專利名稱：植物細胞培養(yǎng)期間改變培養(yǎng)基溫度來大量生產紫杉醇的方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種大量生產植物細胞培養(yǎng)次級代謝物——紫杉醇的方法。
現有技術描述紫杉醇是一種從美國太平洋紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中提取的紫杉烷類化合物，它可有效治療癌癥，如白血病。據報道紫杉醇通過抑制微管解聚分別可治愈30％、50％和20％的卵巢癌，乳腺癌和肺癌。通常情況下，可通過化學全合成，利用前體如巴卡亭進行半合成，從紅豆杉屬植物中直接提取紫杉醇或培養(yǎng)產生紫杉醇的細胞等方法生產紫杉醇。在這些方法中，通過植物細胞培養(yǎng)來生產紫杉醇的方法具有以下優(yōu)點。首先，生產可連續(xù)進行而不必考慮由于枯萎、有害昆蟲或自然災害造成杉樹供應的波動。第二，細胞培養(yǎng)可在大生物反應器中進行，通過控制培養(yǎng)條件可大量生產紫杉醇。第三，細胞培養(yǎng)法與其它方法相比所產生的化合物種類更為簡單，從而大大簡化了分離和提純工作。第四，細胞培養(yǎng)法與其它方法相比對于快節(jié)奏的供求變化適應更快。第五，細胞培養(yǎng)法不僅可生產紫杉醇，而且還可生產出可轉化為紫杉醇的紫杉烷前體如巴卡亭。
以下為本領域中已有的通過植物細胞培養(yǎng)生產紫杉醇的方法USP 5,019,504中公開了一種采用美國太平洋紅豆杉培養(yǎng)細胞生產紫杉醇及其衍生物的方法。其中所描述的紫杉醇產量為1～3mg/L，生物體系倍增的時間為7-12天，這不足以供工業(yè)生產。而且紫杉醇的植物培養(yǎng)產量不穩(wěn)定，甚至通過選擇獲得高產率母代細胞后，其子代培養(yǎng)仍難以保持該產率(E.R.M.Wickremesine等人，World Congress onCell and Tissue Culture(1992))。
WO 93/17121提供了一種通過紅豆杉屬植物細胞培養(yǎng)生產紫杉醇的方法，但改變了培養(yǎng)基的組成、生長速率和產率等。對于中國紅豆杉(Taxus chinensis)，在18天的培養(yǎng)中可獲得24.1mg/L的紫杉醇，每2.5天生物體系培增一次。
所有這些描述紫杉醇大量生產方法的專利均控制細胞培養(yǎng)溫度為25℃；并且所述專利中對此未作說明，而且也已未預計當培養(yǎng)溫度改變時生長速率和產率如何改變。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供一種方便和有效的、用于大量生產紫杉醇的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種方便的生產紫杉醇的方法，其中通過控制植物細胞培養(yǎng)期間的溫度可達到高產率。
本發(fā)明的又一目的是提供一種更為高產的生產紫杉醇的方法，其是通過接種可產生紫杉醇的高濃度的細胞株來進行。
附圖簡述以下描述和附圖將使本發(fā)明的上述以及其它的目的及特征更為明晰，其中

圖1顯示溫度對產生紫杉醇的細胞系——中國紅豆杉SYG-1生長速率的影響。
圖2顯示中國紅豆杉SYG-1培養(yǎng)期間溫度改變對紫杉醇產量的影響。
圖3顯示溫度改變的時間點對中國紅豆杉SYG-1生長的影響發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種在植物細胞培養(yǎng)期間通過改變溫度增加紫杉醇產量水平的方法。更具體而言，本發(fā)明包括一種大量生產紫杉醇的方法，其是在紅豆杉屬植物細胞充分生長后通過改變培養(yǎng)基的培育溫度來高產率地生產紫杉醇。
一般來說，植物中產生的次級代謝物是不影響其生長的。一些次級代謝物參與保護植物免受環(huán)境的影響。在植物細胞培養(yǎng)中，通過調節(jié)與植物防御機制有關的代謝可提高次級代謝物的產量。本發(fā)明開發(fā)了一種在細胞培養(yǎng)期間改變溫度而最大化紫杉醇產量的方法。本發(fā)明還開發(fā)一種增加紫杉醇產量的方法，其中通過增加初始培養(yǎng)細胞的數量并調節(jié)細胞培養(yǎng)基中糖的濃度來達到目的，而糖濃度的調整是依據初始培養(yǎng)細胞的數量進行的，糖的初始濃度可影響代謝。
本發(fā)明的發(fā)明者們首先優(yōu)化了細胞生長的溫度，然后試圖找出通過抑制細胞生長而增加紫杉醇產量的培養(yǎng)溫度。為此，發(fā)明者們在最佳生長溫度下培養(yǎng)紅豆杉屬植物細胞直至獲得足量細胞，然后在另一溫度下培養(yǎng)細胞以增加包括紫杉醇在內的次級代謝物的產量水平。
依據本發(fā)明，紫杉醇的生產包括以下步驟(ⅰ)在培養(yǎng)基中于約20至25℃、優(yōu)選為約20至24℃下培養(yǎng)紅豆杉屬植物細胞；和(ⅱ)當植物細胞充分生長后，將培養(yǎng)溫度變?yōu)榧s26至32℃、優(yōu)選為約28至30℃并繼續(xù)培養(yǎng)以生產紫杉醇。
依賴于植物細胞種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成及其它條件，細胞充分生長的時間點有變化。根據本發(fā)明的實施例，在開始培養(yǎng)l0天后、優(yōu)選為14天或更優(yōu)選為2l天后改變細胞培養(yǎng)溫度。
根據本發(fā)明的方法，當細胞在一略低的溫度下充分生長后，增加培養(yǎng)溫度可增加紫杉醇產量。接種細胞后，需將溫度轉變?yōu)楦哂谏L溫度，為26至32℃、優(yōu)選為28至30℃。認為轉變后的溫度最適于紫杉醇的生成或使參與紫杉醇生物合成的酶的活性最高。
本發(fā)明的方法不受限制地用于紅豆杉屬中的任何植物。例如本發(fā)明的方法可用于美國太平洋紅豆杉、加拿大紅豆杉(Taxus canadensis)、東北紅豆杉(Taxus cuspidata)、漿果紅豆杉(Taxus baccata)、Taxusglobosa、佛羅里達紅豆杉(Taxus floridana)、西藏紅豆杉(Taxuswallichiana)、Taxus x media和中國紅豆杉。
本發(fā)明的植物細胞培養(yǎng)基為補充酪蛋白水解物的B5培養(yǎng)基(Gamborg等人，Exp.Cell Res.50:151-158(1968))。為增加紫杉醇產量水平，優(yōu)選使用表1所示的優(yōu)化B5培養(yǎng)基。此外，可在第5至30天內加入一種糖，優(yōu)選為麥芽糖，至少添加一次，優(yōu)選添加二次；一次在培養(yǎng)開始后第7至12天，而另一次在第18至24天，每次添加量為10至100g/L，優(yōu)選為10至40g/L的單劑量。
表1紅豆杉屬植物細胞培養(yǎng)基組成 濃度(mg/L)無機鹽無水CaCl2113.23
CoCl2·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.025FeSO4·7H2O27.8H3BO33.0KI 0.75KNO32,500MgSO4·7H2O246MnSO4·H2O10NaH2PO4·H2O 150Na2MoO4·2H2O 0.25(NH4)2SO4134ZnSO4·7H2O2維生素肌醇 10煙酸 1戊糖酸鈣0.874鹽酸維生素B6 1維生素B20.015鹽酸維生素B1 10激素萘乙酸鹽10μ M芐基氨基嘌呤 0.2μM酪蛋白水解產物500AgNO31-15μM蔗糖 30,000
本發(fā)明的另一方法包括比正常值如每升4g干細胞更高濃度接種細胞的步驟。對于較高濃度下接種細胞，要求培養(yǎng)基中糖濃度也較正常值如糖用量為40g/L更高。
采用以下實施例進一步說明了本發(fā)明，這些實施例不應被認為是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1培養(yǎng)溫度對紅豆杉屬細胞的生長以及紫杉醇產量的影響在補充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國紅豆杉Hu-1、中國紅豆杉SYG-1(KCTC-0232BP)、漿果紅豆杉、Taxus x media以及東北紅豆杉培養(yǎng)物15天。將每種細胞培養(yǎng)物接種于含75ml表1所列培養(yǎng)基的250ml Erlenmeyer瓶中并于24℃培養(yǎng)20天。在21天時將培養(yǎng)溫度變?yōu)?9℃。在21天和42天時測量干細胞重及紫杉醇產量，結果列于表3中。
采用以下方法測量干細胞重。
首先將一5.5cm濾紙(No.541,Whatman Co.U.S.A)置于一裝配有抽濾瓶的多孔濾斗中。在其上噴蒸餾水使濾紙完全貼于漏斗上。然后將5ml待分析植物細胞培養(yǎng)基鋪展于濾紙上并于減壓下除水。將抽濾過的濾紙置于一鋁箔制成的盤中，并在爐中于80℃干燥24小時。經此步操作后，將濾紙從爐中取出并在室溫下放置10分鐘，然后稱出鋁箔盤和濾紙的總重。減去鋁箔盤和濾紙的預先測定值后再乘以200即得出每升培養(yǎng)基中的干細胞重。
采用表2中HPLC條件定量分析紫杉醇產量。
表2紫杉醇的定量分析條件
表3溫度改變對紅豆杉屬植物細胞生長及紫杉醇產量水平的影響
實施例2溫度對植物細胞生長的影響將預先在補充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天的SYG-1細胞培養(yǎng)物接種于含75ml表1所列培養(yǎng)基的250mlErlenmeyer瓶中，于20℃、24℃、29℃、32℃和36℃培養(yǎng)20天。采用實施例1中的方法測量干細胞重以確定最佳生長溫度。干細胞重的測量結果顯示在圖1中(-●-:20℃；-■-:24℃；-_-:29℃；-_-:32℃；-_-:36℃)。
從圖1中可見在第13天時20℃、24℃、29℃、32℃和36℃所培養(yǎng)的植物細胞的干細胞重分別為8.23、12.3、6、4.5和3.8g/L。
實施例3植物細胞培養(yǎng)期間溫度改變對細胞生長及紫杉醇產量水平的影響為測定細胞在24℃下充分生長后細胞繼續(xù)生長時的溫度改變，將植物細胞——中國紅豆杉SYC-1在以下條件下繼續(xù)生長(1)在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基溫度為24℃(以下為方便起見將其稱為‘24℃對照組’)；(2)保持培養(yǎng)基溫度為24℃直至第21天然后改變?yōu)?9℃(24℃-29℃測試組)；(3)保持培養(yǎng)基溫度為24℃直至第21天然后改變?yōu)?2℃(24℃-32℃測試組)；(4)保持培養(yǎng)基溫度為24℃直至第21天然后改變?yōu)?0℃(24℃-20℃測試組)。測量干細胞重及紫杉醇的產量。
將在補充500mg/L酪蛋白水解物的B5培養(yǎng)基中預培養(yǎng)了14天的SYG-1細胞培養(yǎng)物接種于含75ml表1所列培養(yǎng)基的250ml Erlenmeyer瓶中，然后在24℃下培養(yǎng)。在7天時在每個燒瓶中加入10g/L麥芽糖繼續(xù)培養(yǎng)。在21天時在每個燒瓶中加入20g/L麥芽糖，并將其中一個組的培養(yǎng)溫度維持在24℃。對于其它組，將溫度分別變?yōu)?9℃(24℃-29℃測試組)、32℃(24℃-32℃測試組)和20℃(24℃-20℃測試組)繼續(xù)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)完成后從每組中取出7ml培養(yǎng)物，采用實施例1中的方法測量干細胞重及紫杉醇的產量。結果顯示在表4和圖2中。(-●-:24℃對照組；-■-:24℃-29℃測試組；-_-:24℃-32℃測試組；-_-:24℃-20℃測試組)。24℃-29℃測試組具有最高的紫杉醇產量水平。
表4溫度改變對生長的影響
實施例4溫度改變時間點對生長及紫杉醇產量的影響如實施例3所述培養(yǎng)細胞，但改變溫度改變的時間點以及培養(yǎng)溫度。測量干細胞重及紫杉醇的產量。
采用實施例1中的方法測量在24℃下49天、在29℃下49天、從第8天為29℃、從第15天為29℃和從第22天為29℃培養(yǎng)時的干細胞重及紫杉醇的產量。結果顯示在圖3和表5中。
表5溫度改變時間點對生長及紫杉醇產量的影響
實施例5高濃度下接種的作用測量高濃度下接種以及培養(yǎng)期間溫度改變對細胞生長和紫杉醇產量水平的影響。在測試組1中，將SYG-1在補充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，以1∶4的比例接種于表1的培養(yǎng)基中，并于24℃下培養(yǎng)14天，然后加入3％麥芽糖于24℃下繼續(xù)培養(yǎng)。在測試組2中，所有條件與測試組1相同，只是在第14天后將培養(yǎng)溫度改為29℃。在測試組3中，將細胞接種濃度加倍并在24℃下培養(yǎng)。在測試組4中，所有條件與測試組3相同，只是在第14天后將培養(yǎng)溫度變?yōu)?9℃。在第14天、第28天和第42天測量4個測試組的干細胞重和紫杉醇產量。結果列于表6和表7中。
表6在高濃度下接種時測試組的干細胞重(g/L)
表7在高濃度下接種時測試組的紫杉醇含量(mg/L)以及每克干細胞的產量水平(mg/g)
實施例6高濃度接種和高糖濃度的影響觀測在高濃度細胞接種以及細胞培養(yǎng)期間溫度改變和高糖濃度對細胞生長和紫杉醇產量水平的影響。在測試組1中，將SYG-1在補充了500mg/L酪蛋白水解物的B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，以1∶4的比例接種于表1的培養(yǎng)基中，并于24℃下培養(yǎng)14天，然后加入3％麥芽糖于24℃下繼續(xù)培養(yǎng)。在測試組2中，初始培養(yǎng)基中含6％的麥芽糖，在培養(yǎng)期間不再補充麥芽糖。在測試組3中，所有條件與測試組1相同，只是將細胞接種濃度加倍。在測試組4中，所有條件與測試組3相同，只是在14天后將培養(yǎng)溫度變?yōu)?9℃。在第14天、第28天和第42天測量4個測試組的干細胞重和紫杉醇產量。結果列于表8和表9中。
表8在高濃度下接種時測試組的干細胞重(g/L)
表9在高濃度下接種時測試組的紫杉醇含量(mg/L)以及每克干細胞的產量水平(mg/g)
以上事實清楚地說明和證明了本發(fā)明提供了一種可供工業(yè)用的，有效的方法，用于高產率、大規(guī)模地生產紫杉醇。
權利要求
1.一種通過改變培養(yǎng)溫度來大量生產紫杉醇的方法，其包括以下步驟(ⅰ)于約20至25℃下培養(yǎng)紅豆杉屬植物細胞；和(ⅱ)培養(yǎng)開始后，當植物細胞充分生長時，將培養(yǎng)溫度變?yōu)榧s26至32℃并繼續(xù)培養(yǎng)。
2.如權利要求1所述的大量生產紫杉醇的方法，其中，在培養(yǎng)開始后第10天或之后改變培養(yǎng)溫度。
3.如權利要求1所述的大量生產紫杉醇的方法，其中，在培養(yǎng)開始后第5天至30天補充的10至100g/L的碳源至少添加一次。
4.如權利要求1所述的大量生產紫杉醇的方法，其中，在步驟(ⅰ)的接種中，以干重計紅豆杉屬植物細胞的濃度大于或等于4g/L。
5.如權利要求4所述的大量生產紫杉醇的方法，其中，步驟(ⅰ)中所述的培養(yǎng)在糖濃度大于40g/L的培養(yǎng)基進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產紫杉醇的方法,其中在植物細胞培養(yǎng)期間通過改變溫度增加紫杉醇的產量。依據本發(fā)明,紫杉醇的生產包括以下步驟:(i)在培養(yǎng)基中于約20至25℃下培養(yǎng)紅豆杉屬植物細胞;和(ii)當植物細胞充分生長后,將培養(yǎng)溫度變?yōu)榧s26至32℃并繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明還包括一種增加紫杉醇產量的方法,其中以高初始濃度接種細胞并增加培養(yǎng)基中糖濃度。依據本發(fā)明,可方便地大量生產紫杉醇,并因而具有工業(yè)應用價值。
文檔編號C12P17/02GK1237210SQ98801232
公開日1999年12月1日 申請日期1998年6月25日 優(yōu)先權日1997年6月26日
發(fā)明者崔豪埈, 崔亨均, 金尚翼, 尹晶煥, 孫朱宣, 張文碩, 崔圻修, 金泓樂, 洪承緒, 李賢秀 申請人:株式會社三養(yǎng)吉耐克斯