專利名稱：一種谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說涉及一種谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
營養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)上的新發(fā)現(xiàn)逐漸糾正了人們對于谷氨酰胺的認識，谷氨酰胺現(xiàn)在已被作為一種條件必需性氨基酸看待，谷氨酰胺的產(chǎn)業(yè)化將會有極大的經(jīng)濟效益和社會效益。盡管國內(nèi)外有一些研究小組對其產(chǎn)生作了許多研究工作(微生物學(xué)通報，4(5):211-212(1984)；16(2):73-76(1989)；微生物學(xué)雜志，6(3):35-37(1986)；工業(yè)微生物，21(5):11-17(1988)；食品與發(fā)酵工業(yè)，No.2:21-25(1992)；發(fā)酵科技通訊，19(2):16-18(1990)；Agri.Biol.Chem.，51(8):2089-2094(1987)，日本特許公報昭62-186796；昭63-21379)，但絕大多數(shù)研究集中于菌種選育和搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基配方與發(fā)酵條件優(yōu)化，而對規(guī)模生產(chǎn)至關(guān)重要的發(fā)酵罐水平上的工藝優(yōu)化則沒有文獻或?qū)＠l(fā)表，其結(jié)果是搖瓶發(fā)酵水平在發(fā)酵罐規(guī)模上不能重現(xiàn)，菌種潛力難以發(fā)揮。
本發(fā)明針對上述不足，提出一整套優(yōu)化的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，給出影響谷氨酰胺產(chǎn)生的種種因素的控制方法，從而在發(fā)酵罐規(guī)模上進一步重現(xiàn)和提高搖瓶發(fā)酵的結(jié)果，充分發(fā)揮菌種潛力。
本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)工藝包括如下順序的步驟(1)發(fā)酵菌株的選擇黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)之一。
(2)母斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種斜面，29-37℃恒溫培養(yǎng)8-20小時，制得母斜面，母斜面冷藏待用。
(3)子斜面將步驟(2)得到的母斜面接種子斜面，培養(yǎng)方法同步驟(2)。
(4)一級種子培養(yǎng)將步驟(3)得到的斜面菌苔接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在29-37℃下?lián)u床培養(yǎng)8-20小時。
(5)二級種子培養(yǎng)將步驟(4)培養(yǎng)好的一級種子按2％-10％(體積比)接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的種子罐開始培養(yǎng)；培養(yǎng)條件通氣量0.5-1.5VVM，罐壓0.01-0.05Mpa，溫度29-37℃，溶解氧3％-80％飽和度；培養(yǎng)時間6-18小時。
(6)發(fā)酵罐發(fā)酵將步驟(5)培養(yǎng)好的種子按2％-10％(體積比)接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制條件為溫度29-37℃，通氣量0.5-1.5VVM，罐壓0.01-0.05MPa，溶解氧0.5％-90％飽和度，pH6.5-7.5，并以消泡劑消泡；發(fā)酵8-24小時，補入發(fā)酵初始培養(yǎng)基0.5-1.5％(重量體積比)的氯化鉀；發(fā)酵14-26小時，停止pH控制，使pH自然降低至6.2-6.6，之后控制pH在此范圍內(nèi)，溶解氧在20-80％飽和度之間，并連續(xù)流加30-80％(重量體積比)的糖溶液，或者將糖溶液按每次每升發(fā)酵液10-30克糖分批補入，控制發(fā)酵罐中糖濃度在5-40g/L之間；補加氯化鉀之后，每間隔8-24小時補入發(fā)酵液總體積0.05％-0.3％(體積比)的玉米漿；發(fā)酵50-68小時停止補糖，待糖濃度降低至1-10g/L時發(fā)酵結(jié)束。
在上述發(fā)酵生產(chǎn)工藝過程中，步驟(1)中的黃色短桿菌是黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、AS 1.495、AS 1.582和它們的突變株之一，谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13286、ATCC 14751、ATCC 14752、ATCC 13032、AS 1.805、ACCC11067、ACCC 11063、IFFI 10056、IFFI 10054、IFFI 10131、IFFI 10039、IFFI10031、IFFI 10051、IFFI 10052、IFFI 10111和它們的突變株之一，北京棒桿菌是指北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)AS 1.299和其突變株之一，鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)AS 1.452和其突變株之一。
步驟(2)中保存菌株的時間以不超過一個月為佳。
步驟(6)中溶解氧的控制通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓實現(xiàn)。
步驟(6)中pH通過補入濃度為10％-30％(重量體積比)的氨水調(diào)節(jié)。
步驟(6)中消泡劑是聚醚類或硅酮類消泡劑之一。
步驟(6)中玉米漿是濃玉米漿或稀玉米漿，濃玉米漿干物質(zhì)含量為50％-90％(重量比)，稀玉米漿干物質(zhì)含量為5％-50％(重量比)。
步驟(6)中稀玉米漿的補入量以發(fā)酵液總體積的0.10％-0.30％(體積比)更佳；濃玉米漿補入量以發(fā)酵液總體積的0.05％-0.15％(體積比)更佳。
步驟(6)中糖溶液是指葡萄糖、淀粉水解糖之一。
發(fā)酵罐上采用上述工藝后，發(fā)酵水平大大高于搖瓶發(fā)酵結(jié)果，菌種潛力得到充分發(fā)揮，其工藝為大規(guī)模生產(chǎn)谷氨酰胺提供了依據(jù)。下表展示了搖瓶發(fā)酵實驗與50升發(fā)酵罐發(fā)酵實驗的效果對比。
表搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐發(fā)酵72小時產(chǎn)谷氨酰胺濃度對比(單位g/L
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1使用的培養(yǎng)基包括斜面培養(yǎng)基(葡萄糖0.1，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0,NaCl0.5，瓊脂2.0)、搖瓶種子培養(yǎng)基(葡萄糖2.0,(NH4)2SO41.0,KH2PO40.1,K2HPO4·3H2O 0.3,MgSO4·7H2O 0.01，尿素0.2，玉米漿0.1)、發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖10.0,NH4Cl 4.0,KH2PO40.025，脲0.5,K2HPO4·3H2O 0.025,MgSO4·7H2O 0.05，玉米漿液1.0，生物素5μg/L，維生素B1 20μg/L,ZnSO45mg/L,FeSO45mg/L)，以上未說明單位的成分均為重量體積百分比。
將黃色短桿菌ATCC14067菌株于31℃下恒溫培養(yǎng)10小時后制得母斜面，放置于4℃冰箱中保存15天。從母斜面轉(zhuǎn)接子斜面，于31℃培養(yǎng)10小時后，分別接一環(huán)培養(yǎng)物于兩只已滅菌的各裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，31℃往復(fù)式搖床培養(yǎng)，往復(fù)頻率110次，振幅5.8厘米。培養(yǎng)15小時后，按5％體積比接種于已滅菌的裝有2升種子培養(yǎng)基的二級種子罐并開始培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通氣量1.0VVM，罐壓0.03-0.035Mpa，溫度31℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧在30％-50％之間。培養(yǎng)時間13小時后，將此培養(yǎng)液按5％的體積比接種于已滅菌的裝有40升發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度31℃，通氣量1.0VVM，罐壓0.035-0.040MPa，以25％重量體積比氨水控制pH6.9-7.1，以聚氧乙烯氧丙烯甘油(又稱泡敵)消泡劑消泡，并通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧處于20％-30％飽和度之間；發(fā)酵13小時，一次性補入已滅菌的濃度為30％(重量體積比)的氯化鉀溶液1.35升；發(fā)酵18小時，停止補入氨水，使pH自然降低至6.40，之后繼續(xù)以25％氨水控制pH在6.35-6.45范圍內(nèi)，溶解氧在35-50％飽和度之間，并連續(xù)流加70％重量體積比的葡萄糖溶液，控制發(fā)酵罐中糖濃度在10-15g/L之間。在發(fā)酵至34小時和50小時，分別補入已滅菌的濃玉米漿40ml。發(fā)酵64小時停止補糖，72小時結(jié)束發(fā)酵，此時，培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛?g/L,L-谷氨酰胺濃度56g/L。
實施例2所用各種培養(yǎng)基配方同實施例1。
將谷氨酸棒桿菌ATCC13286菌株于29℃下恒溫培養(yǎng)20小時后制得母斜面，放置于4℃冰箱中保存3天。從母斜面轉(zhuǎn)接子斜面，于29℃培養(yǎng)20小時后，分別接一環(huán)培養(yǎng)物于兩只已滅菌的各裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，29℃搖床培養(yǎng)，往復(fù)頻率110次，振幅5.8厘米，培養(yǎng)20小時后，按2％體積比接種于已滅菌的裝有2升種子培養(yǎng)基的二級種子罐并開始培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通氣量1.5VVM，罐壓0.01-0.03Mpa，溫度29℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧在40％-90％飽和度之間。培養(yǎng)時間18小時后，將此培養(yǎng)液按2％的體積比接種于已滅菌的裝有40升發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度29℃，通氣量1.5VVM，罐壓0.01-0.03MPa，以29％重量體積比氨水控制pH7.2-7.5，以泡敵消泡劑消泡，并通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧處于30％-80％飽和度之間；發(fā)酵24小時，一次性補入已滅菌的濃度為20％(重量體積比)的氯化鉀溶液3.0升；發(fā)酵26小時，停止補入氨水，使pH自然降低至6.45，之后繼續(xù)以29％氨水控制pH在6.5-6.6范圍內(nèi)，溶解氧在40-80％飽和度之間，并連續(xù)流加80％重量體積比的葡萄糖溶液，控制發(fā)酵罐中糖濃度在24-40g/L之間。在發(fā)酵至32小時、42小時、54小時，分別補入已滅菌的稀玉米漿40ml。發(fā)酵68小時停止補糖，80小時結(jié)束發(fā)酵，此時，培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛?g/L,L-谷氨酰胺濃度42g/L。
實施例3所用各種培養(yǎng)基配方同實施例1。
將北京棒桿菌AS 1.299菌株于37℃下恒溫培養(yǎng)8小時后制得母斜面，放置于4℃冰箱中保存30天。從母斜面轉(zhuǎn)接子斜面，于37℃培養(yǎng)8小時后，分別接一環(huán)培養(yǎng)物于兩只已滅菌的各裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)，往復(fù)頻率110次，振幅5.8厘米，培養(yǎng)8小時后，按10％體積比接種于已滅菌的裝有2升種子培養(yǎng)基的二級種子罐并開始培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通氣量0.5VVM，罐壓0.04-0.05Mpa，溫度37℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧在3％-40％之間。培養(yǎng)時間8小時后，將此培養(yǎng)液按10％的體積比接種于已滅菌的裝有40升發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度34℃，通氣量0.5VVM，罐壓0.04-0.05MPa，以10％氨水(重量體積比)控制pH6.5-6.9，以硅酮消泡乳劑消泡，并通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速控制溶解氧處于0.5％-40％飽和度之間；發(fā)酵8小時，一次性補入已滅菌的濃度為30％(重量體積比)的氯化鉀溶液0.66升；發(fā)酵14小時，停止補入氨水，使pH自然降低至6.2，之后繼續(xù)以10％(重量體積比)氨水控制pH在6.2-6.3范圍內(nèi)，溶解氧在20-40％飽和度之間，并將已滅菌的濃度為40％(重量體積比)的淀粉液化糖溶液按每次2升分批補入，于發(fā)酵22小時、34小時、50小時各補一次。在發(fā)酵至30小時和54小時，分別補入已滅菌的稀玉米漿40ml。64小時結(jié)束發(fā)酵，此時，培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛?0g/L,L-谷氨酰胺濃度19g/L。
權(quán)利要求
1．一種谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其步驟順序如下(1)發(fā)酵菌株的選擇黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)、鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)之一。(2)母斜面制備將上述發(fā)酵菌株接種斜面，29-37℃恒溫培養(yǎng)8-20小時，制得母斜面，母斜面冷藏待用。(3)子斜面將步驟(2)得到的母斜面接種子斜面，培養(yǎng)方法同步驟(2)。(4)一級種子培養(yǎng)將步驟(3)得到的斜面菌苔接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在29-37℃下?lián)u床培養(yǎng)8-20小時。(5)二級種子培養(yǎng)將步驟(4)培養(yǎng)好的一級種子按2％-10％(體積比)接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的種子罐開始培養(yǎng)；培養(yǎng)條件通氣量0.5-1.5VVM，罐壓0.01-0.05Mpa，溫度29-37℃，溶解氧3％-80％飽和度；培養(yǎng)時間6-18小時。(6)發(fā)酵罐發(fā)酵將步驟(5)培養(yǎng)好的種子按2％-10％(體積比)接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制條件為溫度29-37℃，通氣量0.5-1.5VVM，罐壓0.01-0.05MPa，溶解氧0.5％-90％飽和度，pH6.5-7.5，并以消泡劑消泡；發(fā)酵8-24小時，補入發(fā)酵初始培養(yǎng)基0.5-1.5％(重量體積比)的氯化鉀；發(fā)酵14-26小時，停止pH控制，使pH自然降低至6.2-6.6，之后控制pH在此范圍內(nèi)，溶解氧在20-80％飽和度之間，并連續(xù)流加30-80％(重量體積比)的糖溶液，或者將糖溶液按每次每升發(fā)酵液10-30克糖分批補入，控制發(fā)酵罐中糖濃度在5-40g/L之間；補加氯化鉀之后，每間隔8-24小時補入發(fā)酵液總體積0.05％-O.3％(體積比)的玉米漿；發(fā)酵50-68小時停止補糖，待糖濃度降低至1-10g/L時發(fā)酵結(jié)束。
2．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(1)中所述的黃色短桿菌是黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、AS 1.495、AS 1.582和它們的突變株之一，谷氨酸棒桿菌是指谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13286、ATCC 14751、ATCC 14752、ATCC 13032、AS 1.805、ACCC 11067、ACCC 11063、IFFI 10056、IFFI10054、IFFI 10131、IFFI 10039、IFFI 10031、IFFI 10051、IFFI 10052、IFFI10111和它們的突變株之一，北京棒桿菌是指北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)AS 1.299和其突變株之一，鈍齒棒桿菌是指鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)AS 1.452和其突變株之一。
3．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(2)中保存菌株的時間以不超過一個月為佳。
4．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中溶解氧的控制通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓實現(xiàn)。
5．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中pH通過補入濃度為10％-30％(重量體積比)的氨水調(diào)節(jié)。
6．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中消泡劑是聚醚類或硅酮類消泡劑之一。
7．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中玉米漿是濃玉米漿或稀玉米漿，濃玉米漿干物質(zhì)含量為50％-90％(重量比)，稀玉米漿干物質(zhì)含量為5％-50％(重量比)。
8．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中稀玉米漿的補入量以發(fā)酵液總體積的0.10％-0.30％(體積比)更佳；濃玉米漿補入量以發(fā)酵液總體積的0.05％-0.15％(體積比)更佳。
9．如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中糖溶液是指葡萄糖、淀粉水解糖之一。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)工藝,它有效地解決了目前谷氨酰胺生產(chǎn)研究中搖瓶發(fā)酵結(jié)果在發(fā)酵罐規(guī)模上不能重復(fù)、菌種潛力不能充分發(fā)揮等問題。本發(fā)明采用分階段控制pH、溶解氧,控制發(fā)酵液中糖濃度,并補入氯化鉀、玉米漿等工藝發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸胺。本發(fā)明方法新穎,谷氨酰胺發(fā)酵水平提高幅度大,適用于谷氨酰胺大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12P13/14GK1225946SQ9812215
公開日1999年8月18日 申請日期1998年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月28日
發(fā)明者孫際賓, 許平, 沈亞領(lǐng), 馬翠卿, 錢新民 申請人:山東大學(xué)