醇?xì)埩魳?biāo)記和作為一種內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。所述提取介質(zhì)在60℃被加熱1小時(shí)，再次用小杵在所述離心管中研磨并離心以沉降不溶性物質(zhì)。上清液被轉(zhuǎn)移到含約100微升混合層樹(shù)脂的第二只微離心管中，所述混合物被簡(jiǎn)單震搖并移出20微升所述樹(shù)脂上面的溶液，并在真空中干燥。殘留物被重新溶解在110微升總體積中并取55微升注入Zorbax Amino柱，如上述方法過(guò)柱。收集海藻糖峰并取20微升柱級(jí)分再次注入Dionex系統(tǒng)。通過(guò)與海藻糖內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行肌醇峰的定量。野生型肌醇含量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差是2.18±0.98微摩爾/(克干重)，而5ST-1434種子含0.77±0.32微摩爾/克干重。兩次實(shí)驗(yàn)表明攜帶LR33突變的種子在快速棉子糖合成期含較低的肌醇。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有總肌醇庫(kù)全部丟失的現(xiàn)象。然而，此類實(shí)驗(yàn)僅能測(cè)量總代謝種子庫(kù)，并且肌醇還有另外的途徑，該途徑通過(guò)肌醇半乳糖苷合酶進(jìn)一步限制其使用(附圖1)。肌醇灌注法在棉子糖類體內(nèi)標(biāo)記方面的作用為確認(rèn)是否所觀察到的LR33衍生種子的游離肌醇含量的降低可能是成熟時(shí)棉子糖類降低的原因，進(jìn)行了組織切片灌注研究。按上述成熟標(biāo)準(zhǔn)從野生型品系2242和LR33衍生品系5ST-1434每種收集四個(gè)種子。除去種子外被并在pH5.5的5mM磷酸鉀緩沖液中沖洗子葉，然后切成約1毫米厚的切片并再次用所述緩沖液沖洗。所述組織切片被分成兩組。一組被滲泡在磷酸鉀緩沖液中，而另一組被滲泡在含50mM肌醇的磷酸鉀緩沖液中。所述組織切片被真空滲透過(guò)濾并在室溫溫孵30分鐘。在預(yù)溫孵期后，每組加入5微居里14C葡萄糖并將該組織再次真空滲透過(guò)濾。每組10個(gè)組織切片在加入所述葡萄糖標(biāo)記后被放置2小時(shí)和8小時(shí)。所述組織切片被放置在涂焦油的1.5毫升微離心管中以取得鮮重并在300微升80％甲醇中研磨。所述離心管被離心，移出上清液到第二個(gè)離心管中，重復(fù)所述提取兩次并合并上清液。將在真空中干燥合并的上清液重新溶解在50％乙腈中并在Zorbax aminoHPLC系統(tǒng)中分離。在通過(guò)含葡萄糖，蔗糖，棉子糖和肌醇半乳糖苷的色譜區(qū)時(shí)以15秒間隔收集級(jí)分和通過(guò)含水蘇糖區(qū)時(shí)以1分鐘間隔收集級(jí)分進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。對(duì)應(yīng)于糖標(biāo)準(zhǔn)峰的放射性級(jí)分被分組分析。結(jié)果被表示為表4中給出的四個(gè)糖產(chǎn)物中的標(biāo)記百分?jǐn)?shù)。
表4蔗糖，肌醇半乳糖苷，棉子糖和水蘇糖中的放射性標(biāo)記被表示為用于對(duì)照的結(jié)合糖中的標(biāo)記百分?jǐn)?shù)和在與或未與肌醇預(yù)溫孵的LR33衍生品系中標(biāo)記百分?jǐn)?shù)
野生型與5ST-1434組織切片均轉(zhuǎn)變標(biāo)記從14C葡萄糖成為蔗糖，然后成為肌醇半乳糖苷，棉子糖和水蘇糖。與野生型相比(8小時(shí)后58.9％)，未加入外源肌醇，含LR33突變(5ST-1434)的品系轉(zhuǎn)變很少的標(biāo)記成為棉子糖類(8小時(shí)后，20.5％)。兩種基因型通過(guò)轉(zhuǎn)變更多的所提供的標(biāo)記成為棉子糖類而與外源肌醇相關(guān)。加入肌醇時(shí)，兩種基因型在其首先轉(zhuǎn)變提供的標(biāo)記成為肌醇半乳糖苷，然后轉(zhuǎn)變成棉子糖和水蘇糖的能力方面基本相同。與未經(jīng)滲泡的對(duì)照相比，甚至在野生型品系中轉(zhuǎn)變速率得到增加。
顯然，給肌醇半乳糖苷合酶提供肌醇對(duì)合成棉子糖和水蘇糖的速率總是個(gè)限制。LR33突變的存在使這種限制作用更大。
這種標(biāo)記模式是出人意料的，因?yàn)槿绻拮犹呛厦钢械腖R28突變?nèi)栽诤喜⒌耐蛔兤废抵型ㄟ^(guò)減慢流動(dòng)起作用的話，就不會(huì)有如所期望的肌醇半乳糖苷中的標(biāo)記組合了。雖然加入肌醇可期望通過(guò)肌醇半乳糖苷合酶增加向肌醇半乳糖苷的流動(dòng)，但是所述標(biāo)記由于棉子糖合酶活性的降低而應(yīng)該在那里積累。這種積累的缺乏產(chǎn)生的問(wèn)題是或者LR28突變?cè)谠撈废抵衅鹱饔没蛘咴谠撈废抵写嬖?。LR33突變對(duì)種子植酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽水平的影響上述結(jié)果提示LR33突變存在于附圖1給出的途徑中游離肌醇之前。為進(jìn)一步限制可能的突變部位，測(cè)量了所述途徑的該部位的其他代謝物。
由于大豆種子在成熟時(shí)含20到30微摩爾/克的植酸水平并由于50到70％的總種子磷酸鹽包含在植酸中[Raboy等(1984)《作物科學(xué)》(Crop Science)24431-434]，看來(lái)很可能影響肌醇合成的突變也可影響植酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽的水平。通過(guò)Raboy[上述]描述的方法的修改方法在干燥種子中對(duì)三個(gè)野生型大豆品系和三個(gè)含LR33突變的品系中的植酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽的水平進(jìn)行了檢測(cè)。每個(gè)品系取約20個(gè)種子在一個(gè)小型沖擊研磨機(jī)中研磨并稱重100毫克的所得粉末到15毫升旋蓋試管中。加入5ml的0.4N HCI和0.7M硫酸鈉到所述粉末中并在一個(gè)震動(dòng)平臺(tái)上震蕩混合過(guò)夜。所述試管在3900xg離心15分鐘。移出2毫升上清液到第二只玻璃試管中。加入2毫升水和1毫升15mM氯化鐵，將所述試管在沸水浴中加熱20分鐘。如上述離心所述試管以沉淀鐵∶植酸混合物，棄去上清液。將沉淀物重懸浮于2毫升0.2N HCI中并在沸水浴中加熱10分鐘。將所述沉淀再次用離心法除去并重懸浮在2毫升5mM EDTA中。
取15微升EDTA懸浮液進(jìn)行濕灰化以獲得植酸磷酸鹽。向每只含15微升一份的試管加入10微升10％硝酸鈣溶液。使水蒸發(fā)并在火焰上加熱殘留物直到在所述試管中剩下白灰。所述灰份被溶解在0.3毫升的0.5N HCI中并在90℃加熱20到30分鐘。加入鉬酸鹽試劑(0.7毫升0.36％鉬酸銨和1.42％維生素C在0.86N硫酸中)并顯色1小時(shí)，然后在820nm讀值。
通過(guò)加入0.3毫升的0.5N HCI和0.7毫升的磷酸鹽顯色試劑到20或40微升一份的初始5毫升提取物中測(cè)定無(wú)機(jī)磷酸鹽。在同時(shí)進(jìn)行磷酸鉀標(biāo)準(zhǔn)物的顯色。將所述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，其結(jié)果在表5中給出。
表5在無(wú)機(jī)磷酸鹽和植酸中的種子無(wú)機(jī)磷酸鹽表達(dá)為微摩爾/無(wú)機(jī)磷酸鹽/克(在兩次平行實(shí)驗(yàn)取得多個(gè)值或兩次平行實(shí)驗(yàn)取平均值時(shí)，數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示)種子品系 基因型平行實(shí)驗(yàn)無(wú)機(jī)磷酸鹽植酸磷酸鹽2872 野生型 7 2.7±3 125±8.41923 野生型 1 2.0 1261929 野生型 2 1.5 1555ST-1309 LR334 76.0±5.762.5±12.4G×E-117 LR337 36.7±6.455.8±13.9G×E-76 LR336 32.2±3.572.8±14根據(jù)所獲得突變的遺傳背景的不同，LR33突變還引起種子植酸水平(在植酸組分中表示為磷酸鹽)約兩倍的降低和種子無(wú)機(jī)磷酸鹽含量的約15被到25倍的同時(shí)增加?；诟綀D1的代謝途徑，植酸含量的降低以及游離肌醇含量的降低更可能是由于降低的肌醇1-磷酸合酶的活性的突變所引起。
無(wú)機(jī)磷酸鹽含量的增加的確切原因尚屬未知，但長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為植酸起在植物的種子和其他部位中的磷酸鹽儲(chǔ)存形式的作用。可能，當(dāng)優(yōu)選的儲(chǔ)存平臺(tái)(肌醇)不可利用時(shí)，不斷形成的無(wú)機(jī)磷酸鹽沒(méi)有其他歸宿，而只能簡(jiǎn)單積累。
實(shí)施例3純合LR33品系的種子表型的鑒定分析了幾個(gè)另外的大豆品系的種子無(wú)機(jī)磷酸鹽。將100毫克的研磨種子用1毫升熱水提取并離心除去不溶性物質(zhì)。將上清液用100微升二氯甲烷提取以除去脂類物質(zhì)，用三氯醋酸將所述水提取物的其余部分制成10％溶液。離心所述溶液以除去蛋白質(zhì)并按實(shí)施例2中的描述取5微升上清液分析無(wú)機(jī)磷酸鹽。表6給出這些檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表6野生型，LR28，LR33和LR28×LR33大豆植株種子的無(wú)機(jī)磷酸鹽含量(μmoleg-1)品系 基因型無(wú)機(jī)磷酸鹽A2872 野生型 12.7LR28LR28 12.7LOW2LR28 12.95ST-1190LR28 14.45ST-1191LR28 14.05ST-1441LR33 23.45ST-1309LR28×LR33 117.65ST-1310LR28×LR33 113.95ST-1433LR28×LR33 74.25ST-1434LR28×LR33 57.1G×E-117LR28×LR33 74.3G×E-305LR28×LR33 70.7G×E-76 LR28×LR33 79.1G×E-77 LR28×LR33 58.4全部含LR28突變克隆的品系無(wú)機(jī)磷酸鹽水平與野生型對(duì)照相等。品系5ST-1441來(lái)自LR33(上述實(shí)施例2)并有水蘇糖的平緩降低，這種降低原與所述突變相伴隨。5ST-1441僅有無(wú)機(jī)磷酸鹽含量的略微增加。盡管事實(shí)上兩親本均無(wú)高無(wú)機(jī)磷酸鹽水平，但LR33與LR28雜交所得的全部品系的無(wú)機(jī)磷酸鹽水平明顯上升。
只含LR33突變的品系5ST-1441的中間產(chǎn)物無(wú)機(jī)磷酸鹽表型是出人意料的。這可能表明產(chǎn)生低植酸/高無(wú)機(jī)磷酸鹽表型一定有LR28和LR33突變的存在。然而，如果所述的兩個(gè)突變事實(shí)上發(fā)生在編碼似乎被降低的兩種活性的結(jié)構(gòu)基因中，則它們就在某種意義上與所述代謝途徑無(wú)關(guān)，這提示了對(duì)改變植酸合成的一種附加作用。如果LR33中的突變既影響了游離肌醇又影響了總肌醇的產(chǎn)生，該突變自身就應(yīng)與低植酸和產(chǎn)生的高無(wú)機(jī)磷酸鹽表型有關(guān)。
另一個(gè)解釋可能是品系5ST-144不是LR33突變的純合型，而且對(duì)大量種子的分析僅給出野生型，純合突變型與雜合型種子的平均表型。為檢查這種可能性，將取自大量5ST-1441種子樣品中的13個(gè)單一種子稱重，研磨并用熱水提取。不沉淀蛋白質(zhì)并如前述測(cè)量無(wú)機(jī)磷酸鹽。結(jié)果在表7中給出。
表7品系5ST-1441的13個(gè)種子的大約無(wú)機(jī)磷酸鹽含量(微摩爾/克)(由于樣品中蛋白質(zhì)的存在，與表6的結(jié)果比較的實(shí)際上升數(shù)值)種子號(hào) 機(jī)磷酸鹽5ST-1441-a21.95ST-1441-b30.45ST-1441-c25.45ST-1441-d81.15ST-1441-e29.75ST-1441-f25.75ST-1441-g25.55ST-1441-h30.85ST-1441-i28.25ST-1441-j123.55ST-1441-k27.95ST-1441-l115.95ST-1441-m27.6用字符d，j和l表示的種子比分析的其余10個(gè)種子有高出約3倍的無(wú)機(jī)磷酸鹽。其中的比例接近從分離種子群體的期望值，其中高無(wú)機(jī)磷酸鹽的突變表型是隱性的并且應(yīng)歸因于單基因的活動(dòng)。為檢查這個(gè)推斷，取自5ST-1441大批量樣品的20個(gè)種子被滲泡在室溫的水中共6小時(shí)。篩去多余的水并切下遠(yuǎn)離胚胎莖軸一端的子葉樣品。將該組織切片稱重，放置在1.5毫升微離心管中并在充足的70％甲醇中研磨以得到每100微升提取體積10毫克鮮重。如上述測(cè)量離心后上清液中存在的磷酸鹽，結(jié)果在表8中給出。
表8來(lái)自品系5ST-1441種子的分離群體的20個(gè)部分種子的無(wú)機(jī)磷酸鹽含量種子號(hào) PO4(微摩爾/克鮮重)1 4.92 4.33 5.3440.15 6.16 5.0737.18 9.99 5.9103.811 26.9124.7135.5143.9155.216 17.7175.9184.9192.520 28.9種子4，7，11，16和20被種植在栽培室的花盆中。種子7，11，16和20存活下來(lái)并在實(shí)施例2描述的生長(zhǎng)條件下栽培成熟。來(lái)自所述成熟植株的大批種子和兩種野生型對(duì)照(A2872)被干燥后收集并每株取20個(gè)種子在容器中研磨供使用實(shí)施例1和2中描述的方法分析可溶性碳水化合物與植酸。總種子植酸含量如(植酸磷酸鹽含量)/6計(jì)算。其結(jié)果在表9中給出。
表9來(lái)自攜帶LR33突變種子的分離群體之四個(gè)植株的可溶性碳水化合物含量(表示為微摩爾/克)并選擇與兩個(gè)對(duì)照一起進(jìn)行部分種子中上升的無(wú)機(jī)磷酸鹽分析(植酸值是兩個(gè)復(fù)本的平均值。)品系 植酸水蘇糖棉子糖 肌醇半乳糖苷 蔗糖A287232.3 7119 3 166A287230.8 6724 0 144LR33-7 23.7 4016 0 155LR33-11 8.8 4 13 0 212LR33-16 9.5 4 13 2 209LR33-20 7.6 4 11 0 208盡管7號(hào)(LR33-7)種子長(zhǎng)出的植株的可溶性碳水化合物表型十分類似于表1中給出的LR33突變所描述的表型，但其他植株有十分低水平的棉子糖類和十分高水平的蔗糖。這些可溶性碳水化合物的水平十分類似于表2中的突變體結(jié)合LR28×LR33中的某些植株所描述的表型。對(duì)這種差異的最有可能的解釋是在表1中給出數(shù)據(jù)的大批被分析的種子來(lái)自LR33突變的植株分離，而非所述突變的純合植株。在挑選突變是純合的植株時(shí)，如本實(shí)施例中植株11，16和20所發(fā)生的情況，觀察到真正的純合種子表型。先前有關(guān)產(chǎn)生低棉子糖，水蘇糖和肌醇半乳糖苷的結(jié)合物需要LR28和LR33突變都存在的假設(shè)是不正確的。雖然LR33突變型純合品系不是從自花受粉的原初鑒定的突變品系獲得的，但從其與LR28雜交而產(chǎn)生的分離子可獲得它們。盡管所述雜交的某些后代可能確實(shí)含有兩種突變型，但LR33突變的表型對(duì)從LR28突變產(chǎn)生的表型是顯性的。這種顯性主要來(lái)源于位于LR28突變形成的碳流的LR33突變上游的位置。(見(jiàn)附圖1和實(shí)施例2)。
純合LR33表型仍令人費(fèi)解的原因可能是由于原初突變品系所遇到的發(fā)芽問(wèn)題。在大片分離的條件下，來(lái)自自花受粉LR33的種植種子有25％(該比例已成為突變純合型)丟失沒(méi)有被觀察到。因此，從大批群體收獲的植株的純合型被排除，而突變型基因被保留在雜合狀態(tài)的群體中。我們推測(cè)遺傳背景的異型雜交更易使LR33純合子在大田條件下出現(xiàn)，從而使得發(fā)現(xiàn)純合子。最初的異型雜交屬于攜帶棉子糖類生物合成途徑中的另一突變，這對(duì)于所述雜交的原始意圖是容易發(fā)生的，并且對(duì)超表型或增加在大田中的出現(xiàn)都不是必需的。
因此，LR33突變能產(chǎn)生大豆植物，所述大豆植物產(chǎn)生的種子含每克種子低于5微摩爾水蘇糖，每克種子低于20微摩爾棉子糖，每克種子高于200微摩爾蔗糖和每克種子低于10微摩爾植酸磷酸鹽。
實(shí)施例4含LR33突變型大豆品系的可溶性碳水化合物與植酸含量進(jìn)行低棉子糖類品系LR33與LR28的雜交并通過(guò)實(shí)施例1中描述的HPLC檢測(cè)篩選分離的F2植株，其F2植株種子中有低水平的棉子糖，水蘇糖與肌醇半乳糖苷含量。然后將這種雜交中篩選的品系與優(yōu)良栽培親本雜交，這些雜交的子代以同樣方法在F2代中選擇。在這些含低水平棉子糖類品系中，挑選數(shù)個(gè)有先進(jìn)蔬菜植物農(nóng)藝學(xué)特征的品系。隨后將其中一個(gè)品系(命名為4E76)與另一優(yōu)良大豆栽培植株進(jìn)行測(cè)交，并對(duì)從所述測(cè)交獲得的自花受粉F1植株的單一種子分析其可溶性碳水化合物與無(wú)機(jī)磷酸鹽含量。所述種子分成兩類，具有很低的無(wú)機(jī)磷酸鹽和棉子糖加水蘇糖野生型含量的那些種子，和有升高的無(wú)機(jī)磷酸鹽水平以及很低的棉子糖加水蘇糖水平的較小的一類。這兩類的比例十分接近隱性LR33突變所預(yù)期的3∶1比例。沒(méi)有影響棉子糖類的其他突變的LR28分離證據(jù)出現(xiàn)在原始的雜交中。因此品系4E76代表在選擇的優(yōu)良栽培品種背景中的LR33突變。這種品系被種植在總共9種環(huán)境下兩年以上，同時(shí)進(jìn)行優(yōu)良檢查品系的碳水化合物分析。來(lái)自3種環(huán)境下的一組更多限制的樣品被分析其植酸含量。所述碳水化合物的數(shù)據(jù)在表10中給出，而植酸數(shù)據(jù)在表11中給出。
表10含LR33品系4E76和13個(gè)優(yōu)良栽培品種檢測(cè)的水蘇糖，棉子糖和蔗糖含量平均值，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)與平均值的雙標(biāo)準(zhǔn)差(2SD)(全部數(shù)值表示為微摩爾/克種子重)
表11含LR33品系4E76和優(yōu)良栽培查對(duì)品系A(chǔ)2872的植酸含量的平均值和平均值的雙標(biāo)準(zhǔn)差(全部數(shù)值表示為微摩爾/克種子重量并代表來(lái)自三種環(huán)境的數(shù)據(jù))品系 植酸平均值 SD 2SD4E76 12.3 2.4 4.8A287220.9 0.9 1.8與優(yōu)良大豆栽培品種(典型的上市大豆)比較，所述LR33衍生品系比每克種子重的總棉子糖類質(zhì)量低8到9倍。植酸質(zhì)量也降低約40％。
與優(yōu)良大豆栽培品種比較，LR-33衍生品系棉子糖和水蘇糖質(zhì)量均低。盡管棉子糖含量只略微比優(yōu)良品系中所見(jiàn)值低，但水蘇糖含量則被顯著降低了。已知，在用大豆飼料飼養(yǎng)單胃動(dòng)物時(shí)，大豆棉子糖類對(duì)能量使用效率的有害作用是由于對(duì)α-半乳糖苷鍵的不良消化能力。因此，結(jié)合的棉子糖加水蘇糖含量的降低是對(duì)增加的消化能力的適當(dāng)測(cè)量方法。事實(shí)上，這種測(cè)量方法甚至可能低估了直接的表型效應(yīng)，因?yàn)樗K糖每摩爾糖含兩摩爾的α-半乳糖苷鍵。
成熟大豆的絕對(duì)水蘇糖類含量已知隨環(huán)境因素而有不同。存在于LR33衍生品系中的突變的作用具有足夠的力量使所述品系的結(jié)合棉子糖加水蘇糖含量低于14.5微摩爾/克種子重，并且應(yīng)總是保持遠(yuǎn)低于同樣環(huán)境中生長(zhǎng)的野生型大豆的相應(yīng)含量。
還知道成熟大豆種子的植酸含量相對(duì)于環(huán)境因素，主要是由于土壤中可利用的磷酸鹽的水平的改變而變化。再次重申，LR33衍生品系中存在的突變?cè)诟鞣N生長(zhǎng)環(huán)境下均保持總種子植酸含量低于17微摩爾/克。
實(shí)施例5LR33突變的分子鑒定實(shí)施例2中存在的LR33衍生品系中代謝物分析的證據(jù)提示LR33突變引起種子產(chǎn)生肌醇能力的降低。
在植物以及其他生物中，唯一產(chǎn)生肌醇的途徑是從葡糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換成肌醇-1-磷酸開(kāi)始，該反應(yīng)由肌醇-1-磷酸合酶催化，并終止于特異性肌醇-1磷酸磷酸酶催化的1-磷酸鹽水解(見(jiàn)附圖1；Loews，F(xiàn).A.《植物中的肌醇代謝》(Inositol Metabolism in Plants)(1990)Wiley-Liss，New York，13-19頁(yè)])。由于植酸有作為其可能前體的肌醇-1-磷酸并且由于植酸水平因LR33突變而降低，所以肌醇磷酸合酶的基因及基因產(chǎn)物在野生型中和LR33突變體植株中被表征。野生型大豆肌醇-1-磷酸合酶的cDNA的克隆如下制備cDNA庫(kù)。從豆莢中移出大豆胚胎(每個(gè)約50毫克鮮重)并在液氮中冷凍。冷凍的胚在液氮存在下被磨成細(xì)粉，然后用Polytron勻漿提取并分級(jí)分離以通過(guò)Chirgwin等((1979)《生物化學(xué)》(Biochemistry)185294-5299)的方法富集總RNA。
核酸級(jí)分通過(guò)使總RNA過(guò)oligo-dT纖維素柱而富集polyA+RNA并用如Goodman等((1979)《酶學(xué)法》Meth.Enzymol.6875-90)描述的鹽洗脫polyA+RNA。用cDNA合成系統(tǒng)(Bethesda ResearchLaboratory，Gaithersburg，MD)和廠商的說(shuō)明從純化的polyA+RNA合成cDNA。所得產(chǎn)物雙鏈DNA通過(guò)EcoRI DNA甲基化酶(Promega)甲基化，此前用T4DNA聚合酶(Bethesda Research Laboratory)充填其末端并用T4DNA連接酶(Pharmacia)平頭連接到磷酸化的EcoRI多接頭。用EcoRI酶消化雙鏈DNA，通過(guò)凝膠過(guò)濾柱(SepharoseCL-4B)從過(guò)剩的接頭中分離之，并按照廠商的說(shuō)明連接到λZAP載體(Stratagene)。用GigapackTM包裝提取物(Stratagene)按照廠商的說(shuō)明將所述連接的DNA包入噬菌體。所得cDNA庫(kù)按照每一Stratagene的說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增并儲(chǔ)存在-80℃。
遵循λZAP克隆試劑盒手冊(cè)(Stratagene)，所述cDNA噬菌體庫(kù)被用于感染大腸桿菌XL1細(xì)胞，而總共約300,000噬斑形成單位被鋪到六個(gè)150毫米直徑的培養(yǎng)平板上。
將所述平板的復(fù)本吸印物印跡到纖維素濾膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)。將所述濾膜在含6×SSPE，5×Denhardt’s溶液，0.5％SDS，5％葡聚糖硫酸酯和0.1毫克/毫升變性鮭精DNA(Sigma Chemical Co.)的25毫升雜交緩沖液中于60℃預(yù)雜交2小時(shí)。
然后將封閉的濾膜與從鼠耳芥的cDNA制備的放射性標(biāo)記探針雜交，鼠耳芥已被鑒定其肌醇1-磷酸合酶與酵母肌醇-1-磷酸合酶是同源的[Johnson，M.A.(1994)《植物生理學(xué)》(Plant Phusiol.)1051023-1024]。所述鼠耳芥克隆從Arabidopsis BiologicalResource Center，DNA Stock Center，1060 Carmack Road，Columbus，OH43210-1002獲得，克隆號(hào)為181C18T7113E9T7。通過(guò)用SalI和NotI消化載體DNA移出1.2kBcDNA插入片段，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化所述DNA片段。純化的片段用[32P]dCTP，隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Bethesda Research Laboratory)標(biāo)記。使濾膜在如預(yù)雜交所描述的同樣條件下雜交過(guò)夜。將剩余的放射性標(biāo)記在含0.1％SDS的0.6×SSC中洗去。然后進(jìn)行兩次洗滌，每次在0.2×SSC，0.1％SDS，60℃下約10分鐘以除去非特異性結(jié)合標(biāo)記，并且所述濾膜被用于在感光膠片上曝光過(guò)夜。觀察到約200個(gè)陽(yáng)性信號(hào)。通過(guò)剪下所述信號(hào)周邊區(qū)域，重新鋪噬菌體平板和如上方法重新篩選純化出6個(gè)克隆。使用廠商描述的方法(Strategene)將兩個(gè)克隆剪下成噬菌粒并用于感染大腸桿菌以獲得質(zhì)?？寺　Ｔ趦蓚€(gè)克隆中，一個(gè)稱為p5bmi-1-ps的用Applied Biological Instruments的方法與設(shè)備進(jìn)行測(cè)序。p5bmi-1-ps中的cDNA插入片段的核苷酸序列在SEQ ID NO1中給出，而其推導(dǎo)的氨基酸序列由SEQ ID NO2中的序列編碼。LR33大豆未成熟種子的肌醇1-磷酸合酶的cDNA的克隆來(lái)自編號(hào)為11，16和20的LR33植株的種子以及實(shí)施例3中描述的種子在種子灌漿期約50％時(shí)被收獲，從豆莢中移出并冷凍儲(chǔ)存在-80℃，進(jìn)行mRNA分離時(shí)，來(lái)自大批種子群體的2克冷凍種子用臼和杵在液氮中被研磨。
將冷凍的粉末再次在10毫升總RNA提取緩沖液中研磨，該緩沖液包含10mM Tris-HCI，pH 9，10mM EDTA，0.5％CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，0.8M NaCI，1％2-巰基乙醇，和2％聚乙烯吡咯烷酮。配制全部試劑的水用0.05％焦氨基甲酸二乙酯處理，然后高壓30分鐘。組織漿液被轉(zhuǎn)移到15毫升聚丙烯試管中并在5,500Xg離心15分鐘。上清液通過(guò)Miracloth(Calbiochem)進(jìn)入第二只聚丙烯試管并加入0.3體積的氯仿。在5,500xg離心10分鐘分相，將上層相轉(zhuǎn)移到另一只聚丙烯試管，向其中加入1.5體積的10mM Tris-HCI(pH9)，10mM EDTA，0.5％CTAB和0.1％2-巰基乙醇。室溫溫孵30分鐘后通過(guò)5,500xg離心20分鐘沉淀核酸。
所述核酸被重新溶解在含0.1％2-巰基乙醇的0.4毫升1M NaCl中。用一體積的1∶1酚∶氯仿提取后，用兩體積的乙醇沉淀核酸。
用Pharmacia的mRNA沉淀純化盒從該核酸級(jí)分中純化mRNA。獲得約12微克的mRNA。13ng的聚腺苷酸化的mRNA被用做模板以使用GeneAmpRNA-PCR試劑盒(Perkin Elmer Cetus，Part no.N808-0017)從oligo-dT進(jìn)行擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)在42℃進(jìn)行30分鐘。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，用所述試劑盒廠商提供的DNA聚合酶代替VentTMDNA聚合酶(New England Biolabs)并加入另2微升100mM硫酸鎂到每個(gè)100微升反應(yīng)物中。5’引物序列在SEQ ID NO3中給出，其包含SEQ IDNO1中的第57到77堿基另加堿基5’-GGGAATTCCATATG-3’以編碼NdeI位點(diǎn)，在該引物中有八個(gè)5’的附加堿基促進(jìn)限制酶對(duì)該序列的活性。
3’引物含SEQ ID NO4給出的序列并包含SEQ ID NO1中第1566到1586堿基的反向互補(bǔ)片段，還含有5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGC-3’堿基附加在所述引物中以提供NotI位點(diǎn)，還有另10個(gè)堿基以促進(jìn)限制酶消化反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)在52℃退火溫度和1.5分鐘延長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。獲得一個(gè)約1550堿基對(duì)的產(chǎn)物并通過(guò)Amicon50微離心管濾器而純化，然后用等體積的1∶1酚∶氯仿提取，酚∶氯仿分離相的上層用一個(gè)體積的氯仿提取并用乙醇沉淀。將所得5微克純凈PCR產(chǎn)物用NdeI和NotI在37℃消化過(guò)夜。將限制酶消化物通過(guò)上述酚∶氯仿提取方法除蛋白并連接到2微克用NdeI和NotI消化好并用小牛腸堿性磷酸酶處理以水解其末端磷酸的pET24aT7表達(dá)載體(Novogen)中。所述連接混合物被用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)(electocompetant)DH 10B大腸桿菌細(xì)胞并通過(guò)在含30毫克/升卡那霉素的平板上培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化體。從轉(zhuǎn)化平板挑出18個(gè)單菌落并放在100微升的無(wú)菌水中。40微升的所述細(xì)胞混合物被用做PCR反應(yīng)的DNA模板，該反應(yīng)用TaqTM聚合酶(Perkin Elmer)，所述引物和最初在分離所述cDNA插入片段時(shí)使用的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行。將六個(gè)菌落用做擴(kuò)增正確大小的產(chǎn)物的模板。這些克隆的其余60微升細(xì)胞混合物被培養(yǎng)過(guò)夜并從每個(gè)克隆制備質(zhì)粒DNA制劑。從六個(gè)克隆的每個(gè)克隆純化的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)(electrocompetant)DE3大腸桿菌細(xì)胞。野生型與LR33大豆的肌醇-1-磷酸合酶在大腸桿菌中的功能表達(dá)通過(guò)用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中的引物進(jìn)行p5bmi-1-ps的PCR擴(kuò)增和通過(guò)上述有關(guān)來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄mRNA的LR33肌醇-1-磷酸合酶克隆化的克隆方法將野生型大豆肌醇-1-磷酸合酶放入所述pET24aT7表達(dá)載體中。在這種情況下，顯示出含攜帶所述cDNA插入片段的質(zhì)粒的9個(gè)DH10B克隆來(lái)源的質(zhì)粒制劑被匯集并用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)(electrocompetant)DE3大腸桿菌細(xì)胞。
篩選卡那霉素抗性菌落并挑選六個(gè)用于接種過(guò)夜培養(yǎng)物。使過(guò)夜培養(yǎng)物在30℃的含30毫克/升卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，用新鮮培養(yǎng)基稀釋兩倍，使其在生長(zhǎng)1小時(shí)，通過(guò)加入異丙基硫代半乳糖苷到1mM終濃度進(jìn)行誘導(dǎo)。
3小時(shí)后通過(guò)離心收集細(xì)胞并再懸浮于含0.1mM DTT和0.2mM苯基甲磺酰氟化物的50微升50mMTris-HCI pH8.0中。加入少量1毫米玻璃珠并用微探針超聲發(fā)生器將混合物超聲處理3次，每次5秒鐘。所述混合物被離心并測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)濃度。取每個(gè)克隆培養(yǎng)物的可溶性級(jí)分來(lái)源的1微克蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離。選產(chǎn)生約60千道爾頓質(zhì)量的額外蛋白質(zhì)帶的培養(yǎng)物進(jìn)行活性測(cè)定。
檢測(cè)時(shí)，使用[32P]-γ-ATP作為磷酸的供體通過(guò)己糖激酶催化的葡糖磷酸化來(lái)制備[32P]葡糖-6磷酸。室溫30分鐘后，使所述反應(yīng)混合物過(guò)SEP-PAC C18柱(Millipore Corp.Milford，MA)，該柱首先用80％甲醇然后用水洗滌過(guò)。與另外0.5毫升一起收集過(guò)柱物并通過(guò)SEP-PAC SAX柱，然后用1毫升80％甲醇洗柱。用2毫升0.02N HCl的80％甲醇溶液洗脫[33P]-葡糖-6-磷酸。加入40微升1MTris堿并在真空下除去甲醇。剩余溶液中的葡糖-6-磷酸濃度通過(guò)葡糖-6-磷酸脫氫酶將其轉(zhuǎn)換成6-磷酸葡糖醛酸進(jìn)行測(cè)定。在該反應(yīng)中產(chǎn)生的NADPH通過(guò)340nm吸收度定量。
將10微升細(xì)胞提取物在100微升反應(yīng)物中，37℃溫孵30分鐘，所述反應(yīng)物是2mM葡糖-6-磷酸(57，334dpm總33P)，0.1mM NAD和15mM醋酸銨。所述反應(yīng)物被加熱到90℃以沉淀蛋白質(zhì)，離心到澄清。將47微升的上清液與0.1N NaOH和0.1N醋酸鈉一起上DionexTMPA-1柱，流速0.9毫升/分鐘。灌注后8到10分鐘之間洗脫的標(biāo)準(zhǔn)肌醇1-磷酸和分離的反應(yīng)混合物的1分鐘級(jí)分在相應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)被取來(lái)做閃爍計(jì)數(shù)。加合峰值級(jí)分的放射活性以獲得葡糖-6-磷酸到肌醇-1-磷酸的轉(zhuǎn)化率以及一個(gè)含空pET24aT7載體的對(duì)照大腸桿菌DE3培養(yǎng)物和含大豆肌醇1-磷酸合酶cDNA的兩個(gè)克隆的結(jié)果，它們?cè)诒?2中給出。
表12三個(gè)大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)提取物(大豆克隆1和2含大豆肌醇1-磷酸合酶，而對(duì)照含空質(zhì)粒)的比活性(微摩爾肌醇1-磷酸產(chǎn)生/分鐘/毫克蛋白質(zhì))品系 比活性對(duì)照 0.024微摩爾份鐘/毫克大豆克隆10.524微摩爾/分鐘/毫克大豆克隆20.892微摩爾/分鐘/毫克在所述檢測(cè)進(jìn)行時(shí)，含cDNA的兩個(gè)克隆基本上使用全部可用底物并且因此比對(duì)照品系活性高35倍以上。因此，大豆肌醇1-磷酸合酶基因在大腸桿菌中能產(chǎn)生有功能的酶。
培養(yǎng)野生型大豆肌醇1-磷酸合酶克隆1號(hào)(大豆克隆1)和三個(gè)LR33肌醇1-磷酸合酶克隆用于如上描述的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE分離來(lái)自每個(gè)克隆的可溶性細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)5微克。LR33克隆10號(hào)(LR33-10)產(chǎn)生可溶的，60千道爾頓蛋白質(zhì)，基本上與野生型克隆1號(hào)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)同樣豐富。通過(guò)上面描述的方法，使用100微升反應(yīng)物，其中有3微摩爾NAD和90微摩爾葡糖-6-磷酸，檢測(cè)來(lái)自兩種提取物的每個(gè)提取物的4微克蛋白質(zhì)。野生型肌醇1-磷酸合酶的比活性是1.5nmol/分鐘/毫克蛋白質(zhì)，而在這些條件下LR33衍生的肌醇1-磷酸合酶比活性是0.16nmol/分鐘/毫克蛋白質(zhì)。編碼LR33肌醇1-磷酸合酶的cDNA核苷酸序列使用對(duì)野生型克隆時(shí)所描述的相同質(zhì)粒源和DNA測(cè)序法而得到的克隆的DH10B大腸桿菌菌株測(cè)定克隆LR33-10中的cDNA插入片段的核苷酸序列(含編碼LR33肌醇1-磷酸合酶的核酸片段)。所述核苷酸序列在SEQ ID NO5中給出，而推導(dǎo)的氨基酸序列從SEQ ID NO6中所述克隆的可讀框獲得。通過(guò)編碼鏈上的單堿基對(duì)的改變，SEQ IDNO5的G變成SEQ ID NO1的1241號(hào)堿基的T。這種改變導(dǎo)致第396號(hào)氨基酸從野生型序列中的賴氨酸(SEQ ID NO2)變成LR33氨基酸序列(SEQ ID NO6)中的天冬酰胺。
為確認(rèn)這種堿基對(duì)的改變產(chǎn)生于LR33基因組中的改變，而不是PCR產(chǎn)生的錯(cuò)誤，這種錯(cuò)誤在克隆LR33肌醇1-磷酸合酶時(shí)可能會(huì)發(fā)生，制備了兩套PCR引物。野生型引物(SEQ ID NO7)和LR33引物(SEQ ID NO8)被用于擴(kuò)增來(lái)自大豆栽培品系A(chǔ)2782的干種子和大豆品系LR33第16號(hào)克隆(見(jiàn)表8)制備的基因組DNA。在SEQ ID NO4中描述的PCR引物被用做共同的反義鏈引物。在退火溫度62℃或64℃和35個(gè)進(jìn)行退火和延長(zhǎng)的循環(huán)條件下，當(dāng)使用A2872DNA為模板時(shí)只有野生型引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而當(dāng)使用LR33DNA為模板時(shí)，只有相應(yīng)于LR33序列的引物產(chǎn)生產(chǎn)物。
為進(jìn)一步檢查測(cè)試所述突變的引物的特異性，從實(shí)施例3(見(jiàn)表8)中描述的分離的LR33克隆第7號(hào)品系的種子長(zhǎng)出的六棵單植株制備DNA。在從分離群體檢測(cè)出的六棵單植株中，兩棵提供作為兩引物的模板的DNA，三棵提供作為只與野生型引物在一起的引物的DNA，而一棵提供只與LR33引物在一起產(chǎn)生產(chǎn)物的DNA。這些成為從含一個(gè)野生型和一個(gè)突變型拷貝基因的雜合子的群體所預(yù)期的結(jié)果。
從代謝物數(shù)據(jù)和序列數(shù)據(jù)中，我們總結(jié)出所觀察到的十分低的總棉子糖類，十分高的蔗糖和低植酸的種子表型全部是由于與SEQ IDNO1和SEQ ID NO5中給出的野生型和LR33序列相比而描述的單堿基變化的突變所致。實(shí)施例6轉(zhuǎn)化大豆以達(dá)到肌醇-1-磷酸合酶的基因沉默和相伴隨的種子表型用于轉(zhuǎn)化大豆以減低肌醇-1-磷酸合酶在發(fā)育的大豆種子中的表達(dá)之載體的構(gòu)建含大豆Kunitz Trypsin Inhibitor3(KTi3)啟動(dòng)子[Jofuku和Goldberg，(1989)《植物細(xì)胞》(Plant Cell)11079-1093]控制下的反義和有義方向的大豆肌醇1-磷酸合酶cDNA序列，菜豆7S種子儲(chǔ)存蛋白質(zhì)(菜豆蛋白)啟動(dòng)子[Sengupta-Gopalan等，(1985)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)823320-3324；Hoffman等，(1988)《植物分子生物學(xué)》(Plant Mol.Biol.)11717-729]和大豆β-conglycinin啟動(dòng)子[Beachy等，(1985)《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO J.)43047-3053]的質(zhì)粒被構(gòu)建。通過(guò)使用下述質(zhì)粒pML70，pCW108和pCW109A便利構(gòu)建表達(dá)這些啟動(dòng)子控制下的大豆肌醇-1-磷酸合酶cDNA的載體。
pML70載體含KTi3啟動(dòng)子和KTi3 3’非翻譯區(qū)并且是從市售載體pTZ18R(Pharmacia)通過(guò)中間質(zhì)粒pML51，pML55，pML64和pML65衍生而來(lái)。一個(gè)2.4kb的完整大豆KTi3基因的BstBI/EcoRI片段[Jofuku和Goldberg前文]被連接到pTZ18R的AccI/EcoRI位點(diǎn)以創(chuàng)建質(zhì)粒pML51，所述片段含5’非翻譯區(qū)的全部2039個(gè)核苷酸和終止于與Jofuku等(1989)《植物細(xì)胞》(Plant Cell)427-435中描述的序列的755到761堿基對(duì)應(yīng)的EcoRI位點(diǎn)之KTi3編碼序列的390堿基。將質(zhì)粒pML51用NcoI切開(kāi)，用Klenow充填，并連接(以破壞KTi3插入片段5’非翻譯區(qū)中部的一個(gè)NcoI位點(diǎn))而產(chǎn)生質(zhì)粒pML55。將質(zhì)粒pML55用XmnI/EcoRI部分消化以釋放0.42kb片段(對(duì)應(yīng)于上面引述序列的732到755堿基)。含一個(gè)NcoI位點(diǎn)的合成XmnI/EcoRI接頭通過(guò)制備一個(gè)互補(bǔ)的合成寡聚核苷酸的二聚體而構(gòu)建，所述寡聚核苷酸含一個(gè)XmnI位點(diǎn)(5’-TCTTCC-3’)和一個(gè)NcoI位點(diǎn)(5’-CCATGGG-3’)的編碼序列，后面緊接EcoRI位點(diǎn)的一部分(5’-GAAGG-3’)。通過(guò)一個(gè)短的間隔序列(5’-ATAGCCCCCCAA-3’)將XmnI與NcoI/EcoRI位點(diǎn)連接起來(lái)。將這個(gè)合成接頭連接到4.94kb片段的XmnI/EcoRI位點(diǎn)以創(chuàng)建質(zhì)粒pML64。KTi3基因的3’非翻譯區(qū)從Jofuku等[前文]所描述的序列通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR方法使用引物ML51和ML52擴(kuò)增。引物ML51含對(duì)應(yīng)于上面引述的序列之1072到1091堿基的20個(gè)核苷酸外加在所述引物5’端的對(duì)應(yīng)于EcoRV(5’-GATATC-3’)，NcoI(5’-CCATGG-3’)，XbaI(5’-TCTAGA-3’)，SmaI(5’-CCCGGG-3’)和KpnI(5’-GGTACC-3’)位點(diǎn)的核苷酸。引物ML52含對(duì)應(yīng)于上面引述的序列的1242到1259堿基的確切的核苷酸補(bǔ)體，在所述引物的5’端外加對(duì)應(yīng)于SmaI(5’-CCCGGG-3’)，EcoRI(5’-GAATTC-3’)，BamHI(5’-GGATCC-3’)和SalI(5’-GTCGAC-3’)位點(diǎn)的核苷酸。PCR擴(kuò)增的KTi3基因的3’端被連接到pML64的NcoI/EcoRI位點(diǎn)以創(chuàng)建質(zhì)粒pML65。合成的多克隆位點(diǎn)接頭通過(guò)形成互補(bǔ)合成寡核苷酸二聚體而構(gòu)建，所述二聚體含PstI(5’-CTGCA-3’)，SalI(5’-GTCGAC-3’)，BamHI(5’-GGATCC-3’)和PstI(5’-CTGCA-3’)位點(diǎn)的編碼序列。所述接頭被連接到pML65的PstI位點(diǎn)(緊鄰KTi3啟動(dòng)子區(qū)5’)以創(chuàng)建質(zhì)粒pML70。
pCW108載體含菜豆的菜豆蛋白啟動(dòng)子和3’非翻譯區(qū)并且是從市售pUC18質(zhì)粒(Gibco-BRL)通過(guò)質(zhì)粒AS3和pCW104衍生而來(lái)。質(zhì)粒AS3含495堿基對(duì)的菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白(7S種子儲(chǔ)存蛋白質(zhì))啟動(dòng)子，它開(kāi)始于5’-TGGTCTTTTGGT-3’，后接被克隆到pUC18的HindIII位點(diǎn)的同一基因之3’非翻譯區(qū)完整的1175堿基對(duì)[見(jiàn)Doyle等(1986)《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2619228-9238和Slightom等(1983)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)801897-1901中的序列描述；進(jìn)一步的序列描述可在世界專利申請(qǐng)WO911/3993中找到]。所述pUC18多克隆區(qū)的附加克隆位點(diǎn)(EcoRI，SphI，PstI和SalI)通過(guò)用EcoRI和SalI消化而移除，用Klenow填平末端并再次連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pML104。在5’菜豆蛋白的495bp與3’菜豆蛋白的1175bp之間的新多克隆位點(diǎn)通過(guò)插入一個(gè)互補(bǔ)合成的寡核苷酸二聚體而創(chuàng)建，所述二聚體含NcoI位點(diǎn)(5’-CCATGG-3’)編碼序列，后接三個(gè)充填堿基(5’-TAG-3’)，SmaI位點(diǎn)(5’-CCCGGG-3’)編碼序列，最后是KpnI位點(diǎn)(5’-TAC-3’)的三個(gè)堿基，一個(gè)胞嘧啶和一個(gè)XbaI位點(diǎn)(5’-TCTAGA-3’)編碼序列以創(chuàng)建質(zhì)粒pCW108。該質(zhì)粒含直接與所述菜豆蛋白啟動(dòng)子結(jié)合的唯一的NcoI，SmaI，KpnI和XbaI位點(diǎn)。
載體pCW109A含大豆β-conglycinin啟動(dòng)子序列和菜豆蛋白3’非翻譯區(qū)并且是載體pCW108的一個(gè)修飾版本，后者是從市售質(zhì)粒pUC18(Gibco-BRL)衍生而來(lái)。載體pCW109通過(guò)向克隆載體pUC18的HindIII位點(diǎn)插入β-conglycinin基因的555bp5’非編碼區(qū)(含啟動(dòng)子區(qū))后接含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI，SmaI，KpnI和XbaI(如上面pCW18中所述)的多克隆序列，然后將共同的菜豆蛋白3’非翻譯區(qū)的1174bp插入HindIII位點(diǎn)(如上所述)。
由于在27個(gè)核苷酸位置的差別，所使用的β-conglycinin啟動(dòng)子是發(fā)表的β-conglycinin基因[Doyle等，(1986)《生物化學(xué)雜志》J.Biol.Chem.2619228-9238]的等位基因。這個(gè)基因的進(jìn)一步序列描述可在世界專利發(fā)布WO91/13993中找到。
這三個(gè)核酸構(gòu)建體組成含蓋廣泛的發(fā)育期間，包括為隨后轉(zhuǎn)變成植酸的肌醇合成期之表達(dá)的種子特異性表達(dá)載體，在上面實(shí)施例5中描述的PCR方法便利將SEQ ID NO1和SEQ ID NO5中描述的序列插入這些載體。與SEQ ID NO1或SEQ ID NO5的選擇區(qū)域互補(bǔ)的PCR引物可用附加的堿基合成，所述堿基構(gòu)成限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，而所述內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列選自那些也在pML70，pCW108和pCW109的啟動(dòng)子序列之后的多克隆序列內(nèi)進(jìn)行切割的識(shí)別序列?？蛇x定限制位點(diǎn)的位置以便指導(dǎo)來(lái)自大豆肌醇1-磷酸合酶的核酸片段的取向進(jìn)入有義方向以達(dá)到超表達(dá)或共抑制或進(jìn)入反義方向以達(dá)到次表達(dá)。體細(xì)胞大豆胚胎培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化與大豆植株的再生下列儲(chǔ)液和培養(yǎng)基用于支持體外大豆組織的生長(zhǎng)儲(chǔ)液
培養(yǎng)基成分(每升)SB55SBP6SB103 SB71-1MS硫酸鹽儲(chǔ)液 10mL10mL10mL -MS鹵化物儲(chǔ)液 10mL10mL10mL -MSFeEDTA儲(chǔ)液 10mL10mL10mL -維生素B5儲(chǔ)液 1mL 1mL -1mL2，4-D儲(chǔ)液(10毫克/毫升)1mL 0.5mL --蔗糖 60g 60g -3％麥芽糖 - - 6％ -天冬酰胺 0.667g 0.667g --硝酸銨 0.8g0.8g--硝酸鉀 3.033g 3.033g --氯化鎂 - - 750mg750mg脫乙酰吉蘭糖膠 - - 0.2％0.2％pH 5.7 5.7 5.7 5.7
大豆胚基因懸液培養(yǎng)物被保持在一旋轉(zhuǎn)震蕩器上的35毫升液體培養(yǎng)基中(SB55或SBP6)，150轉(zhuǎn)/分鐘，28℃，熒光燈或白熾燈按168小時(shí)的晝/夜時(shí)間表。通過(guò)每四周接種約35毫克組織到35毫升液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)物的次級(jí)培養(yǎng)。
大豆胚胎懸浮培養(yǎng)物可用含有義或反義方向的肌醇1-磷酸合酶的種子特異性表達(dá)載體通過(guò)粒子槍轟擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化(見(jiàn)Kline等(1987)《自然》(Nature)(London)32770)。DuPont BiolisticTMPDS1000/HE儀器(氦更新法)被用于這些轉(zhuǎn)化。
向50毫升60毫克/毫升的1微摩爾金粒子懸液(依次)加入5微升DNA(1微克/微升)，20微升亞精胺(0.1M)，和50微升氯化鈣(2.5M)。攪拌所述粒子制備液3分鐘，在微離心管中旋轉(zhuǎn)10秒鐘并移出上清液。然后在400微升70％乙醇中洗滌DNA包被的粒子一次并重懸浮在40微升的無(wú)水乙醇中。所述DNA/粒子懸液被超聲三次，每次1秒鐘。然后將5微升DNA包被的金粒子上載到各大載體圓盤(pán)上。
約300-400毫克四周齡的懸浮培養(yǎng)物被放在空的60×15毫米培養(yǎng)皿中并用吸管從組織中移出殘留液體。在每個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，通常轟擊約5-10個(gè)平板的組織。破壞膜的壓力設(shè)置在1000psi且小室被抽成28英寸汞柱的真空。所述組織被放在距離遮擋屏約3.5英寸處并被轟擊三次。轟擊之后，所述組織被放回到液體中并如上述進(jìn)行培養(yǎng)。
轟擊后11天，將所述液體培養(yǎng)基用含50毫克/毫升潮霉素的新鮮SB55替換。此后，每周新?lián)Q選擇性培養(yǎng)基。轟擊7周后，觀察到綠色轉(zhuǎn)化的組織從未轉(zhuǎn)化的壞死胚發(fā)生群體中生長(zhǎng)。分離的綠色組織被移出并接種到各燒瓶中以產(chǎn)生新的，克隆化繁殖的，轉(zhuǎn)化胚胎懸浮培養(yǎng)物。因此，將這種新的品系作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化情況處理。然后通過(guò)次級(jí)培養(yǎng)可維持這些懸浮物作為在未成熟的發(fā)育階段中簇集的胚胎懸液或通過(guò)各體細(xì)胞胚胎的成熟和發(fā)芽而再生成為完整植株。
轉(zhuǎn)化的胚胎簇被從液體培養(yǎng)物中移出并放在不含激素或抗菌素的固體瓊脂糖培養(yǎng)基上(SB103)。將胚胎用混合的熒光燈和白熾燈按16∶8小時(shí)晝/夜時(shí)間表，在26℃培養(yǎng)8周。在此期間，各胚胎可從所述簇集中被移出并分析胚胎發(fā)育的各個(gè)階段。在8周之后，體細(xì)胞胚胎變得適合于發(fā)芽。將在發(fā)芽時(shí)8周齡的胚胎從成熟培養(yǎng)基移出并在空培養(yǎng)皿中干燥1到5天。然后將干燥的胚胎種植在SB71-1培養(yǎng)基，在那里他們被容許在同樣光照和上述發(fā)芽條件進(jìn)行發(fā)芽。然后發(fā)芽的胚胎可被轉(zhuǎn)移到無(wú)菌土壤中并生長(zhǎng)到成熟以便收集種子。
當(dāng)在如上述的液體培養(yǎng)基中的球形胚胎狀態(tài)下，體細(xì)胞大豆胚胎含十分低含量的成熟的，合子大豆胚的典型三酰甘油或儲(chǔ)存蛋白質(zhì)。在這個(gè)發(fā)育階段，總?cè)８视团c總極性脂類(磷脂和糖脂)的比例約為1∶4，這是典型的合子大豆胚，它們處于體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)物開(kāi)始的那個(gè)發(fā)育階段。仍是在球形階段，主要種子蛋白質(zhì)(βconglycinin的α-亞單位，Kunitz胰蛋白酶抑制劑3和大豆種子凝集素)的mRNAs是基本不存在的。當(dāng)轉(zhuǎn)移到無(wú)激素培養(yǎng)基以使之分化成如上所述的成熟體細(xì)胞胚胎狀態(tài)時(shí)，三酰甘油成為最豐富的脂類。而且，βconglycinin的α亞單位的mRNAs，Kunitz胰蛋白酶抑制劑3和大豆種子凝集素成為總mRNA群體中的十分豐富的信息。在這些方面，體細(xì)胞胚胎大豆系統(tǒng)的表現(xiàn)十分類似于在體內(nèi)成熟的合子大豆胚。在早成熟期，存在于所述體細(xì)胞胚中的主要可溶性碳水化合物是蔗糖，葡萄糖和麥芽糖(在所述成熟期期間所提供的糖)。在體細(xì)胞胚成熟并開(kāi)始發(fā)黃時(shí)，棉子糖和水蘇糖均被形成。仍是在這方面，體細(xì)胞胚的表型在其進(jìn)入種子發(fā)育的晚期階段時(shí)十分類似于合子胚。因此對(duì)用種子特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的胚的篩選應(yīng)導(dǎo)致成熟的，豐盛的攜帶同樣表型大豆種子之大豆植株的再生，其中所述載體指導(dǎo)SEQ ID NO1或SEQ IDNO5 l中描述的核苷酸序列按有義或反義方向表達(dá)。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人HITZ，WILLIAM D.
SEBASTIAN，SCOTT ANTHONY(ii)發(fā)明題目產(chǎn)生具有降低的棉子糖類和植酸水平之種子的大豆植物(iii)序列號(hào)8(iv)聯(lián)系地址(A)地址E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY(B)街道1007 MARKET STREET
(C)城市WILMINGTON(D)州DELAWARE(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼19898(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型3.5英寸軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)微軟WINDOWS 95(D)軟件微軟WORD FOR WINDOWS 95(7.0)(vi)現(xiàn)申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(viii)代理人/代理公司信息(A)名稱MAJARIAN，WILLIANM R.
(B)注冊(cè)號(hào)P41，173(C)參考/登記號(hào)BB-1077(ix)電信資料(A)電話(302)992-4926(B)傳真(302)773-0164(2)序列描述SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1782個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(wú)(iv)反義結(jié)構(gòu)無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大豆品系LR13(vii)現(xiàn)有來(lái)源
(B)克隆p5bmi-1-ps(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置54..1586(xi)序列描述SEQIDNO1CTCTTCTTTA TTCCTTTTGT AATTTCATTC ATTCTTAATC TTTGTGAAAA ATAATGTTCA 60TCGAGAATTT TAAGGTTGAG TGTCCTAATG TGAAGTACAC CGAGACTGAG ATTCAGTCCG 120TGTACAACTA CGAAACCACC GAACTTGTTC ACGAGAACAG GAATGGCACC TATCAGTGGA 180TTGTCAAACC CAAATCTGTC AAATACGAAT TTAAAACCAA CATCCATGTT CCTAAATTAG 240GGGTAATGCT TGTGGGTTGG GGTGGAAACA ACGGCTCAAC CCTCACCGGT GGTGTTATTG 300CTAACCGAGA GGGCATTTCA TGGGCTACAA AGGACAAGAT TCAACAAGCC AATTACTTTG 360GCTCCCTCAC CCAAGCCTCA GCTATCCGAG TTGGGTCCTT CCAGGGAGAG GAAATCTATG 420CCCCATTCAA GAGCCTGCTT CCAATGGTTA ACCCTGACGA CATTGTGTTT GGGGGATGGG 480ATATCAGCAA CATGAACCTG GCTGATGCCA TGGCCAGGGC AAAGGTGTTT GACATCGATT 540TGCAGAAGCA GTTGAGGCCT TACATGGAAT CCATGCTTCC ACTCCCCGGA ATCTATGACC 600CGGATTTCAT TGCTGCCAAC CAAGAGGAGC GTGCCAACAA CGTCATCAAG GGCACAAAGC 660AAGAGCAAGT TCAACAAATC ATCAAAGACA TCAAGGCGTT TAAGGAAGCC ACCAAAGTGG 720ACAAGGTGGT TGTACTGTGG ACTGCCAACA CAGAGAGGTA CAGTAATTTG GTTGTGGGCC 780TTAATGACAC CATGGAGAAT CTCTTGGCTG CTGTGGACAG AAATGAGGCT GAGATTTCTC 840CTTCCACCTT GTATGCCATT GCTTGTGTTA TGGAAAATGT TCCTTTCATT AATGGAAGCC 900CTCAGAACAC TTTTGTACCA GGGCTGATTG ATCTTGCCAT CGCGAGGAAC ACTTTGATTG 960GTGGAGATGA CTTCAAGAGT GGTCAGACCA AAATGAAATC TGTGTTGGTT GATTTCCTTG 1020TGGGGGCTGG TATCAAGCCA ACATCTATAG TCAGTTACAA CCATCTGGGA AACAATGATG 1080GTATGAATCT TTCGGCTCCA CAAACTTTCC GTTCCAAGGA AATCTCCAAG AGCAACGTTG 1140TTGATGATAT GGTCAACAGC AATGCCATCC TCTATGAGCC TGGTGAACAT CCAGACCATG 1200TTGTTGTTAT TAAGTATGTG CCTTACGTAG GGGACAGCAA GAGAGCCATG GATGAGTACA 1260CTTCAGAGAT ATTCATGGGT GGAAAGAGCA CCATTGTTTT GCACAACACA TGCGAGGATT 1320CCCTCTTAGC TGCTCCTATT ATCTTGGACT TGGTCCTTCT TGCTGAGCTC AGCACTAGAA 1380TCGAGTTTAA AGCTGAAAAT GAGGGAAAAT TCCACTCATT CCACCCAGTT GCTACCATCC 1440TCAGCTACCT CACCAAGGCT CCTCTGGTTC CACCGGGTAC ACCAGTGGTG AATGCATTGT 1500CAAAGCAGCG TGCAATGCTG GAAAACATAA TGAGGGCTTG TGTTGGATTG GCCCCAGAGA 1560ATAACATGAT TCTCGAGTAC AAGTGAAGCA TGGGACCGAA GAATAATATA GTTGGGGTAG 1620CCTAGCTGAA TGTTTTATGT TAATAATATG TTTGCTTATA ATTTTGCAAG TGTAATTGAA 1680TGCATCAGCT TCATTAATGC TTTAGAGCGG GGCATATTCT GTTTACTAGG AACATGAATG 1740AATGTAGTAT AATTTTGTGT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1782(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度510氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Phe Ile Glu Asn Phe Lys Val Glu Cys Pro Asn Val Lys Tyr Thr1 5 10 15Glu Thr Glu Ile Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Glu Thr Thr Glu Leu Val20 25 30His Glu Asn Arg Asn Gly Thr Tyr Gln Trp Ile Val Lys Pro Lys Ser35 40 45Val Lys Tyr Glu Phe Lys Thr Asn Ile His Val Pro Lys Leu Gly Val50 55 60Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Gly Gly65 70 75 80Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Ile85 90 95Gln Gln Ala Asn Tyr Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Ala Ile Arg100 105 110Val Gly Ser Phe Gln Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu115 120 125Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Ile Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile130 135 140Ser Asn Met Asn Leu Ala Asp Ala Met Ala Arg Ala Lys Val Phe Asp145 150 155 160Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Leu Pro165 170 175Leu Pro Gly Ile Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Glu Glu180 185 190Arg Ala Asn Asn Val Ile Lys Gly Thr Lys Gln Glu Gln Val Gln Gln195 200 205Ile Ile Lys Asp Ile Lys Ala Phe Lys Glu Ala Thr Lys Val Asp Lys210 215 220Val Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Val225 230 235 240Val Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ala Val Asp Arg245 250 255Asn Glu Ala Glu Ile Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Ile Ala Cys Val260 265 270Met Glu Asn Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val275 280 285Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Ala Arg Asn Thr Leu Ile Gly Gly290 295 300Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp305 310 315 320Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn325 330 335His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Thr Phe340 345 350Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Asn355 360 365Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Glu Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val370 375 380Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Lys Arg Ala Met Asp385 390 395 400Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Ser Thr Ile Val Leu405 410 415His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp420 425 430Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Glu Phe Lys Ala Glu435 440 445Asn Glu Gly Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser450 455 460Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn465 470 475 480Ala Leu Ser Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Met Arg Ala Cys485 490 495Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys500 505 510(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(寡核苷酸)(xi)序列描述SEQ ID NO31GGGAATTCCA TATGTTCATC GAGAATTTTA AGGTT 35(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(寡核苷酸)(xi)序列描述SEQ ID NO4AAGGAAAAAA GCGGCCGCTC ACTTGTACTC GAGAATCAT 39(2)SEQID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1775個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型CDNA(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(wú)(iv)反義結(jié)構(gòu)無(wú)(vi)原始來(lái)源(A)有機(jī)體大豆品系LR33(vii)現(xiàn)有來(lái)源(B)克隆LR33-10(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDC(B)位置1..1533(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞點(diǎn)突變(B)位置1188(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGTTCATCG AGAATTTTAA GGTTGAGTGT CCTAATGTGA AGTACACCGA GACTGAGATT60CAGTCCGTGT ACAACTACGA AACCACCGAA CTTGTTCACG AGAACAGGAA TGGCACCTAT 120CAGTGGATTG TCAAACCCAA ATCTGTCAAA TACGAATTTA AAACCAACAT CCATGTTCCT 180AAATTAGGGG TAATGCTTGT GGGTTGGGGT GGAAACAACG GCTCAACCCT CACCGGTGGT 240GTTATTGCTA ACCGAGAGGG CATTTCATGG GCTACAAAGG ACAAGATTCA ACAAGCCAAT 300TACTTTGGCT CCCTCACCCA AGCCTCAGCT ATCCGAGTTG GGTCCTTCCA GGGAGAGGAA 360ATCTATGCCC CATTCAAGAG CCTGCTTCCA ATGGTTAACC CTGACGACAT TGTGTTTGGG 420GGATGGGATA TCAGCAACAT GAACCTGGCT GATGCCATGG CCAGGGCAAA GGTGTTTGAC 480ATCGATTTGC AGAAGCAGTT GAGGCCTTAC ATGGAATCCA TGCTTCCACT CCCCGGAATC 540TATGACCCGG ATTTCATTGC TGCCAACCAA GAGGAGCGTG CCAACAACGT CATCAAGGGC 600ACAAAGCAAG AGCAAGTTCA ACAAATCATC AAAGACATCA AGGCGTTTAA GGAAGCCACC 660AAAGTGGACA AGGTGGTTGT ACTGTGGACT GCCAACACAG AGAGGTACAG TAATTTGGTT 720GTGGGCCTTA ATGACACCAT GGAGAATCTC TTGGCTGCTG TGGACAGAAA TGAGGCTGAG 780ATTTCTCCTT CCACCTTGTA TGCCATTGCT TGTGTTATGG AAAATGTTCC TTTCATTAAT 840GGAAGCCCTC AGAACACTTT TGTACCAGGG CTGATTGATC TTGCCATCGC GAGGAACACT 900TTGATTGGTG GAGATGACTT CAAGAGTGGT CAGACCAAAA TGAAATCTGT GTTGGTTGAT 960TTCCTTGTGG GGGCTGGTAT CAAGCCAACA TCTATAGTCA GTTACAACCA TCTGGGAAAC 1020AATGATGGTA TGAATCTTTC GGCTCCACAA ACTTTCCGTT CCAAGGAAAT CTCCAAGAGC 1080AACGTTGTTG ATGATATGGT CAACAGCAAT GCCATCCTCT ATGAGCCTGG TGAACATCCA 1140GACCATGTTG TTGTTATTAA GTATGTGCCT TACGTAGGGG ACAGCAATAG AGCCATGGAT 1200GAGTACACTT CAGAGATATT CATGGGTGGA AAGAGCACCA TTGTTTTGCA CAACACATGC 1260GAGGATTCCC TCTTAGCTGC TCCTATTATC TTGGACTTGG TCCTTCTTGC TGAGCTCAGC 1320ACTAGAATCG AGTTTAAAGC TGAAAATGAG GGAAAATTCC ACTCATTCCA CCCAGTTGCT 1380ACCATCCTCA GCTACCTCAC CAAGGCTCCT CTGGTTCCAC CGGGTACACC AGTGGTGAAT 1440GCATTGTCAA AGCAGCGTGC AATGCTGGAA AACATAATGA GGGCTTGTGT TGGATTGGCC 1500CCAGAGAATA ACATGATTCT CGAGTACAAG TGA 1533(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度510個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Phe Ile Glu Asn Phe Lys Val Glu Cys Pro Asn Val Lys Tyr Thr1 5 10 15Glu Thr Glu Ile Gln Ser Val Tyr Asn Tyr Glu Thr Thr Glu Leu Val20 25 30His Glu Asn Arg Asn Gly Thr Tyr Gln Trp Ile Val Lys Pro Lys Ser35 40 45Val Lys Tyr Glu Phe Lys Thr Asn Ile His Val Pro Lys Leu Gly Val50 55 60Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Gly Gly65 70 75 80Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Ile85 90 95Gln Gln Ala Asn Tyr Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Ala Ile Arg100 105 110Val Gly Ser Phe Gln Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu115 120 125Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Ile Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile130 135 140Ser Asn Met Asn Leu Ala Asp Ala Met Ala Arg Ala Lys Val Phe Asp145 150 155 160Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Leu Pro165 170 175Leu Pro Gly Ile Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Glu Glu180 185 190Arg Ala Asn Asn Val Ile Lys Gly Thr Lys Gln Glu Gln Val Gln Gln195 200 205Ile Ile Lys Asp Ile Lys Ala Phe Lys Glu Ala Thr Lys Val Asp Lys210 215 220Val Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Val225 230 235 240val Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ala Val Asp Arg245 250 255Asn Glu Ala Glu Ile Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Ile Ala Cys Val260 265 270Met Glu Asn Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val275 280 285Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Ala Arg Asn Thr Leu Ile Gly Gly290 295 300Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp305 310 315 320Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn325 330 335His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Thr Phe340 345 350Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Asn355 360 365Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Glu Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val370 375 380Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Asn Arg Ala Met Asp385 390 395 400Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Ser Thr Ile Val Leu405 410 415His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp420 425 430Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Glu Phe Lys Ala Glu435 440 445Asn Glu Gly Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser450 455 461Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn465 470 475 480Ala Leu Ser Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Met Arg Ala Cys485 490 495Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys500 505 510(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成的寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CGTAGGGGAC AGCAAG16(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成的寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CGTAGGGGAC AGCAAT1權(quán)利要求
1.編碼大豆肌醇-1-磷酸合酶的分離的核酸片段。
2.權(quán)利要求1的核酸片段，其中被編碼的大豆肌醇-1-磷酸合酶的氨基酸序列基本上類似于SEQ ID NO2中給出的氨基酸序列。
3.含有權(quán)利要求1核酸片段或權(quán)利要求1核酸片段的互補(bǔ)片段的嵌合基因，有效連接到適當(dāng)調(diào)節(jié)序列上，其中所述嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致編碼大豆肌醇-1-磷酸合酶的天然基因的表達(dá)降低。
4.含有權(quán)利要求1之核酸片段的次級(jí)片段或權(quán)利要求1的核酸片段之次級(jí)片段的互補(bǔ)片段的嵌合基因，有效連接到適當(dāng)調(diào)節(jié)序列上，其中所述嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致編碼大豆肌醇-1-磷酸合酶的天然基因的表達(dá)降低。
5.編碼具有降低的肌醇-1-磷酸合成能力的突變型肌醇-1-磷酸合酶之分離的核酸片段。
6.權(quán)利要求5的核酸片段，其中被編碼的突變型肌醇-1-磷酸合酶的氨基酸序列基本上類似于SEQ ID NO5中給出的氨基酸序列。
7.至少一種基因是純合的大豆植物，所述基因編碼有降低了肌醇-1-磷酸合成能力的突變型肌醇1-磷酸合酶，所述基因提供一種可遺傳表型(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)假設(shè)所述植物不是LR33，高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量。
8.權(quán)利要求7的大豆植物的種子。
9.含選自如下之組成的大豆植物(i)權(quán)利要求3的嵌合基因；(ii)權(quán)利要求4的嵌合基因；和(iii)權(quán)利要求5的核酸片段；其中所述大豆植物具有可遺傳表型，該表型包括(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)假設(shè)所述植物不是LR33，高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量。
10.權(quán)利要求9的任何大豆植物的種子。
11.使大豆植物具有可遺傳表型的方法，所述表型包括(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量，所述方法包括(a)使LR33或權(quán)利要求9大豆植物的任何一種與優(yōu)良大豆植物雜交；和(b)篩選步驟(a)的具有可遺傳表型的雜交子代植物，所述可遺傳表型包括(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量。
12.從至少一種編碼就突變型肌醇1-磷酸合酶的基因而言是純合的大豆植物的種子獲得的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物，所述合酶具有降低的合成肌醇1-磷酸的能力，所述基因提供一種可遺傳表型，該包括(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量。
13.從加工權(quán)利要求8的大豆種子獲得的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
14.從加工權(quán)利要求10的大豆種子獲得的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
15.產(chǎn)生從至少一種基因是純合的大豆植物種子獲得的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，所述基因編碼一種突變型肌醇1-磷酸合酶，該酶有降低的肌醇-1-磷酸合成能力，所述基因提供一種可遺傳表型，該表型包括(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量。所述方法包括(a)用農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良的大豆植物與LR33或權(quán)利要求9的任何大豆植物雜交；(b)篩選從步驟(a)獲得的子代植物種子，就，(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量；和(c)處理步驟(b)中篩選的種子以獲得需要的大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
16.使用至少一種基因是純合的大豆植物的方法，所述基因編碼一種突變型肌醇1-磷酸合酶，該酶有降低的肌醇-1-磷酸合成能力，所述基因提供一種可遺傳表型，該表型包括(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量，從而產(chǎn)生子代品系，所述方法包括(a)將含具有降低的合成肌醇1-磷酸能力的突變型肌醇1-磷酸合酶的大豆植物與不含該突變的任何大豆親本雜交以產(chǎn)生F1雜交體；(b)雜交的F1代自花受粉至少一代；和(c)鑒定步驟(b)至少一種基因是純合的子代，所述基因編碼一種突變型肌醇1-磷酸合酶，該酶有降低的肌醇-1-磷酸合成能力，所述基因提供一種可遺傳表型，該表型包括(i)低于17微摩爾/克的種子植酸含量，(ii)低于14.5微摩爾/克的棉子糖加水蘇糖結(jié)合的種子含量，和(iii)高于200微摩爾/克的種子蔗糖含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大豆酶的鑒定,表征和處理,所述酶導(dǎo)致大豆種子的棉子糖類,蔗糖,植酸和無(wú)機(jī)磷酸鹽成分的改變,由此導(dǎo)致有價(jià)值和有用的大豆產(chǎn)物。本發(fā)明包括的大豆品系與其他大豆品系種子相比降低了發(fā)育種子的組織中合成肌醇1磷酸能力。如本文所論述的,通過(guò)幾個(gè)方法中的任何方法降低肌醇1磷酸合酶的酶活性將導(dǎo)致呈現(xiàn)本發(fā)明表型的大豆種子。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1252098SQ98804008
公開(kāi)日2000年5月3日 申請(qǐng)日期1998年4月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月8日
發(fā)明者W·D·希茨, S·A·塞巴斯蒂安 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司