專利名稱：梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)產(chǎn)生天然生根劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種由梔子細(xì)胞培養(yǎng)生成的促進(jìn)植物生根物質(zhì)--梔子甙(Geniposide，Jasminoidin)的方法，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法，可以得到較高產(chǎn)率的植物細(xì)胞，進(jìn)而提取促進(jìn)植物生根作用的梔子甙。
梔子體內(nèi)特別是梔子果實(shí)中都含有能促進(jìn)植物生根的物質(zhì)環(huán)烯醚萜甙類成分，如梔子甙(Geniposide，Jasminoidin)，羥異梔子甙(Gardenoside)及京尼平-1-0-龍膽雙糖甙(Genipin1-0-1-gentiobioisde)等。但無論是野生還是人工栽培均存在野生資源少，缺乏環(huán)境保護(hù)，栽培技術(shù)跟不上和勞力昂貴等問題。將其應(yīng)用于大力提高現(xiàn)有土地面積上的農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量的農(nóng)業(yè)技術(shù)中，還存在著嚴(yán)重的供不應(yīng)求之勢。
本發(fā)明的目的在于提供一種梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)天然生根劑的方法，其可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模地工業(yè)生產(chǎn)，不受季節(jié)和土地面積的限制。
本發(fā)明提供了一種梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然生根劑的方法，所生產(chǎn)的生根劑中除含有部分色素和糖外，主要含有梔子甙1～9‰，羥異梔子甙1～9‰，京尼平-1-0-龍膽雙糖甙1～9‰，該方法包括梔子細(xì)胞組織的建立、培養(yǎng)及梔子甙提取步驟，其特征在于(1)采用的梔子細(xì)胞組織是由梔子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織；(2)所使用的培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，組分如下大量元素NH4NO31000～2000(mg/L)KNO31500～2500CaCl2·2H2O 300～500MgSO4·7H2O 150～200微量元素KI1.5～1.7H3BO35.5～7.0MnSO4·7H2O 20～25ZnSO4·7H2O 5～15Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5
CuSO4·5H2O 0.01～0.03CoCl2·6H20.01～0.03Na2EDTA35～40FeSO4·7H2O 20～30生長調(diào)節(jié)物質(zhì)肌醇80～120煙酸0.3～0.7鹽酸吡哆醇B10.3～0.7鹽酸硫胺素B60.05～0.2甘氨酸 1.0～3.0α-萘乙酸(NAA) 0.5～5激動(dòng)素(KT) 0.05～0.5蔗糖1.0～5.0瓊脂0～5.0pH值5.0～6.5(3)梔子細(xì)胞的培養(yǎng)條件(a)固體培養(yǎng)改良的MS固體培養(yǎng)基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，濕度60～85％，光強(qiáng)1000～3000lx；(b)液體培養(yǎng)改良的MS液體培養(yǎng)基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，轉(zhuǎn)速50～150rpm，光強(qiáng)1000～3000lx。
本發(fā)明中梔子愈傷組織的誘導(dǎo)過程是取梔子植株上的葉片，清洗，消毒，切片，平鋪在改良的固體MS培養(yǎng)基上，溫度為20～30℃，濕度60～85％，光強(qiáng)1000～3000lx條件下培養(yǎng)20～40天，葉片切口部分隆起，長出的一團(tuán)團(tuán)淡黃色細(xì)胞團(tuán)即為梔子愈傷組織。
本發(fā)明中梔子甙的提取為將梔子細(xì)胞用甲醇浸提。
本發(fā)明提供的梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)的天然生根劑，在使用時(shí)需要稀釋100～1000倍，高于此濃度對(duì)植物生長有抑制作用，通常情況下浸種稀釋500～1000倍；拌種稀釋500～1000倍；葉面噴施稀釋300～600倍。
本發(fā)明由于采用細(xì)胞組織培養(yǎng)的方法生產(chǎn)梔子甙天然生根劑，因而不受季節(jié)限制(一年四季均可生產(chǎn))，占地面積小，易于篩選優(yōu)秀品種，所生產(chǎn)的梔子甙易溶于水，含量高，能促進(jìn)植物生根，便于工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的市場前景。下面通過實(shí)施例詳述本發(fā)明。
附

圖1為梔子細(xì)胞優(yōu)良株系的選育流程。
實(shí)施例11.梔子愈傷組織的誘導(dǎo)1)從梔子植株上取葉片用清水洗凈(以下步驟均在無菌室超凈工作臺(tái)上進(jìn)行)；2)洗凈的葉片用8％NaClO3消毒10min后用無菌水沖洗3～5次，將水用無菌紙吸干；3)將葉片切成約1cm的小方塊，平鋪在改良的MS培養(yǎng)基上，在溫度為25℃，濕度為75％，光強(qiáng)2000lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4)培養(yǎng)一個(gè)月左右的葉片，其邊緣切口部分隆起，長出一團(tuán)團(tuán)淡黃色的細(xì)胞團(tuán)，即為梔子愈傷組織。
2.改良的MS培養(yǎng)基大量元素NH4NO31650(mg/L)KNO31900CaCl2·2H2O 400MgSO4·7H2O 190KH2PO4170微量元素KI 1.66H3BO36.20MnSO4·7H2O 22.3ZnSO4·7H2O 8.60Na2MoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O 0.025CoCl2·6H2O 0.025Na2EDTA 37.3FeSO4·7H2O 27.8肌醇100煙酸0.5鹽酸吡哆醇B10.5
鹽酸硫胺素B60.1甘氨酸 2.0α-萘乙酸(NAA) 1.0激動(dòng)素(KT) 0.1蔗糖3.0(％)瓊脂0.8pH值5.83.梔子固體細(xì)胞及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的建立1)將以上生長旺盛的淡黃色細(xì)胞團(tuán)取下，轉(zhuǎn)入新配制了的改良MS固體培養(yǎng)基中，接種量1g/100ml，在溫度為25℃，濕度為75％，光強(qiáng)為2000lx的光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)多次重復(fù)，即可獲得性狀比較一致的細(xì)胞株系，即為細(xì)胞固體培養(yǎng)。
2)將繼代3～5次的固體培養(yǎng)細(xì)胞，壓碎轉(zhuǎn)接到改良MS液體培養(yǎng)基中，接種量2g/100ml，在溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為80rpm，光強(qiáng)為2000lx的搖床上培養(yǎng)。
3)培養(yǎng)一個(gè)月左右后，將所培養(yǎng)的梔子細(xì)胞上清培養(yǎng)液濾去，加入新的液體改良MS培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)即為梔子懸浮培養(yǎng)。
4.梔子愈傷組織和懸浮細(xì)胞的生物量
植物組織培養(yǎng)的細(xì)胞生長速率一般固體培養(yǎng)為10g/L.d，懸浮培養(yǎng)為20g/L.d。
5.梔子細(xì)胞中粗梔子甙的制備方法1)梔子懸浮細(xì)胞離心，除去水分；2)沉淀的細(xì)胞加400ml甲醇冷浸48h后離心，上清待用；
3)沉淀后再加300ml甲醇冷浸2h后離心，此過程重復(fù)三次，上清待用；4)將離心所得全部上清液合并，用減壓蒸餾法濃縮，除去甲醇；5)濃縮后的干品加入1～3倍的蒸餾水溶解，即為梔子甙粗提取液，粗梔子甙液中除含有部分色素和糖外，其主要成分為梔子甙 0.297％環(huán)烯醚萜甙類羥異梔子甙 0.260％京尼平-1-0-龍膽雙糖甙 0.212％實(shí)施例2 梔子細(xì)胞改良MS培養(yǎng)基中激素對(duì)細(xì)胞生物量的影響
實(shí)施例3 不同培養(yǎng)方式所產(chǎn)生的粗梔子甙
實(shí)施例4 粗梔子甙用于小麥的生根作用
>本發(fā)明梔子甙可以用作為一般植物如糧食、蔬菜、水果等促進(jìn)其根系生長的生根劑。應(yīng)用浸種、沾根、拌種及葉面噴施等方法，均能促使植物根系發(fā)達(dá)，提高產(chǎn)量，使用濃度范圍為稀釋100～1000倍。
權(quán)利要求
1.一種梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然生根劑的方法，所生產(chǎn)的生根劑中除含有部分色素和糖外，主要含有梔子甙1～9‰，羥異梔子甙1～9‰，京尼平-1-0-龍膽雙糖甙1～9‰，該方法包括梔子細(xì)胞組織的建立、培養(yǎng)及梔子甙提取步驟，其特征在于(1)采用的梔子細(xì)胞組織是由梔子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織；(2)所使用的培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，組分如下大量元素NH4NO31000～2000(mg/L)KNO31500～2500CaCl2·2H2O 300～500MgSO4·7H2O 150～200微量元素KI1.5～1.7H3BO35.5～7.0MnSO4·7H2O 20～25ZnSO4·7H2O 5～15Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5CuSO4·5H2O 0.01～0.03CoCl2·6H20.01～0.03Na2EDTA 35～40FeSO4·7H2O 20～30生長調(diào)節(jié)物質(zhì)肌醇 80～120煙酸0.3～0.7鹽酸吡哆醇B10.3～0.7鹽酸硫胺素Be0.05～0.2甘氨酸 1.0～3.0α-萘乙酸(NAA) 0.5～5激動(dòng)素(KT) 0.05～0.5蔗糖1.0～5.0瓊脂0～5.0pH值 5.0～6.5(3)梔子細(xì)胞的培養(yǎng)條件(a)固體培養(yǎng)改良的MS固體培養(yǎng)基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，濕度60～85％，光強(qiáng)1000～3000lx；(b)液體培養(yǎng)改良的MS液體培養(yǎng)基，接種量1～5g/100ml，溫度20～30℃，轉(zhuǎn)速50～150rpm，光強(qiáng)1000～3000lx。
2.按照權(quán)利要求1所述梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然生根劑的方法，其特征在于梔子愈傷組織的誘導(dǎo)過程是取梔子植株上的葉片，清洗，消毒，切片，平鋪在改良的固體MS培養(yǎng)基上，溫度為20～30℃，濕度60～85％，光強(qiáng)1000～3000lx條件下培養(yǎng)20～40天，葉片切口部分隆起，長出的一團(tuán)團(tuán)淡黃色細(xì)胞團(tuán)即為梔子愈傷組織。
3.按照權(quán)利要求1所述梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然生根劑的方法，其特征在于梔子甙的提取為將梔子細(xì)胞用甲醇浸提。
全文摘要
一種梔子細(xì)胞組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然生根劑的方法,該方法包括梔子細(xì)胞組織的建立、培養(yǎng)及梔子甙提取步驟,其特征在于:(1)采用的梔子細(xì)胞組織是由梔子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織;(2)所使用的培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基;(3)梔子細(xì)胞的培養(yǎng)條件:(a)固體培養(yǎng):改良的MS固體培養(yǎng)基, 接種量1～5g/100ml,溫度20～30℃,濕度60～85%,光強(qiáng)1000～3000lx;(b)液體培養(yǎng);改良的MS液體培養(yǎng)基,接種量1～5g/100ml,溫度20～30℃,轉(zhuǎn)速50～150rpm,光強(qiáng)1000～3000lx。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模地工業(yè)生產(chǎn),不受季節(jié)和土地面積的限制。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1276424SQ99112969
公開日2000年12月13日 申請(qǐng)日期1999年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月2日
發(fā)明者白雪芳, 杜昱光, 王靖楣, 王毓福, 朱亮 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所