專利名稱：細(xì)莖雙蝴蝶的組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是細(xì)莖雙蝴蝶的組織培養(yǎng)方法，涉及這種藥用植物的有效快速 繁殖，開發(fā)利用。 技術(shù)背景對雙蝴蝶屬植物的研究，文獻(xiàn)很少，國內(nèi)主要是分類、發(fā)育方面的文章，國外和我國臺灣省對該屬植物的5個(gè)種進(jìn)行了植物化學(xué)成分和藥物功 能活性成分方面的研究。細(xì)莖雙蝴蝶植物，種子細(xì)小，休眠期長，發(fā)芽率 極低，申請者經(jīng)過三年實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該植物種子繁殖時(shí)，其實(shí)生苗有一個(gè)沒 有實(shí)效的幼年期，發(fā)芽后6個(gè)月完成不了二葉期，故不僅發(fā)芽率極低，發(fā) 芽后成苗率也極低，所以種子繁殖難度很大。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需解決的技術(shù)問題是針對細(xì)莖雙蝴蝶植物發(fā)芽率低、發(fā)芽后 成苗率低、種子繁殖難度大的問題，而建立一種高效的細(xì)莖雙蝴蝶的組培 方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的第一步，無菌苗獲得和培養(yǎng)取一年生植株的根莖(靠近地面10公分 的地上莖， 一般從酸性紅壤土的茶林或油茶與馬尾松、油桐、杉樹的混交 林下釆集細(xì)莖雙蝴蝶無病蟲害的莖作為外植體。因?yàn)榭拷孛娴母o比根 莖上面的纏繞莖的生理年齡更年輕，生理年齡越年輕的外植體，其側(cè)芽在 芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上萌發(fā)出新芽的時(shí)間越早、出芽率越高，細(xì)莖雙蝴蝶基 本不形成愈傷組織，都是由休眠側(cè)芽萌發(fā)出芽。)去除葉片和葉柄，剪成6cm長的莖段，先用自來水洗凈后用飽和洗衣粉溶液漂洗l-5分鐘，再用自 來水流水沖洗1-2小時(shí)，然后用蒸餾水沖洗1-2次以后在無菌室內(nèi)于超凈 工作臺上，用75。/。的酒精浸30s，并不斷地?fù)u動，以便充分殺菌。倒掉酒精， 加入0. 1%的升汞溶液和一滴吐溫80浸泡8-10分鐘，以進(jìn)一步消毒。倒掉 升汞溶液后，再用無菌水沖洗6次，置于無菌培養(yǎng)皿中干燥的無菌濾紙上， 吸干表面水分。用利刀切成長1.5cm左右，每段有一個(gè)節(jié)的帶芽莖段，以 下端插入培養(yǎng)基中，節(jié)和腋芽露在培養(yǎng)基外，接種于培養(yǎng)基上。暗培養(yǎng)5 天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。6天后，萌發(fā)培養(yǎng)基上外植體陸續(xù)萌動，長出嫩芽。第二步增殖培養(yǎng)接種后30-35d，芽長l-2cm時(shí)，選健康無雜菌感染 的芽連同外植體一起移入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繁芽培養(yǎng)。接種40天后，苗高 5cm左右，具3-4個(gè)節(jié)，繁殖系數(shù)5. 1，以后每30_35d更換一次培養(yǎng)基。第三步生根培養(yǎng)當(dāng)不定芽長到2-3cm，具3-4片葉時(shí)，將其切下， 轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行根的誘導(dǎo)，培養(yǎng)30天左右，開始長出不定根。第四步煉苗移栽當(dāng)試管苗株高4cm左右，根長2-3cm時(shí)，選擇生 長健壯，根系發(fā)達(dá)的植株進(jìn)行煉苗移栽。先將幼苗移出組培室，置于蔭蔽 度(與日光下相比)7(Fc)左右的溫室內(nèi)閉瓶煉苗3d，進(jìn)行光照適應(yīng)性鍛煉， (經(jīng)對該種植物原產(chǎn)地環(huán)境生態(tài)限制因子的研究，發(fā)現(xiàn)該植物喜分布于下 午背光一面的山坡的油茶林下。經(jīng)照度計(jì)和干濕計(jì)測定，在蔭蔽度70%左右， 云障霧罩的灣糟環(huán)境中生長良好，莖長可達(dá)一米以上，單株莖葉重達(dá)0. 25kg 左右。)再將培養(yǎng)瓶蓋打開一半，半開瓶煉苗1天，再開瓶煉苗一天。然后將苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于裝有珍珠巖紅壤土河砂比例為1: 2: 1基質(zhì)的塑料小花缽中，(其基質(zhì)應(yīng)為0. 1%高錳酸鉀溶液或0. 1%菌絕殺處理24小時(shí))，經(jīng)噴霧(每100kg水+少量MS培養(yǎng)液+1支鏈霉素)洗凈葉面和莖表面，待葉片表面無積水后，用透明塑料袋封好缽口，從第二天起， 每天在封口塑料袋上刺一個(gè)筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，進(jìn)入正常生 長，移栽成活率95%以上。移栽至與原產(chǎn)地環(huán)境相似的油茶權(quán)木林下， 一年纏繞莖長達(dá)50cm以上，兩年內(nèi)可開花結(jié)果，收獲其植物體入藥。 其中上述培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基均由L9(34)正交試驗(yàn)、方差分析選出。① 萌發(fā)培養(yǎng)基MS+ZT 1. Omg. L-1② 增殖培養(yǎng)基MS+6BA 1.8mg. L-1③ 生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.8m. L-1以上培養(yǎng)基均添加3%蔗糖，1.1%卡拉膠，ra5.8，培養(yǎng)溫度25士rc，自控日光燈光源，光強(qiáng)2000LX，光照時(shí)間14h. cT ，增殖時(shí)每30d更換一次培養(yǎng)基。 采用上述方法，具有下列優(yōu)點(diǎn)1. 芽誘分化培養(yǎng)基采用ZTmg/L (玉米素)作為生長刺激素代替 6-BA1. 5mg/L誘導(dǎo)休眠芽萌發(fā)成新芽的誘導(dǎo)率從15%提高到47%.2. 明確肯定不用纏繞莖作外植體，而用近地面10公分的粗壯根莖作為 外植體，這樣外植體不僅生理年齡年輕，而且營養(yǎng)豐富，使萌芽的時(shí)間提 早1天以上，芽也粗壯，這也是繁殖系數(shù)提高的原因，根的條數(shù)增加0.4 條/株。3. 增殖培養(yǎng)基中，6-BA份數(shù)由1. 5mg/L增加到1. 8mg/L，是繁殖系數(shù)提 高的又一原因，每兩個(gè)月可增殖4.6個(gè)芽。4. 在煉苗移栽時(shí)①先在溫室內(nèi)進(jìn)行三天光照適應(yīng)性鍛煉②培養(yǎng)瓶蓋 分兩天，兩步打開，后種入花缽后選用透明塑料薄膜袋封口保濕，防止自 身抗生素物質(zhì)的揮發(fā)，逐漸刺穿封口袋膜，使之受到濕度適應(yīng)性鍛煉，增 加抗菌能力。③用高錳酸鉀和菌絕殺徹底處理基質(zhì)中的病菌，移栽后用鏈霉素稀溶液噴霧一次后封上透明薄膜，使組培苗煉苗時(shí)由于莖的皮層發(fā)達(dá)， 膠狀物質(zhì)多，易于感染病菌導(dǎo)致死亡率高的突出矛盾得到較好解決，也使 該植物因產(chǎn)于高寒山區(qū)林下草叢中，空氣濕度大，莖運(yùn)輸水分能力差，適 應(yīng)干燥空氣能力差的矛盾得以解決。④將基質(zhì)配方中的腐殖土改為原產(chǎn)地3.5-5.5的紅壤土，使土壤中腐敗微生物減少，生境更接近原產(chǎn)地條件，加 上在基質(zhì)中加適量MS營養(yǎng)液，故使移栽成活率提高了 6%，達(dá)到95%以上。 5.用成年材料作外植體經(jīng)組培——營養(yǎng)繁殖產(chǎn)生的植株，不存在沒有實(shí) 效的幼年期?？朔嗽摲N植物種子繁難度大，制約該種藥用植物廣泛開發(fā) 利用的巨大矛盾。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明 第一步獲取無菌苗取一年生植株的根莖，去除葉片和葉柄，剪成 6cm長的莖段，先用自來水洗凈后用飽和洗衣粉溶液漂洗5分鐘，再用自來 水流水沖洗兩小時(shí)，然后用蒸餾水沖洗2次以后在無菌室內(nèi)于超凈工作臺上，用75。/。的酒精浸泡30s ，并不斷地?fù)u動，以便充分殺菌。倒掉酒精，加 入O. 1%的升汞溶液和一滴吐溫一80浸泡10分鐘，以進(jìn)一步消毒。倒掉升 汞溶液后，再用無菌水沖洗6次，置于無菌培養(yǎng)皿中干燥的無菌濾紙上， 吸干表面水分。用利刀切成長1.5cm左右，每段有一個(gè)節(jié)的帶芽莖段，以 下端插入培養(yǎng)基中，節(jié)和腋芽露在培養(yǎng)基外，接種于培養(yǎng)基上。暗培養(yǎng)5 天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。6天后，萌發(fā)培養(yǎng)基上外植體陸續(xù)萌動，長出嫩芽。第二步增殖培養(yǎng)接種后30d，芽長2cm時(shí)，選健康無雜菌感染的芽 連同外植體一起移入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繁芽培養(yǎng)。接種40天后，苗高5cm 左右，具3-4個(gè)節(jié)，繁殖系數(shù)5. 1，以后每35d更換一次培養(yǎng)基。第三步生根培養(yǎng)當(dāng)不定芽長到2cm，具3-4片葉時(shí)，將其切下，轉(zhuǎn) 接入生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行根的誘導(dǎo)，培養(yǎng)30天，開始長出不定根。第四步煉苗移栽當(dāng)試管苗株高4cm左右，根長3cm時(shí)，選擇生長 健壯，根系發(fā)達(dá)的植株進(jìn)行煉苗移栽。先將幼苗移出組培室，置于蔭蔽度 (與日光下相比)70%左右的溫室內(nèi)閉瓶進(jìn)行光照適應(yīng)性鍛煉3(1，再將培養(yǎng) 瓶蓋打開一半，半開瓶煉苗l天，再開瓶煉苗一天。然后將苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于裝有珍珠巖紅壤土河砂比例為l: 2: 1基質(zhì)的塑料小花缽中，(其基質(zhì)應(yīng)為0. 1%高錳酸鉀溶液或0. 1%菌絕殺處理24小時(shí))， 經(jīng)噴霧(每100kg水+少量MS培養(yǎng)液+l支鏈霉素)洗凈葉面和莖表面，待 葉片表面無積水后，用透明塑料袋封好缽口，從第二天起，每天在封口塑 料袋上刺一個(gè)筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，進(jìn)入正常生長。然后，移 栽至與原產(chǎn)地環(huán)境相似的油茶權(quán)木林下。其中上述培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基均由L9(34)正交試驗(yàn)、方差分析選出。① 萌發(fā)培養(yǎng)基MS+ZT l.Omg.L-'② 增殖培養(yǎng)基MS+6BA 1.8mg. L-1③ 生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.8m. L-1以上培養(yǎng)基均添加3%蔗糖，1.1%卡拉膠，PH5.8，培養(yǎng)溫度25。C，自控 日光燈光源，光強(qiáng)2000LX，光照時(shí)間14h. d—"，增殖時(shí)每30d更換一次培養(yǎng) 基。
權(quán)利要求
1.細(xì)莖雙蝴蝶的組織培養(yǎng)方法，其特征在于采用下述步驟第一步，無菌苗獲得和培養(yǎng)取一年生植株的根莖，去除葉片和葉柄，剪成6cm長的莖段，先用自來水洗凈后用飽和洗衣粉溶液漂洗1-5分鐘，再用自來水流水沖洗1-2小時(shí)，然后用蒸餾水沖洗1-2次以后在無菌室內(nèi)于超凈工作臺上，用75％的酒精浸20-30s，并不斷地?fù)u動，以便充分殺菌；倒掉酒精，加入0.1％的升汞溶液和一滴吐溫80浸泡8-10分鐘，以進(jìn)一步消毒，倒掉升汞溶液后，再用無菌水沖洗3-6次，置于無菌培養(yǎng)皿中干燥的無菌濾紙上，吸干表面水分，用利刀切成長1.5cm左右，每段有一個(gè)節(jié)的帶芽莖段，以下端插入萌發(fā)培養(yǎng)基中，節(jié)和腋芽露在萌發(fā)培養(yǎng)基外，接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，6天后萌發(fā)培養(yǎng)基上外植體陸續(xù)萌動，長出嫩芽；第二步增殖培養(yǎng)接種后30-35d，芽長1-2cm時(shí)，選健康無雜菌感染的芽連同外植體一起移入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繁芽培養(yǎng)；接種40天后，苗高5cm左右，具3-4個(gè)節(jié)，繁殖系數(shù)5.1，以后每30-35d更換一次培養(yǎng)基；第三步生根培養(yǎng)當(dāng)不定芽長到2-3cm，具3-4片葉時(shí)，將其切下，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行根的誘導(dǎo)，培養(yǎng)30天；第四步煉苗移栽當(dāng)試管苗株高4cm左右，根長2-3cm時(shí)，選擇生長健壯，根系發(fā)達(dá)的植株進(jìn)行煉苗移栽，先將幼苗移出組培室，置于與日光下相比蔭蔽度為70％的溫室內(nèi)閉瓶煉苗3d，進(jìn)行光照適應(yīng)性鍛煉，再將培養(yǎng)瓶蓋打開一半，半開瓶煉苗1天，再開瓶煉苗一天，然后將苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于裝有珍珠巖紅壤土河砂比例為1∶2∶1的基質(zhì)的塑料小花缽中，其基質(zhì)應(yīng)為0.1％高錳酸鉀溶液或0.1％菌絕殺處理24小時(shí)，經(jīng)每100kg水+少量MS培養(yǎng)液+1支鏈霉素噴霧洗凈葉面和莖表面，待葉片表面無積水后，用透明塑料袋封好缽口，從第二天起，每天在封口塑料袋上刺一個(gè)筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，進(jìn)入正常生長，移栽至與原產(chǎn)地環(huán)境相似的油茶權(quán)木林下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)莖雙蝴蝶的組織培養(yǎng)方法，其特征是上述培 養(yǎng)基均由L9(34)正交試驗(yàn)、方差分析選出，其中① 萌發(fā)培養(yǎng)基:MS+ZT l.Omg丄-1② 增殖培養(yǎng)基MS+6BA 1.8mg. L-1③ 生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.8m. L」以上培養(yǎng)基均添加3%蔗糖，1. 1%卡拉膠，PH5.8，培養(yǎng)溫度25士rC，自控日 光燈光源，光強(qiáng)2000LX，光照時(shí)間14h. d—^ ，增殖時(shí)每30d更換一次培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明是細(xì)莖雙蝴蝶的組織培養(yǎng)方法，是一種用于雙蝴蝶屬植物組織培養(yǎng)方法，涉及一種植物培養(yǎng)方法。該方法包括無菌苗獲得和培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，煉苗移栽等四個(gè)步驟。其中，上述培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基均由L9(3⁴)正交試驗(yàn)、方差分析選出。①萌發(fā)培養(yǎng)基MS+ZT 1.0mg.L-¹；②增殖培養(yǎng)基MS+6BA 1.8mg.L-¹；③生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.8m.L-¹以上培養(yǎng)基均添加3％蔗糖，1.1％卡拉膠，pH5.8，培養(yǎng)溫度25±1℃，自控日光燈光源，光強(qiáng)2000LX，光照時(shí)間14h.d^-1，增殖時(shí)每30d更換一次培養(yǎng)基。該方法可以提高新芽的誘導(dǎo)率，繁殖系數(shù)和移栽成活率，克服了該種藥用植物種子繁難度大的問題。
文檔編號C12N5/04GK101248758SQ200810030759
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者李國民, 田宏現(xiàn) 申請人:吉首大學(xué)